Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul
Unidade Universitária de Dourados
Programa de Pós- Graduação em Recursos Naturais
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E BIOATIVIDADE DE
COMPOSTOS NA RAIZ DA Jatropha ribifolia (Pohl) Baill.
Elaine de Souza Fernandes
Dourados – MS
Março-2012
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul
Unidade Universitária de Dourados
Programa de Pós- Graduação em Recursos Naturais
ISOLAMENTO, CARACTERIZAÇÃO E BIOATIVIDADE DE
COMPOSTOS NA RAIZ DA Jatropha ribifolia (Pohl) Baill.
Elaine de Souza Fernandes
Orientador: Prof. Dr. Rogério Cesar de Lara da Silva
Co-orientador: Prof. Dr. Sandro Minguzzi
“Dissertação apresentada ao programa de
pós-graduação em Recursos Naturais, área
de concentração em Recursos Naturais, da
Universidade Estadual de Mato Grosso do
Sul, como parte das exigências para a
obtenção do título de Mestre em Recursos
Naturais”.
Dourados – MS
Março-2012
i
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul
Unidade Universitária de Dourados
Programa de Pós- Graduação em Recursos Naturais
FICHA CATALOGRÁFICA
F399i Fernandes, Elaine de Souza.
Isolamento, caracterização e bioatividade de compostos na
raiz da Jatropha ribifolia (Pohl) Baill./ Elaine de Souza
Fernandes. Dourados, MS: UEMS, 2012.
87p. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) – Recursos Naturais –
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, 2012.
Orientador: Prof. Dr. Rogério Cesar de Lara da Silva.
1.Jatropha ribifolia. 2. Terpenos. 3. Bioensaios. I. Título.
CDD 20.ed. 581.498
ii
Acadêmica: Elaine de Souza Fernandes
Orientador: Prof. Dr. Rogério Cesar de Lara da Silva
APROVADO (A) ( __/__/__)
______________________________________________________________
Dr. Rogério Cesar de Lara da Silva
(orientador)
_________________________________________________________________________
Dr. Paulo Mitsuo Imamura
(1° membro da banca)
_________________________________________________________________________
Dr. Euclésio Simionatto
(2° membro da banca)
iii
Tudo que uma pessoa é capaz de planejar,
ela é capaz de realizar.
Tenha fé, otimismo e ação.
Obrigada Senhor pela graça recebida.
iv
Por todo amor, carinho, paciência,
incentivo, dedicação e sacrifício é a
vocês, pai e mãe, que dedico este
trabalho.
v
AGRADECIMENTOS
Ao Deus, criador e senhor da minha vida. Aquele que, encarnado em Jesus Cristo,
demonstra que somente o amor pode transformar conhecimento e inteligência em
sabedoria.
Aos meus maiores amores, pai, mãe e irmãos, por estarem sempre ao meu lado em todos os
momentos.
Ao orientador, Prof. Dr. Rogério César de Lara da Silva, pela competente orientação,
dedicação e profissionalismo na realização deste trabalho.
Ao co-orientador, Prof. Dr. Sandro Minguzzi, pela colaboração de extrema importância na
execução deste trabalho e pela contribuição em minha formação científica e pessoal.
A vocês Mestres deixo uma mensagem: “Mestre, depois de pai, é o nome mais nobre e
doce que um homem pode dar ao outro.” (Edmondo d’ Amicis)
A Dra. Inês Cordeiro, do Instituto Botânico de São Paulo pela identificação botânica da
espécie.
Ao Prof. Dr. Paulo Imamura, pela orientação, dedicação, paciência e profissionalismo
durante o estágio na Unicamp, que fundamentalmente contribuiu na execução deste
trabalho.
A toda equipe da Unicamp e CPQBA, que contribuiu na elucidação estrutural e em
bioensaios.
A CAPES pela bolsa de estudo.
Aos colegas do curso de Pós-Graduação, em especial a Vanessa do N. Simões, pela
convivência amiga e pelos momentos de descontração.
Aos amigos e amigas do Laboratório, em especial Danilo Tofóli e Gabriela P. T. Santini,
pela contribuição e amizade.
Aos amigos que conquistei durante o estágio na Unicamp, Myriam Salazar, Layla Melo,
Alessandra Guaragna, Aline Muller, Sara Herreras, Thiago Valadão, Guilherme Guaragna,
Ricardo Frutuozo e Wagner William.
A todos os meus amigos, que de uma forma ou de outra estiveram ao meu lado durante esta
caminhada. Silvanice Lopes, Cristina Marangueli, Michela Holsbach, obrigada.
vi
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS
ix
LISTA DE TABELAS
xii
LISTA DE ABREVIATURA E SIGLAS
xiii
RESUMO
xv
ABSTRACT
xvi
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1
1. INTRODUÇÃO
1
1.1
1
PRODUTOS NATURAIS
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3
2.1.
FAMÍLIA E GÊNERO
3
2.2.
ESPÉCIE
5
2.3.
TÉCNICAS
DE
ISOLAMENTO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE
PRODUTOS NATURAIS
6
2.3.1. Técnicas Cromatográficas
7
2.3.2. Técnicas Espectroscópicas
8
2.4.
8
BIOENSAIOS
2.4.1. Ensaio de Atividade Antioxidante
9
2.4.2. Ensaio Enzimático
9
2.4.3. Ensaio Antitumoral in vitro
9
3. OBJETIVOS
11
3.1.
GERAL
11
3.2.
ESPECÍFICO
11
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
12
4.1.
MATERIAIS E MÉTODOS PARA ANÁLISE QUÍMICA
12
4.2.
COLETA DO MATERIAL VEGETAL
13
4.3.
PREPARAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL E DOS EXTRATOS
13
4.4.
FRACIONAMENTO DE EXTRATOS
14
4.5.
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DAS FRAÇÕES
15
4.6.
ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO
16
4.6.1. Procedimentos Cromatográficos Preliminares
16
vii
4.6.2. Fração Hexânica (F-C6H14)
16
4.6.3. Fração Clorofórmica (F-CHCl3)
18
4.6.4. Esterificação do sesquiterpeno com diazometano
19
4.7. BIOENSAIOS
20
4.7.1. Ensaio de Atividade Antioxidante
20
4.7.2. Ensaio Enzimático
20
4.7.3. Ensaio Antitumoral in vitro
22
4.7.3.1.
Células
22
4.7.3.2.
Cultivo celular
22
4.7.3.3.
Descongelamento das células
24
4.7.3.4.
Congelamento das células
24
4.7.3.5.
Atividade antiproliferativa de extratos e compostos
24
4.7.3.6.
Preparo das placas e inoculação das células
25
4.7.3.7.
Preparo e aplicação das amostras
25
4.7.3.8.
Análise dos dados
27
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
28
5.1.
RENDIMENTO DOS EXTRATOS
28
5.2.
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DOS COMPOSTOS ISOLADOS
28
5.2.1. Elucidação Estrutural de SQJR
28
5.2.2. Esterificação do sesquiterpeno com diazometano
40
5.2.3. Elucidação Estrutural de DTJR
46
5.3.
61
COMPOSTOS ISOLADOS NA ETAPA DE FRACIONAMENTO
5.3.1. SBJR e SMJR
61
5.4. BIOENSAIOS
65
5.4.1. Ensaio de Atividade Antioxidante
65
5.4.2. Ensaio Enzimático
66
5.4.3. Ensaio Antitumoral in vitro
68
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
73
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
74
CAPÍTULO 2 – ARTIGO
80
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Estrutura Isopreno
2
Figura 2. Folhas da Jatropha ribifolia
6
Figura 3. Raiz da Jatropha ribifolia
6
Figura 4: Fracionamento dos extratos da raiz da Jatropha ribifolia
15
Figura 5: Esquema de isolamento e purificação do diterpeno na fração hexânica da
primeira extração da raiz da Jatropha ribifolia
17
Figura 6: Esquema de isolamento e purificação do sesquiterpeno na fração hexânica da
terceira extração da raiz da Jatropha ribifolia
18
Figura 7: Esquema de isolamento e purificação do diterpeno na fração clorofórmica da
primeira e segunda extração da raiz da Jatropha ribifolia
19
Figura 8. Placa controle (T0) contendo as linhagens celulares testadas e o controle
contendo apenas meio de cultura (branco)
25
Figura 9. Placa de 96 wells usada nos testes antiproliferativos mostrando a disposição e
concentrações das amostras, o branco das amostras, das células e do meio de cultura
26
Figura 10. Espectro de Infravermelho do SQJR, em pastilhas de KBr
29
Figura 11. Espectro de RMN-1H do SQJR, em CDCl3
31
Figura 12. Expansão do espectro de RMN-1H do SQJR, em CDCl3
31
Figura 13. Espectro de RMN-13C do SQJR, em CDCl3
32
Figura 14. Espectro de DEPT do SQJR em CDCl3
32
Figura 15. Cristais do ácido ciperenóico isolados da raiz da Jatropha ribifolia
33
Figura 16: Estrutura química do ácido ciperenóico C15H22O2
34
Figura 17. Correlações vistas no espectro NOESY do ácido ciperenóico
34
Figura 18. Espectro de NOESY do ácido ciperenóico em CDCl3
35
Figura 19. Espectro de COSY do ácido ciperenóico em CDCl3
36
Figura 20. Espectro de HMQC do ácido ciperenóico em CDCl3
36
Figura 21. Espectro de HMBC do ácido ciperenóico em CDCl3
37
Figura 22. Proposta de fragmentação para o ácido ciperenóico
38
Figura 23. Cromatograma do ácido ciperenóico obtido por CG-EM
39
Figura 24: Espectro de Massas do ácido ciperenóico obtido por CG-EM
39
Figura 25: Espectro UV-VÍS do ácido ciperenóico em metanol
40
Figura 26. Esquema de reação no processo de metilação do ácido ciperenóico
41
ix
Figura 27. Espectro de Infravermelho do SQ-Me, em filme
1
Figura 28. Espectro de RMN- H do SQ-Me, em CDCl3
1
42
43
Figura 29. Expansão do espectro de RMN- H do SQ-Me, em CDCl3
44
Figura 30. Espectro de RMN-13C do SQ-Me, em CDCl3
44
Figura 31. Expansão do espectro de RMN-13C do SQ-Me, em CDCl3
45
Figura 32. Espectro de DEPT do SQ-Me em CDCl3
45
Figura 33: Estrutura química do ácido ciperenóico metilado C16H24O2
46
Figura 34. Espectro de Infravermelho do DTJR, em pastilhas de KBr
47
Figura 35. Espectro de RMN-1H do DTJR, em CDCl3
49
Figura 36. Expansão do Espectro de RMN-1H do DTJR, em CDCl3
49
Figura 37. Expansão do Espectro de RMN-1H do DTJR, em CDCl3
50
Figura 38. Espectro de RMN-13C do DTJR, em CDCl3
50
Figura 39. Espectro de DEPT do DTJR em CDCl3
51
Figura 40. Cristais de jatrofona isolados da raiz da Jatropha ribifolia
52
Figura 41: Estrutura química da jatrofona C20H24O3
53
Figura 42. Correlações vistas no espectro NOESY da jatrofona
53
Figura 43. Espectro de NOESY da jatrofona
54
Figura 44. Espectro de COSY da jatrofona em CDCl3
55
Figura 45. Expansão Espectro de COSY da jatrofona
55
Figura 46. Espectro de HMQC da jatrofona
56
Figura 47. Expansão Espectro de HMQC da jatrofona
56
Figura 48. Expansão Espectro de HMQC da jatrofona
57
Figura 49. Espectro de HMBC da jatrofona
57
Figura 50. Expansão Espectro de HMBC da jatrofona
58
Figura 51. Expansão Espectro de HMBC da jatrofona
58
Figura 52. Proposta de fragmentação para a jatrofona
60
Figura 53: Espectro de Massa da jatrofona
60
Figura 54. Espectro UV-VÍS da jatrofona em metanol
61
Figura 55. Espectro de Infravermelho do SBJR, em pastilhas de KBr
62
Figura 56. Sal oxálico isolados da raiz da Jatropha ribifolia
62
Figura 57. Espectro de Infravermelho do SMJR, em pastilhas de KBr
64
Figura 58. Espectro de RMN-1H do SMJR, em DMSO-d6
64
x
Figura 59. Lignina isolada da raiz da Jatropha ribifolia
65
Figura 60. Potencial antioxidante da raiz da Jatropha ribifolia, frente ao radical DPPH 65
Figura 61. Perfil de atividade vs inibição da enzima LMW
66
Figura 62. Perfil de atividade vs inibição da enzima PTP1B
67
Figura 63. Perfil de atividade vs inibição da enzima Cdc25b
67
Figura 64. Perfil de atividade enzimática na presença dos candidatos a inibidores
68
Figura 65. Perfil de inibição enzimática na presença dos candidatos a inibidores
68
Figura 66. Gráfico de atividade antitumoral da doxorrubicina em cultura de células
tumorais humanas
69
Figura 67. Gráfico de atividade antitumoral do extrato hexânico da raiz da Jatropha
ribifolia em cultura de células tumorais humanas
70
Figura 68. Gráfico de atividade antitumoral da lignina (SMJR) isolada da Jatropha
ribifolia, em cultura de células tumorais humanas
70
Figura 69. Gráfico de atividade antitumoral do ácido ciperenóico isolado da Jatropha
ribifolia, em cultura de células tumorais humanas
71
Figura 70. Gráfico de atividade antitumoral da jatrofona isolada da Jatropha ribifolia, em
cultura de células tumorais humanas
71
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Estruturas de terpenos isolados no gênero Jatropha
4
Tabela 2. Estruturas de terpenos isolados no gênero Jatropha
5
Tabela 3. Protocolo experimental para LMW-PTP
21
Tabela 4. Protocolo experimental para PTP-1B
21
Tabela 5. Protocolo experimental para Cdc25b
21
Tabela 6. Linhagens celulares, oriundas de tumores humanos, cedidas ao CPQBA pelo
National Cancer Institute (NCI - USA)
22
Tabela 7. Linhagens celulares tumorais humanas e normais (Vero e HaCat) utilizadas nos
ensaios de atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação
23
Tabela 8. Rendimento das frações obtidas da raiz da Jatropha ribifolia
28
Tabela 9. Dados de RMN do composto SQJR, em CDCl3 em 500MHz e 62.5 MHz
33
Tabela 10. Dados de RMN do ácido ciperenóico, em CDCl3 em 500MHz
37
Tabela 11. Dados de RMN do composto SQ-Me, em CDCl3 em 500MHz e 62.5 MHz 46
Tabela 12. Dados de RMN do composto DTJR, em CDCl3 em 500MHz e 62.5 MHz
51
Tabela 13. Dados de RMN da jatrofona, em CDCl3 em 500MHz
59
Tabela 14. TGI – Total Growth Inhibition - concentração necessária para que ocorra 0%
de crescimento
72
xii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
786-O – linhagem celular renal
AcOEt - acetato de etila
CCD - cromatografia em camada delgada
Cdc25b - proteína tirosina fosfatase dual
CG-EM - cromatografia gasosa acoplada à espectrometria de massas
COSY (1H-1H) - correlação próton-próton (COrrelation SpectroscopY)
CPQBA - Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas e Agrícolas
DEPT - espectro de carbono 13 com seleção de carbonos (Distortionless Enhancement by
Polarization Transfer)
DMSO - dimetilsulfóxido
DMSO- d6 – dimetilsulfóxido deuterado
DPPH● - 2,2-difenil-1-picrilhidrazil
DTJR - diterpeno de Jatropha ribifolia
F.M- fase móvel
F-AcOEt - fração de acetato de etila
F-C6H14 - fração hexânica
F-CHCl3 - fração clorofórmica
HaCat - queratinócito humano
HMBC - hetero-correlação 1H-13C a duas e três ligações (Heteronulear Multiple Bond
Correlation)
HMQC - hetero-correlação com detecção de próton (Heteronuclear Multiple Quantum
Correlation)
HT-29 – linhagem celular tumoral de cólon
IC - inibição de crescimento
IV - espectroscopia na região do infravermelho
K-562 - linhagem celular tumoral de leucemia
LMW- tirosina fosfatase de baixo peso molecular
m/z - relação massa/carga
MCF-7 - linhagem celular tumoral de mama
MHz - megahertz
NCI - National Cancer Institute
xiii
NCI-ADR/ RES - linhagem celular tumoral de ovário com fenótipo resistência multidroga
NCI-H460 – linhagem celular tumoral de pulmão
NOESY - espectroscopia de efeito nuclear de overhauser (Nuclear Overhauser Effect
SpectroscopY)
OVCAR-3 - linhagem celular tumoral de ovário
P.A – pró-análise
PC-3 - linhagem celular tumoral de próstata
PI/DT – diterpeno jatrofona
PI/ST – sesquiterpeno ácido ciperenóico
pNPP- para-Nitrophenylphosphate
PTP-1B - proteína tirosina fosfatase específica
PTPs – proteína tirosina fosfatase
Rf - fator de retenção
RMN - ressonância magnética nuclear
RMN-13C - ressonância magnética nuclear de carbono 13
RMN-1H - ressonância magnética nuclear de próton
RMN-2D - ressonância magnética nuclear bidimensional
RPMI-1640 – solvente utilizado como meio de cultura
SBJR – sal oxálico, sólido branco de Jatropha ribifolia
SFB - soro fetal bovino
SMJR – lignina, sólido marrom de Jatropha ribifolia
SQJR - sesquiterpeno de Jatropha ribifolia
SQ-Me - sesquiterpeno metilado de Jatropha ribifolia
SRB - corante protéico sulforrodamina B
TCA - ácido tricloroacético
TGI - total growth inhibition (inibição total do crescimento)
U251- linhagem celular tumoral de glioma
UACC-62 - linhagem celular tumoral de melanoma
UV-VÍS - espectroscopia na região do ultravioleta e visível
Vero - linhagem celular normal de rim de macaco verde
δ - deslocamento químico
xiv
RESUMO
Os terpenos bioativos apresentam uma expressiva importância para a indústria
farmacêutica na qual abrangem uma grande variedade de compostos químicos
diversificados, proporcionando grandes oportunidades para química sintéticas e também
pesquisas bioquímicas, que podem usar como ferramentas para a compreensão dos
caminhos bioquímicos. No intuito de contribuir com a descoberta de novos constituintes,
estudos foram realizados com a raiz da Jatropha ribifolia (Pohl) Baill, por ser os terpenos
bastante comum no gênero Jatropha. Técnicas de isolamento e elucidação estrutural
possibilitaram o isolamento de quatro substâncias, duas na forma de cristais incolores, a
jatrofona e o ácido ciperenóico; um sólido marrom caracterizado como lignina e um sólido
branco caracterizado como um sal oxálico. O ácido ciperenóico foi esterificado com
diazometano para converter o grupo carboxílico em éster metílico. Bioensaios foram
realizados com objetivo de conhecer o potencial biológico dos extratos e substâncias
isoladas. A atividade antioxidante foi avaliada nas frações orgânicas da raiz da Jatropha
ribifolia, apresentando resultado satisfatório, principalmente para as frações de clorofórmio
e acetato de etila com valores expressivos quanto a sua capacidade em extrair antioxidantes
naturais. Ensaios enzimáticos, utilizando proteínas tirosinas fosfatases (PTPs) tendo como
candidatos a inibidores o ácido ciperenóico e jatrofona, apresentaram resultados
expressivos principalmente para a jatrofona que mostrou um maior potencial inibitório,
visto que, a inibição de PTPs está intimamente relacionada ao tratamento de diversos tipos
de cânceres, do diabetes e da obesidade. O ensaio antitumoral in vitro realizado com o
extrato hexânico, a lignina e os terpenos ácido ciperenóico e jatrofona mostraram
resultados bastante expressivos frente à linhagem de células tumorais, sendo a jatrofona, o
composto que melhor expressou inibição do crescimento celular em concentração inferior
a 0,25µg.mL-1 para linhagem celular tumoral de leucemia.
Palavras-chave: Terpenos, jatrofona, ácido ciperenóico, bioensaios, Jatropha ribifolia.
xv
ABSTRACT
The bioactive terpenes have a significant importance for the pharmaceutical industry in
which cover a wide range of diverse chemical compounds providing great opportunities for
synthetic chemistry and also biochemical research, they can use as tools for understanding
the biochemical pathways. In order to contribute to the discovery of new terpenes, studies
were performed with the roots of Jatropha ribifolia (Pohl) Baill, terpenes to be quite
common in the genus Jatropha. Techniques isolation and structural elucidation allowed the
isolation of four substances, two in the form of colorless crystals, cyperenoic acid and
jatrophone; a brown solid characterized a lignin and a white solid characterized as oxalic
acid. The cyperenoic acid was esterified with diazomethane to convert the carboxylic in an
ester group. Bioassays were conducted in order to know the biological potential of extracts
and isolated compounds. The antioxidant activity was evaluated in the organic fractions of
the roots of Jatropha ribifolia, with satisfactory results, especially for the fractions of
chloroform and ethyl acetate with expressive values and its ability to extract natural
antioxidants. Enzymatic assays, using protein tyrosine phosphatases (PTPs) and as the
candidate inhibitors jatrophone and cyperenoic acid, presented results mainly for the
jatrophone showing greater inhibitory potencial, since inhibition of PTPs is closely related
to treatment of various cancers, diabetes and obesity. The in vitro antitumor assay
performed with the hexane extract, lignin and terpenes cyperenoic acid and jatrophone
results showed significant results against tumor cells, being jatrophone, the compound that
expressed better inhibition of cell growth, at concentrations less than 0.25 μg.mL-1 for
tumor cell line of leukemia.
Keywords: Terpenes, jatrophone, cyperenoic acid, bioassays, Jatropha ribifolia.
xvi
CAPÍTULO 1 – CONSIDERAÇÕES GERAIS
1.
INTRODUÇÃO
1.1.
PRODUTOS NATURAIS
Por mais de 50 anos, os produtos naturais têm sido utilizados no combate às
bactérias infecciosas e fungos. Durante o século 20, plantas com ação antimicrobiana e
seus metabólitos secundários proporcionaram um aumento na expectativa de vida, a
redução ou alívio da dor, bem como proporcionar melhorias no tratamento medicinal. 1
Os produtos naturais desempenham um papel importante na terapia e na prevenção
de doenças em humanos. Mais de 60% e 75% dos medicamentos quimioterápicos para
tratamento de câncer e doenças infecciosas, respectivamente, são de origem natural.
Pesquisas com produtos naturais tornam-se cada vez mais necessárias devido as:
necessidades médicas não atendidas, notáveis diversidades de estruturas e atividades,
métodos sensíveis de ensaio; melhoria nos métodos de isolamento, purificação e
caracterização. 2
Com cerca de 30.000
4
compostos conhecidos, os terpenóides, também referido
como terpenos, são a maior classe de produtos singulares. Entre estes terpenóides, muitos
compostos interessantes são amplamente utilizados na indústria alimentícia como aditivos
alimentares, proporcionando melhores sabores, aromas e especiarias, assim como para a
indústria de cosméticos em perfumarias e produtos rejuvenescedores. Os terpenos com
atividades biológicas são usados para fins medicinais e explorados pela indústria
farmacêutica na qual abrangem uma grande diversidade de compostos químicos,
proporcionando grandes oportunidades para sínteses, e que podem ser usados como
ferramentas para a compreensão dos caminhos bioquímicos. 2
Os terpenóides são derivados de unidade básica de isopreno C5 (Figura 1). Com
base na unidade de isoprenos os terpenóides são comumente classificados como
monoterpenos (C10), sesquiterpenos (C15), diterpenos (C20), e sesterterpenos (C25).
Muitos destes terpenóides possuem a capacidade de exibir uma gama de atividades
biológicas como: contra o câncer, a malária, a inflamação, e uma variedade de doenças
infecciosas (virais e bacterianas). 2,3.
1
Figura 1. Estrutura Isopreno.3
Derivados de três unidades de isopreno, os sesquiterpenos C15 podem ter seu
esqueleto na forma alifática ou cíclica (nanocíclicos, bicíclicos, e tricíclicos) com grupos
funcionais orgânicos. Como nos monoterpenos, a maioria dos sesquiterpenos são
componentes do óleo essencial da planta. Os diterpenos C20 compõem um grupo variado
de compostos com base em quatro grupos de isopreno. Devido ao seu maior ponto de
ebulição, eles não são considerados óleos essenciais. São classificados como resinas, sendo
obtido do material que permanece após a destilação a vapor de um extrato de planta. 4
A diversidade estrutural dos terpenos é imensa e sua importância a nível terapêutico
justifica os numerosos esforços realizados ao longo das últimas quatro décadas no sentido
da elucidação estrutural e biogenética. Considerando a relevante importância dos terpenos
para fins terapêuticos, realizou-se o estudo com a espécie Jatropha ribifolia, pertencente à
família das Euphorbiaceae, por ser a classe dos terpenos bastante comum no gênero
Jatropha. 13
2
2.
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.
FAMÍLIA E GÊNERO
As Euphorbiaceae estão entre as famílias de maior importância econômica,
especialmente na alimentação humana, produção de látex e óleos, e ainda na medicina
popular. É uma das mais ricas em número de espécies, contendo cerca de 7500 espécies em
aproximadamente 290 gêneros
10
. Sua distribuição é ampla, possuindo representantes em
todos os diferentes tipos de vegetação do país, apresenta um grande número de espécies
endêmicas da caatinga. 5
Pertencente a esta família esta o gênero Jatropha, reconhecido como uma
importante fonte de numerosas classes estruturais de metabólitos secundários, incluindo
alcalóides, diterpenos, lignanas, triterpenos e peptídeos cíclicos. Propriedades medicinais
têm sido relatadas às espécies de plantas do gênero Jatropha (Euphorbiaceae). Por
exemplo, o látex fresco de plantas pertencentes a este gênero é utilizado na medicina
popular para o tratamento de bolhas na boca, espinhas e sarna. 6
Aos compostos biologicamente ativos são atribuídas atividades antibacteriana,
antiinflamatória, anti-reumática, antihipertensiva, antimalárica, diarréico e antidiarréico,
antitumoral, antiespasmódicas, anticoagulante, antifúngica, moluscicida, larvicida,
cicatrizante, ação hemostática e vaso relaxante, assim como, obstrução das vias
abdominais, tratamento de feridas infecciosas, efeito analgésico, gastroprotetor e
citotóxico, atividade leishmanicida e tripanossomicida. 9, 11, 12.
A composição química do gênero Jatropha é diversificada e é composta por ácidos
orgânicos, alcalóides, terpenóides, esteróides, flavonóides, lignanas, taninos e saponinas.9
Na Tabela 1, seguem representadas algumas das estruturas de terpenos isolados no gênero
Jatropha.
3
Tabela 1. Estruturas de terpenos isolados no gênero Jatropha.7
(1)
(4) 2α-OH
(5)2β-OH
(2) 15β-OH
(3)15α-OH
(6) 15β-OH
(7) 15α-OH
(9)
(8)
(11)
(10)
O diterpeno jatrofona (1)
12
, é um dos componentes mais abundantes do gênero
encontrado na maioria das espécies. Os diterpenos 4Z-jatrogrossidentadiona (2), 15-epi-4Z
jatrogrossidentadiona
hidroxiisojatrogrossidiona
(3),
(5),
2-hidroxiisojatrogrossidiona
4E-jatrogrossidentadiona
(4),
(6),
2-epi15-epi-4E-
jatrogrossidentadiona (7), jatrogrossidiona (8), jatrowediol (9) 7, japodagrina (10) e
japodagrona (11) compõem terpenos isolados no gênero. 8
Outras estruturas também isoladas do gênero Jatropha são mostradas na Tabela 2
para os sesquiterpenos 6-hidroxi-ciperano (12)
10
, ácido ciperenóico (13), os diterpenos
4
jatropholones A e B (14 e 15) e 9β,13α-dihidroxiisabellione (16), o monoterpeno 1,4epoxy-p-menthan-2-ol (17) e o triterpeno ácido acetil aleuritolico (18).12
Tabela 2. Estruturas de terpenos isolados no gênero Jatropha.
10,12.
(13)
(12)
(14) R: β CH3; α H
(15) R: α CH3; β H
(16) R: H
(16)* R: Ac
(18)
(17)
2.2.
ESPÉCIE
A Jatropha ribifolia (Pohl) Baill (Figuras 2 e 3) é um arbusto que pode crescer até
2,0 m de comprimento, com folhas lâmina foliar 3-lobada e ovada. Suas flores possuem 7,5
mm de comprimento, e seu fruto capsular apresenta 1,0 cm comprimento. A espécie se
distingue dos demais gênero Jatropha principalmente pelo formato das folhas lâmina foliar
3-lobada e pela coloração das flores alvo-amareladas a amarelas. 5
5
Trata-se de uma espécie bastante comum no nordeste do Brasil, sendo
popularmente conhecida como pinhãozinho, pinhão-manso, pinhão rasteiro e na região de
Naviraí-MS como minâncora do campo.5, 14.
Figura 2. Folhas da Jatropha ribifolia
Figura 3. Raiz da Jatropha ribifolia.
2.3.
TÉCNICAS
DE
ISOLAMENTO E ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DE
PRODUTOS NATURAIS
O estudo da composição química de produtos naturais tem o isolamento como parte
fundamental de um processo em que se deseja caracterizar um dado composto. Para
quantificar ou identificar substâncias de qualquer natureza é necessário, na maioria dos
casos, isolar o composto de interesse dos demais elementos constituintes da amostra.
6
Quanto mais pura e homogênea é a substância a ser analisada menor será a probabilidade
de erro na sua identificação e quantificação. Dentre todos os métodos disponíveis para o
isolamento e purificação de produtos naturais, estão o de cristalização, as partições, a
filtração através de membranas e a cromatografia que é a mais utilizada. 15
A cromatografia ocupa um lugar de destaque devido à facilidade com que efetua a
separação, identificação e quantificação de compostos, por si mesma, utilizando um padrão
ou em conjunto com outras técnicas instrumentais de análise. Outra parte deste trabalho
reside na elucidação da estrutura molecular das substâncias isoladas. Atualmente, utiliza-se
para a determinação de substâncias os métodos espectroscópicos e espectrométricos. Sendo
utilizados no diagnóstico de grupos funcionais, na determinação das estruturas
tridimensionais utilizando pequenas quantidades de amostras, e geralmente, não
destrutíveis. Isto é importante visto que na maioria dos casos a massa do produto final é da
ordem de µg a mg. 15
2.3.1. Técnicas Cromatográficas
A cromatografia é um método físico-químico de separação. Ela está fundamentada
na migração diferencial dos componentes de uma mistura, que ocorre devido a diferentes
interações, entre duas fases imiscíveis, a fase móvel e a fase estacionária. A cromatografia
pode ser utilizada para a identificação de compostos, por comparação com padrões
previamente existentes, para a purificação de compostos, separando-se as substâncias
indesejáveis e para a separação dos componentes de uma mistura. 16
A cromatografia em camada delgada (CCD) é uma técnica de adsorção líquido–
sólido. Nesse caso, a separação se dá pela diferença de afinidade dos componentes de uma
mistura pela fase estacionária. Por ser um método simples, rápido, visual e econômico, a
CCD é a técnica predominantemente escolhida para o acompanhamento de reações
orgânicas, sendo também muito utilizada para a purificação de substâncias e para a
identificação de frações coletadas em cromatografia líquida clássica. O parâmetro mais
importante a ser considerado em CCD é o fator de retenção (Rf), o qual é a razão entre a
distância percorrida pela substância em questão e a distância percorrida pela fase móvel.
Os valores ideais para Rf estão entre 0,4 e 0,6. 16
7
Cromatografia em coluna ou cromatografia líquida clássica é uma técnica muito
utilizada para isolamento de produtos naturais e purificação de produtos de reações
químicas. As fases estacionárias mais utilizadas são sílica e alumina. A principal etapa ao
se utilizar essa técnica é o empacotamento, o qual, entre outros fatores, define a eficiência
da separação. Enquanto a alumina é empacotada em sua forma original, a sílica deve sê-lo
na forma de suspensão. 16
2.3.2. Técnicas Espectroscópicas
Na identificação de compostos tornam-se necessárias técnicas espectroscópicas e
espectrométrica: massas, infravermelho, ressonância magnética nuclear e ultravioleta.
Essencialmente a molécula em questão é submetida à análise por feixes de energia radiante
e as respostas dadas são registradas como espectros. As pequenas quantidades de
compostos puros, habitualmente isoladas de misturas complexas por cromatografia,
constituem-se em um desafio para o químico interessado na identificação e elucidação de
estruturas de compostos orgânicos. Estas técnicas têm duas importantes características: são
realizadas rapidamente e são eficazes principalmente para quantidades da ordem de
miligramas e do micrograma. Não há desperdício de tempo nem de material, como ocorre
nas manipulações clássicas. 17
2.4.
BIOENSAIOS
O bioensaio pode ser definido como uma estimativa da concentração ou da potência
de determinada substância através de uma resposta biológica produzida pela mesma.
Dentre suas utilizações está a medição da atividade de substâncias novas ou quimicamente
não definidas.18
Eles oferecem vantagem especial na padronização e controle de qualidade de
produtos de origem vegetal e, de uma maneira geral, podem envolver organismos
inferiores, como microrganismos e microcrustáceos, ensaios bioquímicos visando alvos
moleculares, como enzimas e receptores e cultura de células animais ou humanas. O que
determinará o teste adequado é a doença alvo a ser estudada. 18
8
2.4.1. Ensaio de Atividade Antioxidante
A atividade antioxidante de metabólitos secundários deve-se principalmente às suas
propriedades redutoras e estrutura química. Estas características desempenham um papel
importante na neutralização ou sequestro de radicais livres e quelação de metais de
transição, agindo tanto na etapa de iniciação como na propagação do processo oxidativo. 19
Dentre as substâncias utilizadas para determinar a atividade antioxidante tem-se a
molécula de 2,2-difenil-1-picrilidrazil (DPPH●) caracterizada por ser um radical estável em
virtude da deslocalização espacial do elétron livre por toda estrutura da molécula. Uma
solução de DPPH● ao ser misturada com uma substância que possa ser doadora de átomos
de hidrogênio promove o aumento da forma reduzida difenilpicrilhidrazina, de coloração
amarela, sendo observada a descoloração da solução. O monitoramento desta reação
mostra um decréscimo da absorbância da solução proporcional à atividade antioxidante da
amostra adicionada. 20
2.4.2. Ensaio Enzimático
As proteínas tirosina fosfatases (PTP) constituem uma grande família de enzimas
com analogia às proteínas quinases em sua complexidade e diversidade estrutural.
Portanto, estudos genéticos e bioquímicos mostraram que estas proteínas exercem efeitos
tanto regulando negativamente, como positivamente, as vias de sinalização e no controle
fisiológico de uma variedade de tecidos. Mudanças anormais na atividade dessas enzimas
acarretam na fosforilação inapropriada de resíduos de tirosina, o que contribui para o
desenvolvimento de várias patologias, como neoplasias, diabetes e doenças resultantes de
defeitos imunológicos. A importância das PTPs na regulação de vários eventos celulares
qualifica-as como alvos terapêuticos para a descoberta de novas drogas. 21
2.4.3. Ensaio Antitumoral in vitro
Atualmente, ervas medicinais, especialmente as ditas anticâncer, têm chamado
atenção de institutos farmacêuticos à medida que cientistas percebem que elas são uma
9
fonte quase infinita para o desenvolvimento de drogas, e que a toxicidade destas é muito
baixa, sem apresentar efeito colateral. 22
Como ferramenta útil na determinação de drogas contra o câncer, avaliações para
atividade biológica, utilizando bioensaios simples e rápidos têm sido adicionadas para
obtenção de uma melhor indicação da utilidade de plantas. Assim, separações fitoquímicas
são, hoje, rotineiramente direcionadas por bioensaios que garantem o isolamento de
princípios bioativos, sem determinar se eles pertencem a certa classe de compostos ou
não.22
10
3. OBJETIVOS
3.1 GERAL
Contribuir com o isolamento e identificação de constituintes químicos presentes na
raiz da espécie Jatropha ribifolia utilizando técnicas de extração, de isolamento e
caracterização; e verificar a aplicabilidade destes constituintes através de bioensaios.
3.2 ESPECÍFICO
 Isolamento de constituintes presentes na raiz da espécie
Jatropha ribifolia
utilizando técnicas cromatográficas.
 Elucidação estrutural dos compostos isolados a partir de métodos espectroscópicos.

Realização de bioensaios:
o Avaliação da atividade antioxidante.
o Ensaio enzimático.
o Ensaio antitumoral in vitro.
11
4. PROCEDIMENTO EXPERIMENTAL
4.1.
MATERIAIS E MÉTODOS PARA ANÁLISE QUÍMICA
Todos reagentes utilizados no processo de extração foram de grau analítico P.A.
Para obtenção do extrato etanólico, assim como no processo de purificação dos extratos
utilizou-se hexano, acetato de etila, acetona, clorofórmio, etanol, metanol e n-butanol
(todos de marca Synth e Dinâmica, SP, Brasil). Água destilada foi adquirida do próprio
laboratório.
Os extratos e frações foram concentrados sob pressão reduzida em temperaturas de
40°C-50°C, em evaporador rotativo (QUIMIS modelo Q344B2), acoplado a uma bomba de
vácuo (MARCONI modelo MA053). Balança analítica (Químis modelo Q500L210C) foi
utilizada para as pesagens.
Sílica gel 60 foi utilizada (MERCK 0,063-0,0200 mm) para empacotamento das
colunas. Para o acompanhamento do processo de isolamento das substâncias foram
utilizadas cromatofolhas de sílica gel 60F254 MERCK.
A visualização dos compostos nas cromatofolhas pôde ser feita à luz natural,
utilizando-se como revelador o reagente
cromogênico anisaldeído-sulfúrico de
composição: 0,5mL de p-anisaldeído (Aldrich Chemical Company, EUA), 10mL de ácido
acético glacial, 5mL de ácido sulfúrico e 85mL de metanol (DINÂMICA, SP, Brasil).
Chapa de aquecimento (Nova Ética modelo 208) em temperatura de 70oC foi
utilizada para revelação das cromatofolhas. A visualização das cromatofolhas foi realizada
em câmara contendo lâmpada UV fluorescente e germicida com comprimento de onda de
365 e 234 nm respectivamente.
Para a elucidação estrutural das substâncias isoladas foram utilizados os seguintes
equipamentos:
 Espectrômetro de infravermelho BOMEM, Modelo B – 100, para amostras sólidas
em pastilhas de KBr e em filme para amostras pastosas.
 Espectrômetro de ressonância magnética nuclear Bruker-250 para a obtenção dos
espectros de RMN de 1H- 500MHz, RMN de 13C- 62.5 MHz e DEPT. Os espectros
de COSY e HMQC em INOVA-500, Varian, NOESY e HMBC em Avance-400,
Bruker. As amostras foram solubilizadas em clorofórmio deuterado (CDCl3) e
12
dimetil sulfóxido deuterado (DMSO-d6) CAMBRIDGE (Cambridge Isotope
Laboratories, EUA).

Cromatógrafo a gás 17A SCHIMADZU 2P – 5000, acoplado a um espectrômetro
de massa PQ-5000 CLASS-5000.

Espectrofotômetro UV-VÍS AGILENT, Modelo: HP 8453.
O ponto de fusão dos compostos foi medido no aparelho de ponto de fusão da
MICROQUÍMICA modelo MQAPF-301.
4.2.
COLETA DO MATERIAL VEGETAL
O material vegetal utilizado constituiu-se de raízes de Jatropha ribifolia (Pohl)
Baill, de uma Euphorbiacea exemplar presente na região do município de Naviraí- MS. A
identificação botânica foi realizada pela professora Dra. Inês Cordeiro, do Instituto de
Botânica de São Paulo. O material testemunho (exsicata) esta catalogado sob número de
registro herbário CGMS 31.481.
4.3.
PREPARAÇÃO DO MATERIAL VEGETAL E DOS EXTRATOS
Em laboratório as raízes foram limpas e trituradas. O processo de extração ocorreu
de três modos visando um melhor rendimento. Sendo 1,5 kg de raízes trituradas foram
submetidas à percolação por 10 dias, o extrato obtido foi filtrado em um funil de Buchner
conectado a uma bomba de vácuo, o volume de solvente foi reduzido com o auxílio de um
evaporador rotativo sob pressão reduzida. Após concentração a massa de extrato foi de
386g.
Numa segunda extração utilizou-se de 1 kg de raiz triturada para a extração do óleo
essencial por meio de destilação por arraste de vapor, a extração foi realizada durante dois
dias, sendo três horas diárias de extração, o volume do óleo obtido foi de 2mL.
Posteriormente essa raiz foi submetida à percolação por um período de 10 dias e após
filtração o extrato foi concentrado sob pressão reduzida, resultando em 280g de extrato.
A extração com hexano à quente foi feita com 660g de raiz triturada. A extração foi
realizada durante duas semanas, sendo três horas diárias de extração. O extrato foi
concentrado sob pressão reduzida obtendo-se 8g de extrato. Após isto, as raízes foram
13
submetidas à percolação por 10 dias. O extrato foi filtrado e concentrado, rendendo 15,4g
de material.
Os extratos serão diferenciados no texto como primeira extração (percolação),
segunda extração (extração óleo essencial+percolação), e terceira extração (hexano a
quente).
4.4.
FRACIONAMENTO DE EXTRATOS
O extrato etanólico, assim como a água de hidrodestilação do óleo, foram
transferidos para um funil de separação para o fracionamento por partição sequencial
utilizando solventes em ordem crescente de polaridade: hexano, clorofórmio, acetato de
etila e n-butanol (3x de 100 mL cada). Foram obtidas quatro frações orgânicas que foram
concentradas no evaporador rotativo. Foi utilizado nesta etapa soluções 1% de hidróxido
de sódio e de ácido clorídrico. O fracionamento é descrito conforme esquema da Figura 4.
14
Figura 4. Fracionamento dos extratos da raiz da Jatropha ribifolia.
Dois compostos foram isolados na etapa de fracionamento. Um deles um sólido
branco codificado SBJR, isolado na fração hexânica, proveniente do fracionamento da
água usada na destilação do óleo essencial. A massa obtida foi de 266,3 mg. O segundo
composto, um sólido marrom codificado SMJR, foi isolado na fração clorofórmica e
apresentou-se na forma de uma resina insolúvel em clorofórmio, com uma massa de
463,5mg.
4.5.
ANÁLISE CROMATOGRÁFICA DAS FRAÇÕES
Foram realizadas cromatografias analíticas com as frações para uma avaliação
prévia dos componentes extraídos. Foram avaliadas as frações hexânica, clorofórmica,
acetato de etila e n-butanólica obtidas do extrato etanólico bruto. Utilizou-se cromatofolhas
15
de sílica gel 60F254 como fase estacionária e como eluente para a fração hexânica uma
mistura de hexano:AcOEt (9:1 v/v), para a fração clorofórmica uma mistura de
CHCl3:EtOH (8:2 v/v), para a fração de acetato de etila uma mistura de AcOEt:MeOH (9:1
v/v) e para a fração n-butanólica uma mistura de CHCl3:MeOH (6:4 v/v).
Após eluição as cromatofolhas foram visualizadas na lâmpada ultravioleta
fluorescente de λ365 nm e na lâmpada ultravioleta germicida de λ234 nm, e em seguida
aspergidas com revelador de anisaldeído sulfúrico, seguida de aquecimento em 70°C,
podendo assim ser visualizada na luz natural.
4.6.
ISOLAMENTO E PURIFICAÇÃO
4.6.1. Procedimentos Cromatográficos Preliminares
Sucessivas colunas cromatográficas em sílica gel foram realizadas com as frações
hexânicas e clorofórmicas, o que possibilitou o isolamento de duas substâncias pertencente
à classe dos terpenos. Na fração hexânica foram isolados um sesquiterpeno e um diterpeno
e na fração clorofórmica, o mesmo diterpeno isolado na fração hexânica.
4.6.2. Fração Hexânica (F-C6H14)
O processo de isolamento de substâncias na fração hexânica codificada F-C6H14,
utilizou sílica gel convencional como fase estacionária e um sistema de solventes em
gradiente com hexano: AcOEt em proporção crescente de polaridade. A proporção entre
sílica e amostra utilizada foi de 1:50 (m/m), assim obteve-se uma boa separação das
substâncias.
Após o empacotamento da coluna com sílica gel e a aplicação da amostra na
mesma, as frações foram coletadas em tubos de ensaio, essas foram avaliadas quanto ao
grau de purificação através de cromatografia em camada delgada. As que apresentaram um
perfil cromatográfico semelhante foram unidas e concentradas sob pressão reduzida.
Algumas vezes tornou-se necessário submeter às frações a uma nova coluna para
uma melhor purificação e/ou utilizar-se de técnicas de recristalização. As Figuras 5 e 6
ilustram o procedimento utilizado no isolamento e purificação do diterpeno e sesquiterpeno
respectivamente, em frações hexânicas.
16
Figura 5. Esquema de isolamento e purificação do diterpeno na fração hexânica da primeira extração da raiz
da Jatropha ribifolia.
O diterpeno isolado na fração hexânica (Figura 5), ocorreu por cromatografia em
coluna. Na proporção de solvente hexano:AcOEt 20%, correspondendo a fração 146-160
resultou no isolamento do diterpeno em meio impurezas. A fração 146-160 foi submetida a
uma nova coluna cromatográfica, e na fração 46-60 obtida com hexano:AcOEt 20% foi
isolado 43,5 mg do diterpeno puro.
17
Figura 6. Esquema de isolamento e purificação do sesquiterpeno na fração hexânica da terceira extração da
raiz da Jatropha ribifolia.
O extrato hexânico obtido a quente, após concentrado no evaporador rotativo,
apresentou cristais incolores em meio uma resina amarela. Tentativas de purificação desses
cristais foram realizadas com hexano a frio. Com este sistema de “lavagem” obteve-se uma
quantia de 126mg de cristais puros. Foram realizadas recristalizações na tentativa de
purificação deste material, porém o composto apresentou dificuldade em recristalizar,
sendo assim fez-se necessário utilizar de técnicas cromatográficas para a obtenção do
material puro.
4.6.3. Fração Clorofórmica (F-CHCl3)
Para o isolamento do diterpeno na fração clorofórmica, codificada F-CHCl3, reuniuse a fração da primeira e segunda extração. Foram necessárias duas colunas
18
cromatográficas, já que na primeira tentativa de isolamento a substância apresentou
impurezas, detectadas através de cromatografia em camada delgada. Para o procedimento
foi utilizado sílica gel convencional como fase estacionária e um sistema de solventes em
hexano:AcOEt e AcOEt:MeOH, em proporção crescente de polaridade. O procedimento
ocorreu conforme o esquema da Figura 7.
Figura 7. Esquema de isolamento e purificação do diterpeno na fração clorofórmica da primeira e segunda
extração da raiz da Jatropha ribifolia.
Após sucessivas colunas cromatográficas com as frações hexânica e clorofórmica,
obtivemos do diterpeno uma massa de 431,3mg e do sesquiterpeno 475,8mg.
4.6.4. Esterificação do sesquiterpeno com diazometano
Na estrutura do sesquiterpeno isolado de Jatropha ribifolia foi identificado um
grupo carboxílico através do espectro no infravermelho. O mesmo foi esterificado para
converter o ácido carboxílico em éster metílico. Foram utilizados 15mg do sesquiterpeno
no processo de esterificação, a reação ocorreu com diazometano (CH2N2).
19
4.7. BIOENSAIOS
4.7.1. Ensaio de Atividade Antioxidante
A preparação do material vegetal se deu conforme o item 4.3. Foram avaliadas as
frações hexânica (F-C6H14), clorofórmica (F-CHCl3) e de acetato de etila (F-AcOEt). A
atividade antioxidante foi avaliada frente ao radical livre DPPH (2,2-difenil-1picrilhidrazil) em solução metanólica (0,004%).
Para o ensaio utilizou-se 10mg de cada fração, dissolvida a um volume de 5mL de
metanol, posteriormente realizou-se diluições em concentrações de 0,04; 0,08; 0,16; 0,32;
0,4 mg/mL, a cada diluição foi adicionado 1mL de solução DPPH. Após um intervalo de
30 min de incubação à temperatura ambiente, ao abrigo da luz, mensurou-se a redução do
radical livre DPPH através da leitura da absorbância num espectrofotômetro UV-VÍS em
517nm. Neste ensaio, a rutina um antioxidante natural foi utilizado como padrão positivo.
O percentual de inibição do radical DPPH nas amostras foi calculado pela seguinte
fórmula: % inibição de DPPH = [(AB - AA) / AB] x 100, onde AB = absorbância do branco
(t = 0 min) e AA = absorbância da amostra (t = 30 min).
4.7.2. Ensaio Enzimático
Para o ensaio foram utilizados como candidato a inibidores os terpenos isolados por
técnicas cromatográficas e identificados por técnicas espectrais. O ensaio foi realizado com
três enzimas: a LMW (proteína tirosina fosfatase de baixo peso molecular), PTP-1B
(proteína tirosina fosfatase específica) e a Cdc25b (proteína tirosina fosfatase dual).
Utilizaram-se placas de superfície inerte com 96 compartimentos, a estes foi
adicionado: a enzima, o substrato, o candidato a inibidor e a solução tampão. Ao término a
placa foi envolvida em papel alumínio e após um período de incubação é realizada a leitura
no espectrofotômetro UV-VÍS. A seguir são mostrados os protocolos experimentais do
ensaio. Estes ensaios foram realizados no Instituto de Química da Unicamp-Campinas.
20
Tabela 3. Protocolo experimental para LMW.
LMW (sem His tag; produzida em 02/03/11)
Concentração de enzima no ensaio
90nM
Concentração de substrato (pNPP)
200µM
Concentração de inibidor
100 µM
Volume reacional
100 µL
Tempo de incubação enzima-inibidor
15min
Tempo de incubação reacional
10min
Temperatura de incubação enzima-inibidor
4°C
Temperatura de incubação reacional
37°C
Tempo reacional
Acetato, pH 5, 100mM; NaCl 150mM; DTT
5mM; EDTA 1mM e Triton x-100 0,01%.
Tabela 4. Protocolo experimental para PTP-1B.
PTP1B (com His tag; produzida em 03/03/11)
Concentração de enzima no ensaio
90nM
Concentração de substrato (pNPP)
500µM
Concentração de inibidor
100 µM
Volume reacional
100 µL
Tempo de incubação enzima-inibidor
15min
Tempo de incubação reacional
30min
Temperatura de incubação enzima-inibidor
4°C
Temperatura de incubação reacional
37°C
Tempo reacional
Bis Tris propano, pH 7,2, 100mM; DTT
5mM; EDTA 1mM e Triton x-100 0,01%.
Tabela 5. Protocolo experimental para Cdc25b.
Cdc25b (com His tag; produzida em 08/06/11)
Concentração de enzima no ensaio
180nM
Concentração de substrato (pNPP)
5000µM
Concentração de inibidor
100 µM
Volume reacional
100 µL
Tempo de incubação enzima-inibidor
15min
Tempo de incubação reacional
60min
Temperatura de incubação enzima-inibidor
4°C
Temperatura de incubação reacional
37°C
Tempo reacional
Bis Tris propano, pH 8,2, 100mM; DTT
5mM; EDTA 1mM e Triton x-100 0,01%.
21
4.7.3. Ensaio Antitumoral in vitro
4.7.3.1.
Células
As linhagens tumorais humanas do CPQBA (Centro Pluridisciplinar de Pesquisas
Químicas, Biológicas e Agrícolas) / Unicamp indicadas na Tabela 6 foram cedidas pelo
National Cancer Institute (NCI), localizado nos Estados Unidos da América. Os
procedimentos de experimentação foram realizados em condições estéreis (Fluxo Laminar
Veco®, classe IIB2).
Tabela 6. Linhagens celulares, oriundas de tumores humanos, cedidas ao CPQBA pelo National Cancer
Institute (NCI - EUA).
Tumor
Cólon
Leucemia
Linhagem
HCT-116; HT 29; SW-620
Hl-60; K562
Pulmão
A549/ATCC; NCI-H322M; NCI460
Mama
MCF-7; NCI-ADR
Renal
786-0; A498; RXF-393; VERO (normal)
Melanoma LOX-IMVI; M14; MALME-3; SK-MEL-3; SK-MEL-2; SK-MEL-5; SK-MELOvário
28;
UACC-62;
UACC-257
OVCR-3;
OVCR-5;
OVCR-8
Próstata
PC-3
Glioma
U251
4.7.3.2.
Cultivo celular
As células (Tabela 7) mantidas em frascos de cultivo de 25cm3 com 5mL de meio
de cultura foram repicadas uma vez por semana, quando a monocamada de células atingia
aproximadamente 80% de confluência de 80%, ou seja, quando cobriam 80% da superfície
disponível para crescimento na superfície do frasco.
Para a K562, que cresce em suspensão, o repique foi realizado com a transferência
de volume previamente determinado do frasco de manutenção antigo para o novo frasco
que posteriormente teve o seu volume completado para 5 ou 10mL para garrafas de 25cm2
ou 75cm2, respectivamente.
No caso das linhagens que crescem aderidas, foi necessária a tripsinização, ou seja,
o desprendimento das células do frasco de ação enzimática. Após a aspiração do meio de
22
®
cultura, foram adicionados 500μL de tampão de Hank’s (Sigma ) banhando toda a
monocamada celular por 10 vezes consecutivas. Após a aspiração do tampão, foram
®
adicionados 500μL de tripsina-EDTA 2,5g/L (Vitrocell ) a 37ºC e o frasco foi incubado
por tempo determinado de acordo com a característica de cada tipo celular, já que algumas
linhagens se desprendem mais facilmente que outras. Após a completa soltura das células,
a ação da tripsina foi bloqueada pelo banho com RPMI contendo 5% de SFB. Finalmente,
prosseguiu-se com as mesmas etapas realizadas para a linhagem leucêmica.
O volume de células a ser cultivado, ou seja, a diluição utilizada foi dependente das
características de cada linhagem celular (Tabela 7) e dos objetivos dos experimentos
realizados. Os frascos foram mantidos a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 em ambiente
úmido.
Tabela 7. Linhagens celulares tumorais humanas e normais (Vero e HaCat) utilizadas nos ensaios de
atividade antiproliferativa in vitro e suas densidades de inoculação (DI).
4
Linhagem Celular
Nome
DI (x10 células/mL)
Glioma
U251
4,0
Melanoma
UACC-62
4,0
Mama
MCF-7
6,0
Ovário com Fenótipo Resistência Multidroga
NCI-ADR/ RES
5,0
Renal
786-O
5,0
Pulmão
NCI-H460
4,0
Próstata
PC-3
4,5
Ovário
OVCAR-3
7,0
Cólon
HT-29
5,0
Leucemia
K-562
6,0
Rim de macaco
Vero
4,0
Queratinócito humano
HaCat
4,0
23
4.7.3.3.
Descongelamento das células
A fim de expandir as células em passagens e quantidade adequada para os
experimentos, as células tiveram seus criotubos descongelados a temperatura ambiente,
seu conteúdo transferido para um tubo de centrífuga de 15mL e, para lavagem do glicerol
utilizado no congelamento, teve o seu volume completado para 10mL com meio de cultura
RPMI-1640 (Gibco®) contendo 5% de soro fetal bovino (SFB) (Gibco®). O tubo foi
centrifugado a 2000rpm por 4 minutos a 4°C, o sobrenadante foi aspirado e descartado e o
precipitado de células foi ressuspendido cuidadosamente em 5mL do meio de cultura
descrito. As células em meio de cultura foram transferidas para frascos de manutenção de
25cm2 (T25) e incubadas a 37°C em atmosfera de 5% de CO2 em ambiente úmido.
4.7.3.4.
Congelamento das células
As células foram cultivadas em frascos de 75 cm2, para obtenção de uma
quantidade elevada para que o volume final da solução celular a ser congelado fosse de 1x
106cel/ml. Para células aderidas, após tripsinização (Sigma®), as células foram
ressupendidas em 10mL de meio suplementado com 30% de SFB, procedido pela
contagem do número de células em câmara de Neubawer. A solução celular foi
centrifugada a 2000rpm, por 4 minutos à 4ºC, o sobrenadante foi aspirado e, a seguir, foi
adicionado meio RPMI com 30% de SFB e 20% de glicerol em volume calculado para
obtenção de uma concentração final de 1x 106cel/ml. Cada criotubo contendo 1mL da
solução celular foi colocado na fase gasosa do nitrogênio líquido por 24 horas, para
depois serem imersos na fase liquida.
4.7.3.5.
Atividade antiproliferativa de extratos e compostos
Para a triagem de atividade antiproliferativa in vitro foram selecionadas 10
linhagens celulares, oriundas de tumores humanas, assim designadas: linhagens K562
(leucemia), MCF-7 (mama), NCI-ADR/RES (ovário com fenótipo de resistência a
múltiplas drogas), UACC-62 (melanoma), NCI-H460 (pulmão), PC-3 (próstata), HT29
(cólon), OVCAR-3 (ovário), 786-0 (rim) e U251 (glioma); e 1 linhagem celular normal:
24
VERO (rim de macaco) posteriormente substituída pela HaCat (queratinócito humano). As
demais linhagens da Tabela 6 permaneceram mantidas em nitrogênio líquido.
4.7.3.6.
Preparo das placas e inoculação das células
No início do teste 100µL de suspensão celular foram plaqueados em placas de 96
compartimentos, de acordo com as respectivas densidades de inoculação descritas na
Tabela 7, utilizando meio RPMI/SFB/penicilina-estreptomicina (50µg/mL). Cada placa
continha apenas uma linhagem celular, sendo possível a avaliação de cinco amostras
distintas em triplicata em cada placa além de uma placa controle celular (T0) (Figura 8)
contendo as linhagens celulares utilizadas no experimento. Anteriormente a adição das
amostras, as placas foram incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 e
ambiente úmido.
Figura 8. Placa controle (T0) contendo as linhagens celulares testadas e o controle contendo apenas meio de
cultura (branco).
4.7.3.7.
Preparo e aplicação das amostras
Todos os extratos e as frações obtidas foram submetidos ao teste antiproliferativo a
fim de que fossem selecionados para a continuidade do fracionamento e testes in vivo
apenas extratos e frações que se mostrassem ativas. As
amostras
foram
diluídas
em
soluções estoque em dimetilsulfóxido (DMSO) (Merck®) na concentração de 0,1g/mL.
25
Para adição à cultura de células o DMSO foi diluído em pelo menos 400 vezes em
RPMI/SFB/gentamicina, para não produzir toxicidade. Após a diluição, 100μL de meio
contendo extrato ou fração a ser testada foram adicionados à placa de 96 compartimentos,
exceto na T0 (placa controle), nas concentrações de 0,25; 2,5; 25 e 250μg/mL em triplicata
(Figura 9). As placas foram incubadas por 24 horas a 37ºC em atmosfera de 5% de CO2 e
ambiente úmido.
Figura 9. Placa de 96 wells usada nos testes antiproliferativos mostrando a disposição e concentrações das
amostras, o branco das amostras, das células e do meio de cultura.
Ao término das aplicações das amostras e início do tratamento de 48h, a placa T0
foi fixada com a adição de 50μL de ácido tricloroacético (TCA) 50% (Sigma®)
determinando assim a real quantidade de células presentes no momento em que as
amostras foram aplicadas.
Ao final do tratamento de 48h, as células foram fixadas pela adição de 50μL de
TCA a 50%, e incubação por 1 hora a 4ºC. Em seguida as placas foram submetidas a
quatro lavagens consecutivas com água corrente para a remoção dos resíduos de TCA,
meio, SFB e metabólitos secundários, foram mantidas à temperatura ambiente até a
secagem completa.
Após a completa secagem das placas, foram adicionados a cada
®
compartimento 50µL do corante protéico sulforrodamina B (SRB) (Sigma ) a 0,4 %
(peso/volume), dissolvido em ácido acético a 1 %, e incubadas a temperatura ambiente
26
durante 30 minutos. Após esse período, as placas foram lavadas por 4 vezes consecutivas
com uma solução de ácido acético 1% para a completa remoção dos resíduos de SRB.
Após a completa secagem das placas a temperatura ambiente, o corante ligado as proteínas
foi solubilizado pela adição de 150 µL de Trizma Base na concentração 10µM e pH 10,5
®
(Sigma ). Em seguida, foi feita a leitura espectrofotométrica da absorbância em leitor de
®
microplacas a 540nm (Molecular Devises , modelo VersaMax). A sulforrodamina B ligase aos aminoácidos básicos das proteínas das células viáveis no momento da fixação e
então, quanto maior a quantidade de SRB ligada ao compartimento, menor a atividade
citotóxica da amostra em teste. 23-25.
4.7.3.8.
Análise dos dados
As médias das absorbâncias foram calculadas descontando o valor de seus
respectivos brancos e através das fórmulas a seguir, foi determinada a inibição de
crescimento (IC) de cada amostra testada.
Se T > C a droga estimulou o crescimento, não apresentou IC.
Se T ≥T0 e < C, a droga foi citostática e a fórmula utilizada foi 100 X [(T- T0)/ (CT0)].
Se T< T0 a droga foi citocida e a fórmula utilizada foi 100 X [(T- T0)/( T0)]
Sendo T a média da absorbância da célula tratada, C o controle de célula e T0 o
controle das células no dia da adição das drogas, o resultado obtido foi subtraído de 100%,
obtendo-se então a porcentagem de crescimento. Os dados de absorbância foram
analisados e compilados na elaboração de gráficos relacionando a porcentagem de inibição
ou morte celular com a concentração de extrato ou fração. As amostras foram consideradas
ativas quando apresentaram inibição de crescimento maior que 50% e ainda de forma dose
dependente, preferencialmente apresentando seletividade para os tipos celulares.
Através do software Origin®, foi feita regressão sigmóide das curvas obtidas com
as médias da porcentagem de crescimento, e foram calculados os valores TGI (total
growth inhibition) que são os valores da concentração necessária para inibir totalmente o
crescimento celular. Esses foram utilizados para comparar a potência das amostras e
evidenciar a seletividade.
27
5. RESULTADOS E DISCUSSÕES
5.1.
RENDIMENTO DAS FRAÇÕES
O processo de extração das raízes de Jatropha ribifolia, apresentou os rendimentos
conforme a Tabela 8.
Tabela 8. Rendimento das frações obtidas da raiz da Jatropha ribifolia.
1ª Extração (1,5Kg)
2ª Extração (1,0Kg)
3ª Extração (660g)
Fração Hexânica
7,7522g (0,51%)
5,6543g (0,56%)
8,3922g (1,27%)
Fração Clorofórmica
7,9542g (0,53%)
4,1258g (0,41%)
2,5097g (0,38%)
Fração de Acetato de etila
4,9231g (0,32%)
2,5832g (0,25%)
1,7541g (0,26%)
Fração N-butanólica
2,1260g (0,14%)
1,4204g (0,14%)
-
5.2.
ELUCIDAÇÃO ESTRUTURAL DOS COMPOSTOS ISOLADOS
Os procedimentos descritos na metodologia possibilitaram o isolamento de duas
substâncias puras na forma de cristais. Na fração hexânica foram isolados o sesquiterpeno
e o diterpeno codificados SQJR e DTJR respectivamente. E na fração clorofórmica o
diterpeno (DTJR). Estas substâncias tiveram sua estrutura elucidada por meio do uso de
técnicas espectroscópicas.
5.2.1. Elucidação Estrutural de SQJR.
Das frações hexânica obtidas da raiz da Jatropha ribifolia foram isolados 475,8mg
de um composto cristalino incolor, codificado como SQJR. O comportamento
cromatográfico do SQJR apresentou como uma única mancha de coloração acinzentada
após a revelação com anisaldeído-sulfúrico e aquecimento em 70°C. Esta amostra foi
submetida a infravermelho (IV), ultravioleta-vísivel (UV-VÍS), espectrometria de massa
(CG/EM), e técnicas de ressonância magnética nuclear para a identificação estrutural. O
solvente utilizado para as analises em RMN foi o clorofórmio deuterado (CDCl3).
O espectro no infravermelho (Figura 10) forneceu informações importantes sobre
28
os grupos funcionais presentes na estrutura do composto analisado. O espectro apresentou
uma absorção de banda larga em 3430 cm-1, característico de deformação axial de O-H. A
absorção de uma banda de intensidade forte em 2955 cm-1 evidenciando uma deformação
axial de C-H. Observa-se uma banda intensa em 1674 cm-1 característica de deformação
axial de C=O. O espectro ainda apresentou bandas em 1434 cm-1 e 1287 cm-1, duas bandas
provenientes de deformação angular de O-H e deformação axial de C-O, respectivamente.
Ambas envolvem alguma interação entre a deformação axial de C-O e a deformação
angular no plano de C-O-H. Ainda um sinal no espectro em 950 cm-1 caracteriza uma
deformação angular fora do plano do grupo O-H em ligação de hidrogênio. 17
Figura 10. Espectro de Infravermelho do SQJR, em pastilhas de KBr.
A partir dos espectros de RMN-1H, RMN-13C e DEPT (Figuras 11-14) foram
analisados os deslocamentos químicos e caracterizaram-se os átomos de hidrogênio e
carbono que compõem a estrutura molecular do composto.
29
O espectro de RMN-1H revelou dois singletos de 3-H em C-12 e C-13, com
deslocamento químico de 0,85 e 1,03 respectivamente, um dubleto de 3-H em C-14 com δH
0,88. O espectro apresentou vários grupos CH2 com hidrogênios não equivalentes, estes
sinais ocorreram como multipletos no espectro com δH 1,78 e 1,58 (C-2), δH 2,83 e 2,75
(C-3), δH 2,77 e 2,27 (C-6), δH 1,90 e 1,41 (C-8) e δH 1,55 e 1,16 (C-9). Foi observado
também a presença de grupos metínicos na forma de multipletos em C-7 e C-10 com δH
1,99 e 2,09 respectivamente.
O espectro de RMN-13C indicou a presença de quinze carbonos na estrutura do
SQJR. Desses, dois sinais bem desblindados em δC 173,08 e 170,71 indicando o grupo
carbonila, podendo ser ácidos carboxílicos (R-CO2H). O carbono C-5 apresenta-se
desblindado em relação a uma dupla carbono-carbono devido ao efeito de ressonância da
carbonila do ácido ligado a C-4. Um sinal desblindado em δC 123,07 na região de
insaturação. Sinais em δC 68,19 e 41,70, dois sinais em δC 48,14 e 35,96 na região de
alcanos saturados C-H. Cinco sinais de (CH2) em δC 36,30; 31,30; 27,86; 26,91 e 25,70 e
três sinais em δC 26,18; 19,25 e 17,95 característico de grupo metil simples terminal. Os
sinais em dos grupos metila foram confirmados no espectro de DEPT (Figura 13) com
cinco sinais de grupos metilênicos, dois sinais de grupos metínicos e três de grupos
metílicos. Os dados foram comparados com os da literatura, mostrando grande semelhança,
como pode ser observados na Tabela 9. 17, 26, 27.
30
Figura 11. Espectro de RMN-1H do SQJR, em CDCl3.
Figura 12. Expansão do espectro de RMN-1H do SQJR, em CDCl3.
31
Figura 13. Espectro de RMN-13C do SQJR, em CDCl3.
Figura 14. Espectro de DEPT do SQJR em CDCl3.
32
Tabela 9. Dados de RMN do composto SQJR, em CDCl3 em 500MHz e 62.5 MHz.
POSIÇÃO
1
2a
2b
3a
3b
4
5
6a
6b
7
8a
8b
9a
9b
10
11
12
13
14
15
b
1
Hb
1,781 m (1,78)
1,583 m (1,58)
2,834 m (2,83)
2,753 m (2,75)
2,776 m (2,77)
2,279brd (2,28)
1,997 m (2,00)
1,909 m (1,92)
1,419 m (1,41)
1,553 m (1,55)
1,167 m (1,17)
2,099 m (2,10)
0,854 s (0,86)
1,033 s (1,03)
0,880 d (0,90)
-
13
Cb
68,196 (68,23)
25,707(25,74)
DEPT
C0
C H2
36,305 (36,33)
CH2
123,072 (123,19)
173,089 (173,10)
31,300 (31,34)
C0
C0
C H2
48,148 (48,20)
26,914 (26,96)
CH
C H2
27,862 (27,90)
C H2
35,961 (36,00)
41,702 (41,73)
26,189 (26,22)
19,256 (19,28)
17,959 (17,99)
170,71 (171,05)
CH
C0
C H3
C H3
C H3
C0
Os dados entre parênteses são oriundos da literatura.
Após analisar dos espectros e realizadas comparações com a literatura foi
constatado que a substância isolada (Figura 15) tratava-se de um sesquiterpeno,
denominado ácido ciperenóico de fórmula estrutural C15H22O2 (Figura 16) com ponto de
fusão em 162,3°C. O mesmo foi isolado anteriormente nas espécies Sandwithia
guyanensis,28 Croton crassifolius
antifúngica.
38
36
, em Joannesia princeps onde avaliou-se sua atividade
Posteriormente foi isolado em Jatropha isabelli, e avaliado seu potencial
gastroprotetor e citotóxico. 26, 37.
Figura 15. Cristais do ácido ciperenóico isolados da raiz da Jatropha ribifolia.
33
14
CH3
Hb
Ha
CH3
Hb
2
10
1
3
Ha
9
5 12
4
8
6
15
Ha
Hb
11
CH3
HO
13
7
Ha
Hb
Hb
O
Ha
Figura 16. Estrutura química do ácido ciperenóico C15H22O2. 26
Experimentos COSY, NOESY, HMQC e HMBC contribuíram para a determinação
da estrutura proposta pela literatura para o ácido ciperenóico. O experimento RMN de 1H1
H de NOESY 2-D (Figura 18), relacionou na estrutura os hidrogênios que estavam
próximos no espaço sendo H-2a/H-3b, H-2b/H-3a, H-6a/H-7, H-9a/H-8a, H-9a/H-10, H9b/H-8b e H-13/H-8a, H-13/H-10, H-14/H-2b, H-12/H-10 (Figura 17), confirmando a
estrutura proposta na literatura. 26
14
CH3
Hb
Ha
Hb
13
CH3
2
Ha
4
5
Ha
10
1
3
9
11
12
CH3
6
15
HO
8
7
Hb
Ha
Hb
Hb
O
Ha
Figura 17. Correlações vistas no espectro NOESY do ácido ciperenóico.
34
O espectro bidimensional de correlação homonuclear de hidrogênio (1Hx1HCOSY) (Figuras 19), foi possível realizar atribuições da absorção dos hidrogênios como
H-2a/H-2b, H-2a/H-3b, H-2b/H-3a, H-2b/H-14, H-3a/H-3b, H-6a/H-6b, H-6a/H-7, H-7/H8b, H-8a/H-8b, H-8a/H-9b, H-8b/H-9a, H-8b/H-9b, H-9a/H-9b, H-9a/H-10. Esta análise
juntamente com o espectro de correlação heteronuclear de hidrogênio e carbono HMQC
(uma ligação) e HMBC (duas ou três ligações) (Figuras 20 e 21) presente na Tabela 10
confirmaram a estrutura proposta. Comparando os dados obtidos com os da literatura
chegou-se a uma substância já conhecida, isolada anteriormente na espécie Sandwithia
guyanensis (Euphorbiaceae). 28
Figura 18. Espectro de NOESY do ácido ciperenóico em CDCl3.
35
Figura 19. Espectro de COSY do ácido ciperenóico em CDCl3.
Figura 20. Espectro de HMQC do ácido ciperenóico em CDCl3.
36
Figura 21. Espectro de HMBC do ácido ciperenóico em CDCl3.
Tabela 10. Dados de RMN do ácido ciperenóico, em CDCl3 em 500MHz.
POSIÇÃO
1
2a
2b
COSY (1H-1H)
H-2b, H-3b
H-2a, H-3a, H-14
HMBC (13C-1H)
H-2a, H-2b, H-10
-
3a
3b
4
5
6a
6b
7
8a
8b
H-2a, H-2b,
9a
9b
10
H-2b, H-3b
H-2a, H-3a
H-6b, H-7
H-6a
H-6a, H-8B
H-8b, H-9b
H-7, H-8a, H-9a,
H-9b
H-9b, H-8b, H-10
H-8a, H-8b, H-9a
H-9a
11
-
12
13
14
15
H-2b
-
H-9a, H-12, H-13
H-9b, H-13
H-10, H-14
H-2a, H-2b, H-9a,
H-9b, H-14
H-2a, H-10, H-12,
H-13
H-13
H-12
H-10, H-9 b
37
Na análise por cromatografia gasosa acoplada a espectrometria de massa foi
possível observar no cromatograma um único pico com tempo de retenção de 20,594
minutos (Figura 23). O espectro de massas por impacto de elétron do composto (Figura 24)
mostrou uma razão em m/z 234, que corresponde ao pico molecular do ácido ciperenóico.
A perda da molécula de água formada por uma ponte de hidrogênio entre a hidroxila e H-3
da origem ao pico em m/z 216, correspondendo ao agrupamento C15H20O. A molécula
original é fragmentada tendo como grupo retirante C4H8 de m/z 56 dando origem ao pico
intenso em m/z 178, referente ao agrupamento C11H14O2. Um pico intenso surge em m/z
133, originado da fragmentação do agrupamento C11H14O2 após perda de uma molécula de
água e um agrupamento C2H3 dando origem ao agrupamento C9H9O, que por sua vez é
fragmentado perdendo um agrupamento C3H6 e originando um pico em m/z 91 referente ao
agrupamento C6H3O conforme esquema da Figura 22.
Figura 22. Proposta de fragmentação para o ácido ciperenóico.
38
Figura 23. Cromatograma do ácido ciperenóico obtido por CG-EM.
Figura 24. Espectro de Massas do ácido ciperenóico obtido por CG-EM.
39
A análise UV de ácido carboxílico foi realizada em concentrações bastante baixas,
sendo que o ácido α,β-insaturado produziu uma banda K (transição π  π*) intensa e
característica do sistema conjugado, a absorção também aparece em moléculas aromáticas
que possuem substituição cromofórica. O espectro de UV-VÍS (Figura 25) apresentou uma
banda intensa em 239,97 nm, característica de ligação dupla α, β da carbonila em anel de
cinco.17, 28.
2,0
239,97617
2,5
SQJR
Abs
1,5
1,0
0,5
0,0
200
300
400
500
600
 nm
Figura 25. Espectro UV-VÍS do ácido ciperenóico em metanol.
5.2.2. Esterificação do sesquiterpeno com diazometano
A reação de esterificação do ácido ciperenóico, o sesquiterpeno codificado SQ-Me
foi realizada com 15mg do composto na presença de diazometano (CH2N2), conforme a
Figura 26.
40
Figura 26. Esquema de reação no processo de metilação do ácido ciperenóico.
O espectro no infravermelho (Figura 27) do produto de esterificação do SQ-Me
forneceu a modificação dos grupos funcionais presentes na estrutura do composto.
Comparando com o espectro no infravermelho do composto anterior observa-se o
desaparecimento da absorção larga em 3430 cm-1, característico de deformação axial de
OH do ácido. A absorção das bandas em 2950 e 2927 cm-1 evidenciaram uma deformação
axial de C-H mais nítida. Um deslocamento da absorção de 1674 cm-1 para 1711 cm-1
característico de deformação axial de C=O, de ésteres insaturados. Bandas próximas em
1259, 1207 e 1175 cm-1 evidenciam grupos O-C-C de ésteres metílicos. 17
41
Figura 27. Espectro de Infravermelho do SQ-Me, em filme.
O espectro de RMN-1H do SQ-Me (Figura 28 e 29) revelou três singletos de 3-H
em C-12, C-13 e C-16 com deslocamento químico em 0,85; 1,03 e 3,73 respectivamente. O
δH 3,73 é referente ao grupo metílico adquirido no processo de esterificação. Um dubleto
de 3-H em C-14 com δH 0,88. O espectro apresentou vários grupos CH2 com hidrogênios
não equivalentes, estes sinais ocorreram como multipletos no espectro com δH 1,77 e 1,54
(C-2), δH 2,82 e 2,75 (C-3), δH 2,77 e 2,24 (C-6), δH 1,90 e 1,43 (C-8) e δH 1,54 e 1,15 (C9). Foi observada a presença de grupos metínicos na forma de multipletos em C-7 e C-10
com δH 1,96 e 2,09 respectivamente.
O espectro de RMN-13C (Figura 30 e 31) indicou a presença de dezesseis carbonos
na estrutura do SQ-Me. Desses, um sinal bem desblindados em δC 166,29 localizado na
região da carbonila de éster. Dois sinais desblindado em δC 169,66 e 123,54 na região de
insaturação (R2C=CH2). Sinais em δC 68,04 e 41,85. Dois sinais em δC 48,43 e 36,09 na
região de alcanos saturados C-H. Cinco sinais de (CH2) em δC 36,91; 31,30; 28,13; 27,25 e
25,97 e quatro sinais de (CH3) em δC 51,19; 26,41; 19,51 e 18,18 característico de grupo
42
metil simples terminal. Os sinais em dos grupos metila foram confirmados no espectro de
DEPT (Figura 32) com cinco sinais de grupos metilênicos, dois sinais de grupos metínicos
e quatro de grupos metílicos. Os dados foram comparados com os da literatura, mostrando
grande semelhança, como pode ser observados na Tabela 11.
17, 26, 27.
A atividade
citotóxica, gastroprotetora e antifúngica foram avaliadas segundo a literatura.
26, 38.
A
estrutura química do ácido ciperenóico metilado C16H24O2 está representado na Figura 33.
Figura 28. Espectro de RMN-1H do SQ-Me, em CDCl3.
43
Figura 29. Expansão do espectro de RMN-1H do SQ-Me, em CDCl3.
Figura 30. Espectro de RMN-13C do SQ-Me, em CDCl3.
44
Figura 31. Expansão do espectro de RMN-13C do SQ-Me, em CDCl3.
Figura 32. Espectro de DEPT do SQ-Me em CDCl3.
45
Tabela 11. Dados de RMN do composto SQ-Me, em CDCl3 em 500MHz e 62.5MHz.
POSIÇÃO
1
2a
2b
3a
3b
4
5
6a
6b
7
8a
8b
9a
9b
10
11
12
13
14
15
16
b
1
Hb
1,774 m (1,76)
1,547 m (1,54)
2,822 m (2,82)
2,717 m (2,70)
2,776 m (2,76)
2,243brd (2,24)
2,019 m (1,98)
1,908 m (1,90)
1,382 m (1,38)
1,521 m (1,52)
1,144 m (1,14)
2,082 m (2,08)
0,844 s (0,84)
1,017 s (1,01)
0,885 d (0,87)
3,729 s (3,75)
13
Cb
68,047 (67,80)
25,975 (25,73)
DEPT
C0
C H2
36,913 (36,68)
CH2
123,54 (123,33)
169,66 (169,30)
31,301 (31,08)
C0
C0
C H2
48,432 (48,20)
27,252 (27,01)
CH
C H2
28,130 (27,89)
C H2
36,097 (35,86)
41,857 (41,63)
26,412 (26,19)
19,517 (19,26)
18,186 (17,93)
166,29 (166,00)
51,196 (50,90)
CH
C0
C H3
C H3
C H3
C0
C H3
Os dados entre parênteses são oriundos da literatura. 26
14
CH3
Ha
Hb
5
MeOOC
9
11
12
CH3
15
Ha
10
1
4
16
CH3
2
3
Ha
13
Hb
6
Hb
Ha
8
7
Hb
Hb
Ha
Figura 33. Estrutura química do ácido ciperenóico metilado C16H24O2.
5.2.3. Elucidação Estrutural de DTJR
Das frações hexânica e clorofórmica do extrato etanólico da raiz da Jatropha
ribifolia foram isolados 431,3 mg de um composto cristalino incolor, codificado como
46
DTJR. O comportamento cromatográfico do DTJR apresentou-se como uma única mancha
de coloração marrom-avermelhada após a revelação com anisaldeído-sulfúrico e
aquecimento em 70°C. Esta amostra foi submetida a técnicas espectrais para sua
identificação estrutural. O solvente utilizado para as analises em RMN foi o clorofórmio
deuterado (CDCl3).
O espectro no infravermelho (Figura 34) forneceu informações importantes sobre
os grupos funcionais presentes na estrutura do composto analisado. O espectro apresentou
a absorção de três bandas de intensidade média em 2961, 2926 e 2870 cm-1 evidenciando
uma deformação axial de grupos C-H. Bandas intensas surgiram em 1697 e 1653 cm-1,
característicos de deformação axial de C=O de sistema conjugado. O espectro ainda
apresentou bandas em 1619, 1457 e 1401 cm-1 de absorção forte, evidenciando
insaturações C=C e duas bandas provenientes de deformação axial de C-C e C-O, em 1373
e 1329 cm-1.
Figura 34. Espectro de Infravermelho do DTJR, em pastilhas de KBr.
47
O espectro de RMN-1H apresentou quatro singletos metílicos, referente ao C-17, C18, C-19 e C-20, com deslocamento químico de 1,87; 1,24; 1,36 e 1,73 respectivamente.
Um dubleto metílico em C-16 com δH 1,09. O espectro apresentou dois grupos metilênicos
com hidrogênios não equivalentes, estes sinais ocorreram como dubletos e duplos-dubletos
no espectro, com δH 2,90 e 2,42 (C-11) no dubleto, e δH 2,15 e 1,78 (C-1) do duplo-dubleto.
Ainda três sinais de multipletos referentes a grupos metínicos, com δH 2,98 (C-2), δH 5,79
(C-3 e C-5) os mesmos são carbonos assimétricos. E dois sinais de dubletos de metínicos,
de δH 5,95 (C-8) e δH 6,46 (C-9).
O espectro de RMN-13C do DTJR indicou a presença de vinte carbonos em sua
estrutura. Desses, dois sinais bem desblindados em δC 203,96 e 202,04 localizado na região
da carbonila, podendo ser um aldeído (RCH=O) ou cetona (R2C=O). Um sinal desblindado
em δC 183,30 na região de insaturação (R2C=CH2). Três sinais blindados em δC 141,76;
137,07 e 112,42 também na região de insaturação. Ainda na região de insaturação quatro
sinais correspondendo a grupos metínicos em δC 159,05; 147,14; 128,72 e 123,76. Um
sinal desblindado em δC 99,79. Dois sinais metilênicos em δC 41,23 e 42,46, além de um
sinal em δC 38,34 na região de alcanos saturados C-H e um sinal em δC 36,64, e cinco
sinais metílicos em δC 30,40; 26,90; 20,73; 18,97 e 6,10. Os sinais em dos grupos metila
foram confirmados no espectro de DEPT (Figura 39). Os dados foram comparados com os
da literatura 27, 29 como pode ser observados na Tabela 12.
48
Figura 35. Espectro de RMN-1H do DTJR, em CDCl3.
Figura 36. Expansão do Espectro de RMN-1H do DTJR, em CDCl3.
49
Figura 37. Expansão do Espectro de RMN-1H do DTJR, em CDCl3.
Figura 38. Espectro de RMN-13C do DTJR, em CDCl3.
50
Figura 39. Espectro de DEPT do DTJR em CDCl3.
Tabela 12. Dados de RMN do composto DTJR, em CDCl3 em 500MHz e 62.5MHz.
POSIÇÃO
1
Hb
13
Cb
DEPT
1a
1b
2,15 dd(2,15)
1,78 dd(1,79)
42,461 (42,45)
CH2
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11a
11b
12
13
14
15
16
17
18
19
20
2,98 m(3,00)
5,79 m (5,77)
5,79 m (5,77)
5,95 d (5,98)
6,46 d (6,48)
2,90 d (2,91)
2,42 d (2,44)
1,09 d (1,09)
1,87 s (1,87)
1,24 s (1,26)
1,36 s (1,37)
1,73 s (1,74)
38,342 (38,30)
123,760 (123,07)
137,078 (137,10)
147,143 (147,03)
141,764 (141,75)
202,041 (201,84)
128,722 (128,71)
159,051 (158,71)
36,642 (36,59)
41,237 (41,25)
CH
CH
C0
CH
C0
C0
CH
CH
C0
CH2
183,305 (183,12)
112,424 (112,36)
203,967 (203,78)
99,799 (99,75)
18,974 (18,93)
20,738 (20,68)
30,402 (30,38)
26,909 (26,89)
6,105 (6,02)
C0
C0
C0
C0
CH3
CH3
CH3
CH3
CH3
b
Os dados entre parênteses são oriundos da literatura. 29
51
Realizada a análise dos espectros e as comparações com a literatura constatou-se
que a substância isolada (Figura 40) é a jatrofona, um diterpeno macrocíclico de fórmula
estrutural C20H24O3 (Figura 41), com ponto de fusão em 143°C. Substância esta presente
em várias espécies do gênero Jatropha. A jatrofona tem recebido considerável atenção
devido à sua atividade antitumoral significativa, tanto em in vitro quanto in vivo. Uma
atividade de inibição da insulina,
13, 32
efeito moluscicida,
13
atividade antiprotozoal contra
espécies de Leishmania e Trypanosoma cruzi in vitro e também contra Leishmania
amazonensis in vivo em ratos infectados,
33
inibição da ativação de linfócitos
provavelmente através da inibição da proteína Kinase C.
31
Sua ação relaxante foi
comprovada pela inibição da contração induzida em veia aorta de ratos, provavelmente
pela inibição da proteína Kinase C, relaxamento de longa duração em diversas preparações
incluindo o útero de rato, íleo e bexiga urinária de porquinho da índia, ureteres de cães e
também inibiu o inotropismo do átrio esquerdo em ratos.
apresentou efeito gastroprotetor e citotóxico.
34, 35, 39.
Além disso, a jatrofona
13, 33.
Figura 40. Cristais de jatrofona isolados da raiz da Jatropha ribifolia.
52
16
b
H 3C
a
H
H
20
CH3
O
2
14
13
1
a
3
12
15
4
H
H
b
11
O
19
CH3
10
5
8
9
CH3
6
7
H 3C
18
O
17
Figura 41. Estrutura química da jatrofona C20H24O3.
A estrutura da jatrofona foi confirmada por experimentos COSY, NOESY, HMQC
e HMBC que apresentaram uma contribuição correta das posições dos carbonos e
hidrogênios na estrutura. A técnica espectroscópica de RMN-2D do efeito nuclear
Overhauser, NOESY (Figura 43), mostrou de forma eficiente a correlação dos hidrogênios
que estão diretamente próximos no espaço como H-16/H-1b, H-16/H-2, H-16/H-3, H19/H-11b, H-19/H-8, H-18/H-11a H-18/H-9 e H-20/H-11a (Figura 42), confirmando a
estrutura proposta na literatura. 29
H 3C
16
a
H
H
b
20
CH3
O
2
14
13
1
a
3
12
15
4
H
11
O
10
5
8
6
7
H 3C
17
H
9
b
19
CH3
CH3
18
O
Figura 42. Correlações vistas no espectro NOESY da jatrofona.
53
Por meio da análise do espectro bidimensional de correlação homonuclear de
hidrogênio (1Hx1H-COSY) (Figuras 44 e 45), foi possível realizar atribuições dos sinais de
hidrogênios como H-1b/H-2, H-1a/H-2, H-1b/H-3, H-2/H-3, H-16/H-2, H-18/H-19, H-8/H9 e H-11b/H-20, presentes na Tabela 13. Esta análise apoiou-se no espectro bidimensional
de correlação heteronuclear de hidrogênio e carbono HMQC (uma ligação) e HMBC (duas
ou três ligações) (Figuras 46-51) confirmando a estrutura proposta. Comparação dos dados
obtidos com a literatura mostrou que essa substância já é conhecida, tendo sido isolada em
espécies do gênero Jatropha.
Figura 43. Espectro de NOESY da jatrofona.
54
Figura 44. Espectro de COSY da jatrofona em CDCl3.
Figura 45. Expansão Espectro de COSY da jatrofona.
55
Figura 46. Espectro de HMQC da jatrofona.
Figura 47. Expansão Espectro de HMQC da jatrofona.
56
Figura 48. Expansão Espectro de HMQC da jatrofona.
Figura 49. Espectro de HMBC da jatrofona.
57
Figura 50. Expansão Espectro de HMBC da jatrofona.
Figura 51. Expansão Espectro de HMBC da jatrofona.
58
Tabela 13. Dados de RMN da jatrofona., em CDCl3 em 500MHz.
POSIÇÃO
COSY (1H-1H) b
1
3
4
5
6
7
8
9
10
H-1b, H-2
(H-1b, H-2)
H-1a, H-2, H-3
(H-1a, H-2, H-3)
H-1a, H-1b, H-3
(H-1a, H-1b)
H-1b, H-2(H-1b)
H-9 (H-9)
H-8 (H-8)
-
11
-
12
-
13
14
15
16
17
18
19
20
H-2 (H-2)
H-19 (H-19)
H-18 (H-18)
H-11b
2
b
HMBC (13C-1H)
-
H-16
H-17
H-1a, H-3, H-5
H-1a, H-16
H-8, H-17
H-9, H-17
H-11b, H-18, H-19
H-11a, H-11b, H-8,
H-18, H-19
H-18, H-19
H-11a, H-11b,
H-20
H-11b, H-20
H-20
H-1a, H-3
H-1b
H-11a, H-19
H-11b, H-18
-
Os dados entre parênteses são oriundos da literatura. 29
O espectro de massa por impacto de elétron do composto (Figura 53) mostrou uma
razão em m/z 312, que corresponde ao pico molecular da jatrofona. A fragmentação ocorre
com a quebra de três ligações no C-1, C11 e C-15 tendo como grupo retirante o C7H7O2
com m/z 123 originando um pico em m/z 189, correspondendo ao agrupamento C13H17O,
que por sua vez é fragmentado dando origem ao pico em m/z 147 referente ao agrupamento
C10H11O. Uma nova fragmentação ocorre com o agrupamento C10H11O de m/z 147, tendo
como grupo retirante o C5H6 de m/z 66 dando origem ao pico em m/z 81 com agrupamento
C5H5O, conforme esquema da Figura 52.
59
Figura 52. Proposta de fragmentação para a jatrofona.
Figura 53. Espectro de Massa da jatrofona.
60
Como compostos carbonilados são polares, as posições das bandas K e R das
enonas são dependentes do solvente. O espectro UV-VIS (Figura 54) apresentou uma
banda intensa em 220,04 nm característica de transição π  π* (banda K) e uma banda em
280,05 nm característica de transição n  π* (banda R).17, 30.
280,05283
12
220,04846
14
DTJR
10
Abs
8
6
4
2
0
200
300
400
500
600
 (nm)
Figura 54. Espectro UV-VÍS da jatrofona em metanol.
5.3.
COMPOSTOS ISOLADOS NA ETAPA DE FRACIONAMENTO
5.3.1. SBJR e SMJR
Os compostos que foram isolados na etapa de fracionamento, apresentaram-se na
forma de substâncias sólidas. Uma delas um sólido branco (SBJR) (Figura 56), isolado na
fração hexânica, proveniente do fracionamento da água usada na destilação do óleo
essencial. O segundo composto, um sólido marrom (SMJR) (Figura 59), isolado na fração
clorofórmica do fracionamento do extrato etanólico bruto.
O espectro no infravermelho (Figura 55) forneceu informações dos grupos
funcionais presente na estrutura do composto. O espectro apresentou uma absorção larga
em 3458 cm-1, característico de deformação axial de O-H. A absorção de duas bandas de
61
fracas intensidades em 2927 e 2103 cm-1 evidenciando uma deformação axial de C-H. Um
pico de baixa intensidade e pouco nítido apareceu em 1630 cm-1 evidenciando possível
deformação axial de C=O. O espectro apresentou um sinal em 1115 cm-1 proveniente de
deformação axial de C-O. Ainda um sinal no espectro em 638 cm-1 característico de anéis
aromáticos ou de deformações angulares fora do plano de C=C.
17
Analisados os dados do
espectro, considerou-se esse composto SBJR, como um sal oxálico. Substância esta
bastante comum em plantas tóxicas. 45
Figura 55. Espectro de Infravermelho do SBJR, em pastilhas de KBr.
Figura 56. Sal oxálico isolados da raiz da Jatropha ribifolia.
62
O espectro no infravermelho do SMJR (Figura 57) apresentou uma larga
deformação axial em 3414 cm-1, característico de grupos O-H. A deformação axial de
grupos C-H de metila em 2928 cm-1. Uma banda intensa surgiu em 1615 cm-1, que sugere a
existência de carbonila de éster ou cetona ou ainda presença de insaturações C=C de
aromáticos. Sinais em 1517, 1449, 1382 e 1245 cm-1, característicos de vibração do
esqueleto aromático, deformações assimétricas em CH3 e CH2 e vibrações de estiramento
C-O. Uma banda de média intensidade em 1057 cm-1, relativo a ligações C-O. E três
bandas provenientes de substituintes de aromáticos, em 980, 819 e 568 cm-1.40, 41.
O espectro de RMN-1H do SMJR (Figura 58) apresentou sinal de singleto em δH
2,5 característico de grupos metoxílicos. A faixa se estende até δH 3,10 apresentou sinais
de multipletos que representam muitos hidrogênios ligados a cadeias carbônicas, que
podem ser α, β e γ. Dois singletos com δH 1,8 e 1,65 surgiram na região caracterizada pela
presença de acetoxílicos difáticos e acetocílicos aromáticos orto à ligação bifenílica.
Muitos sinais surgiram na faixa de 0,7-1,5 ppm caracterizando presença de grupos
alifáticos altamente blindados. 42
Com os dados espectrais e comparações literárias, determinou-se que o composto
isolado tratava-se de uma lignina, substância essa que confere rigidez a parede celular de
espécies vegetais, resistindo assim a ataques de microorganismos. 41
63
Figura 57. Espectro de Infravermelho do SMJR, em pastilhas de KBr.
Figura 58. Espectro de RMN-1H do SMJR, em DMSO-d6.
64
Figura 59. Lignina isolada da raiz da Jatropha ribifolia.
5.4. BIOENSAIOS
5.4.1. Ensaio de Atividade Antioxidante
A Figura 60 mostra os percentuais de atividade antioxidante obtidos para as frações
orgânicas e para a rutina, utilizada como padrão positivo. A atividade antioxidante é
considerada para valores superiores a 80% na capacidade sequestradora de radicais livres
(% Δ0). Observa-se pelo gráfico uma baixa atividade antioxidante para o extrato hexânico
com percentuais inibitórios inferiores a 54,4%. Isto se deve a maior capacidade do solvente
em extrair compostos apolares como lipídeos e clorofila. As frações de clorofórmio e
acetato de etila apresentaram resultados expressivos devido sua capacidade em extrair
antioxidantes naturais. Esta atividade se deve talvez ao alto teor de compostos fenólicos
existentes nas raízes na Jatropha ribifolia.
Figura 60. Potencial antioxidante da raiz da Jatropha ribifolia, frente ao radical DPPH.
65
5.4.2. Ensaio Enzimático
As proteínas tirosinas fosfatases (PTPs) exercem efeitos tanto regulando
negativamente, como positivamente, as vias de sinalização e no controle fisiológico de
uma variedade de tecidos. A inibição de PTPs está intimamente relacionada ao tratamento
de diversos tipos de cânceres,
43
sendo as Cdc25b e LMW identificadas como importantes
alvos para o desenvolvimento de terapias anticâncer e a PTP-1B é considerada um
regulador negativo de sinalização dos hormônios insulina e leptina, e também um agente
para o tratamento do câncer.
44
Os resultados mostraram-se bastante satisfatórios frente à
ação e aplicação dessas PTPs. Conforme o gráfico (Figura 61) a jatrofona codificado
PI/DT apresentou 44% de atividade e 56% de inibição, o ácido ciperenóico codificado
PI/ST apresentou 91% de atividade e 9% de inibição no ensaio com a LMW. Na Figura 62
o gráfico do ensaio com a PTP1B mostra 52% de atividade e 48% de inibição para o PI/DT
e 70% de atividade e 30% de inibição para o PI/ST. Na Figura 63 o gráfico do ensaio com
a Cdc25b mostra 73% de atividade e 27% de inibição para o PI/DT e 86% de atividade e
14% de inibição para o PI/ST. As Figuras 64 e 65 mostram os gráficos gerais da atividade
e inibição dos candidatos à inibidores em relação às três enzimas PTPs. Dos inibidores
testados a jatrofona (PI/DT) foi o melhor candidato a inibidor, apresentando inibição de
56% LMW, 48% PTP-1B, 27% Cdc25b.
Figura 61. Perfil de atividade vs inibição da enzima LMW.
66
Figura 62. Perfil de atividade vs inibição da enzima PTP1B.
Figura 63. Perfil de atividade vs inibição da enzima Cdc25b.
67
Figura 64. Perfil de atividade enzimática na presença dos candidatos a inibidores.
Figura 65. Perfil de inibição enzimática na presença dos candidatos a inibidores.
5.4.3. Ensaio Antitumoral in vitro
Os gráficos se referem à ação dos extratos e compostos isolados de Jatropha
ribifolia em cultura de células tumorais humanas, que relacionam a porcentagem de
68
crescimento celular e a concentração dos extratos e compostos. Foram utilizados no ensaio
o extrato hexânico, a lignina, a jatrofona e o ácido ciperenóico. Como padrão positivo a
doxorrubicina. Os valores abaixo de cem e acima de zero representam inibição de
crescimento celular, enquanto os negativos (abaixo de zero) morte celular, pois a
quantidade de células torna-se menor do que no início do experimento.
Figura 66. Gráfico de atividade antitumoral da doxorrubicina em cultura de células tumorais humanas.
A doxorrubicina (Tecnofarma International®, Uruguai) controle positivo (Figura
66), demonstrou uma boa seletividade e um potencial elevado, com grande efeito inibitório
em concentrações relativamente baixas, sem apresentar morte celular.
69
Figura 67. Gráfico de atividade antitumoral do extrato hexânico da raiz da Jatropha ribifolia em cultura de
células tumorais humanas.
Figura 68. Gráfico de atividade antitumoral da lignina (SMJR) isolada da Jatropha ribifolia, em cultura de
células tumorais humanas.
O extrato hexânico das raízes de Jatropha ribifolia (Figura 67), apresentou inibição
total do crescimento celular de U251 e K562 em concentrações de 1,2 e 2,4 µg/mL,
respectivamente. A lignina (SMJR) (Figura 68) produziu um efeito inibitório em U251 na
70
concentração de 26,6 µg/mL, para as demais células as concentrações foram superiores a
250 µg/mL, concentração considerada tóxica.
Figura 69. Gráfico de atividade antitumoral do ácido ciperenóico isolado da Jatropha ribifolia, em cultura de
células tumorais humanas.
Figura 70. Gráfico de atividade antitumoral da jatrofona isolada da Jatropha ribifolia, em cultura de células
tumorais humanas.
71
O ácido ciperenóico (Figura 69) apresentou inibição total do crescimento celular da
K562 em concentração de 10,5 µg/mL e do U251 em 11,4 µg/mL. Em concentrações
maiores foi evidenciada morte celular.
A jatrofona (Figura 70) apresentou excelentes resultados quanto à inibição do
crescimento celular, em concentração inferior a 0,25 µg/mL a inibição foi de 100% para
K562. Nas concentrações de 0,57 e 0,96 µg/mL apresentou inibição total para as células
U251 e NCl-ADR/RES, respectivamente. Em maiores concentrações produziu inibição
para as demais células, porém seguida de morte celular, sendo considerado um composto
com alto grau de toxicidade.
As substâncias apresentaram resultados expressivos frente à linhagem de células
tumorais. Sendo a jatrofona, o composto que melhor expressou inibição do crescimento
celular em concentração inferior a 0,25µg.mL-1, mostrando-se ser uma substância de
interesse na realização de derivados na tentativa de diminuir sua toxicidade. Os valores
para inibição total do crescimento celular estão listados na Tabela 14.
Tabela 14. TGI – Total Growth Inhibition - concentração necessária para que ocorra 0% de crescimento.
TGI (µg/mL)
Ext.Hex.JR
SMJR (Lignina)
Ácido ciperenóico
Jatrofona
Doxorrubicina
2
1,2
26,6
11,4
0,57
25
m
15,5
>250
86,9
9,2
>25
a
9,5
>250
41,2
0,96
>25
7
9,1
>250
41,0
4,2
>25
4
>250
>250
>250
>250
>25
p
12,3
>250
25,1
8,4
25
o
37,5
>250
65,6
55,8
>25
h
26,5
>250
57,9
16,1
>25
k
2,4
>250
10,5
0,21
25
v
1,7
>250
9,5
0,21
>25
2 = U251 (glioma, SNC); m = MCF-7 (mama); a = NCl-ADR/RES (ovário, com fenótipo de resistência a
múltiplas drogas); 7 = 786-0 (rim); 4 = NCl-H460 (pulmão, tipo não pequenas células); p = PC-3 (próstata);
o = OVCAR-3 (ovário); h = HT-29 (colorretal); k = K562 (leucemia); v = Vero (célula epitelial de rim de
macaco verde).
72
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O trabalho contribuiu para o conhecimento químico e bioativo dos compostos
presentes na raiz espécie Jatropha ribifolia, uma Euphorbiaceae endêmica na região de
Naviraí-MS. A partir de técnicas de fracionamento e cromatografia isolou-se quatro
substâncias, sendo duas pertencentes à classe dos terpenos, uma lignina e um sal oxálico.
Métodos espectroscópicos possibilitaram a identificação estrutural dos terpenos; o
sesquiterpeno ácido ciperenóico C15H22O2, composto este isolado pela primeira vez na
espécie, e o diterpeno jatrofona C20H24O3, composto bastante comum na maioria das
espécies do gênero Jatropha. O ácido ciperenóico foi esterificado com diazometano para
converter o grupo carboxílico em éster metílico. O composto metilado apresentou estrutura
molecular C16H24O2.
O ensaio de atividade antioxidante com frações orgânicas da raiz da Jatropha
ribifolia, apresentou resultados positivos para as frações analisadas, todas mostraram uma
capacidade sequestradora considerável frente ao DPPH. Sendo que a fração clorofórmica e
acetato de etila mostraram valores significativos quando comparadas ao padrão rutina, esta
atividade se deve talvez ao alto teor de compostos fenólicos existentes nas raízes.
O ensaio enzimático, utilizando proteínas tirosinas fosfatases (PTPs) e candidatos a
inibidores
jatrofona
e
ácido
ciperenóico,
apresentaram
resultados
expressivos,
principalmente para a jatrofona que mostrou um maior potencial inibitório frente as três
enzimas, enzimas estas intimamente relacionada ao tratamento de doenças que hoje
afligem grande parte da população que é o câncer, o diabetes e a obesidade.
O ensaio antitumoral in vitro realizado com o extrato hexânico, a lignina e os
terpenos ácido ciperenóico e jatrofona mostraram resultados bastante expressivos frente à
linhagem de células tumorais. Sendo a jatrofona, o composto que melhor expressou
inibição do crescimento celular em concentrações inferiores a 0,25µg.mL-1. Considera-se
diante dados aqui apresentados que, a espécie Jatropha ribifolia é um importante alvo
terapêutico, constatado a ação biológica de seus constituintes.
73
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79
CAPÍTULO 2 – ARTIGO
Isolation, structural identification and cytotoxic activity of hexanic extract from the
roots of Jatropha ribifolia (Pohl) Baill.
Elaine de S. Fernandesa; Fátima Aparecida Rodriguesa, Danilo Tófolib, Paulo M.
Imamurac, João E. de Carvalhod, Ana L.T.G.Ruizd, Sandro Minguzzia and *Rogério C. L.
Silvaa
a
Departamento de Química, Unidade Universitária de Naviraí,
Universidade Estadual de Mato Grosso do Sul, Rua Emílio Máscoli, 275, Centro, 79950000 Naviraí , Mato Grosso do Sul, Brazil. *e-mail: [email protected]
b
Departamento de Química, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Centro de
Ciências Exatas e Tecnologia, Universidade Federal de Mato Grosso do Sul, Av. Senador
Filinto Muller 1555, 79074-900 Campo Grande - MS, Brazil.
c
Departamento de Química, Universidade Estadual de Campinas, CP6154, São
Paulo, Brazil.
d
Centro Pluridisciplinar de Pesquisas Químicas, Biológicas, e Agrícolas, Unicamp,
Universidade Estadual de Campinas, 13083-970 Campinas, SP, Brazil.
Abstract
The ethanolic extract was obtained from the roots of Jatropha ribifolia. The extract
obtained was partitioned in hexanic, pre-concentrated and examined for their effect on the
growth of ten types of human cancer cells comparing with doxorrubicine. The bioassay
showed better results for seven cells than doxorrubicine in concentration low the 25
µg.mL-1. This whether should the jatrophone and cyperenoic acid terpenes isolated and
identification this extract.
Key-word Index: Jatropha ribifolia, Euphorbiaceae, sesquiterpene, diterpene, cytotoxic
activity.
1.
Introduction
Bioactive terpenes have a significant importance for the pharmaceutical industry
which covers a wide range of diverse chemical compounds, providing opportunities for
synthesis (Wang and Bidigare, 2005). The genus Jatropha is recognized as an important
source of secondary metabolites, with the terpenes class very common for this genus
(Valente, 2004; Can-Aké et al., 2007).
80
Jatropha ribifolia (Pohl) Baill belongs to the Euphorbiaceae family being a fairly
common specie in the brazilian northeastern, popularly known as pinhão de purga (purgin
nut), and its latex is used to treat snake bites. It was not found at the literature reporting for
this specie in the brazilian central western, being considered endemic in the state of Mato
Grosso do Sul and knowed in Navirai as “minâncora do campo”, being its roots used as
upper tract descongestant (Ribeiro, 2010; Souza and Rodal, 2010).
In vitro bioassays typically use several tumor cell lines in order to obtain a broad
view of the effects of substances and the discovery of selective agents (Sacoman, 2007).
2. Experimental
2.1.
Plant material
Material was collected at Naviraí, Mato Grosso do Sul, Brazil. Voucher specimen
(CGMS 31.481) was deposited at the Herbarium of the Institute of de Botany of São Paulo
at the University of São Paulo/ Brazil.
2.2.
Isolation procedures
Fresh roots (1.5kg) of Jatropha ribifolia were grounded, and extracted with EtOH
at room temperature. The ethanolic extract (386g) obtained by evaporation was partitioned
between hexane and MeOH-H2O (9:1), the evaporated hexane-soluble fraction (7.75 g)
was chromatographed on silica gel, eluted in gradient, starting with hexane: EtOAc 5% to
100% EtOAc. The fractions eluted with hexane: EtOAc (20 and 25%) were joined and rechromatographed yielding 431.3 mg of Jatrophone (1), in the fraction hexane / EtOAc
20%.
For the isolation of cyperenoic acid (2) the fresh roots (660g) were extracted with
hot hexane, and after evaporation, 8g of the extract was chromatographed, affording 475.8
mg of 2, in the fraction eluted with hexane / EtOAc 10%.
2.3.
Biological tests
Antitumoral in vitro
For the antiproliferative activity screening in vitro, 10 cell lines were selected from
human tumors, designated as: strains K562 (leukemia), MCF-7 (breast), NCI-ADR/RES
(ovarian phenotype of resistance to multiple drugs), UACC-62 (melanoma), NCI-H460
(lung), PC 3 (prostate), HT29 (colon), OVCAR-3 (ovarian), 786-0 (kidney) and U251
(glioma), and a normal cell lines: VERO (monkey kidney) later replaced by HaCat (human
keratinocyte). All cell lines provided by the National Cancer Institute (NCI), USA. The
experimental procedures were performed according with the literature (Skehan et al., 1990;
Monks et al., 1991; Rubinstein et al., 1990).
3.
3.1.
Results and discussion
Isolation and Structural Identification
81
The antitumor properties of species of the genus Jatropha have been targets of
phytochemical studies. The literature does not provide chemical studies on Jatropha
ribifolia, which led to research this specie.
The isolation procedure used two methods, one with the the ethanolic extract obtained
was partitioned into hexane:MeOH-H2O and chromatographed on silica gel, resulting in a
higher proprortion of jatrophone (1), another method used hot hexane to obtain an enriched
this fraction the cyperenoic acid (2). Compound 1 was obtained as colorless crystals with
mp 142-144oC. The HRESIMS spectrum gave an [MH] ion at m/z 312.1723,
corresponding to the molecular formula C20H24O3. The FTIR spectrum had absorptions
indicating OH (3449 cm-1) and carbonyl (1697 cm-1) groups. The 1H, 13C and 2D NMR
techniques (table 1) were compared with literature (Goulart et al., 1993; Taylor et al.,
1983) confirming the isolation of jatrophone (1), a common compound in the genus
Jatropha. Compound 2 was obtained as colorless crystals with mp 162-164oC. The
HRESIMS spectrum gave an [M H] ion at m/z 234,1620, corresponding to the molecular
formula C15H22O2. The FTIR spectrum had absorptions indicating OH (3430 cm-1) and
carbonyl (1674 cm-1) groups indicating a carboxylic acid group. The NMR 1H, 13C and 2D
NMR techinics (table 2) were compared with literature (Pertino et al., 2006) confirming
the isolation of cyperenoic acid (2), this compound is described at the first time in this
specie. NOESY spectrum for 1 and 2 showed the H groups in proximity (Figure 1 and 2)
confirming the stereochemical aspects observed by X-ray for both (Boonyaratavej et
al.,1998; Taylor et al., 1983).
Jatrophone (1): colorless crystals, m.p 142-144oC. GC/MS: 312 u.m.a (C15H22O2:
312.1723) IR (KBr, cm-1) υmax : 3449, 2961, 2926, 2870, 1697, 1653, 1619, 1457, 1401,
1373,
1329.
UV
λmax
(CHCl3)
nm:
220,04
e
280,05.
H 3C
16
a
H
H
b
20
CH3
O
2
14
13
1
a
3
12
15
4
H
11
O
10
5
8
6
7
H 3C
17
H
9
b
19
CH3
CH3
18
O
Figure. 1: NOESY correlations for jatrophone 1.
82
Cyperenoic acid (2): colorless crystals, m.p 162-164°C. GC/MS: 234 u.m.a (C15H22O2:
234,1620) retention time: 20,594 min. IR (KBr, cm-1) υmax : 3430, 2955, 1674, 1434, 1287,
950. UV λmax (CHCl3) nm: 239,97 nm.
14
CH3
Hb
Ha
Hb
13
CH3
2
4
5
Ha
10
1
3
Ha
9
11
12
CH3
6
15
HO
8
7
Hb
Ha
Hb
Hb
O
Ha
Figure. 2: NOESY correlations for 2.
Table 1: NMR data for 1 in CDCl3, with instrument operating at 62.5 MHz for NMR 13C and 500 MHz for
NMR 1H, 2D COSY and HMBC.
Position
1
1
Hb
2,15 dd(2,15)
13
Cb
42,461 (42,45)
COSY (1H-1H) b
2
2,98 m(3,00)
38,342 (38,30)
3
4
5
6
7
8
9
10
5,79 m (5,77)
5,79 m (5,77)
5,95 d (5,98)
6,46 d (6,48)
-
123,760(123,07)
137,078(137,10)
147,143(147,03)
141,764(141,75)
202,041(201,84)
128,722(128,71)
159,051(158,71)
36,642 (36,59)
H-1b, H-2
(H-1b, H-2)
H-1a, H-2, H-3
(H-1a, H-2, H-3)
H-1a, H-1b, H-3
(H-1a, H-1b)
H-1b, H-2(H-1b)
H-9 (H-9)
H-8 (H-8)
-
11
41,237 (41,25)
-
12
2,90 d (2,91)
2,42 d (2,44)
-
183,305(183,12)
-
13
14
15
16
1,09 d (1,09)
112,424(112,36)
203,967(203,78)
99,799 (99,75)
18,974 (18,93)
H-2 (H-2)
1,78 dd(1,79)
HMBC (13C-1H)
-
H-16
H-17
H-1a, H-3, H-5
H-1a, H-16
H-8, H-17
H-9, H-17
H-11b, H-18, H-19
H-11a, H-11b, H-8,
H-18, H-19
H-18, H-19
H-11a, H-11b,
H-20
H-11b, H-20
H-20
H-1a, H-3
H-1b
83
17
18
19
20
1,87 s (1,87)
1,24 s (1,26)
1,36 s (1,37)
1,73 s (1,74)
b
20,738 (20,68)
30,402 (30,38)
26,909 (26,89)
6,105 (6,02)
H-19 (H-19)
H-18 (H-18)
H-11b
H-11a, H-19
H-11b, H-18
-
Data in parenthesis from literature. (Goulart et al., 1993)
Table 2: NMR data for 2 in CDCl3, with instrument operating at 62.5 MHz for NMR 13C and 500 MHz for
NMR 1H, 2D COSY and HMBC.
Position
1
2
1
Hb
1,78 m (1,78)
1,58 m (1,58)
Cb
68,20 (68,23)
25,71(25,74)
COSY (1H-1H)
H-2b, H-3b
H-2a, H-3a, H-14
HMBC (13C-1H)
H-2a, H-2b, H-10
-
3
2,83 m (2,83)
2,75 m (2,75)
2,78 m (2,77)
2,28 brd (2,28)
2,00 m (2,00)
1,91 m (1,92)
1,42 m (1,41)
36,31 (36,33)
H-2a, H-2b,
27,86 (27,90)
10
1,55 m (1,55)
1,17 m (1,17)
2,10 m (2,10)
35,96 (36,00)
H-2b, H-3b
H-2a, H-3ª
H-6b, H-7
H-6ª
H-6a, H-8B
H-8b, H-9b
H-7, H-8a, H-9a,
H-9b
H-9b, H-8b, H-10
H-8a, H-8b, H-9ª
H-9ª
11
-
41,70 (41,73)
-
12
13
14
15
0,85 s (0,86)
1,03 s (1,03)
0,88 d (0,90)
-
26,19 (26,22)
19,26 (19,28)
17,96 (17,99)
170,71 (171,05)
H-2b
-
4
5
6
7
8
9
b
3.2.
13
123,07(123,19)
173,09(173,10)
31,30 (31,34)
48,15 (48,20)
26,91 (26,96)
H-9a, H-12, H-13
H-9b, H-13
H-10, H-14
H-2a, H-2b, H-9a,
H-9b, H-14
H-2a, H-10, H-12,
H-13
H-13
H-12
H-10, H-9 b
-
Data in parenthesis from literature. (Pertino et al., 2006)
Antitumour activity in vitro
The test was realized initially for Doxorubicin as positive control (Figure 3).The
activity profile for hexanic extract against human tumor cells are demonstrated in Figure 4,
which correlate percentage of cell growth versus substances concentration. The values
below one hundred and higher than zero represented the cell growth inhibition and
negative values indicated cell death.
The hexanic extract showed excellent inhibition growth to cells when compared
with the doxorrubicine drug. The concentration to inhibition growth was to PC-3 (12.3
g.mL-1), MCF-7 (15,5 g.mL-1), NCl-ADR/RES (9,5 g.mL-1), 786-0 (9,1 g.mL-1),
K562 ( 2,4 g.mL-1), Vero (1,7 g.mL-1). This high efficiency whether the jatrophone and
cyperenoic acid terpenes exists in concentrated hexane extract.
84
Figure 3: Citotoxic activity profile of doxorubicin in cultured human tumor cells.
Figure. 4. Citotoxic activity profile of concentrate hexanic extract in cultured tumor cells.
85
Table 3: Total Growth Inhibition (TGI).
TGI (µg/mL)
Hexanic extract
Doxorrubicina
2
1,2
25
m
15,5
>25
a
9,5
>25
7
9,1
>25
4
>250
>25
p
12,3
25
o
37,5
>25
h
26,5
>25
k
2,4
25
v
1,7
>25
2 = U251 (glioma, SNC); m = MCF-7 (breast); a = NCl-ADR/RES (ovarian phenotype resistance to multiple
drugs); 7 = 786-0 (kidney); 4 = NCl-H460 (lung); p = PC-3 (prostate); o = OVCAR-3 (ovarian); h = HT-29
(colon); k = K562 (leukemia); v = Vero (monkey kidney epitelial cell).
Jatrophone and cyperenoic acid terpenoids were isolated at the first time from this
specie. Cyperenoic acid has already been described in the species Sandwithia guyanensis
(Jacobs et al., 1987) Croton crassifolius, (Boonyaratavej et al.,1998), Joannesia princeps a
was evaluated antifungic activitie (Achenbach and Benirschke, 1997) and Jatropha isabelli
where it was evaluated as cytotoxic and gastroprotector effect (Pertino et al., 2006;
Fröhlich et al., 2010), all of them are from the Euphorbiaceae family.
4. Acknowledgments
The authors are grateful to the University of Campinas, especially Dr. Lauro E. S.
Barata, for the chemical analysis, Dr. Mary Ann Foglio for helpful discussion.
5.
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