UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
FACULDADE DE FARMÁCIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DE ALIMENTOS
CARACTERIZAÇÃO DE ENZIMAS EM DOIS CULTIVARES DE CACAU Theobroma
cacao L.
ADRIELLE SOUZA LEÃO MACÊDO
Salvador – Bahia
2014
2
ADRIELLE SOUZA LEÃO MACÊDO
CARACTERIZAÇÃO DE ENZIMAS EM DOIS CULTIVARES DE CACAU Theobroma
cacao L.
Dissertação apresentada a Faculdade de Farmácia da Universidade
Federal da Bahia, como parte das exigências do Programa de PósGraduação em Ciência de Alimentos, para obtenção do título de
Mestre.
Orientadora: Profª Drª. Eliete da Silva Bispo
Co-orientador: Prof° Dr. Sérgio Eduardo Soares
Salvador – Bahia
2014
FICHA CATALOGRÁFICA
Bibliotecária: Maria Claudete Marques Barbosa Estrela CRB: 5/806
Macêdo, Adrielle Souza Leão
Caracterização de enzimas em dois cultivares de cacau theobroma cacao l . / Adrielle
Souza Leão Macêdo . – Salvador, 2014.
89f.
Orientadora: Profª Drª. Eliete da Silva Bispo
Dissertação (Mestrado) – Universidade Federal da Bahia. Programa de PósGraduação em Ciência de Alimentos. Faculdade de Farmácia.
Contém referências.
1.
1. Cacau. 2. Cacau – Atividade enzimática I. Bispo, Eliete da Silva. II. Universidade
Federal da Bahia, Faculdade de Farmácia. Programa de Pós-Graduação em Ciência de
Alimentos .
CDD: 633.74
3
Dedico
Aos meus pais;
Ao meu esposo;
Aos meus irmãos;
E, aos meus amigos;
4
“Na vida, não vale tanto o que temos,
nem tanto importa o que somos,
vale o que realizamos com aquilo que possuímos e,
acima de tudo, importa o que fazemos de nós!”
Chico Xavier
5
AGRADECIMENTOS
A Deus por me dar forças e pela presença constante em minha vida;
A minha família, principalmente aos meus pais Violeta e Paulo Leão, pelo incansável e
verdadeiro carinho, amor, ensinamentos, torcida e apoio. Aos meus queridos irmãos, Adriano e
Augusto Leão pelo incentivo e carinho;
Ao meu esposo Acássio Macêdo por estar sempre ao meu lado, me inpulsionando para o
progresso, por toda confiança, amor, compreensão e incentivo;
À Profª. Drª. Eliete Bispo pela orientação, paciência, confiança, ensinamentos e amizade;
Ao Profº. Drº. Sergio Soares pelo apoio irrestrito, auxílio e confiança;
Aos colegas e agora amigos, que quero levar para sempre, e entre tantos, quero dividir em
especial essa alegria com: Margareth Ribeiro, Candice Braga, Lindanor Santana, Fátima Rocha,
Leonardo Maciel e Jaff Ribeiro;
A Universidade Federal da Bahia pelo suporte;
A CAPES pela concessão da bolsa de estudos;
Ao CNPq pelo apoio fianceiro ao projeto;
Aos amigos da Fazenda Lajedo do Ouro pelo acolhimento, suporte e fornecimento do material de
estudo;
As Professoras Janice Druzian, Mara Spínola, Alaúse Gil e Rízia de Cássia pelos conhecimentos
adquiridos;
Aos laboratórios LAPAAC e LAPESCA e a todos os seus colaboradores pelo suporte,
acolhimento do projeto de pesquisa e pelo auxílio e parceria nas análises.
Enfim, a todos que contribuíram direta ou indiretamente na realização deste trabalho.
A Vocês, toda minha gratidão!
6
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO GERAL .................................................................................................. 15
OBJETIVOS ...................................................................................................................... 18
OBJETIVOS GERAIS ........................................................................................................ 18
OBJETIVOS ESPECÍFICOS .............................................................................................. 18
CAPÍTULO I
REVISÃO DE LITERATURA ......................................................................................... 19
1. CACAU ........................................................................................................................... 19
1.1 Características gerais ..................................................................................................... 19
1.2 Influência genética nas características do cacau............................................................ 22
2. PRODUÇÃO DE CACAU NO MUNDO .................................................................... 24
3. PRÉ-PROCESSAMENTO DO CACAU ..................................................................... 26
3.1 Colheita e quebra dos frutos. ......................................................................................... 26
3.2 Fermentação................................................................................................................... 27
3.3 Secagem ......................................................................................................................... 30
3.4 Armazenamento ............................................................................................................. 31
4. ENZIMAS ...................................................................................................................... 32
4.1 Atividade enzimática do cacau. ..................................................................................... 33
4.1.1 Polifenoloxidases ........................................................................................................ 34
4.1.2 Invertases .................................................................................................................... 35
5. FORMAÇÃO DO FLAVOUR DO CHOCOLATE .................................................... 37
REFERÊNCIAS ................................................................................................................. 39
CAPÍTULO II
CARACTERIZAÇÃO DA POLIFENOLOXIDASE EM DOIS CULTIVARES DE CACAU
(Theobroma cacao L.) PRODUZIDOS NA REGIÃO SUL DA BAHIA, BRASIL.. ... 47
RESUMO ........................................................................................................................... 47
7
ABSTRACT ....................................................................................................................... 47
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 49
2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 51
2.1 Materiais ........................................................................................................................ 51
2.2 Reagentes e padrões....................................................................................................... 51
2.3 Fermentação................................................................................................................... 51
2.4 Coleta das amostras ....................................................................................................... 51
2.5 Caracterização da PPO .................................................................................................. 52
2.5.1 Extração da PPO da polpa .......................................................................................... 52
2.5.2. Extração da PPO das sementes .................................................................................. 52
2.5.3 Purificação da PPO dos extratos ................................................................................. 53
2.5.4 Determinação da atividade da PPO dos extratos ........................................................ 53
2.5.5 Determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmax da PPO ................................... 54
2.5.6 Efeito do pH e temperatura na atividade da PPO ....................................................... 54
2.5.7 Determinação do substrato preferencial da enzima .................................................... 54
2.5.8 Correlação entre os parâmetros de fermentação e a atividade enzimática dos extratos
............................................................................................................................................. 54
2.6 Determinação do teor de proteína nos extratos ............................................................. 54
2.7 Análise Estatística ......................................................................................................... 55
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 56
3.1 Determinação da atividade da PPO dos extratos ........................................................... 56
3.2 Efeito do pH na atividade da PPO ................................................................................. 57
3.3 Efeito da temperatura na atividade da PPO ................................................................... 59
3.4 Determinação do substrato preferencial da PPO ........................................................... 60
3.5 Correlação entre os parâmetros de fermentação e a atividade enzimática dos extratos
............................................................................................................................................. 61
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 66
8
CAPÍTULO III
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA INVERTASE EM DOIS CULTIVARES DE
CACAU (Theobroma cacao L.) PRODUZIDOS NO SUL DA BAHIA, BRASIL
............................................................................................................................................. 68
RESUMO ........................................................................................................................... 68
ABSTRACT ....................................................................................................................... 68
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................. 70
2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................................................... 72
2.1 Materiais ........................................................................................................................ 72
2.2 Reagentes e padrões....................................................................................................... 72
2.3 Fermentação................................................................................................................... 72
2.4 Coleta das amostras ....................................................................................................... 72
2.5 Caracterização da Invertase ........................................................................................... 73
2.5.1 Extração da Invertase da polpa ................................................................................... 73
2.5.2. Extração da Invertase das sementes .......................................................................... 73
2.5.3 Purificação da Invertase dos extratos ......................................................................... 74
2.5.4 Determinação da atividade da Invertase dos extratos................................................. 74
2.5.5 Determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmax da Invertase ............................ 75
2.5.6 Efeito do pH e temperatura na atividade da Invertase ................................................ 75
2.5.7 Correlação entre os parâmetros de fermentação e a atividade enzimática dos extratos
............................................................................................................................................. 75
2.6 Determinação do teor de proteína nos extratos ............................................................. 75
2.7 Análise Estatística ......................................................................................................... 75
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO .................................................................................. 76
3.1 Determinação da atividade da Invertase dos extratos .................................................... 76
3.2 Efeito do pH na atividade da Invertase .......................................................................... 78
3.3 Efeito da temperatura na atividade da Invertase ............................................................ 79
3.4 Correlação entre os parâmetros de fermentação e a atividade enzimática dos extratos
............................................................................................................................................. 81
9
REFERÊNCIAS .................................................................................................................. 85
CONCLUSÕES FINAIS ..................................................................................................... 87
SUGESTÕES PARA ESTUDOS FUTUROS..................................................................... 89
10
LISTA DE FIGURAS
CAPÍTULO I
Figura 01. (A) Corte longitudinal de um fruto de cacau - 1: Placenta; 2: Polpa Mucilaginosa; 3:
Casca; (B) Corte longitudinal de uma semente de cacau - 4: Testa; 5: Cotilédone; 6: Gérmen ou
embrião ................................................................................................................................ 20
Figura 02. Variedades de cacau: (A) Criollo; (B) Forastero; (C) Trinitário ..................... 21
Figura 03. (A) Frutos amontoados na plantação de cacau; (B) Quebra dos frutos ............ 26
Figura 04. A) Cocho de madeira e massa de cacau coberta com folha de bananeira; (B)
Revolvimento da massa de cacau ........................................................................................ 27
Figura 05. Mudanças químicas e bioquímicas dentro da semente do cacau durante a fermentação
............................................................................................................................................. 29
Figura 06. Secagem natural ao sol em barcaça................................................................... 31
CAPÍTULO II
Figura 01. Atividade da PPO para o substrato catecol em diferentes concentrações (0,05 M a 0,4
M ). (A) Polpa; (B) Semente .............................................................................................. 56
Figura 02. Parâmetros cinéticos pelo método de LINEWEVER-BURK com diferentes
concentrações do substrato catecol para a enzima PPO nos dois cultivares de cacau. (A) Polpa;
(B) Semente ......................................................................................................................... 57
Figura 03. Efeito do pH na atividade da PPO. (A) Cultivar PH 16; (B) Cultivar TSH 1188
............................................................................................................................................. 58
Figura 04. Efeito da temperatura na atividade da PPO. (A) Cultivar PH 16; (B) Cultivar TSH
1188 ..................................................................................................................................... 59
Figura 05. Determinação da atividade PPO para substrato preferencial: Catequina e
Epicatequina. (A) Polpa; (B) Semente ............................................................................... 61
11
Figura 06. Parâmetros de fermentação e pH ótimo de atuação da PPO. (A) PH 16 - Polpa; (B)
PH 16 - Semente; (C) TSH - Polpa; (D) TSH 1188 – Semente........................................... 62
Figura 07. Parâmetros de fermentação e temperatura ótima de atuação da PPO. (A) PH 16; (B)
TSH-1188 ............................................................................................................................ 64
CAPÍTULO III
Figura 01. Atividade das Invertases para o substrato sacarose em diferentes concentrações (0,05
M a 0,4 M ). (A) Polpa; (B) Semente ................................................................................ 76
Figura 02. Parâmetros cinéticos pelo método de LINEWEVER-BURK com diferentes
concentrações de sacarose, para as invertases nos cultivares estudados. (A) PH16 - Polpa; (B)
PH16- Semente; (C) TSH 1188 - Polpa; (D) TSG 1188 – Semente.................................... 77
Figura 03. Efeito do pH na atividade das Invertases. (A) Ácida; (B) Neutra.................... 79
Figura 04. Efeito da temperatura na atividade da Invertase. (A) Ácida; (B) Neutra .......... 80
Figura 05. Acompanhamento do pH para polpa e semente durante o processo de fermentação.
(A) Cultivar PH 16; (B) Cultivar TSH 1188 ....................................................................... 81
Figura 06. Parâmetros de fermentação e temperatura ótima de atuação da Invertase. (A) PH 16 –
Invertase Ácida; (B) PH 16 – Invertase Neutra; (C) TSH - Invertase Ácida; (D) TSH 1188 –
Invertase Neutra................................................................................................................... 83
12
LISTA DE TABELAS
CAPÍTULO I
Tabela 01. Composição de sementes de cacau (Forastero) do Oeste Africano ................. 21
Tabela 02. Maiores produtores mundiais de cacau............................................................. 24
Tabela 03. Principais enzimas ativas durante a fermentação de sementes de cacau .......... 33
CAPÍTULO III
Tabela 01. Km e Vmax das invertases para os cultivares com o substrato sacarose. ......... 78
13
RESUMO
O interesse do cultivo do cacau (Theobroma cacao L.) está relacionado no aproveitamento de
suas sementes para produção de derivados, principalmente para produção de chocolate.
Basicamente após a colheita do cacau, são efetuadas as etapas de separação da casca do material
interno (sementes e polpa) que é conduzido à fermentação, etapa indispensável para a obtenção
de amêndoas de boa qualidade devido a complexas reações bioquímicas que provocam a morte
do embrião, hidrólise de açúcares e proteínas, liberação das enzimas e substratos e difusão de
compostos fenólicos que entram em contato com as enzimas. Em seguida as amêndoas de cacau
são conduzidas à etapa de secagem que além de auxiliar a eliminação da água, possibilita a
continuidade das mudanças bioquímicas, iniciadas na fermentação. Durante estas etapas, são
gerados inúmeros compostos de aroma e sabor, sendo que as reações que favorecem a formação
desses precursores são levadas a cabo por enzimas endógenas do cacau. Com o objetivo de
contribuir para a melhoria da qualidade do cacau na produção de chocolates monovarietais, as
atividades enzimáticas de dois cultivares de cacau, PH 16 e TSH 118, produzidos na região Sul
da Bahia, foram caracterizadas e correlacionadas com os parâmetros de fermentação (pH e
temperatura). A atividade enzimática da PPO foi determinada através da medida do aumento da
absorbância a 420nm por espectrofotometria, e para a enzima invertase (ácida e neutra), as
atividades enzimáticas foram avaliadas pela dosagem de açúcares redutores segundo método de
Somogyi-Nelson e determinadas por espectrofotometria. Os resultados expostos demostram que a
ação da PPO será favorecida em temperaturas mais baixas, e que o aumento na frequência dos
revolvimentos da massa de cacau no início da fermentação, poderá retardar a elevação da
temperatura e a queda do pH. Foi observado também que as estabilidades e atividades da
invertase, são fatores limitantes para a conversão total da sacarose e formação de precursores de
sabor. Foi evidenciada a diferença e especificidade existente entre os cultivares de cacau, e entre
polpa e semente em cada cultivar, o que sugere que durante o processo de fermentação devem ser
utilizados critérios específicos para cada cultivar, tomando como base os parâmetros ideais de pH
e temperatura com o intuito de prolongar o período de melhor atuação destas enzimas,
contribuindo assim para a obtenção de amêndoas de maior qualidade para produção de chocolates
no que diz respeito à formação e potencialização dos precursores de aroma e sabor.
Palavras-chave: cacau, atividade enzimática, polifenoloxidase, invertase.
14
ABSTRACT
The interest of the cultivation of cocoa (Theobroma cacao L.) is referenced in the use of its seeds
for production of derivatives, mainly for the production of chocolate. Basically after harvest,
cocoa steps are effected separation of the inner bark materials (pulp and seeds) which is led to the
fermentation step essential for obtaining good quality beans due to the complex biochemical
reactions that cause the death of the embryo, hydrolysis of sugars and protein release of enzymes
and substrates and distribution of phenolic compounds that come into contact with the enzymes.
Then the cocoa beans are conveyed to the drying step that also aids the elimination of water
allows the continuity of biochemical changes initiated in the fermentation. During these steps,
many flavor and aroma compounds are generated, and the reactions which favor the formation of
these precursors are carried out by endogenous enzymes of cocoa. Aiming to contribute to
improving the quality of the cocoa production monovarietais chocolates, the enzymatic activities
of both cultivars cocoa, PH 16 and TSH 1188 produced in the South of Bahia, were characterized
and correlated with fermentation parameters (pH and temperature). The enzymatic activity of
PPO was determined by measuring the increase in absorbance at 420nm by spectrophotometry,
and the enzyme invertase (acid and neutral), the enzymatic activities were evaluated by
measuring reducing sugars second method of Somogyi - Nelson and determined by
spectrophotometry. The above results demonstrate that the action of PPO will be favored at lower
temperatures, and that the increase in the frequency of turnings of cocoa mass at the beginning of
fermentation, can slow the rise in temperature and decrease in pH. It was also observed that the
stabilities and activities of invertase, limit the total conversion of sucrose and formation of
precursors of flavor factors. It was demonstrated and the difference between existing cultivars
specificity cocoa and between each pulp and seed cultures, suggesting that during the
fermentation process specific criteria for each cultivar must be used, based on optimal parameters
of pH and temperature in order to prolong the activity of these enzymes better, thus contributing
to the achievement of higher quality beans to chocolate production with respect to the formation
and enhancement of the aroma and flavor precursors.
Keywords: cocoa, enzymatic activity, polyphenol oxidase, invertase.
15
INTRODUÇÃO GERAL
A partir das sementes do cacau, Theobroma cacao L, é obtido um dos alimentos mais
conhecidos e apreciados: o chocolate. Seu flavour é condicionado não apenas a atributos
genéticos do cacaueiro (variedade), como também a modificações que ocorrem durante seu
beneficiamento (BECKETT, 1994). Basicamente após a colheita do cacau, os frutos são
amontoados no chão da plantação cacaueira e abertos com facões. A casca e a placenta são
separadas e o material interno (formado de sementes e polpa) é levado às etapas posteriores. A
primeira delas é a fermentação que facilita a separação da polpa da semente além de proporcionar
a ocorrência de uma série de reações bioquímicas (OETTERER, 2006). Esta etapa é essencial ao
processamento, pois é a etapa responsável pelo desenvolvimento dos precursores e inúmeros
compostos de sabor. Durante esta etapa, a polpa envoltória das sementes é degradada pela ação
sucessiva de microrganismos (leveduras e bactérias ácido-lácticas e ácido-acéticas) naturais do
ambiente, com a elevação da temperatura para cerca de 50ºC (CRUZ et al., 2013).
Esses microrganismos atuam nos açúcares e ácidos orgânicos da polpa, que são
transformados em etanol, ácido láctico e especialmente em ácido acético (SCHWAN e
WHEALS, 2004). Os ácidos orgânicos gerados penetram nas sementes, e juntamente com a
elevação da temperatura causada pela fermentação aeróbica, causam a morte do embrião e
acidificação no tecido armazenado. Com a morte do embrião, é perdida a permeabilidade seletiva
de membranas, possibilitando o contato entre enzimas e substratos (LOPEZ, 1986). Estas reações
e transformações afetam significativamente a qualidade do produto final, principalmente os
aspectos que envolvem a formação de sabor (SCHWAN, 1996).
Depois de fermentadas, as amêndoas são secas e torradas a 7% de umidade, o que
estabiliza o sabor e produz o aroma e a cor característicos do chocolate, pois muitas das reações
bioquímicas iniciadas na fermentação continuam na secagem como as reações de oxidação
que proporcionam redução da acidez das amêndoas, além do escurecimento dos cotilédones
(ROHAN; STEWART, 1967; LOPEZ; QUESNEL, 1973; BECKETT, 1994), redução do teor de
compostos fenólicos que são responsáveis pelo amargor e adstringência (FELLOWS, 2006;
DOMINGUES, 2010) e remoção de compostos indesejáveis formados durante a fermentação,
como por exemplo, o ácido acético. Segundo Beckett (2009) o desenvolvimento dos precursores
do flavour do cacau ocorre nos cotilédones durante fermentação e secagem. Existem dois tipos
16
importantes de células dentro os cotilédones: células de armazenamento contendo gorduras e
proteínas, e as células de pigmento contendo compostos polifenólicos e metilxantinas
(teobromina e cafeína).
Um problema recorrente na indústria de chocolate é a baixa qualidade das amêndoas de
cacau, considerando que o processo de fermentação e secagem é feito ainda nas fazendas, sem
qualquer controle de processo, uma porcentagem significativa das sementes não sofre as
alterações necessárias (principalmente a acidificação do pH e aumento da temperatura) para
que as reações enzimáticas se processem de forma satisfatória. Uma das possibilidades de
solucionar este problema é o acompanhamento e intervenção, principalmente no processo de
fermentação, objetivando caracterizar os compostos, enzimas e melhores condições de processo
para melhor uniformizar e aumentar a qualidade das amêndoas de cacau produzidas
(AQUARONE et. al., 2001).
É sabido que reações que levam à formação de precursores de sabor do chocolate são
levadas a cabo por enzimas endógenas da semente do cacau e que na fermentação a principal
consequência é o abaixamento do pH, favorecendo a ação destas enzimas. Ao contrário de
muitas outras matérias- primas fermentadas, enzimas endógenas desempenham um papel crucial
no desenvolvimento do flavour do cacau (LEHRIAN; PATTERSON, 1983). A atividade
enzimática, em amêndoas de cacau, durante a fermentação, é conhecida e estudada pelo menos
desde a segunda metade do século XX. A confiabilidade e comparação das atividades das
enzimas do cacau são complicadas, devido a variações causadas por diferentes genótipos, a
origem geográfica, métodos de fermentação utilizados e tipos de cochos empregados. Embora o
papel essencial de enzimas endógenas durante a fermentação do cacau tenha sido evidenciado há
muitos anos, existe ainda a falta de estudos sistemáticos abordando o comportamento entre
diferentes cultivares de cacau (HANSEN et al., 1998). Além disso, não está ainda elucidado
como os processos enzimáticos são regulados durante a fermentação, quais substratos
enzimáticos/produtos estão relacionados com o sabor de amêndoas com qualidade superior e
quais os fatores limitantes para esses processos (disponibilidade de substrato e/ou enzima,
genótipo, condições de cultivo ou processo de fermentação).
Neste contexto, estudos regionais possibilitam o monitoramento dos parâmetros existentes
nos processos de fermentação, para se estabelecer a dinâmica das principais enzimas em
diferentes cultivares de cacau, com o objetivo de dimensionar as reais condições do processo e/ou
17
planejar intervenções tecnológicas que contribuam na melhoria da qualidade da matéria-prima
para a produção de chocolates monovarietais.
18
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
Caracterizar as atividades enzimáticas em dois cultivares de cacau produzidos na região Sul da
Bahia, relacionando-as com as condições do processo fermentativo, fornecendo subsídios para
futuras intervenções tecnológicas que possam contribuir para melhoria da qualidade da matériaprima na produção de chocolates monovarietais.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Monitorar o processo de fermentação dos cultivares de cacau PH16 e TSH-1188, através da
medida do pH e temperatura;
Caracterizar as enzimas Polifenoloxidase e Invertase, presentes na polpa e sementes dos dois
cultivares, antes do início da fermentação (tempo zero);
Determinar as condições ótimas de atividade das enzimas caracterizadas;
Correlacionar os parâmetros de fermentação, temperatura e pH, com a atividade das enzimas.
19
CAPÍTULO I
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1. CACAU
1.1 Características gerais
O cacaueiro é uma planta da família Malvaceae, gênero Theobroma, espécie Theobroma
cacao L. originada na Bacia Amazônica e cultivada nas regiões tropicais do mundo. O interesse
de cultivo desta espécie está no aproveitamento de suas sementes para produção de derivados de
cacau (ALVES, 2002). No início do século XVII, o cacau foi citado pela primeira vez na
literatura botânica, por Charles de L’Écluse que o descreveu com o nome de Cacao fructus,
porém, em 1737 foi classificado por Linneu como Theobroma fructus, para em 1753 ser
modificado para Theobroma cacao L., denominação que permanece atualmente. É uma planta
típica dos trópicos úmidos, e é cultivado em regiões onde o clima apresenta variações
relativamente pequenas durante o ano, especialmente em termos de temperatura, radiação solar e
comprimento do dia (SILVA NETO et al., 2001).
Foi introduzido na região Sul da Bahia em 1746, às margens do Rio Pardo na Fazenda
Cubículo, hoje município de Canavieiras, por sementes vindas do Pará. A partir daí a
cultura se expandiu nessa região, onde as condições climáticas e a riqueza dos recursos naturais
contribuíram bastante para torná-la a principal produtora de cacau do país (GRAMACHO et al.,
1992; SANCHES, 2006). O interesse de cultivo desta espécie está no aproveitamento de suas
sementes (amêndoas) para produção de cacau, de gordura e de chocolate (ALVES, 2002).
O fruto tem forma oval com 15 a 20 cm de comprimento do eixo maior, e cor amarela
quando maduro. O cotilédone e um pequeno gérmen de planta embrionária são recobertos por
uma película denominada testa, e a semente é revestida por uma polpa branca com tons rosados,
mucilaginosa e adocicada, representados na Figura 01-A (BECKETT, 1994; MARTINI, 2004;
BATALHA, 2009). A polpa é constituída por um parênquima de células esponjosas
mucilaginosas contendo água, frutose, glucose, sacarose, pentosanas, ácido cítrico, proteínas e
vários sais inorgânicos. A testa secreta a mucilagem e atua como via de transporte entre os
cotilédones e a polpa mucilaginosa. O cotilédone apresenta células contendo reservas protéicas,
20
lípides, amido e células polifenólicas. As sementes, Figura 01-B, apresentam um grande e único
vacúolo preenchido por polifenóis sendo responsáveis pela cor dos cotilédones (MARTINI,
2004). Este vacúolo é lisado durante a fermentação (URBANSKI, 1992).
Figura 01. (A) Corte longitudinal de um fruto de cacau - 1: Placenta; 2: Polpa Mucilaginosa; 3: Casca;
(B) Corte longitudinal de uma semente de cacau - 4: Testa; 5: Cotilédone; 6: Gérmen ou embrião.
A.
B.
4
1
2
5
6
3
Fonte: Fazenda Lajedo do Ouro. Autoria Própria.
O cacau é classificado sob três variedades: Criollo, Forastero e Trinitario (Figura 02). O
Criollo, originado do lado ocidental dos Andes e o grupo Forastero do lado oriental. O terceiro
grupo, Trinitario, é oriundo de um cruzamento (hibridização) entre os dois primeiros,
considerado como uma primeira tentativa de melhoramento genético (GRAMACHO et al., 1992;
SANCHES, 2006) e de alta qualidade (BATALHA, 2009). As variedades Trinitario e Criollo
produzem um chocolate considerado de qualidade excelente pelo suave aroma e sabor
(BECKETT, 2009), em contra partida o grupo Forastero responde por 80% da produção
mundial, sendo este predominante nas plantações da Bahia, Amazônia, e nos países produtores
da África (LEMUS et al, 2002; MARITA et al, 2001).
21
Figura 02. Variedades de cacau: (A) Criollo; (B) Forastero; (C) Trinitário.
A.
B.
C.
Fonte: FERREURA et al., (2013).
Todos os tipos têm ampla variabilidade, sendo reconhecidos pelo conjunto geral de
características. Há, no entanto, algumas distinções mais claras: os Criollos possuem sementes
brancas ou de coloração rósea clara e frutos com casca vermelha ou verde, quando
imaturos; Forasteros possuem sementes intensamente pigmentadas e frutos verdes, quando
novos; e Trinitários são 43 identificados pela associação de caracteres de ambos os tipos
anteriores, com coloração de frutos e sementes variáveis (PIRES, 2003).
O cacau é uma matéria-prima com grande valor nutricional e sua composição (Tabela 01)
varia com a época da colheita, tamanho do fruto, grau de maturação, clima, tipo de solo e
manipulação pós-colheita (ZOUMAS et al., 1980). Esta matéria-prima é ingrediente base para
formulação de chocolates, achocolatados, biscoitos entre outros (ISAE, 2003).
Tabela 01: Composição de sementes de cacau (Forastero) do Oeste Africano.
Constituintes
Peso Seco (%)
Cotilédones
89,60
Testa
9,63
Embrião
0,77
Lipídios
53,05
22
Umidade
3,65
Cinzas
2,63
Nitrogênio
Nitrogênio Total
2,28
Nitrogênio proteico
1,50
Teobromina
1,71
Cafeína
0,085
Carboidratos
Glicose
0,30
Sacarose
1,58
Amido
6,10
Pectina
2,25
Fibras
2,09
Pentosans
1,27
Polifenóis
7,54
Ácidos
Acético
0,014
Oxálico
0,29
Fonte: AFOAKWA, 2010.
1.2 Influência genética nas características do cacau
Um dos fatores determinantes na qualidade, sabor e intensidade do chocolate é o genótipo
do cacau (AFOAKWA, 2010).
Estudos relatados por American Cocoa Research Institute
(ACRI) em 1991 demostraram que alguns híbridos da Estação de Pesquisas de Cacau da Costa
Rica (CATIE) apresentavam características de aroma e sabor inferiores em relação a outros
materiais estudados (MATILIK, 1994).
Zamalloa (1994) citados por Efraim (2009) avaliaram as características químicas, físicoquímicas e sensoriais de genótipos dos tipos Forastero e Trinitário cultivados no Estado de São
Paulo, em condições climáticas distintas das quais o cacaueiro vem sendo cultivado no mundo em
larga escala. Tucci et al. (2002) e Efraim et al. (2006) avaliaram os mesmos genótipos,
respectivamente com relação a composição em ácidos graxos, triacilgliceróis e conteúdo de
23
gordura e os teores de compostos fenólicos. Todos os três estudos encontraram diferenças entre
os materiais em relação às características avaliadas.
Trabalhos conduzidos por Efraim (2009) comprovaram a diferença do comportamento dos
cultivares de cacau ao serem monitorados os parâmetros de temperatura e pH durante a
fermentação, da mesma forma que foi encontrada diferenças nos liquors, manteiga e chocolate.
Uma das principais dificuldades em avaliar comparativamente as diferenças entre variedades de
cacau encontra-se na escassez de trabalhos que tenham utilizado materiais distintos submetidos
aos mesmos protocolos de fermentação, secagem e torração. Ainda que se tenha dados de alguns
trabalhos conduzidos com genótipos de cacaueiro e de sua influência nas características
sensoriais, físicas, físico-químicas, não há uma conclusão concreta e generalizada sobre a real
influência de genótipos no sabor do chocolate (BUCHELI et al., 2000).
24
2. PRODUÇÃO DE CACAU NO MUNDO
O cacau tem importância econômica no contexto internacional por ser um commodity de
participação relevante no comércio mundial de produtos agrícolas tanto em importações quanto
exportações (GUYTON, 2003). De acordo com o International Cocoa Organization (ICCO,
2011), os maiores produtores mundiais de cacau (Tabela 02) são a Costa do Marfim seguida por
Gana, Indonésia, Nigéria, Camarões, Brasil, Equador e Papua Nova Guiné. A estimativa de
produção mundial para o período 2012/2013 foi de 4.003 milhões de toneladas (ICCO, 2013).
No Brasil, a produção tem grande destaque na região Nordeste, principalmente na Bahia.
O Sudeste da Bahia, onde se concentra a produção de cacau no estado, foi o responsável, no ano
de 2004, por cerca de 80% da produção nacional. Os principais municípios produtores de cacau
da região são Itabuna e Ilhéus (CEPLAC, 2005).
Tabela 02: Maiores produtores mundiais de cacau.
Países
Produção de Cacau t/ ano
Costa do Marfim
1.511.000
Gana
1.025.000
Indonésia
440.000
Nigéria
250.000
Camarões
229.000
Brasil
200.000
Papua Nova Guiné
47.000
Fonte: Annual Report 2010/2011 (ICCO, 2011).
A cacauicultura foi tida por muito tempo como um dos principais fatores do
desenvolvimento econômico do Estado da Bahia e de bastante importância na produção agrícola
da região Amazônica (PINTO; PIRES, 1998), envolvendo investimentos em torno de R$ 2,5
bilhões, e aproximadamente
300.000
empregos
diretos
(FÓRUM
NACIONAL DA
AGRICULTURA, 1997). A partir de 1989, esse monocultivo passa a ser fortemente
comprometido pela queda dos preços, descapitalização e endividamento dos produtores, já antes
25
desestimulados pelas políticas governamentais desfavoráveis, baixa competitividade do setor,
exploração de plantações já antigas e em decadência, manejo inadequado da lavoura, estresse
hídrico por mais de seis anos consecutivos na região (GRAMACHO et al., 1992; COUTO, 2000;
SANCHES, 2006) e a ocorrência, em 1989, do fungo causador da “vassoura-de-bruxa” do
cacaueiro – Moniliophthora perniciosa (AIME; PHILLIPS-MORA, 2005; SANCHES, 2006).
Essa enfermidade causou danos na região, grandes o suficiente para quase dizimar a
cacauicultura na região a ponto de sair de uma produção de 400.000 t/ano para menos de 150.000
t/ano (DIAS, 2001).
Entre os esforços concentrados no controle da vassoura-de-bruxa no Brasil, destacam-se
as pesquisas sobre novos cultivares de cacau resistentes, produtivos e que originam matériasprimas de qualidade industrial, além de estudos genéticos e de agentes químicos ou biológicos
capazes de controlar a doença. Uma das formas mais eficientes encontradas para a recuperação da
lavoura cacaueira baiana tem sido a seleção e utilização de clones de cacau provenientes de
materiais resistentes à doença, trabalho que tem sido realizado com o apoio de instituições de
pesquisa, como o Centro de Pesquisa do Cacau – CEPEC, da Comissão Executiva do Plano da
lavoura cacaueira – CEPLAC, e dos próprios cacauicultores com orientação técnica do CEPEC.
Com isso, a produção de cacau começou a se recuperar e o Brasil, de um pico de baixa em
1999/2000, de 196 mil toneladas, apresentou elevação da produção para 221 mil toneladas em
2006/2007, de acordo com as estimativas da FAO (FAO, 2008).
26
3. PRÉ-PROCESSAMENTO DO CACAU
3.1 Colheita e quebra dos frutos
O desenvolvimento do fruto, desde a fecundação até a maturação, demanda o tempo de
cerca de seis meses. Na prática, a maturidade do fruto é reconhecida geralmente pela mudança da
cor do mesmo. Por ocasião da colheita, é essencial colher apenas frutos maduros, pois somente
estes possuem açúcar e outros substratos em quantidade adequada para uma boa fermentação
(LOPES, 2000; CRUZ, 2002).
Inicialmente o fruto é colhido com podões, e a seguir os frutos são amontoados no chão
da plantação de cacau (Figura 03- A) para serem abertos com o auxílio de facões. Um fator que
deve ser levado em consideração é não causar nenhum corte nos frutos, pois desta forma dará
inicio ao processo fermentativo antes mesmo de serem colocados nos cochos, comprometendo a
qualidade das amêndoas de cacau. O intervalo de tempo para se realizar a quebra dos frutos deve
considerar um intervalo de 2 a 3 dias em relação à colheita, pois a separação das sementes da
casca é facilitada, caso esse tempo seja estendido acaba por comprometer a qualidade das
sementes ocasionando germinação no interior dos frutos, alterando todo o mecanismo do sabor e
aroma do chocolate (SERRA, 2004). A casca é então separada (Figura 03-B) e o material interno
constituído de amêndoas e polpa (25%do fruto) é levado à fermentação (OETTERER, 2006).
Figura 03. (A) Frutos amontoados na plantação de cacau; (B) Quebra dos frutos.
A.
Fonte: Fazenda Lajedo do Ouro. Autoria Própria.
B.
27
3.2 Fermentação
Na fermentação o cacau pode ser empilhado aos montões ou em caixas. No sistema de
montões, método mais primitivo, são utilizados de 10 kg a 2 t, sendo essa massa revolvida com
varas de bambu, de tempos em tempos. No sistema de caixas de madeira ou cochos (Figura 04 –
A), o fundo e aas laterais das caixas possuem furos e os lotes são de 200 kg a 1,5 t, com cerca de
1 m de altura. A massa de cacau é transferida (revolvimento) de uma caixa para outra com auxílio
de pás de madeira (Figura 04 – B). Durante o processo de fermentação, a massa é coberta com
sacos de juta ou folhas de bananeira para reduzir as perdas de calor e evitar o ressecamento
excessivo da camada superficial (OETTERER, 2006; PONTILLON, 2009).
O processo de fermentação das sementes é essencial ao processamento, pois é responsável
pelo desenvolvimento dos precursores e inúmeros compostos de sabor (SCHWAN, 1998). No
processo de fermentação, o tipo de sistema, a temperatura do ambiente e da massa, o pH e a
acidez da polpa e do cotilédone, o tempo de processo, o revolvimento da massa bem como a
microflora presente são fatores de grande importância (ROHAM e CONNEL, 1964; LOPEZ;
QUESNEL, 1973).
Figura 04. (A) Cocho de madeira e massa de cacau coberta com folha de bananeira; (B) Revolvimento da
massa de cacau.
A.
B.
Fonte: Fazenda Lajedo do Ouro. Autoria Própria.
28
É uma etapa indispensável para a obtenção de amêndoas de boa qualidade, devido a
complexas reações bioquímicas que provocam a morte do embrião, hidrólise de açúcares e
proteínas, liberação de enzimas e substratos, difusão de compostos fenólicos que entram em
contato com as enzimas (FORSYTH; QUESNEL, 1958; BECKETT, 1994; BRITO, 2000). A
fermentação é essencial para reduzir a acidez, adstringência e amargor nas sementes, formação de
açúcares redutores e aminoácidos, que são os precursores da reação de Maillard durante a
torrefação (HUANG; BARRINGER, 2010).
O tempo requerido para a fermentação das sementes é variável, segundo o material
genético. Para a ocorrência das principais reações que levam à formação dos principais
precursores de sabor do chocolate, as sementes de cacau, devem ser, geralmente, fermentadas por
períodos superiores a cinco dias (BECKETT, 1994). A polpa do cacau é um excelente meio para
o crescimento de microrganismos contendo 10-15% de açúcares. A atividade microbiana provoca
aumento da temperatura da massa, que contribui para o término do poder germinativo da
semente. Têm-se então condições propícias às reações bioquímicas, que culminam com a síntese
dos precursores de sabor e aroma (EFRAIN, 2004). A polpa, em cacaus sadios, é isenta de
microrganismos, contaminando-se imediatamente durante a quebra dos frutos pelas mãos dos
operadores e depois pela exposição ao ambiente. Quando as sementes são removidas dos frutos,
ocorre uma inoculação natural de microrganismos do ambiente para a polpa (BECKETT, 2009).
Segundo Schwan e Wheals (2004) o processo de fermentação pode ser dividido em três fases:
9 Fase 1: Ação das leveduras anaeróbicas: Nas primeiras 24-36 h, as leveduras transformam o
açúcar em álcool sob condições anaeróbicas em um pH abaixo de 4,0. A morte da semente
geralmente ocorre no segundo dia, causada pela presença de ácido acético e álcool. É a partir
deste momento que as sementes podem ser chamadas de amêndoas de cacau. Normalmente a
partir do segundo dia até o final do processo, se faz o revolvimento da massa para que a
temperatura não passe de 45°C e favoreça a ação das enzimas. Os revolvimentos podem
acontecer de um cocho para o outro ou de um local para o outro, quando o processo for efetuado
em montes, e tem por finalidade uniformizar a temperatura e oxigenar a massa (OETERRER,
2006).
9 Fase 2: Ação das bactérias láticas: Estas estão presentes desde o início do fermentação, mas só
se tornam dominantes entre 48 e 96 h. Bactérias láticas convertem açúcares e alguns ácidos
orgânicos em ácido lático. Por volta do terceiro dia, a massa das amêndoas tem sua temperatura
29
elevada entre 45 e 50° C. Nessa fase, há uma difusão dos conteúdos celulares, iniciando-se uma
série de reações relacionadas com as alterações de sabor, aroma e cor da semente.
9 Fase 3: Ação das bactérias acéticas: responsáveis pela conversão do álcool em ácido acético
com o auxílio das bactérias acéticas que tornam o tegumento permeável, fazendo com que as
amêndoas sofram a ação das enzimas. Ressalta-se a oxidação dos polifenóis que formam ou não
complexos com as proteínas e peptídeos levando a redução da adstringência e do amargor.
Segundo Beckett (2009) o desenvolvimento dos precursores do sabor do cacau ocorre nos
cotilédones durante fermentação e secagem. Existem dois tipos importantes de células dentro dos
cotilédones: células de armazenamento contendo gorduras e proteínas, e as células de pigmento
contendo compostos polifenólicos e metilxantinas (teobromina e cafeína). A Figura 02 ilustra as
reações que ocorrem em sementes de cacau durante sua fermentação.
Figura 05. Mudanças químicas e bioquímicas dentro da semente do cacau durante a fermentação.
Fonte: LOPEZ, 1986, citado por BECKETT, 2009.
A fermentação completa das sementes é diretamente proporcional à qualidade do
chocolate. O aroma e sabor característicos são obtidos pela formação dos precursores do flavour,
30
pois as sementes não fermentadas geralmente são amargas e adstringentes, e as parcialmente
fermentadas são amargas (KATTENBERG e KEMMINK, 1993; CALIGIANI et al., 2007). O
escurecimento não enzimático é proveniente da acumulação de compostos insolúveis como
polifenóis, 60% desses compostos são flavanóis (BRITO, 2000).
Na fermentação completa do cacau a secreção de algumas enzimas por microrganismos é
muito útil como a produção de enzimas pectinolíticas que, em contato com o substrato, podem
melhorar a aeração da massa; enzimas amilolíticas, que produzem o aumento da concentração de
açúcares redutores pela hidrólise do amido e as enzimas proteolíticas que geram a melhor
concentração de aminoácidos livres. Todas estas enzimas são requeridas para a formação do
flavour do cacau (AMIN et al., 1998; SCHWAN, 1998).
3.3 Secagem
A secagem deve ser iniciada imediatamente após a fermentação. Não deve ser lenta ou
mal conduzida para que não possibilite o desenvolvimento de fungos que, quando presentes,
conferem sabor desagradável ao produto final. Por outro lado, a secagem não deve ser efetuada
de forma demasiadamente rápida através do emprego de temperaturas elevadas, para evitar
problemas com a gordura (manteiga de cacau) e com o desenvolvimento do sabor do chocolate
(EFRAIN, 2004).
O método mais utilizado no Brasil é a secagem feita em barcaças (Figura 06). Que são
construções típicas constituídas por um lastro de madeira erguido sobre pilares de alvenaria, e
uma cobertura que desliza sobre trilhos. A cobertura, geralmente feita de chapas de alumínio
corrugado ou de zinco, é afastada para expor as amêndoas ao sol e, quando fechada, protege
contra chuva, sereno e calor excessivo. As amêndoas são espalhadas sobre o lastro da barcaça em
uma camada uniforme com cerca de 5 cm de espessura. O revolvimento constante é feito com um
rodo de madeira, principalmente no início da secagem, a fim de evitar aglomerados. O processo
mais utilizado é a secagem ao sol complementada com aquecimento artificial, via estufas
aquecidas por combustão de lenha ou gás liquefeito e/ou energia solar (OETTERER, 2006).
Além da eliminação da água, a secagem do cacau possibilita a continuidade das mudanças
bioquímicas, iniciadas na fermentação, que vão contribuir para o sabor e aroma característico do
chocolate. A secagem é também responsável pela redução da acidez das amêndoas e deve ser
31
conduzida de tal maneira a se obter um teor de umidade em torno de 7%. Secagem excessiva
torna a casca quebradiça, enquanto que excesso de umidade favorece o desenvolvimento de
fungos (LOPES, 2000).
Figura 06. Secagem natural ao sol em barcaça.
Fonte: Fazenda Lajedo do Ouro. Autoria Própria.
3.4 Armazenamento
Além da importância das etapas de fermentação e secagem à qualidade dos produtos
obtidos, as condições de estocagem das amêndoas devem ser observadas, evitando-se o
armazenamento de grandes volumes em ambientes com elevada umidade e pouca circulação de
ar, umas vez que as amêndoas de cacau são higroscópicas e seu ganho de umidade pode levar ao
desenvolvimento de fungos e outros microrganismos indesejáveis (BECKETT, 1994).
Esta etapa assume importância devido ao longo tempo em que o cacau pode permanecer
armazenado. Começa na fazenda produtora em sacos de aniagem de 60 kg por cerca de 30 dias,
fica nas cooperativas vários meses e nos armazéns dos portos por cerca de 15 dias. A amêndoa
armazenada deve ter 7% de umidade e estar em equilíbrio com a umidade relativa do ar (70%)
(OETERRER, 2006). Segundo Serra (2004) as instalações destinadas ao
armazenamento de cacau devem possuir luminosidade e aeração adequadas.
32
4. ENZIMAS
As enzimas são proteínas com ação catalítica que aceleram as reações bioquímicas, sendo
de extrema importância para o controle dos processos (TORTORA et al., 2005). Fatibello-Filho
e Vieira (2002) destacam que a ação enzimática pode ser alterada de acordo com o pH,
temperatura, concentração do substrato e pela presença de inibidores. O local onde os substratos
se ligam para que as reações se processem, é chamado de sítio ativo, constituído pela interação de
alguns resíduos de aminoácidos da cadeia proteica, sendo o
responsável
pela
atividade
biológica da enzima, ou seja, no sítio ativo ocorre a reação catalítica. Essencialmente as
enzimas
apresentam três propriedades principais: estabilidade,
atividade e
especificidade
(BAILEY; OLLIS, 1986; BLANCH; CLARK, 1997; GALVÃO, 2004):
x Estabilidade: a capacidade de uma enzima depende de sua estrutura nativa, a qual é
mantida por meio de forças de interação (pontes de hidrogênio e ligações de sulfeto, forças de
Van der Waals, interações apolares e iônicas). Alterações no ambiente reacional podem debilitar
essas interações, alterando a estrutura tridimensional nativa e ocasionando perda parcial ou total
da sua funcionalidade biológica. Assim a estabilidade pode ser afetada por variação de
temperatura, pH e presença de solventes polares.
x Atividade: esta propriedade de uma enzima atua na diminuição da energia de ativação
requerida para transformar um substrato em produto, aumentando a velocidade de reação. A
capacidade catalítica da enzima reside no seu sítio ativo e este compreende um número pequeno
de aminoácidos. O sítio ativo é uma estrutura complexa cuja configuração permite alojar a
molécula de substrato na posição correta para que os grupos funcionais da enzima efetuem sua
transformação química.
x Especificidade: a especificidade define a afinidade de uma enzima por grupos específicos
em um determinado substrato. Esta é uma propriedade imprescindível das enzimas enquanto
catalisadores. Duas características estruturais são determinantes na especificidade da enzima: O
substrato possui ligações químicas que podem ser atacadas pelos grupos funcionais do sítio ativo
da enzima e o substrato possui grupos funcionais que se unem à enzima, permitindo seu correto
alinhamento no sítio ativo para que a reação possa ocorrer.
33
4.1 Atividade enzimática no cacau
A atividade enzimática, em amêndoas de cacau, durante a fermentação, é conhecida e
estudada pelo menos desde a segunda metade do século XX. A confiabilidade e comparação das
atividades das enzimas do cacau são complicadas, devido a variações causadas por diferentes
genótipos, a origem geográfica, métodos de fermentação utilizados e tipos de cochos empregados
(HANSEN et al., 1998).
O desenvolvimento dos precursores do aroma do cacau envolve a ação de vários
microrganismos presentes na polpa e a ação de enzimas sobre os carboidratos, proteínas e
polifenóis. Ao contrário de muitas outras matérias- primas fermentadas, enzimas endógenas
desempenham um papel crucial no desenvolvimento do sabor do cacau (LEHRIAN e
PATTERSON, 1983). Embora a ação das enzimas endógenas durante a fermentação do cacau
tenha sido evidenciado há muitos anos, existe ainda a falta de estudos sistemáticos abordando o
comportamento entre diferentes cultivares de cacau (HANSEN et al., 1998).
A Tabela 03 relaciona as principais enzimas que catalisam reações que ocorrem durante a
fermentação das sementes de cacau, seu principal substrato e suas condições ideais de atuação.
Essas enzimas possuem importância capital na formação de flavour de chocolate das amêndoas
de cacau (HANSEN et al., 1998; LOPEZ; DIMICK, 1991).
Tabela 03. Principais enzimas ativas durante a fermentação de sementes de cacau.
Enzima
Invertases
Localização
Substrato
Produto
pH
T (ºC)
Semente e
Sacarose
Glicose e
4,0 -
37
frutose
5,25
testa
Glicosidases
Semente e
Glicosídeos, 3- β-
β-galactosidase
cotilédone
galactosidilcianidina
Cianidina e
3,8-
e 3-α-
açúcares
4,5
Peptídeos e
4,7
55
6,0
31,5-
45
arabinosidilcianidina
Proteinases
Semente e
Proteínas
cotilédone
Polifenoloxidase
Semente e
aminoácidos
Polifenóis (epicatequina)
cotilédone
Fonte: LOPEZ, 1986, citado por BECKETT, 1988.
O-quinona e
O-diquinona
34,5
34
As enzimas exibem diferentes estabilidades durante o processo de fermentação,
principalmente no que se refere à inativação. Esta é causada pelo calor gerado durante o processo,
pela formação de ácidos e presença de polifenóis, portanto o período real da acessibilidade e
atuação das enzimas aos substratos, é curto. As proteases, aminopeptidases, invertases e
polifenoloxidases são fortemente inativadas durante a fermentação. Já as carboxipeptidases, são
parcialmente inativadas, enquanto que as endoproteases e glicosidases permanecem ativas
durante todo o processo. O período real da acessibilidade das enzimas aos substratos, e o período
de atuação é curto (HANSEN et al., 2000).
4.1.1 Polifenoloxidases
A Polifenoloxidase (PPO) é enzima pertencente ao grupo das oxirredutases e é
amplamente distribuída na natureza, sendo responsáveis pela oxidação de compostos fenólicos, as
quais, na presença de oxigênio, os transformam em quinonas coloridas que participam,
posteriormente, das reações de polimerização para dar origem às melonoidinas, caracterizadas
pelo aparecimento da coloração marrom-escura (ROELOFSEN, 1958; VÁMOS -VIGYÁZÓ,
1981; WONG, et al., 1990).
A atividade das enzimas oxidativas é desencadeada quando a integridade da célula é
rompida. Nesta ocasião, os substratos fenólicos, de localização vacuolar, entram em contato com
as enzimas catalisadoras das reações de oxidação de polifenóis. O processo oxidativo ocorre
quando os substratos fenólicos, as enzimas, o íon metálico e o oxigênio se encontram em
condições ideais de pH, temperatura e atividade de água (VITTI, 2007). Mazzafera et al.
(2002), explicam que a oxidação de fenóis se dá em função da captura de elétrons por dois
átomos de cobre que se encontram no sítio ativo da enzima, havendo o consumo de
oxigênio durante o processo.
A PPO contém cobre no centro ativo e catalisa dois tipos de reações, ambas envolvendo
oxigênio. A primeira reação corresponde à hidroxilação de monofenóis formando orto-difenóis e
a segunda à oxidação de orto-difenóis formando orto-quinonas. Os fenóis possuem, pelo menos,
um anel benzênico, com um ou mais grupos hidroxila, livres ou substituídos. Algumas formas de
fenóis podem ser convertidas em derivados com radicais de oxigênio, extremamente reativos. As
polifenoloxidases atuam sobre uma grande variedade de substratos: citase p-cresol, tirosina e
35
ácido p-cumárico como substratos monofenólicos, enquanto catecol, diidroxifenilalanina e ácido
clorogênico são substratos difenólicos (VAMOS-VIGYAZO, 1981; CAMPOS et al., 2004).
A presença e a atividade da enzima PPO, durante a fermentação e a secagem das
amêndoas de cacau, são um dos fatores responsáveis pelo desenvolvimento dos precursores do
sabor, começando na fase oxidativa da fermentação e continuando na secagem (ROELOFSEN,
1958; VÁMOS-VIGYÁZÓ, 1981; WONG, et al., 1990). O papel da PPO e sua importância na
produção do sabor característico de chocolate não estão bem compreendidos. Contudo, uma baixa
atividade da enzima ou condições que podem levar a uma redução da atividade têm sido apontada
como fatores responsáveis por uma queda na produção de precursores de sabor de chocolate. A
importância desta enzima é frequentemente mencionada de forma implícita na redução do sabor
adstringente do cacau (REEVES et al., 1988).
4.1.2 Invertases
A enzima invertase também chamada de β-frutofuranosidase, não só catalisa a hidrólise
de sacarose a glicose e frutose, mas em algumas condições também é capaz de catalisar a
transfrutosilação para produzir frutooligossacarídeos (FOS) (RUBIO; RUNCO; NAVARRO,
2002). Na fermentação do cacau são responsáveis pela liberação de açúcares redutores
indispensáveis à formação do sabor durante a torrefação (HANSEN et al., 1998; LOPEZ;
DIMICK, 1991). As invertases são, usualmente, classificadas de acordo com seu pH e localização
celular. A invertase ácida com atividade máxima em pH 5,5, é predominante em tecidos em
crescimento (localizadas no vacúolo e/ou parede celular) e invertase neutra, com um máximo de
atividade em pH 7,0 e com predominância em tecidos completamente expandidos (HUSSAIN et
al., 2008).
Ashokkumar, Kayalvizhi & Gunasekaran (2001) afirmam que a invertase catalisa a
hidrólise da sacarose em quantidades equimolares de frutose e glicose, processo conhecido como
inversão. Invertase hidrolisa sacarose sob concentrações de sacarose mais baixas que 10%
(peso/vol.) (RUBIO; RUNCO; NAVARRO, 2002).
O mecanismo de ação da invertase não é totalmente conhecido, mas estudos sugerem que
há um envolvimento de um ânion carboxilato e uma histidina residual na atividade catalítica
desta enzima (MARQUEZ, 2007). A sacarose resultante da fotoassimilação do CO2 é a principal
36
forma de açúcar translocada nas plantas. O metabolismo da sacarose está estreitamente ligado
com a atividade das enzimas sacarose sintetase, sacarose fosfato sintetase, fosfatase e invertases.
A atividade da invertase pode ser medida seguindo-se vários caminhos: polarimetricamente,
seguindo-se as mudanças na rotação ótica; determinação da presença de açúcares redutores; ou
estimando-se a concentração de glicose resultante da hidrólise pelo uso de glicose oxidase.
37
5. FORMAÇÃO DO FLAVOUR DO CHOCOLATE
O mais notável atributo do chocolate é o seu sabor único. A combinação e o equilíbrio dos
numerosos compostos que contribuem para o flavour final dependem de diversos fatores dentre
os quais estão genética, condições ambientais, condições de colheita e de processamento. Essa
complexidade é evidente quando se considera que, ainda hoje este flavour tão desejável não
foi reproduzido pela indústria química (REINECCIUS, 2006).
Durante as etapas de beneficiamento do cacau são gerados os precursores do sabor
característico dos produtos de cacau, como também compostos que não mais sofrerão
modificações e que contribuirão para esse sabor. No entanto, concomitantemente, nas etapas de
fermentação e secagem, ocorrem as maiores perdas de compostos fenólicos presentes
naturalmente e em elevadas quantidades nas sementes do cacau. Os compostos fenólicos no
cacau, são componentes importantes do sabor, responsáveis principalmente pelo amargor e
adstringência. Segundo alguns autores, os produtos da reação de substâncias fenólicas estão entre
os componentes mais importantes do sabor do cacau, e os produtos da condensação de compostos
fenólicos gerados durante a fermentação e secagem são responsáveis pela cor marrom do cacau e
do chocolate (ELWERS et al, 2009).
Os principais fenólicos encontrados nas sementes de cacau estão dentro das classes dos
taninos e dos flavonoides. Os flavonoides presentes incluem flavanóis, flavonóis, antocianinas,
flavonas e flavanonas. Entre estes, os flavanóis são os mais abundantes, sendo a (+)-catequina e a
(–)-epicatequina os principais representantes. A (–)-epicatequina tem sido reportada como o
principal flavanol monomérico do cacau, representando aproximadamente 35% do conteúdo total
dos fenólicos (WOLLGAST; ANKLAM, 2000). Estes compostos são armazenados em células
de pigmentos dos cotilédones, também chamadas células de armazenamento de polifenóis, e a
quantidade de antocianinas nessas células de pigmentos dão aos grãos coloração que variam de
branco a vinho. Quando os grãos de cacau passam pelos processos de fermentação e secagem,
que são passos críticos no processamento do cacau, as membranas das células de pigmento se
rompem e o seu conteúdo é exposto a outros componentes no grão. Com isso, os polifenóis
passam por uma série de reações, como a difusão da epicatequina pela membrana da célula de
armazenamento, ficando exposta a reações de oxidação e polimerização, formando taninos
complexos (RUSCONI, CONTI, 2010).
38
Os polifenóis do cacau têm sido estudados há várias décadas devido à influência negativa
que exercem no sabor, conferindo o amargor e a adstringência verificados em produtos com
elevados teores desses compostos (ROAHN e CONNEL, 1964; CROSS et al., 1982;
VILLENEUVE et al., 1985; BRITO, 2000; SOARES, 2001). Em contra partida, descobertas mais
recentes sobre os efeitos benéficos desses compostos à saúde humana têm provocado interesse
em mantê-los durante o processamento dos produtos obtidos do cacau, sem prejuízo do sabor
(KEALEY et al., 1998; KEALEY et al., 2004; EFRAIM, 2004; RIZO, 2006).
Uma das mais importantes e complexas reações que envolvem a formação do flavour é a
reação de Maillard, devido presença de aminoácidos livres e açúcares redutores formados durante
a etapa de fermentação do cacau. A reação de Maillard é uma reação entre carbonilas e aminas.
Geralmente, as carbonilas em alimentos são açúcares redutores, enquanto aminas podem vir de
aminoácidos ou proteínas (PORTE et al., 2007). Para que as amêndoas de cacau possam originar
o sabor e o aroma característico de um chocolate de excelente qualidade é imprescindível que
sejam fermentadas, secas e torradas num processo de complexas reações enzimáticas e
químicas como a hidrólise de açúcares e proteínas, liberação de enzimas, difusão de
compostos fenólicos e morte do embrião (FORSYTH; QUESNEL, 1957). Através destas
reações, todos os precursores de aroma do cacau interagem para produzir componentes de sabor,
como álcoois, éteres, furanos, tiazoles, piroles, ácidos, ésteres, aldeídos, iminas, aminas,
oxazolas, pirazinas e pirróis (MISNAWI et al, 2003).
39
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47
CAPÍTULO II
CARACTERIZAÇÃO DA POLIFENOLOXIDASE EM DOIS CULTIVARES DE CACAU
(Theobroma cacao L.) PRODUZIDOS NA REGIÃO SUL DA BAHIA, BRASIL.
RESUMO
Neste estudo a Polifenoloxidase foi caracterizada na polpa e semente de duas variedades de
cacau, PH 16 e TSH 1188, com o objetivo de mensurar sua atividade enzimática quanto a
concentração de substrato, pH e temperatura ótimos de reação correlacionando-a com as
condições do processo fermentativo. A atividade foi determinada por espectrofotometria através
da medida do aumento da absorbãncia a 420 nm. Os resultados demonstram a diferença e
especificidade existente entre os cultivares de cacau, e entre polpa e semente em cada cultivar.
Sugere-se que sejam utilizados critérios específicos para cada cultivar, tomando como base os
parâmetros ideais para prolongar o período de melhor atuação da enzima durante o processo
fermentativo, contribuindo assim para a melhoria na qualidade das amêndoas de cacau e por
consequência maior qualidade na produção de chocolate monovarietal.
Palavras-chave: cacau, parâmetros, atividade enzimática, chocolate.
ABSTRACT
The present study was designed to characterize the activity of polyphenol oxidase (PPO) in the
pulp and seeds of two cocoa varieties, PH 16 and TSH 1188. The PPO activity was determined as
a function of optimal substrate concentration, pH and temperature and was correlated with the
conditions during the fermentation process. PPO activity was determined spectrophotometrically
by measuring the increase in absorbance at 420 nm. The results showed the specificity and
differences between the two cocoa cultivars and between the pulp and seeds of each cultivar. It is
suggested that specific criteria are adopted for each cultivar, based on the optimal PPO
parameters, to prolong the period of maximum PPO activity during fermentation, contributing to
48
the improvement of the quality of cocoa nuts and consequently to higher quality in the production
of monovarietal chocolate.
Keywords: cocoa, parameters, enzyme activity, chocolate.
49
1. INTRODUÇÃO
Atualmente sabe-se que as reações que levam à formação de precursores de sabor do
chocolate são levadas a cabo por enzimas endógenas presentes na semente do cacau e que o
processo de fermentação tem como principal consequência o abaixamento do pH, favorecendo a
ação destas enzimas. Durante a fermentação, a polpa envoltória das sementes do cacau é
degradada pela ação sucessiva de microrganismos (leveduras e bactérias ácido-lácticas e ácidoacéticas) naturais do ambiente, com elevação da temperatura para cerca de 50ºC (CRUZ et al.,
2013).
A atividade enzimática em amêndoas de cacau durante a fermentação, é conhecida e
estudada pelo menos desde a segunda metade do século XX. De acordo com Hansen et al.,
(1998), atualmente acredita-se que as seguintes enzimas tenham importância capital na formação
do flavour do chocolate: a Polifenoloxidase, a Invertase e a Protease. A Polifenoloxidase (PPO) é
amplamente distribuída na natureza, e é responsável por catalisar reações de oxidação de
compostos fenólicos, na presença de oxigênio, cujos produtos se polimerizam, formando
compostos de cor escura (ROBINSON et al., 1991). Sua presença e atividade durante a
fermentação e a secagem das amêndoas de cacau, são fatores responsáveis pelo desenvolvimento
dos precursores do sabor, começando na fase oxidativa da fermentação e continuando na secagem
(LIMA et al., 2001). A importância da atividade desta enzima é também mencionada de forma
implícita na redução do sabor amargo e adstringente do cacau (REEVES et al., 1988).
A confiabilidade e comparação das atividades das enzimas do cacau são complicadas,
devido a variações causadas por diferentes genótipos, a origem geográfica, métodos de
fermentação utilizados e tipos de cochos empregados. Embora o papel essencial de enzimas
endógenas durante a fermentação tenha sido evidenciado há muitos anos, existe ainda a falta de
estudos sistemáticos abordando a comparação entre diferentes cultivares de cacau (HANSEN et
al., 1998). Além disso, ainda não está elucidado como os processos enzimáticos são regulados
durante a fermentação, quais substratos enzimáticos/produtos estão relacionados com o sabor de
amêndoas com qualidade superior e quais os fatores limitantes para esses processos
(disponibilidade de substrato e/ou enzima, genótipo, condições de cultivo ou processo de
fermentação).
50
Neste contexto, este estudo tem por objetivo caracterizar a atividade enzimática da PPO
em dois cultivres de cacau produzidos na região Sul da Bahia e relacioná-la com as condições do
processo fermentativo, fornecendo subsídios para futuras intervenções tecnológicas que possam
contribuir para melhoria da qualidade da matéria-prima na produção de chocolates monovarietais.
51
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Materiais
Foram estudados dois cultivares de cacau, PH 16 e TSH-1188, produzidos na Fazenda
Lajedo do Ouro (S 14° 06' 15.2" WO 39° 38' 45.8"), na cidade de Ibirataia, região sul do estado
da Bahia, Brasil. O material em estudo foi definido pelos produtores, segundo sua disponibilidade
no período de realização do experimento. O cultivar PH 16 (Híbrido Forastero - resultado do
cruzamento do Forastero do Alto Amazônico com o Trinitario) foi identificado em 1996 em uma
população de cacaueiros híbridos da Fazenda Porto Híbrido, no município de São José da Vitória
– BA. Já o cultivar TSH -1188 (Trinidad Selected Hybrids - híbrido trinitario), é originario de
Trinidad and Tobago, localizada próximo a costa oriental da Venezuela e apresenta resistência à
vassoura-de-bruxa e excelente produtividade.
2.2 Reagentes e padrões
Todos os reagentes e padrões utilizados neste estudo foram adiquiridos na Sigma Aldrich
Co.
2.3 Fermentação
A fermentação foi realizada em cochos de madeira (70 x 70 x 75 cm), com capacidade
para 400 kg de massa de cacau, apresentando cerda de 20 furos (1,27 cm cada um) na parte
inferior e nas laterais a fim de permitir o escoamento do mel do cacau produzido pela polpa
durante a feremntação. Este processo teve duração de sete dias, sendo que a cada 48 horas a
massa de cacau era revolvida tendo por finalidade oxigenar a massa e uniformizar a temperatura.
Para cobrir a massa de cacau, foram utilizadas folhas de bananeira.
2.4 Coleta das amostras
As amostras foram coletadas (aproximadamente 500 g) antes do início da fermentação
52
(tempo zero) e a cada 12 horas até o final do processo. Foram congeladas a -18º C para
interrupção enzimática. Durante a fermentação, foram realizadas medidas de temperatura (Digital
Thermometer MINIPA, modelo MT – 450) e pH (Medidor de pH portátil PHtek Digital) da
massa (AOAC, 2000).
2.5 Caracterização da PPO
A atividade da enzima foi determinada na polpa e semente dos dois cultivares de cacau
antes do início da fermentação (tempo zero), tendo como parâmetros a temperatura, o pH e o
substrato preferencial da enzima. Os resultados obtidos para temperatura e pH da enzima foram
confrontados com aqueles obtidos durante o processo de fermentação, visando indentificar a
etapa do processo onde as condições são mais favoráveis para a ação da PPO.
2.5.1 Extração da PPO da polpa
A extração foi realizada segundo o descrito por Lima et al., (2001), utilizando-se 100 g de
cacau. As polpas foram separadas das sementes manualmente e imersas em solução tampão
fosfato de potássio 0,02 M (pH 7,5), contendo 5 % de polietilenoglicol e 5 mM de ácido
ascórbico, o material foi então triturado com o auxílio de um triturador, na mesma solução
tampão, na proporção 1:2 (p/v) e homogeneizado durante 30 minutos a 4 °C. O homogeneizado
foi centrifugado a 11.000.g durante 15 minutos a 0 °C em Centrífuga Refrigerada HITACHI,
modelo CR22GIII. O sobrenadante (extrato) foi então estocado a -18 ºC para realização das
análises.
2.5.2 Extração da PPO das sementes
A extração também foi realizada segundo o descrito por Lima et al., (2001). As sementes
foram liofilizadas (Liofilizador Liotop, modelo L108) e posteriormente, desengorduradas,
utilizando-se éter de petróleo como solvente (YUSEP et al., 2002). As sementes secas e
desengorduradas foram suspensas em solução tampão fosfato de potássio 0,02 M (pH 7,5),
contendo 5 % de polietilenoglicol e 5 mM de ácido ascórbico, na proporção 1:10 (p/v) e
53
homogeneizadas em agitador magnético durante 30 minutos a 4 °C. A suspensão foi então
centrifugada a 11.000.g durante 15 minutos a 0 °C. O sobrenadante (extrato) foi estocado a -18
ºC para realização das análises.
2.5.3 Purificação da PPO dos extratos
A purificação foi realizada segundo o descrito por Erzengin (2009), onde foi adicionado
aos extratos sulfato de amônio [(NH4)2SO4], em quantidade suficiente para fornecer 80 % de
saturação. O sal foi adicionado lentamente com agitação branda a 4 ºC e a mistura centrifugada a
20000.g por 60 minutos a 4 °C, reservando-se o precipitado. O precipitado foi suspenso em
solução tampão fosfato potássio 0,02 M (pH 6,5) e dialisado contra o mesmo tampão em
membrana de acetato por 24 horas a 4 °C. Após a diálise, a fração proteica foi precipitada com
acetona na proporção 2:1 (v/v), e sua separação realizada por centrifugação a 11.000.g durante 15
minutos a 0 °C. O precipitado foi novamente suspenso em tampão fosfato potássio 0,02 M (pH
6,5) e armazenado a -18 °C para realização das demais análises (PERONE et al., 2007).
2.5.4 Determinação da atividade da PPO dos extratos
A atividade enzimática foi determinada por espectrofotometria (Biochrom, Modelo Libra
S50), através da medida do aumento na absorbância a 420 nm para o substrato catecol, nas
concentrações de 0,05 M a 0,4 M. A mistura da reação foi constituída de 2,5ml de solução
tampão fosfato de sódio 0,2 M (pH 7,0), 0,3 ml de substrato em diferentes concentrações e 0,2 ml
do extrato contendo a enzima, atingindo um volume final de 3,0 ml. A amostra em branco teve
apenas 0,3 ml da solução de substrato e 2,7 ml de solução tampão fosfato de sódio 0,2 M (pH
7,0). A temperatura foi mantida constante a 25°C.
A porção linear da curva de atividade foi utilizada para expressar a atividade da enzima.
Uma unidade de atividade da enzima (UE) foi definida como a quantidade de enzima que
provoca um aumento na absorbância de 0,001.ml-1.min-1 (ERZENGIN, 2009).
54
2.5.5 Determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmax da PPO
Os valores de Km e Vmax foram determinados para diferentes concentrações de catecol
(0,05 M a 0,4 M). Os dados foram representados graficamente como 1/V0 e 1/[S] de acordo com
o método de LINEWEVER-BURK (1934).
2.5.6 Efeito do pH e temperatura na atividade da PPO
Para as determinações do pH e temperaturas ótimas da reação, foi utilizada a mesma
metodologia descrita para a medida da atividade enzimática, sendo que para o pH foram testados
os pHs 2, 3, 4, 5, 6, 7 e 8 e para a temperatura foram testadas as temperaturas de 20, 25, 30, 40,
50, e 60 ºC.
2.5.7 Determinação do substrato preferencial da enzima
A atividade enzimática foi determinada utilizando-se a (+)-catequina e a (–)-epicatequina
como substrato, visto que estes são os principais compostos fenólicos presentes no cacau
(EFRAIM et al., 2011). A mesma metodologia descrita para o substrato catecol foi utilizada,
assim como os valores de pH e temperatura ótimos já fixados.
2.5.8 Correlação entre os parêmetros de fermentação e a atividade enzimática dos extrato.
Os resultados da atividade enzimátia da PPO nos extratos da polpa e semente dos
cultivares no tempo zero, foram confrontados com os parâmetros de fermentação (pH e
temperatura), com o objetivo de avaliar o comportamento da enzima no decorrer do processo.
2.6 Determinação do teor de proteína nos extratos.
Para o cálculo da atividade enzimática específica, o teor de proteínas foi determinado pelo
método de Lowry et al. (1951).
55
2.7 Análise Estatística.
Todas as análises foram realizadas em sextuplicata e o desvio padrão dos dados foi
determinado.
56
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Determinação da atividade da PPO dos extratos
Na Figura 01-A, pode-se observar uma grande diferença na atividade enzimática das
polpas dos dois cultivares. A atividade da PPO no cultivar TSH-1188 é aproximadamente 6 vezes
maior que a do PH 16, mostrando uma maior presença da enzima nesse cultivar. Essa maior
atividade enzimática no cultivar TSH-1188, muito provavelmente terá reflexo na concentração e
no comportamento dos compostos fenólicos durante e após a fermentação, pois segundo Misnawi
et al. (2002), a PPO atua intensamente sobre esses compostos durante a fase aeróbica da
fermentação, convertendo-os em quinonas, o que pode acarretar alterações nas características
sensoriais como cor e sabor (MISNAWI et al., 2003). Já na semente, onde a atividade enzimática
é menor que na polpa (Figura 01-B), a PPO atua de forma semelhante nos dois cultivares, pois as
enzimas possuem atividades muito próximas. Contudo, existe uma diferença maior entre as
atividades da polpa e semente no cultivar TSH-1188 do que no cultivar PH 16.
Figura 01. Atividade da PPO para o substrato catecol em diferentes concentrações (0,05 M a 0,4 M ). (A)
Polpa; (B) Semente.
A.
B.
80
TSH 1188
PH 16
3,5
60
-1
Atividade (UE. mg proteína )
-1
Atividade (UE. mg proteína )
70
4,0
TSH 1188
PH 16
50
40
30
20
10
0
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
-1
[catecol] (mg.ml )
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
-1
[catecol] (mg.ml )
0,35
0,40
0,45
57
A diferença de atividade observada entre os cultivares, pode ser evidenciado na Figura 02
através dos parâmetros cinéticos. A PPO possui boa afinidade com o catecol, uma vez que quanto
menor o valor de Km maior será a afinidade da enzima com o substrato. Na polpa (Figura 02-A)
os valores de Km e Vmax encontrados no cultivar PH 16 foram 0,107 mg.ml-1 e 10,6 mg.ml min-1
respectivamente, já para o cultivar TSH 1188 o Km foi de 0,089 mg.ml-1 e Vmax de 81,3 mg.ml
min-1. Na semente (Figura 02-B) foi encontrado Km 0,047 mg.ml-1 e Vmax 2,3 mg.ml min-1
para PH 16 e para o TSH 1188 foi encontrado Km de 0,02 mg.ml-1 e Vmax de 2,3 mg.ml min-1.
Figura 02. Parâmetros cinéticos pelo método de LINEWEVER-BURK com diferentes concentrações do
substrato catecol para a enzima PPO nos dois cultivares de cacau. (A) Polpa; (B) Semente.
A.
B.
0,4
0,9
y = 0,0101x + 0,0942
R² = 0,8981
0,3
0,25
TSH 1188
0,2
PH 16
1/ V0 (mg.ml min -¹)
1/ V0 (mg.ml min -¹)
0,35
y = 0,0207x + 0,4392
R² = 0,9359
0,75
0,6
0,45
0,15
y = 0,0087x + 0,4256
R² = 0,9991
0,3
0,1
TSH 1188
PH 16
y = 0,0011x + 0,0123
R² = 0,9771
0,15
0,05
0
0
0
5
10
15
20
1/[ S ] (mg.ml -¹)
25
0
5
10
15
20
25
1/[ S ] (mg.ml -¹)
A afinidade da PPO pelo tipo e concentração de substrato, é dependente não apenas da
origem da enzima (tipo de planta), como foi observado por Oktay et al. (1995), como também da
espécie e do cultivar.
3.2 Efeito do pH na atividade da PPO
Apesar de apresentar uma maior atividade em maiores concentrações de catecol
58
(Figura 01), foi escolhida a concentração de 0,1 M, tanto para polpa quanto para semente, visto
que o comportamento nessa concentração foi semelhante entre os cultivares e também pelo baixo
desvio encontrado na análise. Os valores de pH ótimos para a atuação da PPO na polpa e semente
de cacau foram determinados no intervalo de pH 2 a 8 sob temperatura constante a 25ºC, com
concentração já fixada do catecol para reação de 0,1 M. Os valores de pH ótimos para o cultivar
PH 16 (Figura 03- A) na polpa foi de 6,5 e semente de 5,8, apresentando atividade enzimática de
7,1 UE. mg proteína-1 e 6,5 UE. mg proteína-1 respectivamente.
No cultivar TSH 1188 (Figura 03-B), o pH ideal para polpa foi de 6,6 e para semente 6,0.
Como já evidenciado anteriormente, na polpa a atividade da enzima foi superior que a atividade
na semente, apresentando valores de 43,1 UE. mg proteína-1 e 4,3 UE. mg proteína-1
respectivamente. Isso pode ser explicado por que o pH ótimo para máxima atividade da PPO nas
plantas varia dependendo do método de extração, natureza dos substratos utilizados para o ensaio,
e a localização da enzima na célula da planta (Dogan et al., 2005). Já no cultivar PH 16, a
atividade na polpa e semente apresentam comportamento semelhantes.
Figura 03. Efeito do pH na atividade da PPO. (A) Cultivar PH 16; (B) Cultivar TSH 1188.
A.
B.
50
-1
8
Atividade (UE. mg proteína )
Polpa
Semente
-1
Atividade (UE. mg proteína )
10
6
4
2
0
2
3
4
5
pH
6
7
8
40
Polpa
Semente
30
20
10
0
0
1
2
3
4
5
6
7
8
pH
De acordo com os resultados apresentados pode-se concluir que, para os cultivares
estudados, em valores baixos de pH, a PPO apresenta baixa atividade e que em pH alcalino há
59
uma diminuição brusca da atividade, chegando a representar entre 70 a 90 % de perda no
potencial de atividade. Este fato também foi observado em estudos realizados por Toralles et al.
(2005) em pêssegos, onde a PPO apresentou o pH ótimo variando numa faixa de 6,0 a 7,5,
dependendo do substrato e do tecido vegetal. Abaixo desse pH a enzima foi menos ativa e acima
desse pH ocorreu a auto oxidação do substrato.
3.3 Efeito da temperatura na atividade da PPO
A partir da concentração de catecol (0,1 M) e de pH (polpa e semente, 6,6 e 6,0 para o
TSH-1188 e 6,5 e 5,8 para o PH 16,respectivamente) já fixados, a temperatura ótima de atuação
da PPO foi determinada numa faixa de temperatura de 20 a 60°C. Para o PH 16 (Figura 4-A), a
PPO atingiu máxima atividade a 30ºC para a semente e 27ºC para a polpa, apresentando atividade
de 9,7 UE. mg proteína-1 e 7,1 UE. mg proteína-1 respectivamente.
Figura 04. Efeito da temperatura na atividade da PPO. (A) Cultivar PH 16; (B) Cultivar TSH 1188.
A.
B.
50
12
Polpa
Semente
Polpa
Semente
Atividade (UE. mg proteína )
40
-1
-1
Atividade (UE. mg proteína )
10
8
6
4
2
0
30
20
10
0
20
30
40
Temperatura (°C)
50
60
20
30
40
50
60
Temperatura (°C)
No cultivar TSH-1188, a temperatura ideal foi de 25ºC, apresentando atividade de 4,3 UE.
mg proteína-1 para semente e 40,3 UE. mg proteína-1 para polpa, representados na Figura 4-B. A
60
queda do potencial da atividade (aproximadamente de 90% para 10 %) da PPO em altas
temperaturas é, provavelmente, devido ao desdobramento da estrutura terciária e desnaturação da
enzima. Este fato também foi observado por Todaro et al. (2011), que caracterizou a PPO em
berinjela, e encontrou uma perda significativa na atividade em temperaturas elevadas.
Pode-se observar que nos dois cultivares, tanto na polpa quanto na semente, a atividade
diminui gradativamente com o aumento da temperatura, o que sugere que altas temperaturas não
favorecem a atuação da PPO, e implica em afirmar que a zona de maior atuação da enzima é
entre 25 e 30°C.
3.4 Determinação do substrato preferencial da PPO
Na figura Figura 05, pode ser observado que tanto para polpa como para semente nos
dois cultivares, há maior afinidade da enzima pela catequina, apresentando valores de atividade
na polpa de 11,93 UE. mg protein-1 e 20,3 UE. mg protein-1, e na semente 4,97 UE. mg protein-1 e
11,69 UE. mg protein-1, para PH 16 e TSH-1188, respectivamente.
Diante destes resultados, observa-se que a enzima não possui maior afinidade com o composto
presente em maior concentração na semente do cacau, pois segundo Kwik-Uribe (2005), em
sementes de cacau não fermentadas in natura, foi observado que a quantidade de (–)-epicatequina
é vinte vezes maior que a de (+)-catequina.
Por outro lado, durante o processo de fermentação, o teor de polifenóis totais diminui
cerca de 70%, sendo que a (–)-epicatequina sofre redução de 90% de sua concentração inicial
(EFRAIM, 2011). Payne et al. (2010), relatou que a redução da epicatequina, pode ser explicada
devido à oxidação biológica e ou a polimerização de monómeros, além da epimerização da (-)epicatequina a (-)-catequina, devido a elevação da temperatura durante a fermentação. Durante as
etapas de processamento do cacau para a produção de chocolate, Cross (1999) observou que os
flavanóis sofrem uma série de reações químicas, como oxidação, complexação e lixiviação, que,
associadas às demais reações em curso – como a hidrólise de proteínas a aminoácidos, e de
açúcares – levam à formação de compostos aromáticos, contribuindo significativamente para a
formação do sabor desejável e a redução do amargor e da adstringência.
61
Figura 05. Determinação da atividade PPO para substrato preferencial: Catequina e Epicatequina. (A)
Polpa; (B) Semente.
A.
B.
12
-1
Atividade (UE. mg proteína )
Epicatequina
Catequina
-1
Atividade (UE. mg proteína )
20
15
10
5
0
10
8
6
4
2
0
PH 16
TSH 1188
Cultivar
Epicatequina
Catequina
PH 16
TSH 1188
Cultivar
Sendo assim, é possível afirmar que a redução drástica sofrida pela (-) epicatequina
durante o processamento do cacau não pode ser atribuída com exclusividade a ação da PPO, mas
a outros mecanismos mais importantes descritos pelos autores já citados.
3.5 Correlação entre os parêmetros de fermentação e a atividade enzimática dos estratos
Nas Figuras 06 e 07, estão representados os parâmetros de fermentação, pH e temperatura,
respectivamente e o pH e temperatura ótimos para a atuação da enzima PPO nos dois cultivares
de cacau estudados.
Para a polpa do cultivar PH 16 (Figura 06-A), a maior atividade da PPO
ocorre em pH 6,5, contudo todo o processo de fermentação dessa variedade ocorre em pH na
faixa de 4,5, somente após 5 dias (120 horas) de fermentação o pH atingiu um valor próximo de
6,0 e novamente voltou a valores próximos a 4,5. Portanto, na fermentação da polpa do cultivar
PH 16, temos apenas 70% da atividade máxima da enzima durante todo o processo. Já para a
semente (Figura 06-B), a maior atividade (6,5 UE. mg protein-1) é obtida em pH 5,8. Durante a
fermentação, o pH da semente no início do processo está em torno de 6,5 e vai reduzindo
lentamente até valores próximos a 4,5. Neste caso, a ação da enzima é favorecida nessa fase
62
inicial do processo, nos primeiros 3 dias (72 horas), após esse período a atividade vai reduzindo
até permanecer próxima a 70% de sua atividade máxima. Sendo assim, embora a atividade da
PPO seja menor na semente do que na polpa, a ação da enzima na semente é favorecida durante o
processo de fermentação, quando considerado o pH do meio.
Figura 06. Parâmetros de fermentação e pH ótimo de atuação da PPO. (A) PH 16 - Polpa; (B) PH 16 Semente; (C) TSH - Polpa; (D) TSH 1188 – Semente.
B.
10
80
60
4
40
2
20
2
3
4
5
6
7
8
9
pH
Polpa
Tempo de Fermentação
80
60
20
40
10
20
4
5
pH
60
4
40
2
20
2
3
4
5
6
7
8
9
0
6
7
8
0
160
140
Semente
Tempo de Fermentação
5
-1
Atividade (UE. mg proteína )
100
30
3
80
6
Tempo de Fermentação (horas)
120
2
6
pH
140
40
0
100
D.
160
50
120
8
0
0
140
Semente
Tempo de Fermentação
120
4
100
3
80
60
2
40
1
0
20
2
3
4
5
6
7
Tempo de Fermentação (horas)
6
160
-1
120
100
C.
-1
140
8
0
Atividade (UE. mg proteína )
12
Atividade (UE. mg proteína )
Polpa
Tempo de Fermentação
-1
Atividade (UE. mg proteína )
10
160
Tempo de Fermentação (horas)
12
Tempo de Fermentação (horas)
A.
0
pH
No cultivar TSH-1188, a PPO presente na polpa (Figura 06-C) tem maior atividade (43,1
UE. mg proteína-1) em pH 6,6. Como o valor médio de pH da fermentação desse cultivar também
63
está em torno de 4,5, conclui-se que durante a fermentação desse cultivar, a enzima atinge
somente 45% da sua atividade máxima, 18 UE. mg proteína-1. Já na semente (Figura 06-D), a
fermentação teve início em pH 6,6 e foi reduzindo ao longo do processo até a estabilização em
pH em torno de 4,8. Portanto, o pH da fermentação permaneceu na zona de maior atividade da
enzima nas primeiras 72 horas do processo, favorecendo a ação da PPO nesse período. Ainda
para este cultivar, após 72 horas, o pH da fermentação permaneceu numa faixa onde a enzima
possui aproximadamente 70% de sua atividade máxima. Com isso, pode-se afirmar, que a ação da
PPO na semente é favorecida também pelo pH no estágio inicial da fermentação (primeiros 3
dias) e que a diferença nas atividades da polpa e semente são compensadas durante o processo.
Deve-se ressaltar que o pH encontrado na polpa no início do processo de fermentação, em
torno de 4,5, para as duas cultivares está de acordo com os dados encontrados na literatura para
amêndoas fermentadas na mesma região da Bahia (CRUZ et al., 2013), Contudo, segundo Amin
et al. (2002), para obtenção dos melhores resultados na qualidade das amêndoas, o pH da
fermentação deve estar na faixa de 5,0 a 5,5. Melhores resultados podem ser obtidos com os
cultivares estudados, se medidas forem adotadas, visando minimizar a fermentação precoce que
ocorre devido à quebra dos frutos no campo e o transporte da massa para os cochos, já em estado
de fermentação.
Com relação à temperatura, para o cultivar PH 16 (Figura 07- A), a polpa apresentou
maior atividade a 30°C e a semente em 27ºC. De acordo com o gráfico, a temperatura somente irá
favorecer a ação da enzima na polpa nas primeiras 48 horas de fermentação. Após esse período, a
medida que a temperatura da fermentação aumenta, a atividade da enzima na polpa cai
inicialmente 50% até que aos 45ºC a atividade da enzima é reduzida a somente 10% da atividade
máxima. Para a semente, a ação da enzima também será favorecida nas primeiras 48 horas de
fermentação, contudo a redução da atividade com o aumento da temperatura será menor,
aproximadamente 40%. De forma análoga ao ocorrido com o pH, embora a atividade da enzima
na polpa seja maior que na semente, sua resistência a altas temperaturas é menor, apresentando
uma redução drástica após 48 horas, enquanto a enzima da semente permanece com maior
atividade durante todo o processo.
No cultivar TSH-1188 (Figura 07-B), a máxima atividade da enzima ocorre a 25° C, tanto
para polpa quanto para semente. Com isso, assim como para a cultivar PH 16 durante a
fermentação, a ação da PPO é maior apenas nos 2 primeiros dias para a polpa, havendo uma
64
redução da atividade de aproximadamente 60% quando a temperatura atinge os 35ºC. Para a
semente a redução é mínima, visto que a enzima, embora apresente atividade bem menor que
aquela presente na polpa, mantem-se no mesmo patamar durante todo o processo.
Figura 07. Parâmetros de fermentação e temperatura ótima de atuação da PPO. (A) PH 16; (B) TSH1188.
A.
B.
10
120
8
100
80
6
60
4
40
2
0
20
20
30
40
Temperatura (°C)
50
60
0
50
140
120
40
100
30
80
60
20
40
10
0
20
20
30
40
50
60
Tempo de Fermentação (horas)
140
160
Polpa
Semente
Tempo de Fermentação
-1
-1
160
Atividade (UE. mg proteína )
12
Atividade (UE. mg proteína )
60
Polpa
Sememnte
Tempo de Fermentação
Tempo de Fermentação (horas)
14
0
Temperatura (°C)
As correlações apresentadas evidenciam a diferença e especificidade existente entre as
enzimas da polpa e semente dos cultivares, assim como entre os cultivares de cacau. Esta
observação também foi relatada nos trabalhos conduzidos por Efraim (2010), que comprovaram a
diferença do comportamento dos cultivares de cacau ao monitorar os parâmetros de temperatura e
pH durante a fermentação, da mesma forma que foi encontrada diferenças nos liquors, manteiga e
chocolate.
Os resultados expostos no presente estudo sugerem, que no decorrer do processo de
fermentação sejam utilizados critérios específicos para cada cultivar de cacau, tomando como
base suas especificidades e parâmetros ideais, para que se possa prolongar e potencializar a
atividade da enzima PPO, visto que a oxidação dos compostos fenólicos presentes na semente,
realizada pela enzima, é de suma importância para características sensoriais do chocolate a ser
produzido, como amargor e adstringência. Logo, prolongar a atuação da PPO em temperaturas
mais baixas, através do aumento na frequência e quantidade dos revolvimentos da massa de
65
cacau, no início do processo de fermentação, pode retardar a elevação da temperatura e a queda
do pH, o que irá favorecer a atuação da enzima nos cultivares em estudo.
O controle do pH e temperatura irá proporcionar maior eficiência da enzima, prolongando
seu período de melhor atuação durante o processo fermentativo, podendo contribuir para a
melhoria nas características das amêndoas de cacau, e por consequência maior qualidade na
produção do chocolate.
66
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68
CAPÍTULO III
EXTRAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA INVERTASE EM DOIS
CULTIVARES DE CACAU (Theobroma cacao L.) PRODUZIDOS NO SUL DA
BAHIA, BRASIL.
RESUMO
A invertase foi caracterizada em dois cultivares de cacau, PH 16 e TSH 1188 na polpa e semente,
objetivando identificar a atividade enzimática quanto a concentração de substrato, pH e
temperatura ótimos de reação correlacionando-a com as condições do processo fermentativo. As
atividades enzimáticas (invertase ácida e neutra) foram avaliadas pela dosagem de açúcares
redutores segundo método de Somogyi-Nelson e determinadas por espectrofotometria. Os
resultados evidenciam a diferença e especificidade da enzima e que a invertase ácida é
cineticamente mais eficiente do que a neutra podendo ser a principal forma de enzima vacuolar
envolvida na hidrólise da sacarose. O controle da temperatura e pH irá prolongar o período de
melhor atuação durante o processo
fermentativo, propiciando uma melhor qualidade das
amêndoas de cacau e por consequência, maior qualidade na produção de chocolates
monovarietais, no que diz respeito à formação e potencialização dos precursores de aroma e
sabor.
Palavras-chave: cacau, enzimas, chocolate monovarientais.
ABSTRACT
The invertase was characterized in two cultivars of cocoa, PH 16 and TSH 1188 the pulp and
seeds in order to identify the enzymatic activity and substrate concentration , pH and temperature
optima of reaction correlated with the conditions of the fermentation process . The enzymatic
activities ( acid and neutral invertase ) were assessed by measurement of reducing sugars second
method of Somogyi - Nelson and determined by spectrophotometry . The results show a
69
difference and specificity of the enzyme and that acid invertase is kinetically more efficient than
the neutral may be the main form of vacuolar enzyme involved in the hydrolysis of sucrose . The
control of temperature and pH will prolong the best performance during the fermentation process
, providing a better quality of cocoa beans and therefore higher quality production monovarietais
chocolates , with regard to training and enhancement of flavor precursors and flavor.
Keywords: cocoa, enzymes, monovarietais chocolate.
70
1. INTRODUÇÃO
O processo de fermentação é uma etapa muito importante no processamento de cacau.
Estudos mostraram que quando o cacau não é submetido ao processo de fermentação, não irá
desenvolver o sabor desejável ao chocolate durante o processo de torração, ficando
excessivamente adstringente e amargo (MISNAWI et al., 2002). Durante este processo, ocorrem
importantes reações bioquímicas que, por meio da hidrólise de proteínas e de açúcares presentes
na polpa e semente do cacau em conjunto com a elevação da temperatura a valores próximos a
50°C, levam à formação dos precursores de sabor, em particular aminoácidos livres e açúcares
redutores (PEZOA-GARCÍA, 1989).
É sabido que enzimas endógenas desempenham um importante papel na produção dos
precursores de aroma e sabor e na degradação de compostos durante a fermentação do cacau
(STURM, 1999). A enzima invertase atua durante este processo na hidrólise da sacarose em
glicose e frutose (açúcares redutores), indispensáveis à
formação do
sabor que serão
potencializados durante a etapa de torração (HANSEN et al., 1998; LOPEZ; DIMICK, 1991).
Esta enzima possui duas isoenzimas: uma ácida com atividade máxima em pH 5,5 e
predominante em tecidos em crescimento e outra neutra, com um máximo de atividade em pH 7,0
e com predominância em tecidos completamente expandidos (HUSSAIN et al., 2008). Contudo,
ainda é pouco o conhecimento sobre invertases neutras/ácidas devido a dificuldades de suas
purificações e atividades enzimáticas
baixas e instáveis (DU, et al., 2013; ROITSCH;
GONZALEZ, 2004).
A identificação e caracterização das atividades enzimáticas no cacau é sensível e
trabalhosa, pricipalmente com relação a inúmeras variações que ocorrem durante as etapas de
processamento do cacau (STURM, 1999). A quantificação e a comparação dessas atividades são
complexas, considerando-se as variações causadas pelas diferenças dos genótipos, diferenças
geográficas e dos métodos de fermentação (HANSEN et al., 1998). Além disso, ainda não é
totalmente compreendido como esses processos enzimáticos são regulados, quais seus parâmetros
limitantes e quais substratos/produtos estão relacionados com obtenção de amêndoas de maior
qualidade.
Diante do exposto, este estudo tem por objetivo caracterizar a atividade enzimática da
invertase do cacau nos cultivres PH 16 e TSH 1188, produzidos na região Sul da Bahia, visando
71
fornecer subsídios para possíveis intervenções tecnológicas que possam contribuir para melhoria
da qualidade da matéria-prima na produção de chocolates monovarietais.
72
2. MATERIAL E MÉTODOS
2.1 Materiais
Foram estudados dois cultivares de cacau, PH 16 e TSH-1188, produzidos na Fazenda
Lajedo do Ouro (S 14° 06' 15.2" WO 39° 38' 45.8"), na cidade de Ibirataia, região sul do estado
da Bahia, Brasil. O material em estudo foi definido pelos produtores, segundo sua disponibilidade
no período de realização do experimento. O cultivar PH 16 (Híbrido Forastero - resultado do
cruzamento do Forastero do Alto Amazônico com o Trinitario) foi identificado em 1996 em uma
população de cacaueiros híbridos da Fazenda Porto Híbrido, no município de São José da Vitória
– BA. Já o cultivar TSH -1188 (Trinidad Selected Hybrids - híbrido trinitario), é originario de
Trinidad and Tobago, localizada próximo a costa oriental da Venezuela e apresenta resistência à
vassoura-de-bruxa e excelente produtividade.
2.2 Reagentes e padrões
Todos os reagentes e padrões utilizados neste estudo foram adiquiridos na Sigma Aldrich
Co.
2.3 Fermentação
A fermentação foi realizada em cochos de madeira (70 x 70 x 75 cm), com capacidade
para 400 kg de massa de cacau, apresentando cerda de 20 furos (1,27 cm cada um) na parte
inferior e nas laterais a fim de permitir o escoamento do mel do cacau produzido pela polpa
durante a feremntação. Este processo teve duração de sete dias, sendo que a cada 48 horas a
massa de cacau era revolvida tendo por finalidade oxigenar a massa e uniformizar a temperatura.
Para cobrir a massa de cacau, foram utilizadas folhas de bananeira.
2.4 Coleta das amostras
As amostras foram coletadas (aproximadamente 500 g) antes do início da fermentação
73
(tempo zero) e a cada 12 horas até o final do processo. Foram congeladas a -18º C para
interrupção enzimática. Durante a fermentação, foram realizadas medidas de temperatura (Digital
Thermometer MINIPA, modelo MT – 450) e pH (Medidor de pH portátil PHtek Digital) da
massa (AOAC, 2000).
2.5 Caracterização da Invertase
A atividade da enzima foi determinada na polpa e semente dos dois cultivares de cacau
antes do início da fermentação (tempo zero), tendo como parâmetros, a temperatura, o pH e o
substrato preferencial da enzima. Os resultados obtidos para temperatura e pH da enzima foram
confrontados com aqueles obtidos durante o processo de fermentação, visando indentificar a
etapa do processo onde as condições são mais favoráveis para a ação da Invertase.
2.5.1 Extração da Invertase da polpa
A extração foi descrita por Gomez et al., (1999) utilizando-se 100g de cacau. As polpas
foram separadas das sementes manualmente e imersas em solução tampão fosfato de sódio 50mM
pH 7,5 contendo NaCl 50mM, glicerol 5%, sulfato de manganês 5mM e β-mercaptoetanol 1mM,
na proporção de 1:2 (p/v) e homogeneizadas durante 30 minutos a 4°C. O homogeneizado foi
centrifugado em centrífuga refrigerada HITACHI, modelo CR22GIII a 20000.g durante 10 min a
0°C. O sobrenadante (extrato) foi estocado a -18ºC para realização das análises.
2.5.2 Extração da Invertase das sementes
A extração também foi realizada segundo o descrito por Gomez et al., (1999). As
sementes removidas da extração das polpas foram liofilizadas (Liofilizador Liotop, modelo L108)
e posteriormente, desengorduradas, utilizando-se éter de petróleo como solvente (YUSEP et al.,
2002). As sementes secas e desengorduradas foram suspensas em solução tampão assim como
descrito para as polpas. A suspensão foi então centrifugada a 20000.g durante 10 min a 0°C. O
sobrenadante foi então estocado a -18ºC para realização das análises.
74
2.5.3 Purificação da Invertase dos extratos
A purificação foi realizada segundo o descrito por Deuner et al. (2005), onde foi
adicionado aos extratos sulfato
de amônio [(NH4)2SO4], em
quantidade
suficiente
para
fornecer 80 % de saturação. O sal foi adicionado lentamente com agitação branda a 4 ºC e a
mistura centrifugada a 20000.g por 60 minutos a 4 °C, reservando-se o precipitado. Este foi
suspenso em 4ml de água deionizada. A seguir, o extrato foi dialisado por 24 horas a 4°C
contra tampão fosfato potássio 100 mM e pH 7,0 obtendo-se o extrato enzimático bruto. Após a
diálise, o extrato foi precipitado com acetona na proporção 2:1 (v/v), e sua separação realizada
por centrifugação a 11.000.g durante 15 minutos a 0 °C. O precipitado foi novamente suspenso
em tampão fosfato de potássio pH 6,5 e armazenado a -18 °C para realização das demais
análises.
2.5.4 Determinação da atividade da Invertase dos extratos
A atividade enzimática foi determinada segundo Nascimento et al., (1998), por
espectrofotometria (Biochrom, Modelo Libra S50), para o substrato sacarose, nas concentrações
de 0,05 M a 0,4 M. A mistura da reação (4,0 ml) foi constituída de 0,5 ml do extrato enzimático,
1,0 ml de sacarose nas diferentes concentrações e 2,5 ml de solução tampão no pH de reação
indicado para cada isoenzima, sendo tampão acetato de potássio 0,2 M, pH 4.5, para invertase
ácida e tampão fosfato de potássio 0,2 M, pH 7.5, para invertase neutra. O meio de reação
foi incubado em banho maria a 37°C durante 30 minutos. A reação foi interrompida pelo
aquecimento a 100°C. As atividades enzimáticas foram avaliadas pela dosagem de açúcares
redutores segundo protocolo para determinação de açúcares redutores pelo método de SomogyiNelson (NELSON, 1960). Uma unidade da enzima foi definida como sendo a quantidade de
enzima capaz de liberar 1 mg de açúcar redutor por mg de proteína por hora (mg glicose.mg
proteína-1.h-1).
2.5.5 Determinação dos parâmetros cinéticos Km e Vmax da Invertase
Os valores de Km e Vmax foram determinados para diferentes concentrações de
75
sacarose (0,05 M a 0,4 M). Os dados foram representados graficamente como 1/V0 e 1/[S] de
acordo com o método de LINEWEVER-BURK (1934).
2.5.6 Efeito do pH e Temperatura na atividade da Invertase
Para as determinações do pH e temperatura ótimos de reação, foi utilizada a mesma
metodologia descrita para a medida da atividade enzimática, sendo que para a invertase ácida
somente foi testado pH 4,5 e para a invertase neutra os pHs 6,5, 7,5 e 8,5. Para a temperatura
foram testadas as temperaturas de 20, 30, 40, 50, e 60ºC para as duas isoenzimas.
2.5.7 Correlação entre os parêmetros de fermentação e a atividade enzimática dos extratos
Os resultados da atividade enzimátia da Invertase (ácida e neutra) nos extratos da polpa e
semente dos cultivares no tempo zero, foram confrontados com os parâmetros de fermentação
(pH e temperatura), com o objetivo de avaliar o comportamento da enzima no decorrer do
processo.
2.6 Determinação do teor de proteína nos extratos
Para o cálculo da atividade enzimática específica, o teor de proteínas foi determinado pelo
método de Lowry et al. (1951).
2.7 Análise Estatística.
Todos as análises foram realizadas em sextuplicata e o desvio padrão dos dados foi
analisado.
76
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 Determinação da atividade da Invertase dos extratos
A partir da Figura 01-A, pode ser observado que a enzima invertase apresenta atividades
diferentes na polpa, nos cultivares PH 16 e TSH 1188, sendo maior para invertase ácida do que
para invertase neutra. Já na semene, Figura 01-B, a invertase atua de forma semelhante nos dois
cultivares, pois a enzima possui atividades muito próximas. Comparando-se polpa e semente nos
dois cultivares, fica evidente que a invertase possui maior atividade na polpa do que na semente,
uma vez que a polpa do cacau é rica em açúcares (10-15%) e é um excelente meio para o
crescimento de microrganismos. Quando as sementes são removidas dos frutos, ocorre uma
inoculação natural de microrganismos do ambiente para a polpa (BECKETT, 2009).
Figura 01. Atividade das Invertases para o substrato sacarose em diferentes concentrações (0,05 M a 0,4
M ). (A) Polpa; (B) Semente.
A.
B.
-1
-1
0,8
TSH 1188 - Invertase Ácida
PH 16 - Invertase Ácida
TSH 1188 - Invertase Neutra
PH 16 Invertase Neutra
Atividade (mg glicose.mg proteína .h )
-1
-1
Atividade (mg glicose.mg proteína .h )
1,0
0,6
0,4
0,2
0,0
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
-1
[sacarose] (mg.ml )
0,14
0,12
TSH 1188 - Invertase Ácida
PH 16 - Invertase Ácida
TSH 1188 - Invertase Neutra
PH 16 - Invertase Neutra
0,10
0,08
0,06
0,04
0,02
0,00
0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 0,30 0,35 0,40 0,45
-1
[Sacarose] (mg ml )
A atuação da enzima invertase sobre a sacarose está relacionada com a hidrólise desse
substrato em glicose e frutose (açúcares redutores) durante o processo de fermentação. Esses
açúcares são importantes precursores de sabor do chocolate, e suas atuações serão potencializadas
nas etapas posteriores do beneficiamento do cacau, sendo de vital importância na participação da
77
reação de Maillard, que é a principal responsável pela formação do sabor desejável do cacau. No
estágio inicial, essa reação envolve a condensação de grupos carbonila de açúcares redutores com
grupos amina provenientes de aminoácidos livres, seguida da degradação dos produtos
originados, formando diversos compostos oxigenados (PEZOA-GARCÍA, 1989; ROSLI et al.,
1996).
Figura 02. Parâmetros cinéticos pelo método de LINEWEVER-BURK com diferentes concentrações de
sacarose, para as invertases nos cultivares estudados. (A) PH16 - Polpa; (B) PH16- Semente; (C) TSH
1188 - Polpa; (D) TSG 1188 – Semente.
A.
B.
6
120
y = 0,0405x + 3,5508
R² = 0,9826
100
4
3
Invertase Ácida
Invertase Neutra
y = 0,0446x + 1,2328
R² = 0,9473
2
1/ V0 (mg.ml min -1)
1/ V0 (mg.ml min -1
5
1
y = 5,2762x - 4,8034
R² = 0,9981
80
60
Invertase Ácida
Invertase Neutra
40
20
0
y = 4,579x + 2,7951
R² = 0,9221
0
0
5
10
15
20
25
0
5
1/[ S ] (mg.ml -1)
D.
14
1/ V0 (mg.ml min -1)
12
10
Invertase Ácida
Invertase Neutra
8
y = 0,1353x + 2,1119
R² = 0,9207
6
15
20
25
250
y = 0,2407x + 7,674
R² = 0,9926
4
1/ V0 (mg.ml min -1)
C.
10
1/[ S ] (mg.ml -1)
200
y = 10,693x - 31,968
R² = 0,9038
Invertase Ácida
150
Invertase Neutra
100
50
y = 5,4286x - 3,5714
R² = 0,9849
2
0
0
0
5
10
15
1/[ S ] (mg.ml -1)
20
25
0
5
10
15
20
25
1/[ S ] (mg.ml -1)
A boa afinidade da enzima com a sacarose pode ser evidenciada na Figura 02 através dos
valores de Km e Vmax (Tabela 01) encontrados para as isoenzimas, invertase ácida e neutra, nos
78
cultivares estudados. Quanto menor o valor de Km maior será a afinidade da enzima com o
substrato.
Tabela 01. Km e Vmax das invertases para os cultivares com o substrato sacarose.
Invertase Ácida
PH 16
Vmax (mg.ml
Invertase Neutra
TSH 1188
PH 16
TSH 1188
Polpa
Semente
Polpa
Semente
Polpa
Semente
Polpa
Semente
0,8
0,4
0,5
0,3
0,3
0,2
0,1
0,03
0,036
1,638
0,064
1,520
0,011
1,098
0,031
0,334
min-1)
Km (mg.ml-1)
Segundo DU at al., (2013), ainda não há dados conclusivos quanto a estabilidade da
enzima invertase. As invertases normalmente apresentam valores de Km muito baixos com o
substrato sacarose, o que é positivo, porém com velocidade de hidrólise lenta, assim como
encontrado no presente estudo.
3.2 Efeito do pH na atividade da Invertase
Os valores de pH ótimos para a atuação da invertase na polpa e semente de cacau foram
determinados no intervalo de pH 6,5, 7,5 e 8,5 para invertase neutra e pH 4,5 para invertase ácida
sob temperatura de incubação constante a 37ºC e interrupção da reação a 100°C, em
concentrações de sacarose fixadas para os dois cultivares, sendo para invertase ácida, polpa e
semente 0,2 M e 0,4 M, respectivamente e invertase neutra 0,3 M polpa e semente. A escolha
destas concentrações é justificada pela maior atividade das invertases encontradas e baixo desvio
padrão.
Estão representados na Figura 03-A as atividades da invertase ácida com pH fixo 4,5. Para
os cultivares PH 16 e TSH 1188, apresentam maior atividade na polpa (0,66 mg glicose.mg
proteína-1.h-1 e 0,31 mg mg glicose.mg proteína-1.h-1 respectivamente) do que na semente (0,14
mg glicose.mg proteína-1.h-1 e 0,14 mg glicose.mg proteína-1.h-1 respectivamente). As invertases
ácidas não foram testadas em outros valores de pH (2,5 e 3,5) pois os valores das atividades
79
poderiam não ser confiáveis, uma vez que a conversão da sacarose em glicose e frutose poderia
ocorrer, provavelmente, pela acidificacação do meio e não pela ação da enzima.
Figura 03. Efeito do pH na atividade das Invertases. (A) Ácida; (B) Neutra.
A.
B.
0,40
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
PH 16
-1
-1
Polpa
Semente
Atividade (mg glicose.mg proteína .h )
0,6
-1
-1
Atividade (mg glicose.mg proteína .h )
0,7
TSH 1188 - Polpa
PH16 - Polpa
TSH 1188 - Senmente
PH 16 - Semente
0,35
0,30
0,25
0,20
0,15
0,10
0,05
0,00
TSH 1188
Cultivar
6,5
7,0
7,5
8,0
8,5
pH
Na Figura 03-B, podemos observar que para invertase neutra, a polpa nos dois cultivares
também apresenta maior atividade que na semente. Para o cultivar PH 16, a polpa apresenta pH
ótimo de reação de 6,5 com atividade de 0,34 mg glicose.mg proteína-1.h-1 e para semente de pH
7,5 com atividade de 0,07 mg glicose.mg proteína-1.h-1. Já no cultivar TSH 1188, apresenta pH
ótimo de 7,5 para polpa e semente com atividades de 0,12 mg glicose.mg proteína-1.h-1 e 0,08 mg
glicose.mg proteína-1.h-1, respectivamente. Os valores ótimos encontrados, assemelham-se com o
relatado por Darren et al., (1998), no qual encontrou valor ótimo de pH 7,2 para cana de açúcar,
encontram-se dentro da faixa de pH ótimo para invertase neutra que varia de pH 6,8, a 8,0.
3.3 Efeito da temperatura na atividade da Invertase
As temperaturas ótimas de atuação das invertases foram determinadas numa faixa de
temperatura de 20 a 60°C, a partir da concentração de sacarose e pH já fixados. Na invertase
ácida (Figura 04-A), para o cultivar PH 16, a enzima atingiu máxima atividade na polpa a 33ºC
80
(0,78 mg glicose.mg proteína-1.h-1) e para a semente apresentou 02 picos de maior atividade,
28°C (0,82 mg glicose.mg proteína-1.h-1) e 43°C (0,89 mg glicose.mg
proteína-1.h-1). Para
o cultivar TSH 1188, apresentou maior atividade a 31ºC (0,39 mg glicose.mg proteína-1.h-1) para
polpa e 27° (0,73 mg glicose.mg proteína-1.h-1) e 43°C (0,70 mg glicose.mg proteína-1.h-1) para
semente. Pode ser observado que a atividade é maior na semente do que na polpa.
Figura 04. Efeito da temperatura na atividade da Invertase. (A) Ácida; (B) Neutra.
A.
B.
0,5
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
20
30
TSH 1188 - Polpa
PH 16 - Pola
TSH 1188 - Semente
PH 16 - Semente
-1
-1
1,0
Atividade (mg glicose.mg proteína .h )
TSH 1188 - Polpa
PH 16 - Polpa
TSH 1188 - Semente
PH 16 Semente
-1
-1
Atividade (mg glicose.mg proteína .h )
1,2
40
50
60
Temperatura (°C)
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
20
30
40
50
60
Temperatura (°C)
Para a invertase neutra (Figura 04-B), as temperaturas ótimas de atuação para o cultivar
PH 16 foi de 52ºC com atividade de 0,43 mg glicose.mg proteína-1.h-1para a polpa e 50ºC e
atividade de 0,17 mg glicose.mg proteína-1.h-1 para a semente. Já para o TSH 1188 a temperatura
ideal foi de 50°C, apresentando atividades de 0,26 mg glicose.mg proteína-1.h-1 para polpa e
0,18 mg glicose.mg proteína-1.h-1para semente.
Com isso pode-se concluir que a atuação desta enzima, em ambos os cultivares, é maior
na polpa do que na semente, e que altas temperaturas favorecem sua atuação, o que implica
afirmar que a zona de maior atividade para esta enzima é entre 50 e 52°C. Comparando-se a
atuação das duas isoenzimas, é possível afirmar que a atividade da invertase ácida é maior do que
na invertase neutra.
81
3.4 Correlação entre os parêmetros de fermentação e a atividade enzimática dos extratos
Estão representados nas Figuras 05 e 06, os parâmetros de fermentação, pH e temperatura,
respectivamente e as temperaturas ótimas para a atuação das invertases nos dois
cultivares de cacau estudados. A ação da invertase ácida, com pH fixo estabelecido 4,5, é maior
na polpa do que na semente para ambos os cultivares, uma vez que o pH da polpa durante a maior
parte do processo de fermentação ocorre nessa faixa de pH (Figura 05-A e B). Sendo assim a
atuação desta enzima é favorecida mais na polpa que na semente. Na semente a ação da enzima,
ainda que baixa, será favorecida no PH 16 nos últimos dias de fermentação (após 120 horas e no
TSH 1188 no quinto dia de fermentação (120 horas).
Figura 05. Acompanhamento do pH para polpa e semente durante o processo de fermentação. (A)
Cultivar PH 16; (B) Cultivar TSH 1188.
A.
B.
7,0
Polpa
Semente
7,0
6,0
5,5
5,5
5,0
5,0
4,5
4,5
4,0
4,0
3,5
3,5
3,0
3,0
2,5
0
20
40
60
80
100
120
140
Tempo de Fermanteção (horas)
160
180
Polpa
Semente
6,5
6,0
pH
pH
6,5
2,5
0
20
40
60
80
100
120
140
160
180
Tempo de Fermentação (horas)
A invertase neutra, apesar de apresentar valores ótimos de pH fixos para maior atividade
da enzima (PH 16, polpa pH de 6,5 e semente pH 7,5; TSH 1188, polpa e semente pH 7,5), atua
fora da faixa de pH durante todo o processo de fermentação como pode ser observado na Figura
05- A e B (valores de pH entre 4,1 a 5,78 na polpa e 4,5, a 6,84 na semente para o cultivar PH 16
e valores de pH entre 4,16 a 4,97 na polpa e 4,58 a 6,89 na semente, para TSH 1188). Isso
82
implica dizer que a invertase neutra não possui atuação nestas condições de fermentação para os
cultivares estudados.
As variações do pH, assim como encontrada na polpa e semente dos cultivares estudados
durante o processo de fermentação, afeta a ionização de resíduos de aminoácidos essenciais no
sítio ativo, o qual está envolvido na ligação do substrato e o catalizador. Alguns resíduos
ionizáveis podem ser localizados na periferia do sítio ativo, vulgarmente conhecido como
resíduos não essenciais. Esta ionização pode provocar distorções no sítio ativo e, portanto, afetar
indiretamente a atividade da enzima (BHATTI et al., 2006).
Com relação à temperatura ótima de atuação, a invertase ácida para o cultivar PH 16
(Figura 06- A), apresentou na polpa maior atividade a 33°C e na semente apresentou 02 picos
para ótima atividade da enzima, o primeiro a 28°C e o segundo a 43ºC. A partir do gráfico, fica
evidenciado que a temperatura somente irá favorecer a ação da enzima na polpa nas primeiras 36
horas de fermentação, no restante do processo apenas 32% da atividade máxima da enzima será
atingida. Para a semente, a maior atividade da enzima será favorecida do primeiro ao terceiro dia
de fermentação (20 a 72 horas aproximadamente).
Para a invertase neutra (Figura 06–B), como já evidenciado anteriormente, na polpa a
enzima apresenta maior atuação do que na semente. Apesar de sua maior atividade (52°C e
atividade de 0,43 mg glicose.mg proteína-1.h-1) encontrar-se fora da faixa de temperatura
alcançada durante a fermentação (temperatura máxima de 51°C), mas ainda assim a atividade é
maior no final da fermentação. Na semente, a atividade da enzima é maior a 50°C (0,17 mg
glicose.mg proteína-1.h-1), e sua maior atuação ocorre no sexto dia de fermentação.
No cultivar TSH-1188 (Figura 06-C), a máxima atividade da enzima ocorre a 31°C para a
polpa em relação à invertase ácida. A ação desta enzima é maior apenas nos 2 primeiros dias,
havendo uma redução da atividade de aproximadamente 44% quando a temperatura atinge os
43°C. Para a semente a máxima atividade é alcançando a 27ºC (0,73 mg glicose.mg proteína-1.
h-1) e a 43°C (0,70 mg glicose.mg proteína-1.h-1), assim após 48 horas do início da fermentação a
atividade da enzima é reduzida a 33% e novamente volta a atingir sua máxima atividade em 72
horas, permanecendo por 12 horas e então é outra vez reduzida a 64% da atividade máxima. Para
a invertase neutra (Figura 06-D), tanto polpa quanto semente apresenta comportamento bastante
semelhante, alcançando maior atividade da enzima a 50ºC.
83
Como pode ser observada a partir do gráfico, essa maior atividade é alcançada a partir do quarto
dia do processo de fermentação.
Figura 06. Parâmetros de fermentação e temperatura ótima de atuação da Invertase. (A) PH 16 – Invertase
Ácida; (B) PH 16 – Invertase Neutra; (C) TSH - Invertase Ácida; (D) TSH 1188 – Invertase Neutra.
B.
120
0,8
100
0,6
80
60
0,4
40
0,2
0,0
20
20
30
40
50
60
0
(Atividade (mg glicose.mg proteína-1.h-1)
140
Tempo de Fermentação (horas)
1,0
0,5
160
Polpa
Semente
Tempo de Fermentação
-1
0,4
100
0,3
80
0,2
60
40
0,1
20
0,0
20
30
40
50
60
0
Temperatura (°C)
C.
D.
Polpa
Semente
Tempo de Fermentação
0,75
120
100
0,60
80
0,45
60
0,30
40
0,15
0,00
20
20
30
40
Temperatura (°C)
50
60
0
-1
-1
140
Atividade (mg glicose.mg proteína .h )
-1
0,90
0,30
160
Tempo de Fermentação (horas)
1,05
-1
140
120
Temperatura (°C)
Atividade (mg glicose.mg proteína .h )
160
Polpa
Semente
Tempo de Fermentação
160
Polpa
Semente
Tempo de Fermentação
0,25
140
120
0,20
100
0,15
80
60
0,10
40
0,05
0,00
20
20
30
40
50
60
Tempo de Fermentação (horas)
-1
Atividade (mg glicose.mg proteína .h )
1,2
Tempo de Fermentação (horas)
A.
0
Temperatura (°C)
A partir das correlações apresentadas, fica evidente que em ambos os cultivares, a
semente apresenta maior atividade do que a polpa em relação a invertase ácida e para invertase
neutra ocorre o inverso, a polpa apresenta maior atividade que na semente. Comparando-se as
isoenzimas, pode-se afirmar que a atividade da invertase ácida é maior que a atividade da
84
invertase neutra tanto na polpa como na semente (4 a 5 vezes maior) durante o processo de
fermentação acompanhado nos dois cultivares. Este fato indica que esta enzima é cineticamente
mais eficiente e pode ser a principal forma de enzima vacuolar envolvida na hidrólise da sacarose
(SACHDEVA et al., 2003).
Os resultados expostos no presente estudo comprovam a diferença e especificidade
existentes entre os cultivares de cacau, e entre polpa e semente em cada cultivar. Sugere-se que
no decorrer do processo de fermentação, sejam utilizados critérios específicos para cada cultivar
de cacau, tomando como base suas especificidades e parâmetros ideais para prolongar e
potencializar a atividade da invertase, uma vez que sua estabilidade e atividade são fatores
limitantes para a conversão total da sacarose e formação de precursores de sabor durante a
fermentação (HANSEN et al., 1998).
As enzimas exibem diferentes estabilidades durante o processo de fermentação,
principalmente no que se refere à inativação. Esta é causada pelo calor gerado durante o processo,
pela formação de ácidos e presença de polifenóis, portanto o período real da acessibilidade e
atuação das enzimas aos substratos, é curto (HANSEN et al., 2000). Sendo assim, o controle da
temperatura e do pH irá proporcionar maior eficiência das isoenzimas, prolongando o período de
melhor atuação durante o processo
fermentativo, propiciando uma melhor qualidade das
amêndoas de cacau e por consequência, maior qualidade na produção de chocolates
monovarietais, no que diz respeito à formação e potencialização dos precursores de aroma e
sabor.
85
REFERÊNCIAS
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86
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87
CONCLUSÕES FINAIS
x Os resultados expostos no presente estudo evidenciam a diferença e especificidade existente
entre os cultivares de cacau (PH 16 e TSH 1188) e entre polpa e semente em cada cultivar, em
relação à atividade enzimática da polifenoloxidase e invertase.
x A PPO apresentou boa afinidade para o substrato catecol, assim como a invertase apresentou
para o substrato sacarose, uma vez que quanto menor o valor de Km maior será a afinidade da
enzima pelo o substrato.
x Com relação ao efeito do pH na atividade da PPO, foi observado que para o cultivar TSH
1188 a polpa apresentou maior atividade que a semente, e para o cultivar PH 16, as atividades
possuem comportamentos semelhantes. Foi evidenciado que a ação da PPO na semente em
ambos os cultivares, é favorecida pelo pH no estágio inicial da fermentação (primeiros 3 dias).
Em pH alcalino há uma diminuição brusca da atividade, chegando a representar entre 70 a 90 %
de perda no seu potencial. Para a invertase em ambos os cultivares, a atuação da invertase ácida
é favorecida mais na polpa do que na semente. A invertase neutra, apesar de apresentar valores
ótimos de pH fixos para maior atividade da enzima, atua fora da faixa de pH durante todo o
processo de fermentação, o que
implica dizer que esta enzima não possui atuação nestas
condições de fermentação para os cultivares estudados, porém apresenta maior atividade na polpa
do que na semente.
x Com relação à temperatura ótima de maior atuação das enzimas, foi observado que nos dois
cultivares, tanto na polpa quanto na semente, a atividade da PPO diminuiu gradativamente com o
aumento da temperatura, o que sugere que altas temperaturas não a favorecem, e implica em
afirmar que zona de maior atuação desta enzima é entre 25 e 30°C. Para a enzima invertase para
ambos os cultivares, foi evidenciado que a atividade da invertase ácida é maior na semente do
que na polpa. Para invertase neutra, a polpa apresenta maior atividade que a semente e sua
atuação é favorecida sob altas temperaturas, apresentando zona de maior atividade entre 50 e
52°C. Comparando-se a atuação das duas isoenzimas (ácida e neutra) nos dois cultivares, tanto na
polpa quanto na semente, é possível afirmar que a atividade da invertase ácida é maior (4 a 5
vezes) do que na invertase neutra. Este fato indica que esta enzima é cineticamente mais eficiente
e pode ser a principal forma de enzima vacuolar envolvida na hidrólise da sacarose durante o
processo de fermentação.
88
x As correlações apresentadas neste estudo sugerem que no decorrer do processo de
fermentação, sejam utilizados critérios específicos para cada cultivar de cacau, tomando como
base suas especificidades e parâmetros ideais, para que se possa prolongar e potencializar a
atividade destas enzimas. Para a PPO, o controle desses parâmetros é de suma importância, visto
que a oxidação dos compostos fenólicos presentes no cacau, realizada pela enzima, é
determinante para às características sensoriais do chocolate a ser produzido, principalmente no
que diz respeito à redução do amargor e da adstringência. Logo, prolongar a atuação da PPO em
temperaturas mais baixas, através do aumento na frequência e na quantidade dos revolvimentos
da massa de cacau no início do processo de fermentação, pode retardar a elevação da temperatura
e a queda do pH, o que poderá favorecer a atuação destas enzimas nos cultivares estudados. Com
relação à invertase, o controle desses parâmetros é crucial para prolongar sua atividade, uma vez
que a estabilidade e atividade desta enzima são fatores limitantes para a conversão total da
sacarose e formação de precursores de sabor durante a fermentação e que serão continuados e
potencializados nas etapas seguintes de secagem e principalmente na torrefação.
x O controle da temperatura e do pH irá proporcionar maior eficiência das enzimas estudadas,
prolongando o período de melhor atuação durante o processo fermentativo, uma vez que estas
exibem diferentes estabilidades durante o processo, principalmente no que se refere à inativação.
Esta é causada pelo calor gerado durante o processo, pela formação de ácidos e presença de
polifenóis, portanto o período real da acessibilidade e atuação das enzimas aos substratos é curto.
Logo, o controle das condições de fermentação e até mesmo a possibilidade de intervenções
tecnológicas, como a aplicação de enzimas exógenas comerciais de padrão de atividade
semelhantes às nativas do cacau, irão propiciar uma melhor qualidade das amêndoas de cacau e
por consequência, maior qualidade na produção de chocolates monovarietais, no que diz respeito
à formação e potencialização dos precursores de aroma e sabor.
89
SUGESTÕES PARA ESTUDOS FUTUROS
x Sugere-se a extração e caracterização da enzima protease e suas isoenzimas, nos mesmos
cultivares estudados no presente trabalho, para que a caracterização das principais enzimas
presentes no cacau seja completa;
x A partir da caracterização e determinação das condições ótimas de atuação das enzimas
polifenoloxidade, invertases e proteases,
poderão ser fornecidos subsídios necessários para
promover possíveis intervenções tecnológicas durante o processo de fermentação do cacau e a
aplicação do controle dos parâmetros de fermentação apontados, visando a melhoria da qualidade
do cacau produzido e principalmente melhoria na qualidade do chocolate a ser processado.