UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS
COMISSÃO DE GRADUAÇÃO DO CURSO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
Michelle de Souza Lima
Análise da Resposta Celular em Linhagens de Câncer Colorretal e
Câncer de Pulmão Expostas ao Tratamento com Agentes
Antineoplásicos Platinados e a Baixas Concentrações de Glicose
Porto Alegre, Dezembro de 2011
Análise da Resposta Celular em Linhagens de Câncer Colorretal e Câncer de
Pulmão Expostas ao Tratamento com Agentes Antineoplásicos Platinados e
a Baixas Concentrações de Glicose
Michelle de Souza Lima
Trabalho de Conclusão de Curso apresentado
à Comissão de Graduação do Curso de
Ciências Biológicas da UFRGS como requisito
parcial para obtenção do título de Bacharel em
Ciências Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. Guido Lenz
Este trabalho foi realizado como parte do projeto de doutorado de Diana Lilian Bordin, intitulado
“Avaliação da Indução de Autofagia por Agentes Alquilantes em Linhagens de Câncer Colorretal
em Condições de Estresse Energético”, o qual está vinculado à linha de pesquisa Reparação do
DNA e Mutagênese em Células Eucarióticas. O trabalho foi realizado sob orientação do Professor
Doutor Guido Lenz e co-orientação do Professor Doutor João Antonio Pêgas Henriques.
Os experimentos foram realizados no Laboratório de Reparação de DNA de Eucariontes,
Departamento de Biofísica, UFRGS. As imagens de imunofluorescência foram coletadas no
Laboratório Genotox-Royal, UFRGS.
3
Revista para submissão: PLoS ONE
Análise da Resposta Celular em Linhagens de Câncer Colorretal e
Câncer de Pulmão Expostas ao Tratamento com Agentes
Antineoplásicos Platinados e a Baixas Concentrações de Glicose
1
1,2
1,2
Michelle S. Lima , Diana Lilian Bordin , João A. P. Henriques , Guido Lenz
1,2
1 Departamento de Biofísica, UFRGS, Porto Alegre, Brasil, 2 Departamento de Biotecnologia, UFRGS, Porto Alegre, Brasil.
Resumo
Os agentes antineoplásicos platinados, como a oxaliplatina e cisplatina, são amplamente utilizados na
clínica oncológica no tratamento de tumores sólidos. O câncer colorretal e o câncer de pulmão são
exemplos de tumores sólidos, os quais apresentam um microambiente com características diferenciadas
dos tecidos normais, como baixa disponibilidade de glicose e ouros nutrientes. O entendimento de como as
células tumorais respondem ao tratamento com agentes anticâncer nas condições do microambiente
tumoral ainda é escasso. Neste estudo foi analisada a resposta celular de células de câncer colorretal
expostas ao tratamento com oxaliplatina e câncer de pulmão expostas ao tratamento com cisplatina, em
baixa concentração de glicose, fornecendo uma condição semelhante à encontrada no microambiente do
tumor. Dentre os resultados obtidos, foi encontrada uma alta viabilidade das células quando cultivadas em
meios contendo baixas concentrações de glicose, mostrando resistência a essa condição. A autofagia tem
sido demonstrada como um importante mecanismo de resistência ao tratamento quimioterápico, no entanto,
não foi observada indução de autofagia nas condições as quais as células foram expostas. Foi evidenciada
uma relação entre a baixa concentração de glicose e a expressão da proteína p53 na linhagem de câncer
colorretal HCT116 wt quando exposta ao tratamento com oxaliplatina. Além disso, a expressão de p53
também esteve aumentada nas células de câncer de pulmão H460 quando expostas ao tratamento com
cisplatina. Desta forma, foi demonstrado neste trabalho que cada linhagem tumoral apresenta diferentes
respostas quando tratadas com agentes antineoplásicos platinados em baixas concentrações de glicose.
4
Introdução
As neoplasias malignas constituem uma classe de doenças na qual um grupo de células apresenta
características distintas das células normais como crescimento desordenado, proliferação incontrolada,
imortalidade e invasão para outros tecidos (metástase). Segundo pesquisas recentes realizadas pelo
Instituto Nacional do Câncer (INCA), o câncer de pulmão é o tipo mais comum de câncer no mundo, sendo
que no Brasil é o segundo tipo mais frequente em homens e o quarto tipo mais frequente em mulheres. O
segundo tipo com maior incidência no mundo é o câncer de mama, seguido pelo câncer colorretal, que
apresenta uma incidência anual no Brasil de mais de 13 mil novos casos em homens e mais de 14 mil
novos casos em mulheres [1].
Tumores sólidos como o colorretal e o de pulmão, apresentam um microambiente tumoral com
metabolismo diferenciado dos tecidos normais, pois à medida que ocorre a proliferação, as células tornamse mais afastadas dos vasos sanguíneos, dispondo de menores quantidades de nutrientes e oxigênio [2].
Nessa condição de estresse fisiológico, o tumor pode apresentar resistência ao tratamento quimioterápico.
Além de uma exposição a concentrações mais baixas do agente antineoplásico, ocorre a seleção de células
com fenótipo diferenciado, tendo características como decréscimo na capacidade apoptótica [3] e alterações
no metabolismo da glicose [4].
Recentemente, a indução de autofagia em células neoplásicas tem sido considerada como um dos
mecanismos envolvidos na resistência ao tratamento de tumores [5]. A autofagia é um processo de
autodigestão celular que leva à degradação de organelas e proteínas envolvendo a formação de uma
vesícula de membrana dupla contendo componentes celulares que se fusionam aos lisossomos [6]. Este
processo fornece energia para a célula, atuando como um mecanismo de sobrevivência em condições de
privação de nutrientes. Entretanto, em condições severas de privação de nutrientes, a autofagia pode atuar
como um mecanismo de morte celular [7]. A forma mais utilizada para avaliar a indução de autofagia é a
expressão de LC3, uma proteína encontrada no citosol (LC3-I) e acoplada à membrana do autofagossomo
(LC3-II). Quando um sinal pró-autofágico é percebido pela célula, a LC3-I sofre clivagem na extremidade Cterminal sendo convertida à sua forma LC3 II [8].
Os agentes platinados estão entre os compostos mais utilizados no tratamento quimioterápico de
tumores sólidos. Sua toxicidade é caracterizada pela formação de adutos de platina no DNA, levando à
morte celular pelo bloqueio da replicação e da transcrição [9, 10]. A cisplatina e a oxaliplatina são exemplos
de compostos amplamente utilizados no tratamento antitumoral que agem principalmente alterando a
progressão do ciclo celular e atuam na modulação de vários genes, no entanto, apresentam entre si
mecanismos de ação distintos [11]. A cisplatina tem sido empregada no tratamento contra o câncer de
pulmão, entretanto, a maioria dos pacientes desenvolve resistência ao tratamento, impedindo a eliminação
do tumor [12]. Inicialmente, a cisplatina induz danos ao DNA que levam à morte celular por apoptose, porém
com a continuidade do tratamento, vários mecanismos de resistência podem ser ativados, dentre os quais,
a indução de autofagia [13].
Na terapia contra o câncer colorretal, a oxaliplatina, um derivado de terceira geração da platina, tem se
mostrado um agente antineoplásico promissor e comparações in vitro mostraram que a oxaliplatina requer
menos adutos no DNA que a cisplatina para inibir o crescimento e a proliferação celular [11]. Todavia, assim
como para a cisplatina, o tratamento crônico com oxaliplatina induz a ativação de mecanismos de
5
resistência. Além disso, a inativação do gene que codifica a proteína p53 está correlacionada a uma maior
resistência a esse agente [14].
No presente trabalho, foi avaliado o comportamento celular das linhagens de câncer colorretal HCT116
wild-type (wt), HCT116 deficiente em p53 (p53-/-) e HT29, e de câncer de pulmão H460, expostas a
oxaliplatina ou cisplatina. Além disso, as células foram expostas a baixas concentrações de glicose com o
objetivo de mimetizar o microambiente tumoral e avaliar a resposta celular nestas condições. Dentre os
resultados encontrados, observou-se que células expostas a baixas concentrações de glicose mostraram
diferentes capacidades de proliferação quando comparadas a células cultivadas em concentrações altas de
glicose. No entanto, não foi encontrada indução de autofagia por cisplatina e oxaliplatina nessas condições.
Resultados
Viabilidade celular em baixas concentrações de glicose
No ensaio de avaliação de formação de colônias em diferentes concentrações de glicose, foram
observadas diferenças significativas em todas as linhagens testadas. Células HCT116 wt (Fig. 1A e 2A) e
p53-/- (Fig. 1B e 2B) expostas às concentrações normal e alta de glicose (1 g e 4,5 g/L) foram capazes de
formar maior número de colônias em relação às células cultivadas com as menores concentrações de
glicose utilizadas. Para a linhagem H460 (Fig. 1D e 2D), somente as células cultivadas em 0,1 g/L de
glicose mostraram menor número de colônias formadas em relação às outras concentrações de glicose.
Diferente das linhagens citadas acima, as células HT29 apresentaram maior capacidade de formação de
colônias em baixas concentrações de glicose e menor capacidade em altas concentrações de glicose (Fig.
1C e 2C).
A partir destes resultados, foram escolhidas as concentrações de 0,5 g/L, 1 g/L e 4,5 g/L de glicose para
os testes posteriores. A concentração de 1 g/L foi escolhida por representar a concentração normal de
glicose encontrada no sangue periférico humano. Sendo assim, a concentração de 0,5 g/L foi escolhida por
representar uma condição hipoglicêmica. Além disso, foi utilizada a concentração de 4,5 g/L por
corresponder a concentração de glicose utilizada normalmente em culturas celulares.
Citotoxicidade
A citotoxicidade dos agentes platinados foi verificada pelo ensaio MTT (Fig. 3). As células de câncer
colorretal foram tratadas por 24 horas com oxaliplatina em concentrações de 0 a 25 µM para HCT116 wt, e
entre 0 e 100 µM para HCT116 p53-/- e HT29. Para as células de câncer de pulmão H460, foi feito o
tratamento por 24 horas com concentrações de cisplatina variando de 0 a 33 µM. Após o período de
tratamento, as células foram mantidas em meio sem agentes quimioterápicos por 48 horas adicionais. A
partir das curvas de viabilidade celular, foram calculados os valores de IC50 de oxaliplatina e cisplatina para
cada linhagem. O valor de IC50 encontrado para HCT116 wt foi de 2,9 µM e para HCT116 p53-/-, 19 µM de
oxaliplatina. Foi encontrado para a linhagem HT29 o valor de IC50 de 25 µM de oxaliplatina e para a
linhagem H460 foi encontrado o valor de 2,9 µM de cisplatina.
6
Indução de autofagia
Como controle positivo, as células receberam um cotratamento com os compostos rapamicina e
cloroquina por 48 horas. A rapamicina induz autofagia por inibir a mTOR (mammalian target of rapamycin),
pois a via PI3K/ Akt/ mTOR é uma das principais repressoras de autofagia [16, 17]. A cloroquina é utilizada
como ferramenta para investigar o papel da autofagia por impedir a degradação autofágica de proteínas,
pois bloqueia a última etapa do processo autofágico, levando ao acúmulo de autofagossomos [18, 19].
As células foram tratadas durante 48 horas com as concentrações correspondentes ao IC50 de
oxaliplatina ou cisplatina nos meios de cultura contendo as diferentes concentrações de glicose. Nas
condições testadas, não foi encontrada indução de autofagia verificada pela expressão de LC3 por
oxaliplatina ou cisplatina em células de câncer colorretal e câncer de pulmão (Fig. 4).
Indução da expressão de p53
As células foram tratadas durante 48 horas com as concentrações correspondentes ao IC50 de
oxaliplatina ou cisplatina nos meios de cultura contendo as diferentes concentrações de glicose. Após o
tratamento com oxaliplatina, as células de câncer colorretal HCT116 wt mostraram maior expressão de p53
em relação ao controle negativo (Fig. 5), principalmente quando expostas a 0,5 g/L de glicose. A linhagem
HCT116 p53-/- não foi submetida ao teste, pois apresenta knockout no gene TP53, não expressando a
proteína p53. Na linhagem HT29, foi observada uma alta expressão de p53 em todas as situações a que
foram expostas (Fig. 6).
Em H460 os tratamentos com cisplatina induziram uma maior expressão de p53 em relação controle. No
entanto, não foram observadas diferenças na expressão entre as diferentes concentrações de glicose (Fig.
7).
Discussão
Tumores sólidos são caracterizados por apresentar um microambiente tumoral frequentemente
associado ao suprimento insuficiente de nutrientes como a glicose [20]. Nos ensaios de avaliação de
formação de colônias, células de câncer colorretal HCT116 wt e p53-/- mostraram menores números de
colônias formadas quando cultivadas em concentrações de glicose abaixo de 1g/L. No entanto, mesmo
nessas condições, essas células mostraram uma eficiência clonogênica satisfatória e mantiveram-se viáveis
pelo mesmo período que células cultivadas em concentrações maiores de glicose. De maneira interessante,
a linhagem HT29 mostrou menor capacidade de formação de colônias em concentrações maiores de
glicose. Este resultado mostra que mutações no gene TP53, como na linhagem HT29, podem contribuir com
o aumento da resistência de células de câncer expostas às condições hostis do microambiente de tumores
sólidos, como a baixa disponibilidade de glicose.
A linhagem de câncer de pulmão H460 também mostrou grande capacidade de formar colônias em
concentrações de 0,5 e 07 g/L de glicose, sendo que esses números não diferiram significativamente das
colônias formadas em maiores concentrações de glicose.
7
As células tumorais apresentam um metabolismo diferenciado em relação às células normais [20, 21]. O
microambiente tumoral, frequentemente associado à baixa disponibilidade de glicose, faz com que as
células aumentem a captação de glicose, a velocidade glicolítica e a utilização de vias alternativas para a
produção de energia, o que pode levar à resistência tumoral [15, 22].
Recentemente, tem-se dado atenção ao papel da proteína p53 no metabolismo da glicose. A p53 é
capaz de modular genes da via glicolítica como hexoquinase II, levando à limitação do fluxo glicolítico, e
diminuindo a expressão de transportadores de glicose como GLUT 1 e GLUT 4 [22, 23]. Desta forma,
mutações no gene TP53, que codifica a proteína p53, podem causar desequilíbrio metabólico levando à
resistência.
A oxaliplatina é um composto platinado que forma principalmente pontes intracadeia entre resíduos de
purinas adjacentes. Embora compostos relacionados, como a cisplatina, não sejam efetivos no tratamento
do câncer colorretal, a oxaliplatina é um agente anticâncer sobremodo eficaz no tratamento contra esse tipo
de neoplasia. Todavia, a concentração de quimioterápico que confere eficácia ao tratamento, é tempo e
dose dependente [14]. A quantidade de oxaliplatina necessária para atingir o IC50 na linhagem HCT116
p53-/- foi aproximadamente 6 vezes maior em relação à linhagem wt (Fig. 3). Mais de 50% dos tumores
humanos possuem mutação no gene TP53, o que confere resistência ao tratamento quimioterápico, devido
ao seu papel no controle do ciclo celular, apoptose e senescência [22]. Baseado nesse fato foi utilizada a
linhagem HT29 nos testes, a qual possui uma mutação (G -> A) no códon 273 do gene que codifica p53,
resultando em uma substituição de arginina para histidina, o que confere uma superexpressão da proteína
p53 [24]. Como esperado, a linhagem apresentou valores de IC50 aproximadamente 8 vezes maiores que a
linhagem HCT116 wt, pois esta mutação pode conferir resistência à oxaliplatina.
A cisplatina é um agente amplamente utilizado no tratamento contra o câncer de pulmão. Entretanto,
com a continuidade do tratamento, as células tumorais tornam-se resistentes através de vários mecanismos.
Os adutos de platina são reconhecidos pelas enzimas do sistema de reparação por excisão de nucleotídeos
(NER) levando à ativação de p53 e à parada no ciclo celular, permitindo o reparo do DNA e impedindo a
morte das células. Assim, a resistência pode ocorrer em decorrência do acúmulo da proteína p53 e do
aumento do reparo dos danos. [9, 12, 25].
A expressão de p53 em HCT116 wt foi maior frente o tratamento com oxaliplatina em relação ao controle
(Fig. 5), pois o dano ao DNA causado pela oxaliplatina é um dos estímulos que levam à ativação e aumento
nos níveis de p53 [26]. Nessa linhagem, a indução da expressão de p53 foi maior quando as células foram
tratadas em baixa concentração de glicose. Este resultado pode estar relacionado ao fato de que a p53 é
ativada em condições de estresse energético ou baixa disponibilidade de glicose levando à inibição da
proliferação celular e da síntese protéica, favorecendo a sobrevivência da célula [27].
A alta expressão de p53 encontrada nas células HT29 pode estar relacionada à superexpressão da
proteína em decorrência da mutação encontrada no gene TP53 [24].
A indução da expressão da proteína p53 nas células de câncer de pulmão H460 foi maior com a
exposição à cisplatina em relação ao controle, no entanto essa resposta não parece ser dependente da
concentração de glicose. A exposição à cisplatina pode levar à parada no ciclo celular, redução na síntese
de DNA e apoptose, além de outras respostas mediadas pela p53 [26].
A autofagia tem sido recentemente descrita como um mecanismo envolvido na resistência aos agentes
quimioterápicos. No presente estudo, as células de câncer colorretal e câncer de pulmão não sofreram
indução de autofagia. O período agudo de exposição a baixas concentrações de glicose e aos agentes
8
antineoplásicos platinados, parece não ter sido suficiente para ativar a via autofágica. Espera-se encontrar
uma maior indução de autofagia em células que sejam cultivadas em baixas concentrações de glicose por
períodos prolongados, pois essa condição leva à inibição da mTOR [28].
Diversos estudos revelam que a autofagia tem um papel dual na tumorigênese. Nos primeiros estágios
da carcinogênese a autofagia poderia atuar suprimindo o tumor, promovendo estabilidade genômica e
prevenindo inflamação. Além disso, deleções em genes relacionados à ativação da autofagia (Atgs e
Beclina-1) são responsáveis pelo surgimento de vários tipos de cânceres [5]. No entanto, em estágios
avançados de tumores sólidos, pode ocorrer uma diminuição de nutrientes na camada mais interna do
tumor, deixando as células em situação de estresse metabólico. O estresse ativa o processo autofágico,
levando ao fornecimento de energia para as células do tumor, dificultando sua eliminação [28, 29]. Além do
estresse energético, estudos recentes mostram que vários medicamentos quimioterápicos são capazes de
induzir autofagia, favorecendo a resistência ao tratamento [30, 31]. Diante destes fatos, a utilização da
autofagia como alvo terapêutico, pode fornecer novas ferramentas para combater a resistência à
quimioterapia [5].
Diante dos resultados obtidos é possível concluir que cada linhagem tumoral apresenta diferentes
respostas frente o tratamento com agentes antineoplásicos platinados em baixas concentrações de glicose.
Além disso, o comportamento celular nas condições avaliadas parece ser dependente do status da proteína
p53 em cada linhagem, mostrando relação com a resistência à quimioterapia. Deste modo, o entendimento
de como cada tipo de tumor responde ao tratamento em condições que mimetizam o microambiente tumoral
é fundamental para fornecer novas ferramentas no combate ao câncer.
Materiais e Métodos
Reagentes e cultivo celular
As linhagens celulares humanas de câncer colorretal HCT116 wt, HCT116 p53-/- e HT29, e a linhagem
humana de câncer de pulmão H460 foram gentilmente cedidas pela Doutora Annette Larsen (Centre de
Recherche Saint Antoine, Paris, França). As células foram cultivadas em meio DMEM 4,5 g/L de glicose
contendo 10% de soro fetal bovino, 2% penicilina/estreptomicina e 0,1% fungizona (Invitrogen). As células
o
foram mantidas em estufa a 37 C com 5% de CO2. Para os tratamentos com agentes antineoplásicos foram
utilizadas oxaliplatina (Eloxatin, Sanofi-aventis) e cisplatina (Fauldcispla, Libbs). Os demais reagentes
utilizados apresentavam grau analítico.
Ensaio clonogênico
Para avaliar a capacidade de formação de colônias em diferentes concentrações de glicose, as células
foram plaqueadas em uma densidade de 200 células/poço em placas de 6 poços, em duplicata. No dia
seguinte foi feita a incubação nos meios de cultura contendo concentrações de glicose variando de 0,1 a 4,5
g/L. Após 10 dias de incubação, as células foram fixadas com álcool metílico, coradas com solução de
cristal violeta 0,1% e as colônias foram contadas. A análise estatística foi feita utilizando as médias do
9
número de colônias de quatro experimentos independentes. Foi feito o teste ANOVA com pós-teste de
Tukey considerando valores estatisticamente diferentes com p ≤ 0,05.
Citotoxicidade
A viabilidade foi determinada utilizando o ensaio MTT [3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difeniltetrazolium
brometo] (Sigma-Aldrich Chemical Co), composto que é reduzido pela succinato desidrogenase ao produto
3
formazan, pelas células viáveis. As células foram semeadas em uma densidade de 7x10 células/poço em
placas de 24 poços e mantidas em DMEM 4,5 g/L. No dia seguinte, foram tratadas em duplicata com
oxaliplatina ou cisplatina. Após 24 horas de tratamento, o meio foi trocado e as células foram mantidas em
estufa por 48 horas adicionais. Posteriormente, adicionou-se o sal MTT durante três horas. Os cristais de
formazan foram dissolvidos em DMSO e foram feitas as leituras das absorbâncias em 540 nm utilizando o
TM
leitor de placas EnSpire
2300 Multilabel Reader (Perkin Elmer Inc). Foram calculados os valores de IC50
com base nas médias de três experimentos independentes.
Imunofluorescência
4
As células foram semeadas em um densidade de 8x10 células/poço em placas de 6 poços, sobre
lamínulas de 18 mm de diâmetro pré-tratadas com poli-lisina para melhor aderência. O plaqueamento foi
feito utilizando as três diferentes concentrações de glicose: 0,5, 1 e 4,5 g/L. No dia seguinte foi feita a
incubação com oxaliplatina ou cisplatina, utilizando a concentração correspondente ao IC50 de cada
substância por 48 horas.
Após este período, as células foram fixadas com paraformaldeído (4%) e
permeabilizadas com PBS-Triton (0,5%). Em seguida, os antígenos foram revelados utilizando os anticorpos
primários anti-LC3 B (Cell Signaling Technology, Danvers, MA, USA) e anti-p53 (Santa Cruz Biotechnology,
Santa Cruz, CA, USA). Foram utilizados anticorpos secundários apropriados conjugados com compostos
fluorescentes para cada anticorpo primário: Cy3 anti-rabbit para LC3 B e FITC anti-mouse para p53. As
imagens foram coletadas utilizando aumento de 10x através do Pathfinder™ Cellscan SreenTox (IMSTAR,
Paris, França) no Laboratório Genotox-Royal, UFRGS. Foram analisadas no mínimo 100 células por grupo
de tratamento quanto à presença de marcação do anticorpo na célula.
10
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31. Manov I, Pollak Y, Bronesshter R, Iancu TC (2011) Inhibition of doxorubicin-induced autophagy in
hepatocellular carcinoma Hep3B cells by sorafenib: the role of extracellular signal-regulated kinase
counteraction. FEBS J 278: 3494-3507.
12
A
0,1
0,5
0,7
1
4,5
(glicose g/L)
0,1
0,5
0,7
1
4,5
(glicose g/L)
0,1
0,5
0,7
1
4,5
(glicose g/L)
0,1
0,5
0,7
1
4,5
(glicose g/L)
HCT116
wt
B
HCT116
p53-/-
C
HT29
D
H460
Figura 1. Ensaio clonogênico em diferentes concentrações de glicose em linhagens de câncer colorretal e
câncer de pulmão. Foram utilizadas as concentrações 0,1, 0,5, 0,7, 1 e 4,5 g/L de glicose. (A) HCT116 wt; (B) HCT116
p53-/-; (C) HT29 e (D) H460.
13
A
B
C
D
Figura 2. Ensaio clonogênico em diferentes concentrações de glicose em linhagens de câncer colorretal e
câncer de pulmão. (A) HCT116 wt; (B) HCT116 p53-/-; (C) HT29 e (D) H460. Letras distintas correspondem a
diferenças estatisticamente significativas. (p ≤ 0,05). Barras de erros referentes ao desvio padrão.
14
A
B
C
D
Figura 3. Efeito citotóxico dos agentes antineoplásicos cisplatina e oxaliplatina. (A) Células HCT116 wt expostas
a oxaliplatina; (B) HCT116 p53-/- expostas a oxaliplatina; (C) HT29 expostas a oxaliplatina; (D) H460 expostas a
cisplatina. Barras de erros referentes ao desvio padrão.
15
A
0,5
1
4,5 g/L
0,5
1
4,5 g/L
C0
OXA
CQ/
RAP
B
C0
OXA
CQ/
RAP
16
C
0,5
1
4,5 g/L
0,5
1
4,5 g/L
C0
OXA
CQ/
RAP
D
C0
CIS
CQ/
RAP
Figura 4. Indução de autofagia em células de câncer colorretal expostas a oxaliplatina (OXA) e câncer de
pulmão expostas a cisplatina (CIS). As células foram expostas às concentrações de glicose 0,5, 1 e 4,5 g/L e tratadas
com valores de IC50 de OXA ou CIS. A concentração zero de droga foi utilizada como controle negativo (C0) e as
drogas cloroquina (CQ) e rapamicina (RAP) foram utilizadas como controle positivo. (A) HCT116 wt (B) HCT116 p53-/-;
(C) HT29 e (D) H460.
17
A
0,5 g/L
C0
OXA
B
1 g/L
4,5 g/L
C0
OXA
C
4,5 g/L
C0
OXA
Figura 5. Expressão de p53 em HCT116 wt. Concentração zero de droga foi utilizada como controle negativo (C0). As
células foram expostas ao tratamento com oxaliplatina (OXA) e às concentrações de glicose (A) 0,5; (B) 1 e (C) 4,5 g/L.
18
A
0,5 g/L
C0
OXA
B
1 g/L
C0
OXA
C
4,5 g/L
C0
OXA
Figura 6. Expressão de p53 em HT29. Concentração zero de droga foi utilizada como controle negativo (C0). As
células foram expostas ao tratamento com oxaliplatina (OXA) e às concentrações de glicose (A) 0,5; (B) 1 e (C) 4,5 g/L.
19
A
0,5 g/L
C0
CIS
B
1 g/L
C0
CIS
C
4,5 g/L
C0
CIS
Figura 7. Expressão de p53 em H460. Concentração zero de droga foi utilizada como controle negativo (C0). As
células foram expostas ao tratamento com cisplatina (CIS) e às concentrações de glicose (A) 0,5; (B) 1 e (C) 4,5 g/L.