CENTRO DE PESQUISA EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
MESTRADO EM CIÊNCIAS DA REABILITAÇÃO
EMILY DELALIBERA RUZZON
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR DE
VITAMINA D (VDR) E SEUS HAPLÓTIPOS COM O
DESENVOLVIMENTO DE OSTEOPOROSE EM IDOSOS DO
SUL DO BRASIL
Londrina
2014
EMILY DELALIBERA RUZZON
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR DE
VITAMINA D (VDR) E SEUS HAPLÓTIPOS COM O
DESENVOLVIMENTO DE OSTEOPOROSE EM IDOSOS DO
SUL DO BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de PósGraduação em Ciências da Reabilitação
(Programa Associado entre Universidade
Estadual de Londrina - UEL e Universidade
Norte do Paraná - UNOPAR), como requisito
parcial à obtenção do título de Mestre em
Ciências da Reabilitação.
Orientador: Profª. Drª. Regina Célia PoliFrederico
Londrina
2014
AUTORIZO A REPRODUÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR
QUALQUER MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO
E PESQUISA, DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de catalogação-na-publicação
Universidade Norte do Paraná
Biblioteca Central
Setor de Tratamento da Informação
R951a
Ruzzon, Emily Delalibera
Análise de polimorfismos do gene receptor de vitamina D (VDR) e seus
haplótipos com o desenvolvimento de osteoporose em idosos do Sul do Brasil /
Emily Delalibera Ruzzon. Londrina: [s.n], 2014.
xii; 49f.
Dissertação (Mestrado). Ciências da Reabilitação. Universidade Norte do
Paraná/Universidade Estadual de Londrina.
Orientadora: Profª Drª. Regina Célia Poli-Frederico
1- Ciências da reabilitação - dissertação de mestrado – UNOPAR/UEL 2Osteoporose 3- Polimorfismo genético 4- Receptor de vitamina D 5- Idosos 6Haplótipo I- Poli-Frederico, Regina Célia; orient. II- Universidade Norte do
Paraná. III- Universidade Estadual de Londrina.
CDU615.8
EMILY DELALIBERA RUZZON
ANÁLISE DE POLIMORFISMOS DO GENE RECEPTOR DE
VITAMINA D (VDR) E SEUS HAPLÓTIPOS COM O
DESENVOLVIMENTO DE OSTEOPOROSE EM IDOSOS DO
SUL DO BRASIL
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação
(Programa Associado entre Universidade
Estadual de Londrina [UEL] e Universidade
Norte do Paraná [UNOPAR]), como requisito
parcial à obtenção do título de Mestre em
Ciências da Reabilitação.
BANCA EXAMINADORA
____________________________________
Prof.ª Dr.ª Regina Célia Poli-Frederico
Universidade Norte do Paraná
____________________________________
Prof. Dr. Rubens Alexandre da Silva Júnior
Universidade Norte do Paraná
____________________________________
Prof.ª Dr.ª Roberta Losi Guembarovski
Universidade Estadual de Londrina
Londrina, _____de ___________de _____.
Dedico esse trabalho primeiramente a Deus,
por ter me dado força e perseverança de seguir
em frente e a minha família pelo amor, carinho
e confiança, me ajudando a chegar onde
cheguei.
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por ter me concedido a vida e estar sempre
iluminando meus passos e me guiando a tomar as decisões corretas.
Aos meus pais: Nelson e Irene, e a minha irmã Eloisi que sempre me
deram forças para seguir em frente me apoiando e me aconselhando desde o início,
com todo o amor e dedicação que só eles são capazes de oferecer e pela confiança
depositada em mim.
A minha orientadora Prof.ª Dr.ª Regina Célia Poli-Frederico, por ter
me acompanhado desde a graduação e ter aberto meus caminhos para o
conhecimento, sempre acreditando em minha capacidade, e também a todos os
professores que contribuíram para a minha formação.
Às minhas amigas Myriam F. Merli, por tantos momentos vividos
durante o mestrado, por comprartilhamos nossas dificuldades e nossas alegrias.
Obrigada pelo total incentivo antes mesmo do inicio do mestrado. À técnica Flávia
Kawahigashi, por me ajudar nas práticas laboratoriais e por se tornar uma verdadeira
amiga, necessária em todos os momentos. À Cintia Martignago, pelas noites
passadas no laboratório, pela ajuda fundamental em meu desempenho prático.
Aos meus verdadeiros amigos, dentro e fora do mestrado que
sempre acreditaram em meu potencial vibrando e parabenizando por cada etapa
concluída, e os que de alguma forma contribuíram para essa conquista!
Aos professores componentes da banca Prof.º Dr.º Rubens
Alexandre da Silva Junior e Prof.ª Dr.ª Roberta Losi Guembaroviski pela contribuição
oferecida para este trabalho.
Por
fim,
às
agências
financiadoras
Coordenação
de
Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) e Conselho Nacional de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pelo suporte financeiro.
“Por vezes sentimos que aquilo que
fazemos não é senão uma gota de água no
mar. Mas o mar seria menor se lhe faltasse
uma gota”.
Madre Tereza de Calcutá
“Para cultivar a sabedoria, é preciso força
interior. Sem crescimento interno, é difícil
conquistar a autoconfiança e a coragem
necessárias. Sem elas, nossa vida se
complica. O impossível torna-se possível
com a força de vontade”.
Dalai Lama
RUZZON, Emily Delalibera. Análise de polimorfismos do gene receptor de
vitamina D (VDR) e seus haplótipos com o desenvolvimento de osteoporose
em idosos do sul do Brasil. 2014. 45fls. Trabalho de Conclusão de Curso do
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação (Programa Associado
entre Universidade Estadual de Londrina [UEL] e Universidade Norte do Paraná
[UNOPAR]) – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2013.
RESUMO
Introdução: A osteoporose é uma doença multifatorial que acomete o metabolismo
ósseo, diminuindo a densidade mineral óssea, levando a um aumento da
suscetibilidade a quedas com fraturas recorrentes. Por possuir grande fator genético
agregado ao seu desenvolvimento, polimorfismos em genes reguladores do
metabolismo dos ossos e do cálcio estão sendo estudados com frequência nos
últimos anos. Entre esses genes, está o receptor de vitamina D (VDR) que promove
o aumento da absorção intestinal de cálcio com consequente aumento da
mineralização óssea. O gene VDR é constituído por 9 éxons e está localizado em
12q13.1, possuindo cerca de 100kb. Entre os polimorfismos de nucleotídeos únicos
(SNPs) deste gene os mais estudados são: BsmI, ApaI, TaqI e FokI. A maioria dos
estudos genéticos enfoca a associação entre estes SNPs no gene VDR e a
densidade mineral óssea, entretanto os resultados ainda não são conclusivos.
Adicionalmente, poucos estudos têm investigado a relação entre a presença de
determinados haplótipos no gene VDR e o desenvolvimento da osteoporose.
Objetivo: O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre os polimorfismos
BsmI, ApaI, TaqI e FokI do gene VDR e seus haplótipos com a suscetibilidade a
osteoporose em idosos fisicamente independentes cadastrados nas unidades
básicas de saúde do município de Londrina/PR. Métodos: A amostra foi composta
por 257 idosos, de ambos os gêneros, sendo 43 indivíduos sem osteoporose
(controle), 78 portadores da doença e 136 indivíduos com osteopenia. A
osteoporose foi avaliada por meio de raio X de dupla absorbância.. A genotipagem
foi feita pela técnica de PCR em tempo real pelo sistema TaqMan®. O índice de
massa corporal (IMC) dos pacientes também foi analisado. O teste do 2 foi realizado
para associação das variáveis demográficas e dos polimorfismos do gene VDR, bem
como para determinar o equilíbrio de Hardy-Weinberg. A análise da regressão
logística simples e múltipla foi usada para testar a associação entre a osteoporose e
as variáveis independentes. A análise dos haplótipos foi realizada através do
programa Haploview 4.2. Resultados: O grupo com osteoporose foi composto por
mulheres (79,5%) e por indivíduos com 70 anos ou mais (47,4%). Não foi encontrada
associação estatisticamente significativa entre as frequências alélica e genotípica e
os polimorfismos estudados. Porém, quando foi conduzida a análise de regressão
logística entre os haplótipos e a variável dependente foi observado que portadores
do haplótipo bAT (BsmI, ApaI e TaqI) possuem 2,36 (95% IC: 1,360 – 4,109; p =
0,002) vezes mais chances de terem osteoporose e portadores do haplótipo BaT
possuem fator protetor de 0,495 (95% IC: 0,299 – 0,820; p = 0,006) comparados
com o haplótipo de referência BAt. Conclusão: Resultados do presente estudo
mostraram associação estatisticamente significativa entre o desenvolvimento de
osteoporose em mulheres (79,5%, p = 0,040), em pacientes com idade acima dos 70
anos (47,4%, p = 0,024) e em indivíduos com IMC normal (43,6%, p = 0,000). Foi
observado também que o haplótipo BaT apresenta um fator protetor de 49% contra o
desenvolvimento da osteoporose, enquanto indivíduos portadores do haplótipo bAT
apresentaram 2,36 vezes mais chances de desenvolverem esta doença.
Palavras-chave: Osteoporose. Polimorfismo Genético. Receptor de Vitamina D.
Idoso. Haplótipo.
RUZZON, Emily Delalibera. Analysis of haplotypes and polymorphisms of the
vitamin D receptor gene (VDR) and the development of osteoporosis in the
elderly in Southern Brazil. 2014. 45fls. Trabalho de Conclusão de Curso do
Programa de Pós-Graduação em Ciências da Reabilitação (Programa Associado
entre Universidade Estadual de Londrina [UEL] e Universidade Norte do Paraná
[UNOPAR]) – Universidade Norte do Paraná, Londrina, 2014.
ABSTRACT
Background: Osteoporosis is a multifactorial disease that affects bone metabolism ,
decreasing bone mineral density, leading to an increased susceptibility to recurrent
falls and fractures. By owning large genetic factor added to their development,
polymorphisms in genes regulating bone metabolism and calcium are often studied in
recent years. Among these genes, are the vitamin D receptor (VDR) that promotes
increased intestinal calcium absorption with a consequent increase in bone
mineralization. The VDR gene consists of 9 exons and is located on 12q13.1, having
about 100kb. Between single nucleotide polymorphisms (SNPs) of this gene most
studied are: BsmI , ApaI , TaqI and FokI. Most genetic studies have focused on the
association between these SNPs in the VDR gene and bone mineral density,
however the results are not yet conclusive. Additionally, few studies have
investigated the relationship between the presence of certain haplotypes in the VDR
gene and the development of osteoporosis. Objective: The aim of this study was to
evaluate the association between the BsmI, ApaI, TaqI and FokI VDR gene
polymorphisms and their haplotypes with susceptibility to osteoporosis in elderly
physically independent registered in basic health units in Londrina / PR . Methods:
The sample comprised 257 elderly of both genders, with 43 individuals without
osteoporosis (control), 78 patients with the disease and 136 patients with osteopenia.
Osteoporosis was assessed by dual X -ray absorbance. Genotyping was done by
PCR in real time by TaqMan®. The body mass index (BMI) of patients was also
analyzed. The test was carried out for 2 combination of demographic and
polymorphism of the VDR gene variables as well as to determine the Hardy Weinberg equilibrium. The analysis of simple and multiple logistic regression was
used to test the association between osteoporosis and independent variables. The
analysis of haplotypes was performed using the Haploview 4.2 program. Results:
The group consisted of osteoporotic women (79.5 %) and individuals aged 70 years
or more (47.4 %). No statistically significant association was found between the allele
and genotype frequencies and polymorphisms. When was conducted logistic
regression analysis between haplotypes and the dependent variable, however, it was
observed that carriers of the haplotype Bat (BsmI , ApaI and TaqI) are 2.36 (95%CI:
1.360-4.109, p=0.002) times more likely having osteoporosis patients and have Bat
haplotype protective factor of 0.495 (95 %CI: 0.299-0.820, p=0.006) compared with
the reference haplotype bat. Conclusion: Results of this study showed statistically
significant association between the development of osteoporosis in women (79.5%,
p=0.040) in patients aged above 70 years (47.4%, p=0.024) and in subjects with
normal BMI (43.6%, p=0.000). It was also observed that the haplotype bat has a
protection factor of 49% against the development of osteoporosis, while individuals
carrying the haplotype BAT contained 2.36 times more likely to develop this disease.
Key-words: Elderly. Genetic polymorphism. Vitamin D receptor. Osteoporosis.
Haplotype.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Esquema representativo do gene VDR e localização dos principais
polimorfismos conhecidos.........................................................................................18
Figura 2 - Distribuição genotípica geral das amostras, indicando homozigotos e
heterozigotos..............................................................................................................40
Figura 3 - Genotipagem individual indicando amostra homozigoto para FAM.........40
Figura 4 - Genotipagem individual indicando amostra homozigoto para VIC...........40
Figura 5 - Genotipagem individual indicando amostra heterozigoto FAM/VIC.........41
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Distribuição das características gerais da população estudada..............28
Tabela 2 - Associação entre caracteristicas gerais, genotípicas e alélicas com os
grupos controle, osteopenia e osteoporose..............................................................30
Tabela 3 - Regressão logística simples e múltipla do grupo controle e osteoporose
com caracteristicas gerais e haplótipos do gene receptor de vitamina D.................31
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
DEXA
Raio X de Dupla absorbância
DMO
Densidade Mineral Óssea
DNA
Ácido desoxirribonucleico
DP
Desvio Padrão
EDTA
Ácido Etilenodiamino Tetra-Acético
EELO
Estudo Sobre o Envelhecimento de Londrina
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IC
Intervalo de Confiança
IMC
Índice de Massa Corporal
LD
Desequilíbrio de Ligação
OMS
Organização Mundial de Saúde
OR
Odds Ratio
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
PHT
Paratormônio
RNAm
Ácido ribonucleico mensageiro
RS
Região de SNP
SNP
Polimorfismo De Nucleotídeo Único
SPSS
Statistical Package for Social Science
UBS
Unidade Básica de Saúde
UVB
Radiação Ultravioleta B
VDR
Receptor de Vitamina D
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................13
2 REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO....................................15
2.1 OSTEOPOROSE...................................................................................................15
2.2 VITAMINA D........................................................................................................17
2.3 GENE RECEPTOR DE VITAMINA D (VDR)..............................................................18
2.4 ESTUDOS
DE
ASSOCIAÇÃO
ENTRE O
POLIMORFISMO
NO
GENE VDR
E A
OSTEOPOROSE.........................................................................................................20
3 OBJETIVO...........................................................................................................23
3.1 OBJETIVO GERAL.................................................................................................23
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS.....................................................................................23
4 ARTIGO..............................................................................................................24
CONCLUSÃO GERAL...........................................................................................36
REFERÊNCIAS......................................................................................................37
APÊNDICES...........................................................................................................39
APÊNDICE A – Imagens obtidas a partir do StepOne Software v.2.3...................40
ANEXOS.................................................................................................................42
ANEXO A – Parecer do Comitê de Ética................................................................43
ANEXO B – Termo de consentimento livre e esclarecido......................................44
ANEXO C – Normas da revista Osteoporosis International para submissão do
artigo.......................................................................................................................45
13
1 INTRODUÇÃO
O índice de envelhecimento populacional no Brasil vem crescendo
consideravelmente nos últimos anos. Dados do Instituto Brasileiro de Geografia e
Estatística (IBGE)(1) apontam que este índice se elevou de 31,7 em 2001 para 51,8 em
2011, ou seja, atualmente há uma pessoa de 60 anos ou mais para cada jovem de 15
anos ou menos, passando de 15,5 milhões em 2001 para 23,5 milhões em 2011,
sendo a maior parcela composta por mulheres (55,7%).
Uma das consequências do aumento no número de idosos na
população geral é a crescente procura por serviços de saúde. Nessa faixa etária, a
internação e o tempo de ocupação dos leitos são maiores. Neste sentido, o
envelhecimento populacional se traduz em aumento do uso dos serviços de saúde
devido a maior taxa de doenças e incapacidades adquiridas (2).
Entre essas doenças está a osteoporose, definida como uma patologia
multifatorial que acomete o metabolismo ósseo, diminuindo sua densidade mineral,
trazendo como consequências um aumento da suscetibilidade a quedas com fraturas
recorrentes(3).
Em decorrência desta doença apresentar um grande fator genético
associado ao seu desenvolvimento (4), estudos têm pesquisado qual a influência de
polimorfismos em genes que regulam o metabolismo ósseo com o aparecimento da
osteoporose(5);(6);(7). Diversos genes candidatos têm sido estudados, e dentre estes
incluem-se o receptor de paratormônio, receptor de estrógeno, colágeno tipo I,
receptor de vitamina D (VDR). Pelo fato de a vitamina D ser um dos compostos com
efeito comprovado no metabolismo ósseo, grande interesse tem sido demonstrado no
conhecimento de seu mecanismo de ação, principalmente do seu receptor 7, cuja ação,
dependente da ligação da vitamina D, promove o aumento da absorção intestinal de
cálcio com consequente aumento da mineralização óssea(8).
O gene VDR é constituído basicamente por 9 éxons e está localizado
no cromossomo 12, na posição 12q13.1, possuindo cerca de 100kb. A maioria de seus
polimorfismos está localizada em regiões regulatórias, podendo ocasionar alterações
na expressão gênica, mas não mudanças estruturais na sequência de aminoácidos
14
das proteínas sintetizadas. Entretanto, essas mudanças podem alterar a estabilidade
do RNAm por existir a possibilidade de estarem em desequilíbrio de ligação (quando
alelos adjacentes são juntamente herdados) com algum outro fator genético o que
poderia causar interferências na absorção de cálcio(9).
Polimorfismos são alterações genéticas decorrentes da substituição,
deleção ou inserção de bases nitrogenadas, alterando a sequência de DNA. São
herdados pela linhagem germinativa e estão presentes em mais de 1% da população.
Estas alterações quando envolvem somente um nucleotídeo são denominadas de
polimorfismo de nucleotídeos únicos (SNPs) gerando ou não sítios de clivagem para o
reconhecimento de enzimas restrição (10). Entre os SNPs mais estudados do gene VDR
estão o rs1544410I (BsmI), rs7975232 (ApaI), rs731236 (TaqI) e rs2228570 (FokI).
Estudos(6);(11) sugerem que há maior índice de fraturas nos portadores
dos genótipos bb, Aa e tt dos polimorfismos BsmI, ApaI e TaqI respectivamente. Além
disso, determinados polimorfismos do gene VDR parecem estar em desequilíbrio de
ligação indicando que o BAt está relacionado a maior estabilidade do RNAm(6);(11).
Considerando a falta de evidências claras entre a interação dos
polimorfismos no gene VDR, sobretudo dos haplótipos e o desenvolvimento de
osteoporose, este estudo teve como objetivos avaliar a associação entre os
polimorfismos BsmI, ApaI, TaqI e FokI do gene VDR e seus haplótipos com o
desenvolvimento de osteoporose em idosos fisicamente independentes.
15
2 REVISÃO DE LITERATURA – CONTEXTUALIZAÇÃO
2.1 OSTEOPOROSE
Entre as diversas patologias que acometem a população idosa está a
osteoporose, que é classificada como uma doença metabólica óssea multifatorial
caracterizada pela diminuição da densidade mineral do osso, ocasionando a redução
da resistência óssea e maiores riscos a quedas e fraturas (3). Ela ocorre a partir de um
desequilíbrio entre a formação e a reabsorção óssea, envolvendo osteoblastos e
osteoclastos, respectivamente. É uma das principais causas do aumento da morbidade
e mortalidade em homens e mulheres idosas (12).
Por se tratar de uma doença crônico-degenerativa e silenciosa, a
osteoporose pode progredir por anos de maneira assintomática, sendo um problema
tão preocupante como câncer e doenças cardiovasculares, atingindo tanto homens
quanto mulheres. Ressalta-se que a principal manifestação clínica apresentada são as
fraturas(13).
Segundo o Ministério da Saúde(14), a incidência de osteoporose vem
aumentando nos últimos anos devido a maior expectativa de vida da população
mundial. Dados populacionais de algumas regiões do mundo demonstram que, em
idosas norte americanas caucasianas, a prevalência é de 17%, comparadas às
hispano-americanas, com 12%, e às afro-americanas com 8%(15). Para a população
brasileira do estado de São Paulo segundo Camargo et al., o índice de
desenvolvimento desta doença pode variar de 13,9 a 28,8% em mulheres acima de 50
anos podendo chegar até 72,7% em mulheres acima de 80 anos (16). Guia em 2009
alisou 582 mulheres com idade igual ou superior a 60 anos e encontrou a seguinte
proporção: 8,2% das pacientes normais, 39% com osteopenia (estágio de perda óssea
leve irreversível que antecede a osteoporose) e 52,8% com osteoporose(17). Outro
estudo brasileiro analisou 999 laudos de densitometria óssea de mulheres acima de 49
anos e obteve o resultado de 32,7% com osteoporose(18).
A maneira mais eficiente para se diagnosticar a osteoporose nos
pacientes é através da técnica de absorciometria por radiografia de dupla energia
(DEXA), que fornece uma medida estática da densidade mineral óssea (DMO)
16
indicando a situação momentânea do paciente(18). Conforme descrito pela Organização
Mundial da Saúde (OMS) desde 1994, os critérios de classificação para o diagnóstico
da doença são analisados através do T score determinado pelo exame de
densitometria óssea nas seguintes condições: normal (T score até -1), osteopenia (T
score entre -1 e -2,5) e osteoporose (T score ≤ -2,5)(19).
A DMO é resultado do processo de formação do tecido ósseo
indicando a concentração de massa óssea em um determinado volume. A diminuição
da DMO está diretamente relacionada a ossos fracos e quebradiços, enquanto que o
aumento da DMO está relacionada a ossos fortes e resistentes (20).
Diversos aspectos estão envolvidos em seu desenvolvimento como
hábitos alimentares, baixa ingestão de cálcio e vitamina D, prática de atividades
físicas, idade avançada, gênero feminino, índice de massa corporal (IMC), etnia
branca, menopausa precoce, utilização de alguns medicamentos e fatores genéticos (3).
De caráter poligênico, a osteoporose possui grande relação genética
como a regulação de parâmetros de modulação da densidade, tamanho e forma do
osso. Um conhecimento mais aprofundado sobre os fatores envolvidos e a sua relação
com o meio ambiente, pode promover a escolha do melhor caminho para prevenção,
detecção e tratamento desta patologia, assim como das outras complicações por ela
geradas(13).
Outro aspecto relevante dessa patologia é o seu caráter irreversível.
Apesar disso, uma vez que o diagnóstico tenha sido feito é possível aderir a um
tratamento de “anti-progressão”. Uma das formas de tratamento é baseada em
hormônios. Os estrogênios são agentes promotores de anti-reabsorção, atuando na
inibição da atividade osteoclástica(21). Uma dieta rica em alimentos que contenham
cálcio aliada a exercícios físicos regulares e exposição solar em horário adequado, são
ótimos recursos para o tratamento dessa doença. Em pacientes que apresentarem
perda óssea ou risco desta, aconselha–se ingerir cálcio e vitamina D, ou dosagem de
suplementos equivalentes para a reposição destes(21).
Pelo fato da osteoporose ser uma doença crônica irreversível, ela gera
diminuição da qualidade de vida da pessoa portadora e incontáveis gastos para a
saúde pública. Segundo o Ministério da Saúde(14), em 2006 foram gastos R$ 49
17
milhões de reais com internações e R$ 20 milhões de reais com medicamentos para o
tratamento da osteoporose. Até outubro de 2009, tais gastos somaram R$ 57,61
milhões e R$ 24,77 milhões, respectivamente. O diagnóstico precoce aliado a
manutenção da saúde e do bem estar juntamente com o conhecimento genético prévio
fará com que a qualidade de vida dos idosos nesse aspecto seja maior e
consequentemente os gastos relacionados diminuirão.
2.2 VITAMINA D
Estudos relatam que a vitamina D possui importante papel regulatório
no metabolismo ósseo(22,
23)
. Essa vitamina pode ser obtida a partir da ingestão de
alguns alimentos, como peixes e frutos do mar, e suplementos alimentares, porém a
síntese cutânea é sua maior fonte, produzida através da exposição adequada à
radiação solar ultra violeta B (UVB)(24). A interação entre a forma ativa da vitamina D
(1,25 dihidroxivitamina D) com seu gene receptor de vitamina D (VDR) aumenta de 30
a 40% a eficiência da absorção de cálcio. É estimado que mais de 1 bilhão de pessoas
no mundo possuem deficiência de vitamina D(25).
A vitamina D absorvida no intestino delgado é transportada por
proteínas até o fígado e os rins para ser metabolizada em sua forma ativa. Uma
pequena fração é encontrada livre (26). Os níveis plasmáticos de paratormônio (PTH),
cálcio e fósforo, regulam a produção de vitamina D. Sua principal ação é manter os
níveis normais de cálcio e fosfato no plasma. Quando ocorre diminuição desses níveis,
o PTH juntamente com a vitamina D ativa, estimulam a atividade de diferenciação de
pré osteoclastos em osteoclastos maduros, fazendo assim a reabsorção óssea,
aumentando os níveis plasmáticos desses íons. A vitamina D também tem função na
mineralização óssea. Quanto em contato com o VDR, promove um feedback negativo,
fazendo com que haja menor liberação de PTH. Sendo assim, promove um aumento
na absorção intestinal de cálcio(25);(27).
Ressalta-se que fatores genéticos são responsáveis por 50 a 80% da
variabilidade inter individual da densidade mineral óssea (DMO)(28). Para ocorrer o
efeito biológico, a vitamina D se liga em seu receptor nuclear específico (VDR)
18
promovendo a síntese de RNAm para formação de proteínas como a osteocalcina que
atua na atividade de formação óssea dos osteoblastos(29).
2.3 GENE RECEPTOR DE VITAMINA D (VDR)
O gene VDR está localizado no cromossomo 12, na posição 12q13.1,
possui cerca de 100kb e é constituído basicamente por 9 éxons(29). (Figura 1).
Figura 1 - Esquema representativo do gene VDR e a localização dos principais
polimorfismos conhecidos. A numeração de 1 a 9 representa os éxons (1A a 1F são
éxons na região 5’). As letras abaixo de cada polimorfismo indicam as bases
nitrogenadas que são trocadas.
Os éxons 2 e 3 estão relacionados com o controle de ligação ao DNA,
e os éxons 7, 8 e 9 estão relacionados com o controle de ligação à vitamina D (30). A
maioria dos polimorfismos do gene VDR está localizada em regiões regulatórias,
podendo ocasionar alterações na expressão gênica, mas não mudanças estruturais na
sequência de aminoácidos das proteínas sintetizadas, entretanto podem alterar a
estabilidade do RNAm por existir a possibilidade de estarem em desequilíbrio de
ligação com algum outro fator genético, o que poderia causar interferências na
absorção de cálcio(9).
19
Vários estudos já relataram diversos polimorfismos nesse gene. Entre
os mais estudados estão os polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNP): ApaI, FokI,
BsmI e TaqI(8);(28);(31). Vale ressaltar que entre esses, o FokI e TaqI estão localizados
em regiões codificantes do gene. Estes SNPs recebem essa nomenclatura devido as
enzimas de restrição extraídas de bactérias, onde a primeira letra maiúscula se refere
ao gênero da bactéria, a segunda e terceira letras são referentes a espécie e o número
em algarismo romano indica o número da enzima descoberta. Essas enzimas são
responsáveis pela clivagem de sequências palindrômicas de DNA(32).
O polimorfismo rs1544410 (BsmI) está localizado no íntron 8 e resulta
na substituição de adenina por guanina (A/G). Conforme a nomenclatura é definido
como alelo “B” a presença da base adenina e como alelo “b” a presença da base
guanina. O polimorfismo rs7975232 (ApaI) também está localizado no intron 8 e resulta
na substituição de timina por guanina (T/G). A nomenclatura define como alelo “A”
presença da base timina e “a” presença da base guanina. Devido ao fato desses dois
polimorfismos estarem localizados próximos a região 3’ surge a hipótese de que a
forma alterada do gene receptor pode influenciar na estabilidade de transcrição, no
entanto há uma lacuna no conhecimento sobre prováveis efeitos na transcrição do
gene ou na estrutura da proteína(13).
O polimorfismo rs731236 (TaqI) está localizado no éxon 9 e resulta na
substituição de timina por citosina (T/C), sendo definido como “T” presença da base
timina e “t” presença da base citosina gerando a troca do códon ATT por ATC, porém
não alteram o aminoácido a ser sintetizado, pois ambos os códons sintetizam a
isoleucina, considerado portanto um polimorfismo silencioso (33).
O polimorfismo rs2228570 (FokI) está localizado na junção do intron 1
com o éxon 2, resultante da substituição de citosina por timina (C/T) e é definido como
“F” quando há presença da base citosina e “f” quando há presença da base timina (33,
34)
. A presença do alelo f gera uma versão mais longa da proteína com 3 aminoácidos
a mais quando comparado com a presença do alelo F. Estudos demonstram que a
proteína mais longa possui menor atividade transcricional quando comparado a
proteína curta, podendo resultar em diminuição da funcionalidade do VDR,
modificando assim o efeito determinado pela vitamina D (34).
20
Padrões de desequilíbrio de ligação no gene VDR foram propostos em
uma população canadense indicando a existência de 2 blocos. Um deles está
localizado na região 5’ e possui aproximadamente 8.4Kb, e o outro está localizado na
região 3’ possuindo aproximadamente 5.8 Kb. Neste segundo bloco, estão localizados
os SNPs BsmI, ApaI e TaqI. Por estarem no mesmo bloco, alelos desses
polimorfismos podem ser herdados juntos (35).
O desequilíbrio de ligação (LD) é uma medida para descrever a
associação entre alelos de polimorfismos adjacentes (36). Essa é uma medida
importante, pois a existência de um polimorfismo pode prever o outro. Elevados níveis
de LD em determinada área coincidem com limitados números de haplótipos nessa
mesma área. Haplótipos são blocos de alelos de polimorfismos adjacentes ligados. A
importância da avaliação de haplótipos na população se da pelo fato de que essa
associação entre os polimorfismos pode contribuir para prever o risco ao
desenvolvimento de doenças(36).
A relevância funcional desses polimorfismos ainda é pouco conhecida,
entretanto há estudos que mostram que ocorre desequilíbrio de ligação entre os
polimorfismos BsmI, ApaI e TaqI, sendo 3 haplótipos bem definidos: baT,
BAt e bAT, e o haplótipo BAt está relacionado a maior estabilidade do RNAm(33);(11).
2.4 ESTUDOS DE ASSOCIAÇÃO ENTRE O POLIMORFISMO NO GENE VDR E A OSTEOPOROSE
Vários estudos de associação entre os polimorfismos no gene VDR
e a osteoporose tem sido realizados em diferentes populações, entretanto, muitos
deles são discordantes quanto a seus resultados.
Estudo realizado em uma população de mulheres chinesas pós
menopausa encontrou uma associação estatisticamente significativa entre os
genótipos Aa e Bb (ApaI e BsmI, respectivamente) e a DMO. Foi verificado que
essas chinesas possuem maior DMO, e consequentemente menores chances de
desenvolverem osteoporose, quando comparadas aquelas com genótipo aa e bb(5).
Foi conduzido estudo de metanálise reunindo 41 pesquisas do tipo
caso controle em relação ao polimorfismo BsmI do gene VDR e a osteoporose em
mulheres caucasianas e asiáticas. A frequência do alelo B encontrada no grupo de
21
caucasianas com osteoporose foi de 44,51% e no grupo controle de 43,65%. Nas
asiáticas, foi de 23,36% no grupo com osteoporose e de 23,92% no grupo controle.
A frequência em ambas populações se mostrou similar tanto nos casos quanto nos
controles. Este estudo não encontrou nenhuma significância estatística entre o
polimorfismo BsmI do gene VDR e o risco do desenvolvimento à osteoporose em
populações asiáticas e caucasianas(7).
Em contrapartida, Ji et al., em sua análise envolvendo os
polimorfismos BsmI, ApaI, TaqI e FokI no gene VDR contemplou 17 estudos em
caucasianos, observando um total de 2112 sujeitos no grupo caso e 4521 no grupo
controle. Os resultados combinados dos estudos mostraram que o genótipo bb do
polimorfismo BsmI apresentou um efeito protetor contra fraturas ósseas (OR=0,87;
95% IC: 0,76 – 0,98). Quando separado por tipo de fratura, os genótipos bb e Tt
(BsmI e TaqI, respectivamente) apresentaram também efeito protetor em caso de
fratura de quadril (OR=0,82; 95% IC: 0,70 – 0,97 e OR=0,65; 95% IC 0,43 – 0,97,
respectivamente) e o genótipo tt (TaqI) foi considerado fator de risco (OR=1,74; 95%
IC 1,05 – 2,91). Em relação às fraturas vertebrais, os indivíduos portadores do
genótipo Aa (ApaI) apresentaram 1,63 vezes mais chances de terem esse tipo de
fratura do que os indivíduos portadores dos genótipos AA ou aa. Quanto ao
polimorfismo
FokI,
nenhuma
associação
estatisticamente
significativa
foi
encontrada(6).
Horst-Sikorska et al.(8) reuniram 501 mulheres caucasianas pós
menopausa com diagnóstico de osteoporose e compararam a frequência alélica dos
polimorfismos BsmI, ApaI e TaqI do gene VDR com o histórico de fraturas.
Encontraram que indivíduos portadores dos alelos b, a e T apresentaram maiores
chances à fraturas não vertebrais quando comparados aos indivíduos portadores
dos alelos B, A e t. Estes resultados estão em desacordo com o estudo de
Uitterlinden et al.(11) que relatam que o haplótipo BAt está relacionado a melhor
estabilidade
do
RNAm
e
por
consequência,
conferir
menor
chance
de
desenvolvimento de osteoporose.
A discrepância entre os estudos e a falta de evidências na
população do sul do Brasil motiva a pesquisa sobre a relação entre os polimorfismos
22
do receptor de vitamina D e o desenvolvimento de osteoporose em idosos, visto que
é uma doença com grande acometimento e que gera diminuição da qualidade de
vida do indivíduo portador.
23
3 OBJETIVO
3.1 OBJETIVO GERAL
Avaliar a associação entre os polimorfismos BsmI, ApaI, TaqI e FokI
do gene receptor de vitamina D (VDR), bem como de seus haplótipos, com o
desenvolvimento de osteoporose em idosos de uma região do sul do Brasil.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Investigar as frequências alélicas, genotípicas e haplotípicas do
gene receptor de vitamina D (VDR) em idosos;
Analisar a suscetibilidade ao desenvolvimento de osteoporose em
idosos com os fatores de risco como gênero, idade e índice de massa corporal;
Verificar a associação entre as variáveis gênero, idade, índice de
massa corporal e das variáveis biológicas (alelos, genótipos e haplótipos do gene
VDR) com o desenvolvimento de osteoporose em idosos.
24
4 ARTIGO
HAPLÓTIPOS ESPECÍFICOS DO GENE RECEPTOR DE VITAMINA D (VDR)
ESTÃO ASSOCIADOS AO DESENVOLVIMENTO DE OSTEOPOROSE EM
IDOSOS DO SUL DO BRASIL
(A ser submetido ao periódico Osteoporosis International – Qualis A1)
Emily Delalibera Ruzzon1,3, Myriam Fernanda Merli 1, Vanessa Suziane Probst2,
Karen Barros Parron Fernandes2, Rubens Alexandre da Silva Júnior 2,4, Paulo
Roberto Adona5, Regina Célia Poli-Frederico2,3
1
Programa de Mestrado e Doutorado Associado em Ciências da Reabilitação UELUNOPAR.
2
Centro de Pesquisa em Ciências da Saúde, Universidade Norte do Paraná
(UNOPAR), Londrina, Paraná, Brasil.
3
Laboratório de Biologia Molecular, Universidade Norte do Paraná (UNOPAR),
Londrina, Paraná, Brasil.
4
Laboratório de Avaliação Funcional e Performance Motora (LAFUP), Universidade
Norte do Paraná (UNOPAR), Londrina, Paraná, Brasil.
5
Agropecuária Laffranchi Comércio e Indústria LTDA conveniada a Universidade
Norte do Paraná (UNOPAR), Londrina, Paraná, Brasil.
*Correspondência ao autor: Regina Célia Poli-Frederico
Laboratório de Biologia Molecular, Universidade Norte do Paraná (UNOPAR), Av.
Paris 675, Jd Piza, CEP 86041-140. Cx. P. 401, Londrina, PR, Brasil. Fone: +55-433371-7820 Fax: +55-43-3371-7741
E-mail: [email protected]; [email protected]
Conflito de interesse: Não há conflito de interesse neste artigo.
25
Resumo
O objetivo deste estudo foi avaliar a associação entre os polimorfismos BsmI , Apal , TaqI e FokI do gene
receptor de vitamina D (VDR) e seus haplótipos com o diagnóstico de osteoporose em idosos fisicamente
independentes de uma cidade do sul do Brasil. O estudo incluiu 257 indivíduos de ambos os gêneros, com idade
média de 68 anos (DP = 6). A análise de polimorfismos do gene VDR foi realizada por PCR em tempo real
usando o sistema de TaqMan® a partir da extração de DNA de leucócitos do sangue periférico. O diagnóstico da
osteoporose foi obtido por realização de raios - X de dupla absorbância. O índice de massa corporal (IMC) dos
pacientes também foi analisado Análise de associação (qui-quadrado, regressão logística e simples e múltipla)
entre a variável dependente e as variáveis independentes foi realizada. O valor do nível de significância foi p <
0,05. Do total de sujeitos avaliados, 78 apresentaram osteoporose. Não foi detectada uma associação
estatisticamente significante entre osteoporose e os polimorfismos BsmI , Apal ,TaqI e FokI do gene VDR. Em
relação aos haplótipos, comparando osteoporose e controle, foi verificado que idosos portadores do haplótipo
bAT (BsmI, ApaI e TaqI) possuem 2,36 (95% IC: 1,4 – 4,1; p = 0,002) vezes mais chances de terem a doença e
portadores do haplótipo BaT foram menos propensos a desenvolverem a osteoporose (OR=0,49; 95% IC: 0,3 –
0,82; p = 0,006), comparados com o haplótipo de referência BAt.
Palavras-chave: Idoso, polimorfismo genético, receptor de vitamina D, osteoporose, haplótipo.
Abstract
The aim of this study was to evaluate the association between the BsmI , ApaI , TaqI and FokI VDR gene
polymorphisms and their haplotypes with the diagnosis of osteoporosis in elderly physically independent
registered in basic health units in Londrina/PR . The study included 257 subjects of both genders with a mean
age of 68 years (SD=6). The analysis of VDR gene polymorphisms was performed by Real Time PCR using
TaqMan® system from the extraction of DNA from peripheral blood leukocytes. The diagnosis of osteoporosis
was obtained by performing X-ray dual absorbance. Analysis of association (chi-square and simple and multiple
logistic regression) between the dependent variable and the independent variables was performed. The value of
the level of significance was p < 0.05. Of the total subjects evaluated, 78 presented osteoporosis. We did not
detect a statistically significant association between osteoporosis and BsmI, ApaI, TaqI and FokI VDR gene
polymorphisms. However there was a statistically significant association between the Bat haplotypes (BsmI,
ApaI and TaqI) (OR=2.36;95%CI:1.360- 4.109, p=0.002) and BAT (OR=0.495; 95%CI:0.299-0.820; p = 0.006),
compared with the reference haplotype bat.
Key-words: Elderly, genetic polymorphism, vitamin D receptor, osteoporosis, haplotype.
Introdução
A osteoporose é uma doença óssea metabólica comum entre as mulheres pós menopausa, caracterizada
pela diminuição da densidade mineral óssea (DMO) e deterioração da microarquitetura esquelética com
consequente aumento a fraturas [1, 2]. Dados epidemiológicos tem mostrado que diversos fatores de risco, tanto
ambientais quanto genéticos, levam ao desenvolvimento dessa doença, como baixa ingestão de cálcio, falta de
atividade física, baixa exposição à luz solar e polimorfismos em genes específicos responsáveis pelo
metabolismo do cálcio e dos ossos [3].
Cerca de 50 a 85% da densidade mineral óssea é determinada pela herdabilidade, segundo estudo
realizado em gêmeos [4]. Devido a esse grande fator genético associado, diversos estudos tem realizado análises
em vários genes responsáveis pela homeostase óssea como o receptor de vitamina D (VDR) [4, 5], receptor de
colágeno tipo 1α1 (COL1A1) [6, 7] e receptor de estrógeno (ER) [8].
Estudos demonstram que a vitamina D contribui de maneira importante no metabolismo ósseo [9, 10].
A ligação da forma ativa da vitamina com seu receptor gera um aumento de 30 a 40% na absorção de cálcio [11].
26
O gene VDR está localizado no cromossomo 12, na posição 12q13.1 e é constituído basicamente por 9 éxons
possuindo cerca de 100kb [12].
Entre os polimorfismos de nucleotídeos únicos (SNPs) mais frequentemente estudados desse gene
encontram-se o rs1544410 (BsmI, A/G, G = b), e rs7975232 (ApaI, T/G, G = a), localizados no intron 8,
rs731236 (TaqI, T/C, C = t) no éxon 9, e rs2228570 (FokI, C/T, T = f) no éxon 2 [13, 14].
Devido ao fato dos polimorfismos BsmI e ApaI estarem localizados próximos a região 3’, surge a
hipótese de que os mesmos podem influenciar na estabilidade de transcrição, no entanto há uma lacuna no
conhecimento de prováveis efeitos na transcrição do gene ou na estrutura da proteína [15].
O polimorfismo TaqI gera a troca do códon ATT por ATC, porém não altera o aminoácido a ser
sintetizado, pois ambos os códons sintetizam a isoleucina, considerado portanto um polimorfismo silencioso
[16].
O polimorfismo FokI promove a troca de um códon de iniciação, gerando a forma truncada da proteína
do VDR com 3 aminoácidos a menos que a versão não polimórfica, sendo a ultima representada pelo alelo f
[13]. Segundo estudos realizados in vitro, a versão curta da proteína (alelo F) parece ter atividade transcricional
maior do que a versão longa, podendo ocasionar maior funcionalidade do VDR [17,12].
Estudo relizado por Li e colaboradores [18] encontrou associação entre o genótipo heterozigoto dos
polimorfismos BsmI e ApaI e maior DMO em mulheres chinesas. Porém, há dados contraditórios sugerindo que
há maior índice de fraturas nos portadores dos genótipos bb, Aa e tt dos polimorfismos BsmI, ApaI e TaqI,
respectivamente [19].
Observando que a relevância funcional desses polimorfismos ainda é pouco conhecida, há estudos que
mostram desequilíbrio de ligação entre os polimorfismos BsmI, ApaI e TaqI, sendo que 3 haplótipos estão bem
definidos: baT, BAt e bAT, indicando que o haplótipo BAt está relacionado a maior estabilidade do RNAm
[14,15] e consequentemente menor risco ao desenvolvimento da osteoporose.
Considerando a falta de evidências claras entre a interação dos polimorfismos no gene VDR e seus
haplótipos e o desenvolvimento de osteoporose, este estudo teve como objetivo avaliar a associação entre os
polimorfismos BsmI, ApaI, TaqI e FokI do gene VDR bem como de seus haplótipos com o desenvolvimento de
osteoporose em idosos fisicamente independentes.
Metodologia
AMOSTRA
A amostra deste estudo (n = 257) foi constituída a partir de uma população de idosos cadastrados em
Unidades Básicas de Saúde (UBS) das cinco regiões da cidade (norte, sul, leste, oeste e centro) que participaram
do Projeto EELO – Estudo sobre Envelhecimento e Longevidade conduzido entre os anos de 2009 a 2011– cujo
objetivo foi realizar uma análise sobre as condições sociodemográficas e de saúde de idosos residentes no
município
de
Londrina/Paraná,
http://www2.unopar.br/sites/eelo.
Brasil.
Informações
detalhadas
estão
disponíveis
em:
27
Os critérios de inclusão adotados foram: ter idade igual ou superior a 60 anos, de ambos os gêneros, ser
fisicamente independente e aceitar participar do estudo voluntariamente. Características gerais como etnia,
gênero e idade foram coletadas a partir de questionário respondido pelos próprios participantes da pesquisa.
Todos os participantes após terem sido informados sobre os procedimentos aos quais seriam submetidos
assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido com o objetivo de respeitar a resolução 196/96 (20)]. O
projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da UNOPAR certificado pelo Conselho Nacional de
Saúde (PP/0100/010).
Diagnóstico de Osteoporose
257 idosos (184 mulheres e 73 homens) participaram do exame de densitometria óssea do fêmur e da
coluna lombar (L1-L4). O aparelho utilizado foi o densitômetro duo-energético (GE–PRODIGY PRIMO; X-ray;
fam beam). Os indivíduos foram classificados em três grupos: controle (até -1,0 DP), osteopênicos (-1,0 a -2,5
DP) e osteoporóticos (abaixo de -2,5DP), seguindo os critérios preconizados pela Organização Mundial de Saúde
(OMS).
Coleta do material para análise do DNA
O DNA foi obtido a partir de 200uL de leucócitos do sangue periférico, colhido com EDTA, utilizando
o Kit de extração de DNA (PureLink Genomic DNA Kits - Invitrogen), segundo as orientações do fabricante. Os
DNAs extraídos foram acondicionados em freezer a -80º C até o momento da realização das análises de
polimorfismo.
A avaliação da qualidade e quantidade de DNA foi realizada por meio de análise de absorbância em
espectrofotômetro (NanoDrop 2000 – Thermo Scientific) a 260nm e 280nm. Posteriormente, foi feita a diluição
do DNA em água ultra pura Milli-Q® para a concentração final de 30ng/uL.
Análise dos polimorfismos no gene do VDR por meio da Reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real
Para análise dos SNPs do gene VDR foi realizada a técnica de amplificação dos fragmentos de DNA
por meio da reação em cadeia da polimerase (PCR) em tempo real pelo sistema TaqMan® (Applied Biosystems,
Foster City, USA). Quatro polimorfismos foram verificados: rs731236 (TaqI), rs1544410 (BsmI), rs7975235
(ApaI) e rs2228570 (FokI).
A reação padronizada utilizada continha 20µL de volume final, sendo 10µl de Taqman® Genotyping
Master Mix (1x), 0,5µL de sonda (1x) (Applied Biosystems, Foster City, USA), 7,5µL de água ultrapura MilliQ® e 2µL de DNA (30ng/uL). Foi utilizado o termociclador StepOnePlus™ Real-Time PCR System (Applied
Biosystems, Foster City, USA) com a seguinte ciclagem: 60ºC por 30 segundos (pré desnaturação), 95ºC por 10
minutos para desnaturação inicial, 50 ciclos de 95ºC por 15 segundos (desnaturação) e 60ºC por 1 minuto e 30
segundos (pareamento dos iniciadores) e um ciclo final de extensão de 30 segundos a 60ºC. A avaliação dos
28
resultados foi realizada pelo StepOne Software v2.3. Exemplos de genótipos homozigoto dominante e recessivo
e heterozigoto estão representados no apêndice A.
Análise estatística
O programa estatístico SPSS (v.17, SPSS Inc., Chicago) foi usado para a análise dos dados.
Frequências, médias e desvio-padrão foram calculados para cada variável. O teste do 2 foi utilizado para testar a
associação entre a osteoporose e as variáveis independentes como: gênero, idade, índice de massa corporal e
frequências genotípicas e alélicas. Para a análise do equilíbrio de Hardy-Weinberg foi utilizado o teste do 2. A
análise da regressão logística simples e múltipla foi usada para testar a associação entre a osteoporose/osteopenia
e as variáveis independentes (gênero, idade, IMC e haplótipos). O nível de significância adotado para todas as
análises foi p < 0,05. Foi utilizado o programa Haploview 4.2 para calcular o desequilíbrio de ligação (LD) a
partir dos SNPs do gene VDR e estimar a frequência dos haplótipos.
Resultados
Participaram do presente estudo 257 idosos com idade média de 68 anos ± 6, sendo a maior parcela
representada pelo gênero feminino (71,6%), pré obeso (42,4%), portadores de osteopenia (52,9%) e de etnia
branca (59,9%) (Tabela 1).
Tabela 1 Distribuição das características gerais da amostra estudada
Caracteristicas
Gênero
Masculino
Feminino
N
%
73
184
28,4
71,6
Idade
60 a 64 anos
65 a 70 anos
Acima de 70 anos
75
98
84
29,2
38,1
32,7
Etnia
Branca
Não branca
154
103
59,9
40,1
Densidade Mineral Óssea
Normal
Osteopenia
Osteoporose
43
136
78
16,7
52,9
30,4
Índice de Massa Corporal
Normal
Baixo Peso
Pré-obeso
Obeso
64
4
109
80
24,9
1,6
42,4
31,1
29
Foi encontrada associação estatisticamente significativa entre a osteoporose, gênero, idade e IMC.
79,5% das mulheres apresentaram osteoporose. Segundo a idade dos individuos, foi observado 28,3% dos idosos
com idade acima dos 70 anos e 8,7% dos idosos com IMC normal. Adicionalmente, 50% dos obesos estavam
livres desta doença. Entetanto, as frequências alélicas (p = 0,530, p = 0,498, p = 0,876, p = 0,412) e genotípicas
(p = 0,697, p = 0,631, p = 0,497 e p = 0,901) não mostraram associação estatisticamente significantes com a
doença em questão para TaqI, BsmI, ApaI e FokI, respectivamente (Tabela 2).
Conforme descrito na Tabela 3, a análise da regressão logística simples indicou que o gênero, idade,
IMC e haplótipos foram associados com o desenvolvimento de osteoporose. Idosos do gênero masculino, pré
obesos ou obesos foram menos suscetiveis à osteoporose em relação às mulheres e peso normal (p < 0,05). Foi
verificado também que quanto maior a idade, maiores são os riscos do acometimento da doença (OR=1,3; 95%
IC: 1,05 – 1,6; p = 0,016).
Na regressão logística múltipla (Tabela 3), o gênero, idade, IMC e haplótipos permaneceram
associados. Os idosos do gênero feminino apresentaram maiores chances de desenvolverem osteoporose (OR=
5,19; 95%IC: 1,62 – 16,18 e p = 0,005) e os indivíduos pré obesos e obesos foram menos propensos a doença
(OR=0,66; 95%IC: 0,55 – 0,8; p = 0,000; OR=0,56; 95%IC: 0,46 – 0,69; p = 0,000, respectivamente). Em
contrapartida os idosos com idade superior a 70 anos apresentaram 1,3 vezes (IC 95%: 1,077 – 1,65) mais
chances de desenvolver a osteoporose comparado aos mais jovens. Em relação aos haplótipos, comparando os
grupos osteoporose e controle, foi verificado que idosos portadores do haplótipo bAT (BsmI, ApaI e TaqI)
possuem 2,36 (95% IC: 1,4 – 4,1; p = 0,002) vezes mais chances de terem a doença enquanto que portadores do
haplótipo BaT foram menos propensos a desenvolverem a osteoporose (OR=0,49; 95% IC: 0,3 – 0,82; p =
0,006), comparados com o haplótipo de referência BAt.
30
Tabela 2 Associação entre caracteristicas gerais, frequências genotípicas e alélicas com os grupos controle,
osteopenia e osteoporose
Características
n
Controle
%
Osteopenia
n
%
Osteoporose
n
%
p
Gênero
Masculino
Feminino
17
29
37,0
63,0
45
102
30,6
69,4
16
62
20,5
79,5
0,040*
Idade
60 a 64 anos
65 a 70 anos
Acima de 70 anos
15
18
13
32,6
39,1
28,3
46
60
41
31,3
40,8
27,9
18
23
37
23,1
29,5
47,4
0,024*
IMC
Normal
Baixo peso
Pré obeso
Obeso
4
19
23
8,7
41,3
50,0
30
1
67
49
20,4
7,0
45,6
33,3
34
3
28
13
43,6
3,8
35,9
16,7
0,000*
13
7
23
30,2
16,3
53,5
59
22
55
43,4
16,2
40,4
26
9
43
33,3
11,5
55,1
0,697
49
37
57,0
43,0
173
99
63,6
36,4
95
61
60,9
39,1
0,530
15
31
27,9
72,1
2
58
76
1,5
42,6
55,9
28
50
35,9
64,1
0,631
31
55
36,0
64,0
80
192
29,4
70,6
50
106
32,0
68,0
0,498
19
5
19
44,2
11,6
44,2
53
17
66
39,0
12,5
48,5
30
8
40
38,5
10,3
51,3
0,497
57
29
66,3
33,7
172
100
63,2
36,8
100
56
64,1
35,9
0,876
21
6
16
48,8
14,0
37,2
63
15
58
46,3
11,0
42,6
31
13
34
39,7
16,7
43,6
0,901
58
28
67,5
32,5
184
88
67,6
32,4
96
60
61,5
38,5
0,412
Genótipo TaqI
TT
Tt
Tt
Alelos
T
T
Genótipo BsmI
BB
Bb
Bb
Alelos
B
B
Genótipo ApaI
AA
Aa
Aa
Alelos
A
A
Genótipo FokI
FF
Ff
Ff
Alelos
F
F
*p < 0,05
31
Tabela 3 Regressão logística simples e múltipla entre os grupos controle e osteoporose com caracteristicas gerais
e haplótipos do gene receptor de vitamina D.
Características
Controle
Osteoporose
Modelo Simples
Valor
Modelo ajustado
de p
Valor
de p
N (%)
N (%)
OR (95% CI)
OR (95% CI)
Masculino
17 (23,3)
16 (21,9)
1
Feminino
26 (14,1)
62 (33,7)
2,534 (1,114 – 5,764)
60 a 64 anos
14 (18,7)
18 (24,0)
1
65 a 70 anos
18 (18,4)
23 (23,5)
0,998 (0,821 – 1,212)
0,981
1,040 (0,875 – 1,236)
0,655
> que 70 anos
11 (13,1)
37 (44,0)
1,292 (1,049 – 1,591)
0,016*
1,331 (1,077 – 1,646)
0,008*
4 (6,2)
34 (53,1)
1
Baixo peso
0
3 (75,0)
1,325 (0,845 – 2,078)
0,221
1,380 (0,841 – 2,265)
0,203
Pré-obeso
19 (17,4)
28 (25,7)
0,680 (0,560 – 0,825)
0,000*
0,665 (0,553 – 0,801)
0,000*
Obeso
20 (25,4)
13 (16,2)
0,573 (0,467 – 0,704)
0,000*
0,558 (0,456 – 0,683)
0,000*
BbAAtt
2 (4,7)
2 (2,6)
1
BbAatt
1 (2,3)
2 (2,6)
1,078 (0,689 – 1,687)
0,741
0,979 (0,598 – 1,604)
0,933
bbAATT
6 (14,0)
7 (9,0)
0,965 (0,605 – 1,538)
0,881
0,963 (0,662 – 1,401)
0,845
BbAaTt
11 (25,6)
21 (26,9)
1,165 (0,843 – 1,611)
0,354
1,118 (0,849 – 1,472)
0,429
BbAATt
10 (23,3)
15 (19,2)
1,064 (0,776 – 1,460)
0,699
1,050 (0,805 – 1,370)
0,717
bbaaTt
1 (2,3)
1 (1,3)
0,965 (0,525 – 1,774)
0,908
0,940 (0,468 – 1,889)
0,863
bbAaTt
1 (2,3)
3 (3,8)
1,248 (0,721 – 2,285)
0,395
1,235 (0,843 – 1,809)
0,278
bbAATt
-
3 (3,8)
2,043 (1,247 – 3,346)
0,005*
2,364 (1,360 – 4,109)
0,002*
BbaaTT
1 (2,3)
-
0,585 (0,280 – 1,223)
0,154
0,495 (0,299 – 0,820)
0,006*
BbAaTT
-
3 (3,8)
1,481 (0,949 – 2,311)
0,083
1,463 (0,969 – 2,208)
0,070
BbAATT
2 (4,7)
2 (2,6)
0,965 (0,522 – 1,783)
0,909
0,995 (0,584 – 1,694)
0,984
bbaaTT
2 (4,7)
7 (9,0)
1,199 (0,847 – 1,698)
0,306
1,139 (0,864 – 1,501)
0,356
bbAaTT
6 (14,0)
12 (15,4)
1,091 (0,806 – 1,475)
0,573
1,001 (0,774 – 1,295)
0,994
Gênero
1
0,027*
5,190 (1,619 – 16,177)
0,005*
Idade
1
IMC
Normal
1
Haplótipos
*p < 0,05
1
32
Discussão
Polimorfismos genéticos têm sido bastante estudados nos últimos anos visando o diagnóstico precoce de
diversas doenças com interesse em tratamento anterior a qualquer avanço prejudicial à saúde da população [21].
A osteoporose é uma doença óssea bem conhecida que afeta milhões de pessoas a cada ano, acometendo
principalmente mulheres após a menopausa pela falta do estrógeno, que age de forma protetora no metabolismo
dos ossos [1]. Por ser de caráter multifatorial e poligênica, é difícil a criação de programas de tratamento para
diagnóstico precoce.
O fato de a vitamina D possuir importante papel regulatório no metabolismo do cálcio e dos ossos
implica na constante análise de polimorfismos no gene do seu receptor (VDR) [10]. Observando a associação
dos fatores de risco (idade, gênero e IMC) com o desenvolvimento de osteoporose, esse estudo está em acordo
com outros autores [5,22], indicando que há maior prevalência do caso da doença em mulheres acima dos 70
anos de idade, ou seja, quanto maior a idade, maiores as chances de desenvolvimento, e IMC normal, devido ao
fato de a vitamina D ser lipossolúvel e se acumular no tecido adiposo, sendo assim, pessoas com IMC maior
possuem maior acumulo da vitamina e menores chances do desenvolvimento à osteoporose.
Em relação às análises das frequências alélicas e genotípicas com o desenvolvimento da doença, o
presente estudo não encontrou nenhuma associação estatisticamente significante (Tabela 2), estando de acordo
com Quin et al. [23], que realizaram uma metanálise em população asiática e caucasiana, não encontrando
nenhuma associação entre o polimorfismo BsmI e osteoporose. Horst-Sikorska et al. [5], também não
encontraram nenhuma associação entre os genótipos dos polimorfismos BsmI, ApaI e TaqI, assim como
Uitterlinden et al. [22] e Fang et al. [24].
Em contrapartida, Ji et al. [19] analisando 2112 mulheres com caso de fratura e 4521 no grupo
controle, todas caucasianas, encontraram maior proporção do genótipo bb (BsmI) em mulheres sem fraturas
(OR=0.87; 95 IC: 0.76, 0.98). Quando separado por tipo de fratura, os casos de fratura de quadril apresentaram
um efeito protetor de 82% nas portadoras do genótipo bb 65% nas portadoras do genótipo Tt (BsmI e TaqI)
(OR=0.82; 95% IC: 0.70, 0.97 e OR=0.65, 95% IC; 0.43, 0.97, respectivamente) e apresentaram 1,74 vezes mais
chances de ter a fratura na presença do genótipo tt (OR=1.74, 95% IC: 1.05, 2.91). Com relação às fraturas
vertebrais, as portadoras do genótipo Aa (ApaI) apresentaram 1,63 vezes mais chances de ter este tipo de fratura
(OR=1.63; 95% IC= 1.03, 2.59). O polimorfismo FokI não apresentou significância, sendo assim, nosso estudo
corrobora com esse resultado.
Outro estudo do tipo caso - controle realizado por Marozik et al. [6] analisou os polimorfismos BsmI,
ApaI e TaqI de 54 mulheres com osteoporose e 77 sem a doença. Foi encontrada significância estatística entre os
polimorfismos BsmI e ApaI. Em relação ao BsmI, portadoras do genótipo Bb possuem 2,64 (95% IC: 1,29 – 5,42;
p = 0,001) vezes mais chances de desenvolverem a doença , estando em desacordo com o estudo de Ji et al. [19],
e portadoras do alelo b em homozigoze, têm um fator de proteção de 0,24 (95% IC: 0,11 – 0,53 p = 0,001).
Associação alélica também foi demonstrada, indicando que o alelo B está relacionado negativamente com a
suscetibilidade da doença (OR=2,29; 95% IC: 1,38 – 3,81; p = 0,001) contrariamente ao alelo b (OR=0,44; 95%
IC: 0,26 – 0,73; p = 0,001).
33
Quanto ao polimorfismo ApaI, Marozik et al. [6] encontraram associação entre o genótipo AA como
fator de risco (OR=2,29; 95% IC: 1,38 – 3,81; p = 0,001) e aa como fator protetor (OR=0,25; 95% IC: 0,10 –
0,62; p = 0,001). Associação alélica analisada foi de que portadoras do alelo A possuem 2,73 vezes mais chances
de desenvolverem a osteoporose. Nenhuma associação foi encontrada quanto ao polimorfismo TaqI. Nosso
estudo corrobora com esse resultado [6].
Nota-se uma relevante discrepância dos resultados encontrados por vários pesquisadores quando se
avalia genótipos do gene VDR de forma isolada. Uma vez que sabemos que polimorfismos estão presentes em
uma determinada área no gene candidato, é importante compreender como se relacionam uns com os outros tanto
num sentido genético bem como em um sentido biologicamente funcional. Geneticamente, nós precisamos
compreender quais alelos estão ligados uns aos outros por meio do estudo de desequilíbrio de ligação entre os
polimorfismos. Funcionalmente, nós temos que determinar como certas combinações de alelos em um
determinado gene candidato podem aumentar ou diminuir determinados efeitos sobre a função gênica [15].
A discordância entre diversos estudos gera uma nova forma de avaliação como a de haplótipos, que
ainda é muito limitada relacionando o gene VDR e o desenvolvimento de osteoporose. Entretanto Uitterlinden et
al. [25], encontraram em seus estudos três haplótipos bem definidos: baT, BAt e bAT, sendo que o haplótipo
BAt está relacionado a uma maior estabilidade do RNAm e bAT está relacionado com menor DMO [25].
Segundo estes mesmos autores [25] foi encontrada uma diminuição significativa da DMO, e consequentemente
maiores chances de desenvolverem osteoporose, nos indivíduos portadores do haplótipo bAT (p = 0,04). Nosso
estudo encontrou resultados semelhantes a estes, onde foi demonstrado a associação entre haplótipos definidos e
a osteoporose, sendo que idosos portadores do haplótipo bAT apresentaram 2,36 mais chances de terem a doença
(OR=2,36; 95% IC: 1,360 – 4,109; p = 0,002), e os que eram portadores do haplótipo BaT eram menos
propensos a terem osteoporose quando comparados a pacientes saudáveis (OR=0,495; 95% IC: 0,299 – 0,820; p
= 0,006).
Nossos resultados fornecem evidências da composição de haplótipos, especialmente o bAT, que
deve ser um dos fatores que influencia a suscetibilidade à osteoporose em idosos Brasileiros. Considerando que
pouco se sabe a respeito da funcionalidade dos haplótipos neste gene candidato na população brasileira, a análise
desta combinação de polimorfismos no gene VDR em uma amostra desta população representa uma importante
informação em relação a um promissor componente genético da osteoporose no Brasil.
O presente estudo indicou associação significativa entre o desenvolvimento de osteoporose em
mulheres com IMC normal. Porém, não encontrou associação genotípica e alélica estatisticamente significante
entre os polimorfismos BsmI, ApaI, TaqI e FokI do gene VDR e osteoporose quando analisados isoladamente.
Além disso, foi observada associação entre dois haplótipos dos polimorfismos BsmI, ApaI eTaqI, sugerindo que
portadores do haplótipo bAT possuem 2,36 vezes mais chances de terem a patologia e portadores do haplótipo
BaT possuem fator protetor de 49% em relação ao desenvolvimento de osteoporose. Com os avanços da
genética molecular em prol da medicina individualizada, a genotipagem e a verificação de indivíduos que
possam apresentar um genótipo que confere maior suscetibilidade ao risco à osteoporose podem garantir melhora
clínica com base em tratamento anti-progressão e na reabilitação de pacientes já portadores da doença.
34
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36
CONCLUSÃO GERAL
Diante dos resultados encontrados foi possível realizar as seguintes
conclusões:
1- Não foi encontrada associação genotípica e alélica estatisticamente
significante entre os polimorfismos BsmI, ApaI, TaqI e FokI do gene VDR e o
diagnóstico de osteoporose quando analisados isoladamente, obtendo maior
frequência dos alelos dominantes dos polimorfismos ApaI, TaqI e FokI e do
alelo recessivo do poliorfismo BsmI em indivíduos com osteoporose.
2- Foi
encontrada
associção
significativa
entre
o
desenvolvimento
de
osteoporose em mulheres (79,5%, p = 0,040); em pacientes com idade acima
dos 70 anos (47,4%, p = 0,024) e também em indivíduos com IMC normal
(43,6%, p = 0,000).
3- Foi observado também uma associação estatisticamente significativa entre 2
haplótipos dos polimorfismos BsmI, ApaI eTaqI, sugerindo que portadoras do
haplótipo bAT possuem 2,36 vezes mais chances de terem a esta patologia e
portadores do haplótipo BaT apresentam uma proteção de 49% contra o
desenvolvimento da osteoporose.
37
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35. Poon AH, Laprise C, Lemire M, Montpetit A, Sinnett D, Schurr E, Hudson TJ (2004)
Association of vitamin D receptor genetic variants with susceptibility to asthma and atopy.
Am J Respir Crit Care Med 170:967-973.
36. Wall JD, Pritchard JK (2003) Haplotype blocks and linkage disequilibrium in the human
genome. Nat Rev Genet 4:587-597.
39
APÊNDICES
40
APÊNDICE A
Imagens obtidas a partir do StepOne Software v2.3.
Figura 2 – Distribuição genotípica geral das amostras, indicando homozigotos e
heterozigotos.
Figura 3 – Genotipagem individual indicando amostra homozigoto para FAM: Alelos
b, a, t, f para os polimorfismos BsmI, ApaI, TaqI e FokI, respectivamente
41
Figura 4 – Genotipagem individual indicando amostra homozigoto para VIC: Alelos
B, A, T, F para os polimorfismos BsmI, ApaI, TaqI e FokI, respectivamente.
Figura 5 – Genotipagem individual indicando amostra heterozigoto – FAM/VIC
42
ANEXOS
43
ANEXO A
Parecer do comitê de ética
44
ANEXO B
Termo de consentimento livre e esclarecido
Termo de consentimento livre e esclarecido para participação na pesquisa intitulada “PROJETO ELLO: ESTUDO
EPIDEMIOLÓGICO DOS FATORES SÓCIO-DEMOGRÁFICOS E INDICADORES DAS CONDIÇÕES DE SAÚDE DE IDOSOS DO MUNICÍPIO
DE LONDRINA-PR” (de acordo com a Resolução 196 de 10/10/1996 do Conselho Nacional de Saúde).
Eu,_______________________________________________________________________,
RG
nº
__________________________ livremente, consinto em participar da pesquisa “PROJETO ELLO: ESTUDO
EPIDEMIOLÓGICO DOS FATORES SÓCIO-DEMOGRÁFICOS E INDICADORES DAS CONDIÇÕES DE SAÚDE DE IDOSOS DO MUNICÍPIO
DE LONDRINA-PR” sob responsabilidade da professora Audrey Marquez de Souza, diretora do Centro de Pesquisa
em Saúde da Universidade do Paraná, localizada à Av. Paris, 675, Jardim Piza, Londrina/PR.
Objetivo da pesquisa:
Este estudo pretende avaliar os fatores sócio-demográficos e os indicadores das condições de saúde de idosos
independentes do munícipio de Londrina/PR,.
Procedimentos que serão necessários:
A pesquisa será conduzida da seguinte maneira:
a) inicialmente será realizada uma entrevista estruturada com o objetivo de obter informações sobre qualidade
de vida e funcionalidade motora;
b) quando necessário será realizado o exame de Raio X para verificar osteoartrite e osteoartrose;
c) quando necessário será realizado o exame de densitometria óssea a fim de verificar a presença de
osteoporose;
d) será necessário coletar uma pequena quantidade de sangue em jejum para realizar exames de sangue e
extração de DNA e RNA;
Esclarecemos que o risco decorrente da sua participação é o mesmo de procedimentos rotineiros de coleta
de sangue, ou seja, não haverá nenhum risco porque será utilizado material descartável e as pessoas são
totalmente treinadas para realizar esta tarefa.
Obs. Serão solicitadas duas autorizações aos doadores de sangue. A primeira é uma autorização específica
para o estudo discutido acima, a segunda é uma permissão para usar o DNA, extraído das células do
sangue, e as alíquotas de soro que serão guardadas para o uso em outros estudos que porventura a
UNOPAR venha a desenvolver no futuro, sempre com a aprovação das comissões de ética da instituição. O
DNA e o soro estocados poderão ser guardados por mais de 10 anos desde que em condições ideais de
preservação. Caso o doador concorde em participar somente do primeiro estudo, ao final deste todo o
material colhido do participante será descartado e não mais será usado em outras pesquisas.
____________________________
Autorização para participar somente
no primeiro estudo.
__________________________
Autorização para usar a doação
em futuros estudos.
Privacidade:
Os dados individualizados serão confidenciais. Os resultados coletivos serão divulgados apenas em eventos e
revistas meios científicos e não é possível a sua identificação.
Benefícios:
As informações obtidas nesta pesquisa poderão ser úteis cientificamente e de ajuda para todos, porém não
receberei nenhuma compensação financeira por participar deste estudo, como também não terei nenhum custo
sobre os exames de Raio X e densitometria.
Riscos:
Não haverá nenhum risco para a minha integridade física, mental ou moral por participar desta pesquisa.
Desistência:
Poderei desistir a qualquer momento deste estudo, sem qualquer conseqüência para mim.
O(a) senhor(a) tem o direito de pedir outros esclarecimentos sobre a pesquisa que considerar necessário e de se
recusar a participar ou interromper a sua participação a qualquer momento, sem que isso lhe traga qualquer
prejuízo.
Contato com os pesquisadores: Centro de Pesquisa em Saúde da UNOPAR, (43) 3371-7990, nos seguintes
horários: 8h:00min. às 12h:00min. e das 14h:00min às 17h:00min.
Declaro estar ciente das informações deste termo de consentimento livre e esclarecido e concordo em participar
desta pesquisa.
________________________________
_____________________________
Assinatura do entrevistado
Assinatura do(a) Pesquisador(a)
45
ANEXO C
Normas da revista Osteoporosis International para submissão do artigo
Manuscript Submission
Submission of a manuscript implies: that the work described has not been published before;
that it is not under consideration for publication anywhere else; that its publication has been
approved by all co-authors, if any, as well as by the responsible authorities – tacitly or
explicitly – at the institute where the work has been carried out. The publisher will not be held
legally responsible should there be any claims for compensation.
Permissions
Authors wishing to include figures, tables, or text passages that have already been published
elsewhere are required to obtain permission from the copyright owner(s) for both the print
and online format and to include evidence that such permission has been granted when
submitting their papers. Any material received without such evidence will be assumed to
originate from the authors.
Online Submission
Authors should submit their manuscripts online. Electronic submission substantially reduces
the editorial processing and reviewing times and shortens overall publication times. Please
follow the hyperlink “Submit online” on the right and upload all of your manuscript files
following the instructions given on the screen.
TITLE PAGE




Title Page
The title page should include:
The name(s) of the author(s)
A concise and informative title
The affiliation(s) and address(es) of the author(s)
The e-mail address, telephone and fax numbers of the corresponding author




Abstract
Please provide a structured abstract of 150 to 250 words which should be divided into the
following sections:
Purpose (stating the main purposes and research question)
Methods
Results
Conclusions
Keywords
Please provide 4 to 6 keywords which can be used for indexing purposes.
Conflict of Interest
Every manuscript must be accompanied by the “Authorship & Disclosure Form”, which can
be found in the tabs along the right-hand side of this page. ALL authors are required to sign
and complete the form and it must then be submitted, alongside the manuscript, as a
46
supplemental file not for review. Manuscripts without a fully complete Authorship &
Disclosure form will not be considered for review.
TEXT
Text Formatting
Manuscripts should be submitted in Word.
 Use a normal, plain font (e.g., 10-point Times Roman) for text.
 Use italics for emphasis.
 Use the automatic page numbering function to number the pages.
 Do not use field functions.
 Use tab stops or other commands for indents, not the space bar.
 Use the table function, not spreadsheets, to make tables.
 Use the equation editor or MathType for equations.
 Save your file in docx format (Word 2007 or higher) or doc format (older Word
versions).
Manuscripts with mathematical content can also be submitted in LaTeX.
 LaTeX macro package (zip, 182 kB)
Headings
Please use no more than three levels of displayed headings.
Abbreviations
Abbreviations should be defined at first mention and used consistently thereafter.
Footnotes
Footnotes can be used to give additional information, which may include the citation of a
reference included in the reference list. They should not consist solely of a reference citation,
and they should never include the bibliographic details of a reference. They should also not
contain any figures or tables.
Footnotes to the text are numbered consecutively; those to tables should be indicated by
superscript lower-case letters (or asterisks for significance values and other statistical data).
Footnotes to the title or the authors of the article are not given reference symbols.
Always use footnotes instead of endnotes.
Acknowledgments
Acknowledgments of people, grants, funds, etc. should be placed in a separate section
before the reference list. The names of funding organizations should be written in full.
TEXT FORMATTING

Introduction: Develop the study rationale and avoid a literature review. Literature
should be cited only to the extent that it helps the reader understand why the question
is asked. End the introduction with a stated aim or question, preferably expressed as
a testable hypothesis. For example, if the study is aimed at identifying the color of
apples, or asks what color are apples, state “we hypothesized that apples will be
green rather than red”. The reason for this hypothesis should be contained in the
rationale.
47



Methods: The methods section should describe the procedures used and provide
sufficient information (subjects, measurements, statistical analyses) so that a reader
can evaluate the credibility of results and interpretation in the light of possible
methodological limitations. Findings should be quantified when possible, and
presented with appropriate indicators of measurement error or uncertainty, e.g.
confidence intervals.
The source or manufacturer name of all products used should be stated.
Authors should always consider clarity for other workers about how and why a study
was in a particular way.
Results: Results concerning the primary testable hypothesis should be presented first.
Do not save the ”best” for last. For example, if the main aim is to assess anti-fracture
efficacy, present these data first and surrogates (BMD or biochemical markers) later.
Data should be presented as concisely as possible, if appropriate, in the form of
tables and/or graphs, although very large tables should be avoided.
If authors wish to present the full data of the study and any technical details, these
can be included as Electronic Supplementary Material.
Discussion: The following paragraph structure is recommended:
• A summary of the main findings from most to least important including a statement
whether the results are consistent with the stated hypothesis.
• Discuss how these results confirm or contrast with the published literature.
• If the results differ, discuss the possible reasons for this. Details of methodology and
results of published literature may be appropriate here. Avoid reviewing the literature
outside the scope of the study.
• Discuss the significance and implications of this new data. Having developed the
rationale to define the limits of current knowledge, how does this new information
advance understanding?
• Write a paragraph concerning the limitations of the study. This is critical. The
inferences made throughout the Discussion must be written bearing in mind the
constraints of the methodological limitations of the work. Papers written without this
section will not be considered for publication.
• Summarize and Conclude: The conclusion is an inference. Within the constraints of
the limitations of the study, the authors may boldly speculate regarding the
significance of the findings and future research.
TERMINOLOGY


Please refer to the list of Standard Abbreviations for this journal. All abbreviations in the
abstract and text must be defined immediately at first mention and used consistently
thereafter.
Bone histomorphometry: Articles on bone histomorphometry should conform to the
recommendations of the American Society for Bone and Mineral Research (Dempster
DW, Compston JE, Drezner MK, et al (2013) Standardized Nomenclature, Symbols
and Units for Bone Histomorphometry: A 2012 Update of the Report of the ASBMR
Histomorphometry Nomenclature Committee. J Bone Miner Res 2013;28:2-17).
Tumor necrosis factor (TNF) family members: Articles on TNF family members should
conform to the recommendations of the American Society of Bone and Mineral
Research (ASBMR President’s Committee on Nomenclature (2000) Proposed
48





standard nomenclature for new tumor necrosis factor family members involved in the
regulation of bone resorption. J Bone Miner Res 15:2293-2296).
Bone markers: Articles on bone markers should conform to the recommendations of
the International Osteoporosis Foundation (Delmas PD, Eastell R, Garnero P, et al.
(2000) The use of biochemical markers of bone turnover in osteoporosis. Osteoporos
Int Suppl 6:S2-S17).
Proprietary substances and materials, and instruments: The correct designation and
the manufacturer’s name should be given. Where the manufacturer is not well known,
the city and country should also be included.
Units of measure: SI units should be used throughout, except where non-SI units are
more common.
Drug names: When drugs are mentioned, the international (generic) name should be
used. The proprietary name, chemical composition, and manufacturer should be
stated in full in the Materials and Methods section. The source of any new and
experimental preparation should also be given.
Papers describing the descriptive epidemiology of osteoporosis using BMD at the
femoral neck should include T-scores derived from the National Health and Nutrition
Examination Survey (NHANES) III reference database for femoral neck
measurements in Caucasian women aged 20–29 years as described in:
Kanis JA, , Adachi JD, Cooper C, Clark P, Cummings SR, Diaz-Curiel M, Harvey N,
Hiligsmann M, Papaioannou A, D Pierroz D, Silverman SL, Szulc P, and the
Epidemiology and Quality of Life Working Group of IOF (2013). Standardising the
descriptive epidemiology of osteoporosis: recommendations from the Epidemiology
and Quality of Life Working Group of IOF. Osteoporos Int. doi: 10.1007/s00198-0132413-7
Available from this:
 Link
Citation
Reference citations in the text should be identified by numbers in square brackets. Some
examples:
1. Negotiation research spans many disciplines [3].
2. This result was later contradicted by Becker and Seligman [5].
3. This effect has been widely studied [1-3, 7].
Reference list
The list of references should only include works that are cited in the text and that have been
published or accepted for publication. Personal communications and unpublished works
should only be mentioned in the text. Do not use footnotes or endnotes as a substitute for a
reference list.
The entries in the list should be numbered consecutively.
Journal article
Gamelin FX, Baquet G, Berthoin S, Thevenet D, Nourry C, Nottin S, Bosquet L (2009)
Effect of high intensity intermittent training on heart rate variability in prepubescent
children. Eur J Appl Physiol 105:731-738. doi: 10.1007/s00421-008-0955-8
Ideally, the names of all authors should be provided, but the usage of “et al” in long
author lists will also be accepted:
49
Smith J, Jones M Jr, Houghton L et al (1999) Future of health insurance. N Engl J
Med 965:325–329
Article by DOI
Slifka MK, Whitton JL (2000) Clinical implications of dysregulated cytokine production.
J Mol Med. doi:10.1007/s001090000086
Book
South J, Blass B (2001) The future of modern genomics. Blackwell, London
Book chapter
Brown B, Aaron M (2001) The politics of nature. In: Smith J (ed) The rise of modern
genomics, 3rd edn. Wiley, New York, pp 230-257
Online document
Cartwright J (2007) Big stars have weather too. IOP Publishing PhysicsWeb.
http://physicsweb.org/articles/news/11/6/16/1. Accessed 26 June 2007
Dissertation
Trent JW (1975) Experimental acute renal failure. Dissertation, University of
California
Always use the standard abbreviation of a journal’s name according to the ISSN List of Title
Word Abbreviations, see www.issn.org/2-22661-LTWA-online.php
For authors using EndNote, Springer provides an output style that supports the formatting of
in-text citations and reference list.
EndNote style (zip, 2 kB)
Authors preparing their manuscript in LaTeX can use the bibtex file spbasic.bst which is
included in Springer’s LaTeX macro package.
TABLES




All tables are to be numbered using Arabic numerals.
Tables should always be cited in text in consecutive numerical order.
For each table, please supply a table caption (title) explaining the components of
the table.
Identify any previously published material by giving the original source in the form of
a reference at the end of the table caption.
 Footnotes to tables should be indicated by superscript lower-case letters (or
asterisks for significance values and other statistical data) and included beneath the
table body.