INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
SEBASTIÃO ALDO DA SILVA VALENTE
ESTUDOS DOS SURTOS DE DOENÇA DE CHAGAS OCORRIDOS NO
PARÁ E AMAPÁ: ANÁLISE PARASITOLÓGICA, SOROLÓGICA E
MOLECULAR
DBP/IOC
FIOCRUZ
Rio de Janeiro
2008
Livros Grátis
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INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
SEBASTIÃO ALDO DA SILVA VALENTE
ESTUDOS DOS SURTOS DE DOENÇA DE CHAGAS OCORRIDOS NO
PARÁ E AMAPÁ: ANÁLISE PARASITOLÓGICA, SOROLÓGICA E
MOLECULAR
Tese apresentada ao Curso de Doutorado em Biologia
Parasitária do Instituto Oswaldo Cruz – Fiocruz, como
requisito parcial para a obtenção do grau de Doutor.
Orientadores: FIOCRUZ: Dr. Octávio Fernandes
UFPA: Dr. Habib Fraiha Neto
DBP/IOC
FIOCRUZ
Rio de Janeiro
2008
Valente Silva, Sebastião Aldo
Estudos dos surtos de doença de Chagas ocorridos no Pará e Amapá: análise
parasitológica, sorológica e molecular / Sebastião Aldo da Silva Valente. Rio de
Janeiro: Instituto Oswaldo Cruz, 2008.
162 fls.
Tese (Doutorado em Biologia Parasitária) Coordenação do Curso de PósGraduação em Biologia Parasitária, Instituto Oswaldo Cruz – FIOCRUZ.
1. Doença de Chagas – epidemiologia 2. Biologia Molecular I. Fundação
Oswaldo Cruz. II. Instituto Oswaldo Cruz. Departamento de Medicina Tropical. III.
Título. CDU: 616.34-002:578
INSTITUTO OSWALDO CRUZ
Pós-Graduação em Biologia Parasitária
ESTUDOS DOS SURTOS DE DOENÇA DE CHAGAS OCORRIDOS NO
PARÁ E AMAPÁ: ANÁLISE PARASITOLÓGICA, SOROLÓGICA E
MOLECULAR
SEBASTIÃO ALDO DA SILVA VALENTE
Tese submetida à Comissão Examinadora composta pelo corpo docente do Programa de PósGraduação em Biologia Parasitária da Fundação Oswaldo Cruz e por professores convidados
de outras instituições, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de doutor.
Aprovada em: ___9__/__07___/__2008___
EXAMINADORES:
Prof. Dr. José Rodrigues Coura - (FIOCRUZ – RJ - Brasil) - Presidente
Prof. Dr. Márcio Neves Bóia - (FIOCRUZ – RJ - Brasil)
Prof. Dr. Ralph Lainson – (SVS-Instituto Evandro Chagas – PA – Brasil)
Prof. Dr. Sylvio Celso Costa– (FIOCRUZ – RJ - Brasil)
Profa. Dra. Ângela Cristina Veríssimo Junqueira - (FIOCRUZ – RJ - Brasil)
Rio de Janeiro, 9 de julho de 20008
Não dês guarida aos maus pensamentos e reage contra
todo e qualquer estado de abatimento e ociosidade que
persista em ti. Não te permitas descansar além do devido
e ocupa tuas mãos com o bem e o coração com o perdão.
Na medida de tuas possibilidades, auxilia a quem sofre e
não te concentres excessivamente em teus próprios
problemas nem dramatizes a tua dor. A prova é a tua
oportunidade de redenção. Caminha e chegarás.
Prece espírita de Carlos A. Bacelli
Dedicatória
A meus pais Waldomiro e Perpétua, incansáveis na proteção e no carinho e por me
ensinarem a não desistir nunca, independente das forças opostas que tenhamos de enfrentar.
Aos meus avós Carlos, Raimunda e Rosemunda, que me ensinaram a amar as coisas
simples do Baixo Amazonas.
A minha esposa Vera, companheira solidária dos caminhos mais difíceis e meus
filhos Aldo Augusto e Luís Alberto presentes que Deus me deu. A todos eles que me perdoem
pela ausência de tantos anos dedicados a uma paixão, quase obsessão: meu trabalho exercido
neste mundão amazônico, dormindo em redes de barcos, lendo à luz de lamparinas, comendo
bolachas e me enchendo de sonhos e esperança, ouvindo os cantos dos pássaros e os ruídos da
mata.
ii
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Professor Dr. Octavio Fernandes, por me nortear num novo caminho
científico. Pela sua conduta científica esmerada e incentivadora em momentos difíceis que foram
superados com firmeza, mas também com confiança, e me fez ver a doença de Chagas na
Amazônia como um desafio a ser superado. Minha gratidão e admiração.
Ao Dr. Habib Fraiha Neto pela visão das endemias da Amazônia e incentivo desde os
primeiros passos no IEC, sempre disposto a me amparar quando minhas forças fraquejavam.
À minha amiga, irmã e tutora Patrícia Cuervo Escobar, pela competência, dedicação e
paciência em me ensinar os primeiros passos desse complexo e surpreendente mundo da biologia
molecular. Jamais esquecerei os momentos de aprendizado compartilhado.
Ao Instituto Evandro Chagas, um bastião de credibilidade científica fincado no coração
da Amazônia e que moldou a minha formação acadêmica.
À FIOCRUZ, formadora de mão de obra especializada para uma região carente como a
Amazônia. Aos Professores Cláudio Ribeiro e Henrique Leonel Lenzi, por fomentar num grupo
de pesquisadores em Belém o espírito da ciência com arte, carinho e determinação.
À amiga e grande incentivadora Dra. Elizabeth Conceição de Oliveira Santos, diretora
do Instituto Evandro Chagas, pelo olhar responsável e empreendedor no trato da coisa pública e
da Saúde da Amazônia.
À Dra. Vera da Costa Valente, responsável pelo Laboratório de Diagnóstico de Doença
de Chagas, pela determinação, seriedade, organização e critérios rigorosos aplicados no
Laboratório de Diagnóstico, principalmente na sorologia, hemocultura, atendimento e seguimento
dos pacientes. O afeto e seriedade com que tratava estas pessoas foram decisivos para que eles
sempre voltassem. A ela meu sincero agradecimento.
A toda a equipe técnica e administrativa do Instituto Evandro Chagas, que nos forneceu
o suporte necessário em toda esta jornada.
Aos amigos e grandes incentivadores: Drs. Michael Miles, Alexandre Linhares, Jorge
Travassos da Rosa, José Maria de Souza, José Augusto Muniz, Antônio Teixeira (UnB) e Marta
Geraldes Teixeira (USP) que me fizeram acreditar nos meus sonhos.
À Dra. Izabel Rodrigues, amiga de fé e incansável de todas as horas a quem recorri nos
momentos mais críticos e sempre recebido com carinho. Muito obrigado pela dedicação.
Ao Núcleo de Medicina Tropical da Universidade Federal do Pará, onde a semente deste
doutoramento foi lançada, especialmente aos professores José Luis Nascimento, Conceição
Pinheiro e Luiz Carlos Silveira.
Ao Ambulatório de Doença de Chagas, à Dra. Ana Yecê N. Pinto, pela dedicação no
atendimento e seguimento dos pacientes e aos dados clínicos. Aos Drs. Ângelo Crescente, Nagib
Abdon, Raimundo Leão e Lourival Marsola, pelo apoio na conduta clínica. A Dra. Maria do
Carmo Brígido, IBAMA-PA pela preciosa ajuda no projeto de licenciamento e manejo animal.
Aos dedicados profissionais técnicos e ex-técnicos do Laboratório de Doença de Chagas/IEC,
iii
José Aprígio, José Abud, Francisco Gomes, Edinaldo Ribeiro, Aguinaldo Freitas, Leonardo
Carvalho, Carlos Alberto, Gilberto César e Raimundo Nivaldo de Almeida.
Aos meus estagiários e bolsistas, fiéis escudeiros e sementes que planto para o futuro:
Leidiane, Deborah, Andréa, Ellen, Sérgio, Fabíola e Caroline, que me apoiaram especialmente
nos meses que enfrentei dificuldades na leitura de artigos e digitação desta tese.
Ao Laboratório de Geo-Processamento do IEC, em especial ao Dr. Nelson Veiga e
Douglas Gasparetto, pelo aconselhamento no geo-referenciamento e confecção de mapas.
Ao serviço de Biblioteca do IEC, em especial a Vânia Cunha Araújo, pelo incentivo e
atendimento sempre oportunos e eficientes. Às Sras. Maria José A. Mateus, Isabella M. A.
Mateus, Sheila de M. Lobo, Maria Izaleth B. do Carmo e Nilton M. Pereira, pelo apoio técnico no
levantamento e obtenção dos artigos e auxílio na editoração desta tese.
À Profa. Edna Souza pela correção gramatical do Manuscrito e ao pessoal do Setor de
Informática do IEC, pelo apoio sempre disponível de pedidos muitas vezes mirabolantes que
precisei fazer, sempre atendido incondicionalmente.
Aos colegas da SEPAR, especialmente a Ocidéa Oliveira, Fátima França, Marinete
Póvoa, Zuíla Corrêa, Lourdes Garcez e Marco Antônio, por acreditarem neste trabalho.
Aos colegas da turma do Doutorado, Elizabeth Salbé, Ana Yecê, Eliete Araújo, Ana
Ventura, Vânia Noronha, Ester Miranda, Sâmia Demachki, Solange Costa, Gionovaldo Lourenço
e Wallace Santos, pelo esforço, luta e cumplicidade ao longo desta batalha.
À Coordenadora do Curso de Pós-Graduação em Biologia Parasitária, Dra. Ana Gaspar,
à secretária Luciane Wandermurem, Fabíola, Eduardo Portugal e demais funcionários, por todos
os serviços e orientação prestados no decorrer deste trabalho.
Aos professores da FIOCRUZ, Cláudio Ribeiro, Ricardo Lourenço, Márcio Bóia, José
R. Coura, Henrique Lenzi, Ana Ma. Gaspar, Márcia Lazera, Bodo Wanke e Leonardo Carvalho,
pelos ensinamentos e incentivos recebidos ao longo deste trabalho.
Às Secretarias Municipais de Saúde de Abaetetuba, Afuá, Ananindeua, Bagre,
Barcarena, Belém, Bragança, Ponta de Pedras, Santarém, Macapá, Mazagão e Santana pelo apoio
logístico neste trabalho tão extenso. Especialmente ao Dr. Clóvis Miranda, da Secretaria Estadual
de Saúde do Amapá, pela insuperável ajuda. A todos nossos pacientes à quem não temos palavras
para agradecer pela disciplina em todo o acompanhamento laboratorial.
Meus sinceros agradecimentos aos colegas do Laboratório de Epidemiologia Molecular
de Doenças Infecciosas da FIOCRUZ – RJ, que durante estes últimos três anos me receberam
com tanta atenção e carinho: Beth, Carla Sodré, Cátia Sodré, Dário, Estela, Fábio, Helena, Joseli,
Kátia, Larissa, Maria Esther, Maria Inês e Simone K.
Um especial agradecimento aos Drs. Adeilton, Aline, Eduardo (Dudu), Mariângela,
Martha, Nédia e Simone Santos, pelo apoio logístico imprescindível e pelas sugestões,
orientações e pela paciência no ensinamento de passos importantes nos meus experimentos. Meus
sinceros agradecimentos e respeito.
iv
Resumo
Relatos de casos de doença de Chagas na Amazônia Brasileira têm sido relativamente
freqüentes na literatura. Entretanto, não se encontram relatos desses surtos acompanhados
sistematicamente. Durante os últimos anos, o Instituto Evandro Chagas teve a oportunidade
de fazer o seguimento de vários surtos agudos da doença, e nessa tese são descritas análises
parasitológicas, sorológicas, entomológicas e de reservatórios de seis deles, utilizando desde
técnicas tradicionais, até técnicas moleculares. A pesquisa parasitológica foi realizada em 423
pessoas (sintomáticos e contatos) relacionadas aos surtos do Pará (Abaetetuba, Ananindeua,
Barcarena, Belém e Bragança) e do Amapá (Mazagão). Foram encontradas 28,6% (121/423)
de positividade em pelo menos um dos testes parasitológicos: 44,62% (54/121) na gota
espessa; 9,09% (11/121) no QBC®; 81% (98/121) no xenodiagnósticos e 60% (73/121) na
hemocultura. A pesquisa sorológica incluiu uma amostragem de 3633 pessoas nos municípios
estudados. No teste de triagem (HAI) foram detectados 4,40% dos indivíduos positivos
(160/3633). Pelo teste de IFI para pesquisa de IgG estes soros apresentaram positividade de
3,19% (116/3633) e 3,02% (110/3633) apresentaram testes positivos para anticorpos IgM
anti-Trypanosoma cruzi. Os pacientes diagnosticados (n=121) foram tratados e acompanhados
pelo menos até dois anos. Realizou-se o seguimento dos exames laboratoriais em 4 cortes de
tempo: antes de tratar, 6 meses, 1 ano e 2 anos após tratamento, exceto o surto de Mazagão
que teve os seguimentos expandidos para cinco e sete anos. Os exames parasitológicos
negativaram em 118 (97,52%) pacientes. Três pacientes foram re-tratados e negativaram os
testes parasitológicos subseqüentes. Em 5 surtos os exames sorológicos seguidos até dois anos
revelaram negativação da IgM e redução progressiva dos títulos de IgG sem desaparecimento
da imunoglobulina. No surto de Mazagão, todos os pacientes se revelaram sorologicamente
negativos após 7 anos. Dos 145 mamíferos silvestres capturados, 75 foram Didelphis
marsupialis, 34 Philander opossum, 21 Marmosa cinerea, 2 Marmosa murina e 13
Proechimys guyanensis. Destes 56 foram coletados em Abaetetuba, 7 em Ananindeua, 40 em
Barcarena, 5 em Belém, 25 em Bragança e 12 em Mazagão. A taxa de infecção por
Trypanosoma cruzi foi de 68,96% (100/145), sendo 69,33% dos D. marsupialis (52/75),
70,58% dos P. opossum (24/34), 61,90% das M. cinerea (13/21), 100% das M. murina (2/2) e
69,23% dos P. guyanensis (9/13). Foram capturados 1022 triatomíneos de 5 espécies. As
taxas de infecção foram R. pictipes - 51,81%; R. robustus - 14%; Rhodnius milesi - 33%;
Panstrongylus geniculatus - 51,47% e Panstrongylus lignarius - 27,27%). Os sítios de coleta
foram palmeiras (73,09%); armadilhas de luz (17,31%) e sítios diversos (9,6%). Um dos
surtos teve o importante agrupamento dos casos de forma familiar levando a hipótese de
transmissão pela mesma via de infecção, possivelmente a via oral sendo o suco de açaí o
único alimento encontrado associado a este grupo. A tipagem de mini-exon mostrou a
existência de TC I e TC Z3. Trypanosoma rangeli também foi evidenciado na região. A
tipagem de RAPD gerou uma diversidade tão grande que não foi possível chegar a qualquer
conclusão, exceto a diversidade existente entre os parasitos que circulam nos surtos e a
possível multiclonalidade dos isolados.
v
Abstract
Reports of Chagas Disease in the Brazilian Amazon region are relatively frequent. However,
reports of Acute Chagas Disease (ACD) outbreaks with regular prospective assessment of the
cases in this region are scarce. During the past few years, the team of Instituto Evandro
Chagas had the opportunity of following-up several outbreaks of ACD in the Amazon and
herein, the parasitological, serological, entomological and sylvan reservoir analyses of six
outbreaks are described using from traditional techniques to molecular approaches.
Parasitological studies were carried out in 423 individuals (symptomatic patients and their
household contacts) related to these six outbreaks (Abaetetuba, Ananindeua, Barcarena,
Belém, Bragança, Mazagão). The overall positivity was 28,6% (121/423), as based on results
from at least one of the parasitological tests: 44,62% (54/121) using stained blood smear;
9,09% (11/121) with Quantitative Buffy Coat (QBCTM) analysis; 81% (98/121) in
xenodiagnosis; and 60% (73/121) in haemoculture. Serology was performed in 3633
inhabitants of the above mentioned municipalities. The screening test (IHA) was positive in
4,40% (160/3633) of the individuals. Using the indirect immuno-fluorescence assay,
positivity rates were of 3,19% (116/3633) and 3,02% (110/3633) for anti-Trypanosoma cruzi
IgG- and- IgM antibodies, respectively. All infected patients with Trypanosoma cruzi (n=121)
were properly treated and followed-up for at least two years upon diagnosis. The laboratory
follow-up was carried out at 4 time-points: before treatment; 6 months, one year and two
years after the start of treatment, except for Mazagão outbreak where the follow up was
extended up to five and seven years. The parasitological tests were negative in 118 (97,52%)
patients. Three patients had to be re-treated and yielded negative parasitological examinations
afterwards. In 5 outbreaks, serological analyses, prospectively conducted up to 2 years,
revealed negative anti-T. cruzi IgM antibodies and progressive declining in the specific IgG
titres, without disappearance of the immunoglobulin. All patients enrolled in the Mazagão
outbreak became serologically negative 7 years after treatment. One hundred and forty five
wild mammals were captured during these investigations corresponding to the following
species: 75 Didelphis marsupialis; 34 Philander opossum; 21 Marmosa cinerea; 2 Marmosa
murina; and 13 Proechimys guyanensis. These animals were caught in the following settings:
Abaetetuba (n=56); Ananindeua (n=7); Barcarena (n=40); Belém (n=5); Bragança (n=25) and
Mazagão (n=12). The T. cruzi infection rate among these mammals was 68,96% - 69,33%
(52/75) of the D. marsupialis, 70,58% (24/34) of the P. opossum, 61,90% (13/21) of the M.
cinerea, 100% (2/2) of the M. murina and 69,23% (9/13) of the P. guyanensis species. A total
of 1022 triatomines bugs were captured corresponding to 5 species which were infected at the
following rates: Rhodnius pictipes, 51,81%; Rhodnius robustus, 14%; Rhodnius milesi, 33%;
Pantrongylus geniculatus, 51,4%; and Panstrongylus lignarius, 27,27%. The collections of
triatomine bugs were carried out in palm trees (73,09%); light traps (17,31%); and various
other settings (9,6%). One of the outbreaks had and important familial clustering of the cases
leading to the hypothesis of a common source for transmission, possibly through the frequent
ingestion of açaí juice. The typing of T. cruzi samples, based on the mini-exon gene, showed
the presence of TC I and TCZ3. Trypanosoma rangeli was also present in the region. The
RAPD genetic analysis yielded a broad diversity of profiles preventing us from drawing any
firm conclusion, except for the observation that a significant variety of parasites circulate
during outbreaks of Chagas disease in the Amazon what is also evidenced by the
multiclonality of prevailing strains.
vi
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
°C
Graus centígrados
µ
Micron
µl
Microlitros
µM
Micromolar
ABA
Abaetetuba
ALAT
Alanina-aminotransferase
ANA
Ananindeua
Ar
Armadilha
ASAT
Aspartato-aminotransferase
BAR
Barcarena
BEL
Belém
bp
Pares de bases
BRA
Bragança
BSA
Bovin Serum Albumin
Cap/Exa
Capturado/ Examinado
CL
Clone
cm
Centímetros
DCA
Doença de Chagas Aguda
DNA
Ácido desoxirribonucléico
dNTPs
Deoxidonucleotídeo
EDTA
Etileno-diamino tetra-acetato de sódio
ELISA
Ensaio imonuenzimático
G6PD
Glicose-6-fosfato-dehidrogenase
GE
Gota espessa
vii
GPI
Glicose-fosfato-isomerase
HAI
Hemaglutinação indireta
Hemo
Hemocultura
HIV
Vírus da Imunodeficiência Humana
Hoff
Meio de cultura desenvolvida por Hoff
IBAMA
Instituto Brasileiro de Meio Ambiente e de Recursos Naturais
Renováveis
IBGE
Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística
IEC
Instituto Evandro Chagas
IFI
Imunofluorescência Indireta
IgG
Imunoglobulina G
IgM
Imunoglobulina M
IOC
Instituto Oswaldo Cruz
Kb
Kilobase
KCl
Cloreto de potássio
KDNA
Ácido desoxirribonucléico da mitocôndria
Kg
Kilograma
LIT
Liver Infusion Tryptose
m RNA
RNA mensageiro
MDH
Malato dehidrogenase
ME
Microepidemia
Mg
Miligramas
MgCl2
Cloreto de magnésio
ml
Mililitros
mM
Milimolar
viii
mm
Milímetros
NEG
Negativo
ng
Nanogramas
NR
Não realizado
NREA
Não reagente
Palm
Palmeira
PBS
Phosphate Buffer Solution
PCR
Reação em Cadeia da Polimerase
PGM
Phosphofoglucomutase
pH
Potencial hidrogeniônico
pmol
Picomol
Pop
População
POS
Positivo
QBC
System Quantitative Buffy-Coat
r DNA
DNA ribossômico
r RNA
RNA ribossômico
RAPD
Randômica Amplificação de DNA Polimórfico
Rnas
Molécula de RNA dotada de função enzimática
RPM
Rotação por Mmnuto
RPMI 1640
Meio monofásico de cultura desenvolvido pela Roswell Park
Memorial Institute
SL
Spliced leader
SUS
Sistema Único de Saúde
SVS
Secretaria de Vigilância em Saúde
TBE
Tampão Tris-Borato EDTA
ix
TCI
Tripanosoma cruzi I
TCII
Tripanosoma cruzi II
TCLE
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
TFD
Tratamento fora do domicílio
TR
Trypanosoma rangeli
Tris KCL
Tris(Hidroximetil) aminometano
Tris-HCL
Tris-Hidroximetil ácido clorídrico
UV
Ultra violeta
W
Watts
Xeno
Xenodiagnóstico
Z1
Zimodema 1
Z2
Zimodema 2
Z3
Zimodema 3
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1.
Distribuição geográfica da Doença de Chagas Aguda na Amazônia
Brasileira de 1968 a 2007....................................................................
Figura 2.
17
Distribuição geográfica dos surtos de doença de Chagas aguda no
Pará e Amapá entre os anos de 1995 e 2005.......................
25
Figura 3.
Discussão dos objetivos do trabalho com as comunidades.................
27
Figura 4.
A. T. cruzi visualizado no QBC® System. B. T. cruzi visualizado
em gota espessa...................................................................................
Figura 5.
Comunidade ribeirinha onde ocorreu surto de doença de Chagas
aguda em Abaetetuba..........................................................................
Figura 6.
39
42
À esquerda, residência de pacientes no surto de Ananindeua. À
direita, dois dos pacientes com diagnóstico positivo de fase aguda
para doença de Chagas........................................................................
Figura 7.
46
À esquerda, residências de pacientes do surto de Barcarena. À
direita, dois pacientes com diagnóstico positivo para fase aguda de
doença de Chagas................................................................................
Figura 8.
49
À esquerda, residência de pacientes do surto de Belém. À direita,
três dos pacientes com diagnóstico positivo para fase aguda de
doença de Chagas................................................................................
Figura 9.
52
À esquerda, residências de pacientes do surto de Bragança. À
direita, coleta de sangue de um dos pacientes com diagnóstico
positivo para fase aguda de doença de Chagas....................................
Figura 10.
Ambiente de transmissão e pacientes num surto de doença de
Chagas familiar no Mazagão-AP........................................................
Figura 11.
55
58
A. Didelphis marsupialis; B. Philander opossum; C. Marmosa
cinerea; mamíferos mais capturados nos estudos dos surtos..............
62
Figura 12.
Coleta de triatomíneos em palmeiras...................................................
65
Figura 13.
Coleta de triatomíneos em armadilhas luminosas...............................
66
Figura 14.
Gel de Mini-Exon com caracterização de isolados do surto de
Mazagão...............................................................................................
Figura 15.
Géis de RAPD com isolados representativos de humanos,
mamíferos e triatomíneos dos 5 surtos................................................
Figura 16.
70
71
Fenogramas por surtos gerados a partir das matrizes de similaridade
obtidos com o coeficiente de Jaccard..................................................
xi
72
LISTA DE GRÁFICOS
Gráfico 1.
Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de
Abaetetuba..................................................................................................
Gráfico 2.
Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Abaetetuba,
em 4 intervalos de tempo...........................................................................
Gráfico 3.
59
Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Mazagão, em
5 intervalos de tempo.................................................................................
Gráfico 18.
57
Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de
Mazagão.....................................................................................................
Gráfico 17.
57
Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no
surto de Bragança.......................................................................................
Gráfico 16.
56
Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Bragança,
em 4 intervalos de tempo............................................................................
Gráfico 15.
54
Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de
Bragança.....................................................................................................
Gráfico 14.
54
Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no
surto de Belém............................................................................................
Gráfico 13.
53
Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Belém, em 4
intervalos de tempo....................................................................................
Gráfico 12.
51
Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de
Belém..........................................................................................................
Gráfico 11.
51
Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no
surto de Barcarena......................................................................................
Gráfico 10.
50
Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Barcarena,
em 4 intervalos de tempo............................................................................
Gráfico 9.
48
Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de
Barcarena....................................................................................................
Gráfico 8.
48
Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no
surto de Ananindeua...................................................................................
Gráfico 7.
47
Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Ananindeua,
em 4 intervalos de tempo...........................................................................
Gráfico 6.
45
Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de
Ananindeua.................................................................................................
Gráfico 5.
44
Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no
surto de Abaetetuba....................................................................................
Gráfico 4.
43
61
Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no
surto de Mazagão........................................................................................
xii
61
LISTA DE TABELAS
Tabela 1.
Surtos de doença de Chagas fora da Amazônia Brasileira 1967-2006.......
11
Tabela 2.
Surtos de doença de Chagas na Amazônia Brasileira 1968-2007..............
13
Tabela 3.
Distribuição geográfica dos surtos de doença de Chagas aguda no Pará e
Amapá entre os anos de 1995 e 2005.........................................
Tabela 4.
26
Pesquisa sorológica em municípios onde ocorreram surtos de doença de
Chagas dos estados do Pará e Amapá entre os anos de 1995 e
2005............................................................................................................
29
Tabela 5.
Iniciadores do gene de Mini-Exon.............................................................
35
Tabela 6.
Oligonucleotídeos usados na análise de RAPD..........................................
36
Tabela 7.
Surtos de doença de Chagas aguda que ocorreram no Pará e Amapá
entre os anos 1995-2005.............................................................................
Tabela 8.
Surtos de doença de chagas aguda selecionados para os estudos no Pará
e Amapá entre os anos de 1995 e 2005......................................................
Tabela 9.
38
39
Pesquisa parasitológica em municípios onde ocorreram surtos de doença
de Chagas no estado do Pará e Amapá entre os anos de 1995 e
2005.........................................................................................................
Tabela 10.
40
Pesquisa sorológica em municípios onde ocorreram surtos de doença de
Chagas nos estados do Pará e Amapá, entre os anos de 1995 e
2005............................................................................................................
Tabela 11.
Mamíferos coletados nas áreas de ocorrência de surtos nos estados do
Pará e Amapá entre 1995 a 2005................................................................
Tabela 12.
65
Triatomíneos capturados em diferentes ecótopos no Pará e Amapá entre
os anos de 1995 e 2005...............................................................................
Tabela 16.
64
Distribuição dos triatomíneos coletados em 5 espécies de palmeiras em
municípios dos estados do Pará e Amapá, 1995-2005...............................
Tabela 15.
63
Palmeiras como principais ecótopos de triatomíneos em municípios do
Pará e Amapá, 1995-2005..........................................................................
Tabela 14.
63
Presença de tripanossomas em mamíferos silvestres coletados nos
estados do Pará e Amapá entre os anos de 1995 e 2005............................
Tabela 13.
41
67
Taxa de infecção de triatomíneos coletados nos estados do Pará e
Amapá entre os anos de 1995 e 2005.........................................................
xiii
68
LISTA DE QUADROS
Quadro 1.
Espécies de triatomíneos já referidas à Região Amazônica do Brasil....
06
Quadro 2.
OTU- Unidade taxonômica operacional.................................................
37
Quadro 3.
Acompanhamento de exames parasitológico dos pacientes de
Abaetetuba em 4 intervalos de tempo.....................................................
Quadro 4.
Acompanhamento
de
exames
sorológicos
dos
pacientes
de
Abaetetuba em 4 intervalos de tempo.....................................................
Quadro 5.
Acompanhamento
de
exames
sorológicos
dos
pacientes
56
Acompanhamento de exames parasitológicos dos pacientes do
Mazagão em 5 intervalos de tempo.......................................................
Quadro 14.
55
Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Bragança
em 4 intervalos de tempo.......................................................................
Quadro 13.
53
Acompanhamento de exames parasitológicos dos pacientes de
Bragança em 4 intervalos de tempo........................................................
Quadro 12.
52
Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Belém em
4 intervalos de tempo..............................................................................
Quadro 11.
50
Acompanhamento de exames parasitológicos dos pacientes de Belém
em 4 intervalos de tempo........................................................................
Quadro 10.
49
Acompanhamento de exames sorológico dos pacientes de Barcarena
em 4 intervalos de tempo........................................................................
Quadro 9.
47
Acompanhamento de exames parasitológicos dos pacientes de
Barcarena em 4 intervalos de tempo.......................................................
Quadro 8.
46
de
Ananindeua em 4 intervalos de tempo....................................................
Quadro 7.
44
Acompanhamento de exames parasitológicos dos pacientes de
Ananindeua em 4 intervalos de tempo....................................................
Quadro 6.
43
59
Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes do Mazagão
em 5 intervalos de tempo........................................................................
xiv
60
SUMÁRIO
1.
Introdução.................................................................................................
1.1.
Retrospectiva dos estudos sobre reservatórios e vetores silvestres do T.
01
cruzi e da doença de Chagas na Amazônia Brasileira..............................
03
1.2.
Importância epidemiológica da transmissão oral da doença de Chagas...
07
1.3.
Histórico dos estudos sobre transmissão oral na América do Sul............
07
1.4.
Evidências de infecção humana por via oral............................................
08
1.4.1.
Na América do Sul...................................................................................
08
1.4.2.
No Brasil...................................................................................................
10
1.5.
Os
surtos
de
doença
de
Chagas
Aguda
na
Amazônia
Brasileira...................................................................................................
11
2.
Diversidade genética do T. cruzi..............................................................
19
3.
Objetivos...................................................................................................
24
3.1.
Objetivo geral...........................................................................................
24
3.2.
Objetivos específicos................................................................................
24
4.
Material e métodos...................................................................................
25
4.1.
Dados gerais do estudo.............................................................................
25
4.1.1.
Municípios ou localidades........................................................................
25
4.1.2.
Visitas às áreas de estudo.........................................................................
26
4.1.3.
Trabalhos com a população humana........................................................
26
4.1.4.
Detecção de casos agudos.........................................................................
27
4.1.5.
Coleta de material e diagnóstico laboratorial...........................................
27
4.1.6.
Exames parasitológicos............................................................................
28
4.1.6.1. Pesquisa de T. cruzi em gota espessa.......................................................
28
4.1.6.2. Exame das amostras pelo QBC® System Quantitative Buffy Coat...........
28
4.1.6.3. Hemocultura..............................................................................................
28
4.1.6.4. Xenodiagnóstico artificial.........................................................................
28
4.1.7.
Sorologia...................................................................................................
28
4.1.8.
Tratamento e seguimento de casos...........................................................
30
5.
Estudo de reservatórios silvestres.............................................................
30
5.1.
Captura e identificação de animais silvestres...........................................
30
5.2.
Coleta de sangue dos animais...................................................................
31
5.3.
Hemoscopia e hemocultura.......................................................................
31
5.4.
Xenodiagnóstico.......................................................................................
31
xv
6.
Estudo entomológico................................................................................
32
6.1.
Coleta de triatomíneos silvestres em palmeiras........................................
32
6.2.
Coleta com armadilhas luminosas............................................................
33
6.3.
Identificação dos espécimes coletados.....................................................
33
6.4.
Exame do conteúdo intestinal dos triatomíneos.......................................
33
7.
Isolamento e cultivo in vitro.....................................................................
34
7.1.
Isolamento de pacientes, de animais silvestres e de triatomíneos
silvestres....................................................................................................
34
8.
Extração de DNA......................................................................................
34
9.
Tipagem genotípica das cepas de tripanossomas pelo gene de Miniexon...........................................................................................................
35
10.
Tipagem por RAPD..................................................................................
36
11.
Análise fenética.........................................................................................
37
12.
Análise estatística dos dados.....................................................................
37
13.
Resultados.................................................................................................
38
13.1.
Casuística
dos
surtos
de
DCA
e
estudos
na
população
humana......................................................................................................
13.2.
38
Exames parasitológicos: Pesquisa de T. cruzi em gota espessa (GE),
Pesquisa de T. cruzi pelo QBC® System Quantitative Buffy Coat,
hemocultura e xenodiagnóstico artificial..................................................
39
13.3.
Sorologia...................................................................................................
40
13.4.
Tratamento e seguimento de casos agudos...............................................
41
13.5.
Surto de Abaetetuba..................................................................................
42
13.6.
Surto de Ananindeua.................................................................................
46
13.7.
Surto de Barcarena....................................................................................
49
13.8.
Surto de Belém..........................................................................................
52
13.9.
Surto de Bragança.....................................................................................
55
13.10.
Surto de Mazagão.....................................................................................
58
14.
Captura de animais....................................................................................
62
14.1.
Captura e identificação de animais silvestres...........................................
62
®
14.2.
Pesquisa de T. cruzi pelo sistema QBC e em gota espessa (GE)............
63
14.3.
Xenodiagnóstico e Hemocultura...............................................................
63
15.
Estudo entomológico................................................................................
64
15.1.
Coleta de triatomíneos em palmeiras........................................................
64
xvi
15.2.
Coleta de triatomíneos em armadilhas luminosas.....................................
66
15.3.
Exame do conteúdo intestinal dos triatomíneos........................................
66
16.
Isolamento e cultivo in vitro.....................................................................
69
16.1.
Isolamento de tripanossomas em amostras de pacientes, animais e
triatomíneos...............................................................................................
69
17.
Tipagem genotípica das cepas de tripanossomas pelo Mini-exon............
69
17.1.
Tipagem de isolados de pacientes.............................................................
69
17.2.
Tipagem de isolados de animais silvestres...............................................
69
17.3.
Tipagem de isolados de triatomíneos silvestres........................................
69
17.4.
Análise fenética por RAPD.......................................................................
70
18.
Discussão..................................................................................................
73
18.1
Diagnóstico parasitológico e sorológico...................................................
75
18.2
Seguimento dos casos com testes parasitológicos e sorológicos..............
78
18.3
Coleta e caracterização de animais silvestres...........................................
79
18.4
Coleta e caracterização de triatomíneos silvestres....................................
81
18.5
A variabilidade e a diversidade genética do T. cruzi................................
83
18.6
Estudo da variabilidade de isolados de surtos do Pará e Amapá pelo
marcador
de
RAPD
(Random
Amplification
of
Polymorphic
Dna)..........................................................................................................
86
19.
Conclusões................................................................................................
90
20.
Referências................................................................................................
91
21
Anexos.......................................................................................................
112
xvii
ANEXOS
Anexo 1.
Submissão do projeto de estudos ao Comitê de Ética do Instituto Evandro
Chagas.............................................................................................................
112
Anexo 2.
Ficha Epidemiológica nos Estudos da População Humana.............................
113
Anexo 3.
Termo de consentimento livre esclarecido......................................................
114
Anexo 4.
Meios de cultura Hoff’s, RPMI 1640 e meio LIT...........................................
116
Anexo 5.
Técnica de Hemaglutinação Indireta...............................................................
117
Anexo 6.
Técnica de Imunofluorescência Indireta..........................................................
118
Anexo 7.
Artigo submetido e aceito para publicação......................................................
119
Anexo 8.
Preparo de soluções salinas para dissecação de triatomíneos..........................
134
Anexo 9.
Autorização do IBAMA...................................................................................
135
Anexo 10.
Protocolo do Comitê de Ética em Pesquisa com Animais do Instituto
Evandro Chagas...............................................................................................
Anexo 11.
136
Isolado de tripanossomatídeos obtidos em surtos de Doença de Chagas no
estado do Pará e Amapá – 1995 a 2005...........................................................
137
Anexo 12.
Isolamentos de pacientes em microepidemia no Pará e Amapá......................
138
Anexo 13.
Isolamentos de animais em surtos no Pará e Amapá.......................
139
Anexo 14.
Isolamentos de triatomíneos em surtos no Pará e Amapá...............
140
xviii
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
1. INTRODUÇÃO
A posição taxonômica do protozoário Trypanosoma schizotrypanum cruzi descrito
por
Carlos
Chagas
em
1909
enquadra-o
na
Ordem
Kinetoplastida
e
Família
Trypanosomatidae. Morfologicamente apresenta um único flagelo e uma mitocôndria que
contém o cinetoplasto e concentra praticamente um terço do DNA (kDNA) da célula em
estruturas reticulares no formato de maxi e minicírculos, diferentes de demais eucariotas que
apresentam o DNA espalhado por toda a mitocôndria. A posição do cinetoplasto é um
referencial para distinguir morfologicamente o estágio do parasita. Na fase de tripomastigota
metacíclico, forma infectante para o hospedeiro, o cinetoplasto situa-se posteriormente ao
núcleo. Na fase de epimastigota, o cinetoplasto apresenta-se em posição justanuclear e
anterior ao núcleo e na fase de amastigota apresenta-se difundido como esferas em torno dos
flagelos ainda em formação.
O parasita apresenta um cilco heteroxênico que envolve vertebardos e invertebrados.
O parasita infecta pelo menos mil espécies de mamíferos e quase uma centena de espécies de
triatomíneos, hemípteros hematófagos obrigatórios da Família Reduviidae.
T. cruzi vive no intestino dos triatomíneos e, após o repasto sanguíneo, as formas de
tripomastigota metacíclico podem penetrar pela pele e mucosas íntegras e com solução de
continuidade do hospedeiro, incluindo o homem, em função do rápido processo alérgico
pruriginoso local. Entre as várias formas de transmissão (vetorial, transfusional, congênita e
acidental), a via oral é a mais importante na Amazônia Brasileira, (VALENTE et al., 2006).
Apesar de descrita desde 1909 por Carlos Chagas, somente décadas depois foi
reconhecida como um agravo de grande repercussão na saúde pública da América Latina.
Estimativas do Banco Mundial e da Organização Mundial de Saúde nos anos que antecederam
as campanhas de combate aos triatomíneos domiciliares apontavam para um contingente de
16 a 18 milhões de pessoas infectadas numa extensa área compreendida desde o México até a
Argentina, cobrindo países como Belize, Guatemala, Honduras, El Salvador, Nicarágua,
Costa Rica, Panamá, Colômbia, Venezuela, Guiana, Suriname, Guiana Francesa, Equador,
Peru, Bolívia, Chile, Paraguai, Uruguai e Brasil, todos apresentando diferentes indicadores de
soro prevalência para a infecção (SCHMUNIS et al., 1999). Na década de 90, da casuística sul
americana o Brasil participava com 40% dos infectados e a região considerada endêmica com
presença de triatomíneos domiciliares abrangia uma faixa de 2 milhões de km2 abrigando uma
população sob risco de infecção em torno de 18 milhões de pessoas e previa-se também que
200.000 novos casos, com 21.000 óbitos, ocorreriam a cada ano (SCHOFIELD & DIAS,
1999; MOREL, 2000). A taxa de mortalidade da doença de Chagas entre as doenças
1
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
parasitárias não pode ser subestimada, considerando que é responsável pela morte de 50 mil
pessoas por ano, ficando atrás somente da malária e da esquistossomose (WHO, 2002).
A doença acomete na América Latina principalmente pessoas muito pobres da
população. A fase aguda apresenta quadro clínico semelhante a outros processos infecciosos,
com lesões pontuais de gravidade variável. Nessa fase podem surgir quadros clínicos graves e
até irreversíveis, como a cardite chagásica, que acomete entre 20 e 30% dos casos, as megasíndromes 6% (cólon e esôfago) e seqüelas neurológicas em 3% dos infectados.
A mortalidade oriunda das lesões cardíacas é alta, haja vista que aparecem,
sobretudo, na fase crônica, décadas após a infecção aguda. Os quadros oligossintomáticos e
silenciosos vão se manifestar muitos anos após a infecção, criando problemas sociais e
previdenciários de relevância (DIAS et al., 2002b). Não existe vacina nem desenvolvimento
de novas drogas mais eficientes do que as duas drogas disponíveis que são as mesmas de 30
atrás, com efeitos colaterais indesejáveis e de eficácia satisfatória somente na fase aguda da
doença.
Iniciativas regionais para controle de triatomíneos foram adotadas nos países andinos
do Cone Sul e da América Central e reduziram a transmissão vetorial, apesar das dificuldades
de recursos financeiros e da falta de pessoal (DIAS et al., 2002a; MONCAYO, 1997, 2003).
A doença de Chagas apresentava-se como endemia em grande parte do território
brasileiro em habitações infestadas por triatomíneos: Triatoma infestans; Triatoma sordida,
Triatoma brasiliensis; Triatoma pseudomaculata e Panstrongylus megistus, todos derivados
dos ecótopos degradados de campos abertos naturais e úmidos da Mata Atlântica e do semiárido de caatingas e cerrados (FORATTINI, 1980; MALCOLM, 1991). Esse cenário mudou
bastante após as ações de controle triatomínico e a atual área endêmica brasileira praticamente
se extinguiu (SILVEIRA, 2002).
Ambientes ecológicos exauridos por alterações contínuas e de longa data
proporcionam a perda da fertilidade do solo, deterioram a qualidade de vida da população
rural que habita as áreas endêmicas. Essas populações sem moradia, educação, saneamento e
alimentação dignas têm favorecido historicamente a domiciliação dos triatomíneos e a
permanência da doença de Chagas. A exploração desordenada dos recursos naturais, seguida
de devastação de grandes faixas territoriais na cobertura vegetal da região equatorial
amazônica tem produzido espaços abertos de dimensões colossais, a ponto de, em alguns
deles, não haver mais sinais de recuperação, fato que leva à aceleração dos processos
irreversíveis de desertificação. Essas condições contribuem para o desaparecimento das
espécies nativas de aves e mamíferos, fontes alimentares imediatas de insetos hematófagos,
constituindo-se na perda de uma barreira que facilita a dispersão de doenças veiculadas por
2
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
insetos, incluindo os triatomíneos silvestres e criam possibilidades de sobrevivência de
espécies importadas, (SHAW et al., 1969; FORATTINI, 1980; MACOLM, 1991; TEIXEIRA
et al., 2001). Até o momento já foram registradas na região 22 espécies (GALVÃO et al.,
2003), sendo que duas, Rhodnius pictipes e Panstrongylus geniculatus infectados com T.
cruzi, eventualmente insetos adultos invadem domicílios picando o homem e favorecendo
aparecimento de casos agudos.
Em decorrência desse fato, o processo de endemização da doença de Chagas já
estaria ocorrendo na Amazônia Brasileira, pelo deslocamento do ciclo silvestre para próximo
do domicílio do homem, incluindo triatomíneos que buscam alternativas de fonte alimentar e
de abrigo (SCHOFIELD et al., 1982; COURA et al., 2002a; VALENTE, et al., 2004).
1.1. RETROSPECTIVA DOS ESTUDOS SOBRE RESERVATÓRIOS E VETORES
SILVESTRES DO T. CRUZI E DA DOENÇA DE CHAGAS NA AMAZÔNIA
BRASILEIRA
FERREIRA & DEANE (1938) foram os pioneiros na realização de estudos sobre
reservatórios e vetores silvestres do T. cruzi na Região Amazônica, encontrando a irara (Tayra
barbara) naturalmente infectada. Mais tarde, DEANE & JANSEN (1939) identificaram o
parasito em material isolado de triatomíneos e de marsupiais. RODRIGUES & MELO (1942),
trabalhando no Aurá, realizaram o primeiro inquérito hemoparasitoscópico de doença de
Chagas na Amazônia e examinaram 117 indivíduos, todos negativos. Observaram, porém, a
infecção natural por tripanossoma tipo T. cruzi em onze gambás, cinco tatus, cinco morcegos,
três tamanduás e uma irara, comprovando o ciclo silvestre na região.
Em outros trabalhos realizados posteriormente por DEANE (1961a. 1961b, 1964a,
1964b,
1967), com reservatórios silvestres na periferia de Belém e na rodovia Belém-
Brasília, foi detectada a presença de organismos tipo T. cruzi em marsupiais e morcegos. Ao
examinarem 1.171 mamíferos de 13 diferentes espécies no Estado do Pará, LAINSON et al.,
(1979) encontraram tripanossomas semelhantes a T. cruzi em marsupiais (Didelphidae), tatus
(Dasypus novemcinctus), porco-espinho (Coendou sp.), quatis (Nasua nasua) e roedores.
DEANE (1963, 1964c) realizou os primeiros inquéritos sorológicos de doença de
Chagas na Amazônia Brasileira, nos Estados do Amapá e Pará e não detectou resultados
positivos nas populações estudadas.
O primeiro caso de doença de Chagas de que se tem registro na Amazônia foi
observado em 1940 na Guiana Francesa, em menor, de 7 anos, quando foram encontrados
amastigotas de T. cruzi em material de punção esternal (FLOCH & TASQUÉ, 1941). Anos
3
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
mais tarde, FLOCH & CAMAIN (1948) descreveram novos casos de infecção assintomática e
casos agudos na Guiana.
Somente no final de 1960 foram descritos em Belém os primeiros casos autóctones
de doença de Chagas da Amazônia Brasileira, quatro casos agudos, simultâneos, numa mesma
família e num mesmo domicílio (SHAW et al., 1969). Outros episódios dessa natureza foram
detectados na região nas décadas seguintes.
Entre os anos de 1975 e 1979, um amplo Inquérito Sorológico Nacional para doença
de Chagas (CAMARGO et al., 1984), revelou baixos índices de soro-prevalência na Região
Amazônica: no Amapá 0%; Roraima 0,3%; Rondônia 0,4%; Pará 0,6%; Amazonas 1,9%; e
Acre 2,4%. Inquéritos recentemente realizados no Município de Barcelos (AM) têm
apresentado índices elevados (12,5%) de anticorpos anti-T. cruzi, associando a infecção
chagásica principalmente a pessoas dedicadas à extração de piaçava, as quais referem
freqüentes ataques por triatomíneos, conhecidos no local como “piolho da piaçava” (COURA
et al., 1994, 1995).
SHERLOCK (1979) e LAINSON et al., (1979) referiram que as espécies
amazônicas, citadas no Quadro 1, com exceção do Triatoma rubrofasciata, são de hábitos
silvestres restritos e que a ausência de triatomíneos colonizando domicílios contribui para que
a região não seja reconhecida como endêmica da doença de Chagas. Essas condições,
entretanto, não explicam nem impedem que episódios familiares regulares e freqüentes
ocorram na região, visto que eventualmente adultos de R. pictipes e P. geniculatus voam para
o interior das casas atraídos pela luz, inclusive picando o homem, originando casos agudos a
partir do ciclo enzoótico (VALENTE et al., 1998a, 1999a,b, 2001, 2004).
São escassos os estudos sobre o envolvimento de espécies silvestres com a
transmissão da doença de Chagas na Amazônia Brasileira. Referem-se, na maioria, a
investigações dos hábitos alimentares (RODRIGUES & MELO, 1942), ou à observação da
taxa de infecção natural por tripanossomas (DEANE, 1947; ALMEIDA, 1971; ALMEIDA &
MACHADO 1971; LAINSON et al., 1979; MASCARENHAS, 1986). Novas perspectivas
nesse campo foram alcançadas por MILES (1976) que introduziu uma metodologia
facilitando o seguimento de mamíferos até seus refúgios, proporcionando a identificação dos
ecótopos naturais de diversas espécies de triatomíneos da Amazônia Brasileira (R. pictipes, R.
robustus, P. geniculatus, P. lignarius, P. rufotuberculatus, E. mucronatus, M. trinidadensis,
Belminus herreri), além da descrição de Rhodnius paraensis (SHERLOCK et al., 1977).
Estudos que empregam essa metodologia foram realizados em outras regiões e os resultados
foram ratificados (MILES et al., 1981b, MILES & SOUZA, 1986).
4
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
O encontro desses triatomíneos, de acordo com BARRETT & GUERRERO (1991), é
relativamente freqüente, diante da existência na Amazônia Brasileira de grandes faixas de
terra, estimadas em 20.000 Km2, ocupadas por babaçuais com variadas espécies de palmeiras
do gênero Orbygnia, ecótopos naturais das principais espécies que compõem a fauna
triatomínica da região, principalmente R. pictipes, R. robustus e P. geniculatus.
Algumas dessas espécies, como adultos do Rhodnius brethesi, no Estado do
Amazonas, vivem em palmeiras de piaçava (Leopoldinia piacaba), associados com pequenos
répteis (MASCARENHAS, 1987; 1991). Quando famintos, atacam as pessoas que exploram a
piaçava, em busca de alimento no Rio Padauari, afluente do Rio Negro (COURA et al.,
1994a).
Na cidade de Manaus, NAIFF et al., (1998) observaram que adultos famintos de P.
geniculatus, portadores da infecção por T. cruzi, entraram em domicílios, sobretudo na
estação seca.
5
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
Quadro 1. Espécies de triatomíneos já referidos à Região Amazônica do Brasil1
Espécie
Alberprosenia malheiroi
Belminus herreri
Cavernicola lenti
Cavernicola pilosa
Eratyrus mucronatus
Brasil
Desconhecido
Desconhecido
Sem registro
Associado à
transmissão
Não
Brasil, Panamá
Brasil
Brasil, Colômbia, Equador, Panamá e Venezuela
Brasil, Bolívia, Colômbia, Guiana Francesa, Guiana, Peru,
Suriname, Trinidad e Venezuela
Brasil, Bolívia, Peru, Colômbia, Panamá, Suriname, Trinidad e
Venezuela
Argentina, Bolívia, Brasil, Colômbia, Costa Rica, Equador,
Guiana Francesa, Guiana, Nicarágua, Suriname, Panamá,
Paraguai, Peru, Trinidad, Uruguai e Venezuela
Tronco de árvores
Cavernas
Cavernas
Árvores ocadas
Lagartixas
Morcegos
Morcegos
Coendou e roedores
Sem registro
Sim
Sim
Sim
Não
Não
Não
Não
Palmeiras
Marsupiais
e Sem registro
roedores
Marsupiais, roedores,
Sim
tatus e animais
domésticos
Não
Descritor(es)
Serra, Serra & Von Atzingen,
1980
Lent & Wigodzinsky, 1979
Barrett & Arias, 1985
Barber, 1937
Stål, 1859
Microtriatoma trinidadensis Lent, 1951
Ecótopo
Animal associado
+ T. cruzi
Buracos no chão,
Sim
palmeiras,
chiqueiros e
galinheiros
Panstrongylus lignarius
Walker, 1873
Brasil, Guiana, Suriname e Venezuela.
Buracos e copas de
Sim
Não
árvores
Panstrongylus rufotuberculatus Champion, 1899
Bolívia, Brasil, Colômbia, Costa Rica, Equador, México, Desconhecido
Desconhecido
Sim
Talvez
Panamá, Peru e Venezuela.
Psamolestes tertius
Lent & Jurgerg, 1965
Brasil
Ninhos de aves
Aves
Sim
Não
Rhodnius amazonicus
Almeida, Santos & Sposina, Pará
Desconhecido
Desconhecido
Desconhecid Desconhecido
1973
o
Rhodnius brethesi
Matta, 1919
Brasil, Colômbia e Venezuela
Palmeiras
Lagartixas
Sim
Talvez
Rhodnius jacundaensis
Serra, Serra & Von Atzingen, Brasil
Desconhecido
Desconhecido
Desconhecid Desconhecido
1980*
o
Rhodnius nasutus
Stål, 1859
Brasil (Ceará, Maranhão, Paraíba, Piauí, Rio Grande do Norte) Palmeiras
Marsupiais
Sim
Sim
Rhodnius neglectus
Lent, 1954
Brasil (Bahia, Goiás, Mato Grosso, Maranhão, Minas Gerais,
Marsupiais e
Sim
Talvez
Paraná, Pernambuco, São Paulo)
roedores
Rhodnius milesi
Valente et al.,; 1999
Brasil
Palmeiras
Marsupiais e
Sim
Talvez
roedores
Rhodnius paraensis
Sherlock, Guitton & Miles, Brasil
Palmeiras
Echimys
Não
Não
1977
Rhodnius pictipes
Stål, 1872
Bolívia, Brasil, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Guiana, Palmeiras
Roedores e
Sim
Sim
Peru, Suriname, Trinidad e Venezuela.
marsupiais
Rhodnius prolixus
Stål, 1859
Colômbia, Costa Rica, Guiana Francesa, Guiana, Guatemala, Palmeiras,
Roedores, marsupiais
Sim
Sim
Honduras, México, Nicarágua, El Salvador e Venezuela
domicílios e anexos e homem
Rhodnius robustus
Larrousse, 1927
Brasil, Colômbia, Equador, Guiana Francesa, Peru e Venezuela Palmeiras e
Roedores e
Sim
Sim
bromélias
marsupiais
Triatoma maculata
Erichson, 1848
Aruba, Boanire, Brasil, Suriname e Venezuela
Desconhecido
Animais silvestres e
Sim
Sim
homem
Triatoma rubrofasciata
De Gerr, 1773
Cosmopolita
Abrigos do rato
Rato doméstico
Sim
Sim
doméstico
1
Fonte: GALVÃO et al., (2003). Checklist of the current valid species of the subfamily Triatominae Jeannel, 1919 (Hemiptera, Reduviidae) and their geographical distribution, with
nomenclatural and taxonomic notes. Zootaxa 202: 1-36 (2003).
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Panstrongylus geniculatus
Latreille, 1811
Distribuição
6
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
1.2. IMPORTÂNCIA EPIDEMIOLÓGICA DA TRANSMISSÃO ORAL DA DOENÇA DE
CHAGAS
A via oral da infecção chagásica ao homem é considerada um mecanismo primário
de transmissão. Esse mecanismo alternativo tem merecido atenção e deverá manter
importância quando medidas sanitárias interromperem a transmissão vetorial e a transfusional
(COURA, 1997).
O conceito de transmissão oral da doença de Chagas está intimamente relacionado ao
ambiente enzoótico natural do T. cruzi. Nesse ciclo, triatomíneos silvestres partilham
ecótopos naturais com mamíferos silvestres, cujo sangue constitui sua fonte alimentar.
Considerando que os mamíferos reservatórios de T. cruzi (marsupiais, edentados e roedores)
são também insetívoros, eles podem, eventualmente, alimentar-se de triatomíneos
naturalmente infectados, desde que tais oportunidades lhes sejam oferecidas. Acredita-se que
assim se mantenha o ciclo do parasito em natureza, por via digestiva e não transcutânea, já
que esta é, certamente, dificultada pela espessura do tegumento e pela própria pelagem dos
animais.
1.3. HISTÓRICO DOS ESTUDOS SOBRE TRANSMISSÃO ORAL NA AMÉRICA DO
SUL
Observações sobre a possibilidade de transmissão de T. cruzi por via oral foram
referidas inicialmente por NATAN-LARRIER (1921), depois por BRUMPT (1931),
KOFOID & DONAT (1933) e CARDOSO (1933), que testaram a capacidade de mamíferos
de se infectarem com fezes de triatomíneos. MAZZA et al., (1936) descreveu um caso agudo
em lactente, atribuindo-o à transmissão por via digestiva, tendo demonstrado a presença de
tripomastigotas no leite materno.
Informações de grande valor histórico sobre casos humanos de doença de Chagas por
essa via são também enumeradas, detalhadamente, pela revisão de STORINO & JÖRG
(1994), em que dois relatos merecem atenção, ambos relacionados à região do Chaco
argentino. No primeiro, o Dr. Ramón Freire informa que, ao tratar uma criança de 3 meses,
em fase aguda, obteve da mãe da criança a informação de que a doença se manifestara
imediatamente após uma curandeira da região “receitar-lhe” uma beberagem composta de
várias ervas em mistura com sangue fresco de tatu. O segundo relato, feito pelo Dr.
Braverman, refere que atendeu uma criança de 12 anos com quadro grave de insuficiência
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7
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
cardíaca, culminando com óbito, vinte dias após participar de uma excursão de caça em que
consumiu exclusivamente carnes de animais silvestres, como pacas, tatus e gambás. Naquela
região esses animais são reservatórios naturais do T. cruzi (MAZZA et al., 1930, 1931).
Nos estudos experimentais sobre a viabilidade do parasito pela via oral, TORRICO
(1950) e WOOD (1960) observaram a sobrevivência de T. cruzi em triatomíneos um mês após
a morte desses insetos, ingeridos por animais domésticos, como coelhos, gatos e cães.
VERGANI (1952) registrou que, quando moscas domésticas se alimentavam de sangue de
animais infectados por T. cruzi, ou mesmo de fezes de triatomíneos, permaneciam com o
parasito por até oito dias, levando cães que se alimentassem delas a se infectar. Esse trabalho,
ampliado por DIAZ UNGRÍA (1968) demonstrou, mesmo temporariamente, que outros
insetos, como baratas Periplaneta americana e Blatella germanica poderiam infectar-se
quando alimentadas com dejetos ou alimentos contaminados com T. cruzi.
MAYER (1961) e DIAZ UNGRÍA (1964) submeteram animais experimentais à
ingestão de leite contaminado com formas infectantes de T. cruzi isoladas de triatomíneos. Os
animais apresentaram infecção no intervalo de 9 a 29, dias com diferentes manifestações
clínicas. DIAZ UNGRÍA (1967) demonstraram que o T. cruzi, se transmitido por via oral, não
perde sua capacidade de infecção quando enfrenta o suco gástrico.
Nos anos seguintes, diversos trabalhos ratificaram a viabilidade da transmissão por
via oral, com a utilização de diferentes vias, hospedeiros e vetores expostos à contaminação
pelo T. cruzi (RICKMANN, 1966; GOMES, 1966; DIAZ UNGRÍA, 1969; DIAZ UNGRÍA &
SOTO BRACHO, 1970; DIAZ UNGRÍA & ZEUSS 1971; DAVIS, RUSSEL & ADAMS,
1980; LAINSON et al., 1980).
1.4. EVIDÊNCIAS DE INFECÇÃO HUMANA POR VIA ORAL
1.4.1. Na América do Sul
A infecção humana por via oral pelo T. cruzi foi presumida por MAZZA et al.,
(1936) e TÁLICE (1964), na Argentina, quando depararam com casos clínicos cuja
epidemiologia afastava qualquer possibilidade de contato com vetor ou história de transfusão.
CARPINTERO (1978), examinando um grupo de mil casos de doença de Chagas, observou
que os pacientes não conheciam triatomíneos, nunca haviam sido submetidos a transfusão,
mas se referiam à ingestão freqüente de carne de animais silvestres hospedeiros do T. cruzi,
quase sempre assados primitivamente “até dourar a pele”, conforme hábitos regionais.
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8
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
No Equador, AMUNARRIZ et al., (1991) e AGUILAR & YÉPEZ (1995) relataram
que estudos sorológicos realizados por GUDERIAN e colaboradores (dados não publicados)
em 1011 pessoas de 18 comunidades da Província de Secumbios, predominantemente nativos
quíchuas da Amazônia equatoriana, resultaram em índice de infecção de 6,03%. No relato, os
autores chamam a atenção que este índice poderia ser atribuído tanto à transmissão vetorial,
quanto à transmissão oral, esta a partir da ingestão de carne de animais silvestres semi-crus,
importante fonte alimentar que talvez fosse responsável por focos da doença entre índios da
Amazônia equatoriana.
A via oral também foi observada na Colômbia. RODRIGUEZ et al., (1992)
encontraram evidência de surto a partir de manifestação de insuficiência cardíaca em
habitantes de Tibu, Norte de Santander. Naquela localidade, seis soldados de um grupamento
militar desenvolveram manifestações clínicas (sem óbito) compatíveis com doença de Chagas
aguda (DCA), confirmadas apenas pelos exames imunológicos. Na ausência de lesão de porta
de entrada, sugeriu-se a transmissão por via oral, considerando que o grupo tinha hábito de
ingerir carne de animais silvestres durante os trabalhos na selva. Ainda na Colômbia,
CARCERES et al., (1999) encontraram insuficiência cardíaca em 13 pessoas (3 óbitos) do
povoado de Guamal, Departamento de Magdalena. Naquela localidade, as casas não tinham
triatomíneos. Suspeitou-se de DCA adquirida por transmissão oral do T. cruzi, por ingestão do
vinho extraído de uma palmeira.
Em dezembro de 2007, um surto de doença de Chagas foi detectado numa escola
primária do Município de Chacao, região metropolitana de Caracas, Venezuela, sendo
confirmados pelo menos 8 casos por exames parasitológicos e mais de 100 por sorologia.
Autoridades locais iniciaram tratamento específico em massa nos escolares. A clínica
predominante foi síndrome febril prolongada, calafrios, cefaléia, mialgias, artralgias,
palpitações, edema facial e de membros inferiores, eritema nodoso (em adultos),
hepatomegalia e parestesias. Esses casos foram inicialmente tratados como dengue e
mononucleose infecciosa. Suspeita-se que o suco de uma fruta local contaminado com fezes
de triatomíneos teria desencadeado o surto (PROMED NEWS, 2007).
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9
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
1.4.2. No Brasil
A suspeita de transmissão de T. cruzi por via oral já pode ser deduzida do próprio
artigo original de CARLOS CHAGAS (1909). Na tentativa de Oswaldo Cruz obter infecção
em macacos pela picada de triatomíneos, a infecção de Calitrix penicilatta foi possivelmente
mediada por ingestão dos triatomíneos pelos sagüis (COURA, 1997).
O primeiro surto de doença de Chagas de que se tem notícia no Brasil foi registrada
em Teutônia, localidade do Município de Estrela (RS), em março de 1965 (COURA, 1966;
SILVA et al., 1968) e se caracterizou como infecção aguda simultânea de 17 pacientes. Seis
deles foram a óbito e, na autópsia observou-se formas amastigotas de T. cruzi no músculo
cardíaco. O xenodiagnóstico e a reação de fixação de complemento confirmaram o
diagnóstico de doença de Chagas. Após a investigação epidemiológica, especulou-se que a
transmissão poderia ter ocorrido pela ingestão de refeição servida na Escola Agrícola de
Teutônia.
O segundo surto foi registrada em Belém (PA) por SHAW et al., (1969), em uma
família de 4 pessoas com quadro clínico típico de fase aguda de doença de Chagas. Após os
estudos epidemiológicos, sugeriu-se a hipótese de transmissão por um alimento contaminado
com fezes de triatomíneo silvestre. A viabilidade experimental dessa hipótese foi
posteriormente demonstrada por LAINSON et al.,( 1980). Na localidade de Riacho de
Santana (BA) um surto com 20 casos foi reportado por BARRETT et al., (1979), mas os
autores não precisaram o alimento envolvido.
Novo surto ocorreu em outubro de 1986 no município de Catolé do Rocha (PB),
descrita por SHIKANAI-YASUDA et al., (1991). Um numeroso grupo de 94 pessoas
participara de uma festa familiar e 26 delas apresentaram, simultaneamente, quadro muito
semelhante aqueles referidos pelos pacientes de Teutônia. Um paciente de 74 anos foi a óbito
após insuficiência cardíaca aguda. Na autópsia, foram observadas miocardite, esofagite e
presença de amastigotas no tecido cardíaco. Exames sorológicos realizados no grupo
revelaram resultados positivos (IgM) em 26 pessoas, das quais, 9 tiveram ainda o
xenodiagnóstico positivo, dentre 14 examinadas. Concluiu-se que a transmissão teria ocorrido
pela ingestão de caldo de cana, único alimento não cozido servido para os convidados e o que
poderia estar contaminado com secreção anal de gambá ou fezes de triatomíneos, ambas
espécies encontradas infectadas com T. cruzi no peridomicílio. Um resumo dos surtos
conhecidos fora da Amazônia Brasileira encontra-se na Tabela 1, abaixo.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
Tabela 1. Surtos de doença de Chagas fora da Amazônia Brasileira, 1967-2006
UF
MUNICÍPIO
ANO
Nº. CASOS
REFERÊNCIA
RS
Teutônia
1967
17
Coura, 1966
BA
Riacho
de 1979
20
Barrett et al., 1979
Santana
PB
Catolé do Rocha
1991
26
Shikanay-Yasuda et al., 1991
SC
Navegantes
2005
24
Steindel et al.,; 2008
CE
Redenção
2006
8
Relato
SVS
no
site:
http://www.saude.ce.gov.br/internet/p
ublicacoes/notastecnicas/nota_tecnica
_chagas.pdf
BA
Macaúbas
2006
7
Relato SVS
BA
Ibipitanga
2006
6
Relato SVS
TOTAL
108
Fonte: Ministério da Saúde, Brasil, 2007.
O surto que mais chamou atenção ocorreu no município de Navegantes, SC, em
2005, e por se tratar de roteiro turístico muito concorrido, teve grande repercussão na mídia
nacional e internacional. Acometeu um grupo de 24 pessoas, com 4 óbitos. Após a
investigação epidemiológica aventou-se a hipótese de que triatomíneos silvestres foram
triturados junto com feixes de cana, contaminado o caldo vendido para pessoas em lanchonete
de uma auto-estrada (STEINDEL et al.,; 2008). Outros três surtos ocorreriam em 2006, sendo
um no Estado do Ceará, município de Redenção, com 8 casos, e dois surtos na Bahia, um no
município de Macaúbas, com 7 casos, e outro no município de Ibipitanga, com seis. As
secretarias de saúde dos dois estados não conseguiram concluir como ocorreu a transmissão,
nem identificou o(s) alimento(s) envolvido(s).
1.5. SURTOS DE DOENÇA DE CHAGAS AGUDA NA AMAZÔNIA BRASILEIRA
Após a ocorrência do primeiro episódio familiar em Belém, outros viriam a ocorrer
na região (resumidos na Tabela 2), como o relatado por RODRIGUES et al., (1988) que
descreveram dois episódios, um com 6 casos no bairro de Santa Rita e outro com 2 casos
agudos no bairro do Pacoval, todos ocorrido simultaneamente em outubro de 1984 na cidade
de Macapá (AP), com história de febre prolongada, edema de membros inferiores, mal estar,
cefaléia e exame parasitológico positivo em gota espessa.
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11
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
Outro episódio com 3 casos foi registrado em 1982 (comunicação pessoal dos Drs.
Sarcinelli & Fraiha) numa família do bairro da Pedreira em Belém. Esses indivíduos
apresentaram quadro agudo grave, todos com exames parasitológicos positivos, havendo um
dos pacientes evoluído para óbito.
Novos surtos seriam detectados: um com 3 casos em Belém, em 1983, e outro com 5
casos, na cidade de Cametá, PA, em 1988 (comunicação pessoal do Dr. Adelson Souza),
todos ocorrendo entre os meses de setembro e outubro. Os pacientes exibiam quadro típico de
fase aguda e enfatizavam nunca terem se ausentado do Estado nem terem sido submetidos a
transfusão. Apresentaram os mesmos sintomas: febre prolongada (35 a 45 dias), edema dos
membros inferiores e da face, cefaléia e eritema cutâneo. Seis dos 8 casos apresentavam
exames parasitológicos positivos e todos revelaram imunofluorescência com IgG e IgM
positivos.
Novamente SOUZA et al., (1989) descreveram outro surto familiar ocorrido em um
bairro da periferia de Belém, num grupo de 3 pessoas, em situações clínicas e
epidemiológicas muito semelhantes àquelas referidas pelo mesmo autor em 1983.
CRESCENTE et al., (1992) observaram em 1991 a ocorrência de surto em 4 pessoas
de uma família residente na Vila de Icoaraci, a 20 km de Belém, todos com sintomas de fase
aguda, sendo os seus exames sorológicos e parasitológicos positivos. Na investigação
epidemiológica não foi comprovada a participação convencional de triatomíneos na
transmissão, sugerindo-se então uma forma alternativa, talvez de transmissão coletiva via
contaminação de alimentos.
No ano seguinte, VALENTE et al., (1993) registraram novo episódio ocorrido em
1992, envolvendo 5 pessoas de uma mesma família, no município de Afuá, na região do
Marajó (PA), que após passarem por vários serviços médicos sem diagnóstico, foram
encaminhadas ao IEC em Belém em estado precário de saúde. Apresentavam sintomas como
febre de mais de 40 dias, eritema cutâneo, edema generalizado, miocardiopatia e cefaléia,
sendo as pesquisas parasitológica e sorológica positivas para doença de Chagas. Investigações
realizadas no local detectaram a presença de vetores e reservatórios silvestres muito próximos
ao domicílio, levando observadores a suspeitar do seu envolvimento na contaminação de
alimentos ingeridos pelos pacientes.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
Tabela 2. Surtos de doença de Chagas na Amazônia Brasileira de 1968 a 20071
UF - MUNICÍPIO
ANO
Nº. DE SURTOS Nº. DE CASOS/SURTO
MA - SÃO LUÍS
1985
01
02
MA- BACURITUBA
1985
01
02
AC - RIO BRANCO
1993
01
03
AP - MACAPÁ
1974-2005
10
50
AP - MAZAGÃO
1996
01
17
AP - SANTANA
1999-2004
03
35
AM - TEFÉ
2004
01
09
AM - COARI
2007
01
25
PA - BELÉM
1968-2005
32
104
PA - CAMETÁ
1988-1999
02
08
PA - AFUÁ
1992
01
05
PA - C. DO ARARI
1992-2006
02
16
PA - VIZEU
1996
01
03
PA - ABAETETUBA
1998-2005
07
55
PA - BAGRE
1999
02
16
PA - SANTARÉM
1999-2006
02
31
PA - PONTA DE PEDRAS
2001
01
09
PA - IGARAPÉ-MIRI
2002
01
12
PA - BARCARENA
2002-2205
03
15
PA - ANANINDEUA
2003
06
23
PA - S. J. DE PIRABAS
2003
01
03
PA - BREVES
2003-2007
02
15
PA - MUANÁ
2004
01
04
PA - S. S. BOA VISTA
2004
01
03
84
465
TOTAL
1
Fonte: Instituto Evandro Chagas, 2007. Citados em Valente et al., (1999 a,b, 2006); Pinto et al.,
(2004).
VIANA et al., (1994) identificaram em Rio Branco (AC) 3 casos agudos numa
mesma família, caracterizados por evolução rápida e grave, com febre alta, edema
generalizado, miocardiopatia, inclusive com óbito de um menor. Na ocasião, os autores não
concluíram sobre a forma de transmissão, apesar de encontrarem no peridomicílio
triatomíneos silvestres infectados com T. cruzi. No quintal da residência foram identificados
vários exemplares de palmeiras denominadas urucurizeiro (Attalea phalerata). Segundo relato
da mãe, era hábito das crianças aguardarem a queda dos frutos do urucuri que lhes serviam de
alimento, muitas vezes não lavados. Esses frutos se dispõem em cachos junto à coroa das
palmeiras, onde foram coletadas dezenas de triatomíneos (R. pictipes) infectados com T.
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13
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
cruzi. Possivelmente algum fruto contaminado com fezes frescas de triatomíneos possibilitou
a transmissão da enfermidade para aquelas crianças.
Em 1996, dois novos episódios foram referidos. O primeiro, em Viseu, apresentou 2
casos e o segundo, em Belém, acometeu 4 indivíduos (VALENTE et al., 1997a). Todos se
encontravam em fase aguda, com quadro febril prolongado, miocardiopatia, edema de
membros inferiores e exame parasitológico positivo. A investigação epidemiológica afastou
totalmente a possibilidade de transmissão vetorial ou transfusional, razão pela qual os autores
sugeriram novamente a transmissão por via oral, porém não tiveram oportunidade de chegar à
conclusão sobre o mecanismo.
A hipótese de transmissão oral foi finalmente apresentada por VALENTE et al.,
(1997b) em episódio verificado no Estado do Amapá, quando 17 pessoas se infectaram por
ingestão do sumo do açaí, tudo levando a crer que um ou mais triatomíneos silvestres,
atraídos pela luz, tivessem caído dentro da máquina elétrica de despolpar os frutos,
contaminando o alimento. O episódio ocorreu entre os meses de outubro e novembro de 1996,
na Serraria Monte Castelo, na localidade de Rio Bispo, Município de Mazagão, onde residem
4 famílias, num total de 26 pessoas, numa pequena vila em que a distância máxima entre as
casas era de 50 metros. Uma das moradoras reconheceu a partir de um mostruário um
triatomíneo, embora não precisando a espécie, ressaltou ter encontrado um exemplar naquele
mesmo ano na sala de uma das residências. Os pacientes nunca se ausentaram do Estado, nem
tinham sido submetidos a transfusão. Os dados referentes a esse estudo encontram-se
descritos em um dos artigos que compõem esta tese.
Estudo epidemiológico realizado no local registrou a presença de triatomíneos
silvestres em palmeiras de urucuri, Attalea phalerata, reconhecido ecótopo desses insetos na
região - 30% das palmeiras examinadas (6/20) estavam infestadas por Rhodnius pictipes e R.
robustus infectados com tripanossomas indistinguíveis de T. cruzi, a uma distância de até 50
metros das casas. Investigou-se o hábito alimentar das famílias, observando-se que o único
alimento comum, não cozido, consumido era o açaí, preparado às 11:00 e às 20:00 h em
máquina elétrica.
Nesse episódio de Mazagão, na ocasião o maior surto da região, o mecanismo de
contaminação foi simulado in loco, mediante a instalação de armadilha de luz nas
proximidades da máquina de processar o açaí, logrando-se a captura de triatomíneos
infectados em várias noites subseqüentes, inclusive no interior da máquina em duas ocasiões.
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14
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
Esse achado de Mazagão permitiu valorizar a importância do açaí como alimento
potencialmente envolvido na transmissão da doença de Chagas, já que reúne características
importantes, como ser um alimento não cozido e amplamente consumido na região.
Em dois novos episódios registrados num bairro central de Belém (4 casos) e em
Santana, no Amapá (4 casos), foi também observada a provável participação do açaí no
mecanismo de transmissão (VALENTE et al., 1998b).
Em 1998, no município de Abaetetuba, dois importantes surtos de doença de Chagas
foram registradas, uma na sede municipal (com 13 casos, 2 óbitos), outra em Vila de Beja (5
casos, um óbito). Além da sintomatologia típica de fase aguda já observada em outros surtos,
foi possível, no episódio da sede do município, encontrar um triatomíneo (P. geniculatus) já
morto, mas com parasitos ainda viáveis no conteúdo intestinal, achado dentro de um cesto
com os frutos procedentes de ilhas da região (VALENTE et al., 1999a,b; PINTO et al., 1999).
Nesse mesmo ano, foi ainda identificado no bairro da Terra Firme, em Belém, um
episódio familiar com 2 casos cuja epidemiologia afastava totalmente a transmissão vetorial
tradicional. O chefe da família, um dos infectados, comercializava açaí numa pequena
revenda e apresentou, junto com a esposa, febre elevada e prolongada, quadro de
miocardiopatia chagásica aguda grave, edema generalizado e insuficiência renal. O estudo
epidemiológico revelou indícios de transmissão pela ingestão de açaí (VALENTE,
comunicação pessoal).
Em 1999, outros 3 episódios com 20 casos foram registrados no Pará: um em Cametá
com 3 casos (PANTOJA et al., 2000), outro em Bagre com 7 casos (VALENTE et al., 2000) e
um surto com 13 casos em Santarém (VALENTE et al., 2001). O episódio de Cametá
envolveu duas jovens, de 18 e 22 anos, e seu pai de 45, que residiam na localidade de
Carapajó, onde é freqüente a ocorrência de leishmaniose visceral. Os familiares referiam
quadro febril prolongado, com edema do rosto e dos membros inferiores, cefaléia, vômito,
diarréia, hepatoesplenomegalia, área cardíaca aumentada, com importante derrame
pericárdico. O diagnóstico sorológico inicial foi dado como leishmaniose visceral, comum
naquela região, posteriormente a pesquisa direta de parasitos circulantes mostrou-se positiva
para DCA. Dois desses casos, uma jovem de 22 anos e o seu pai, evoluíram para óbito antes
de iniciarem o tratamento.
No episódio de Bagre, 7 pessoas de 3 famílias foram envolvidas. Esses indivíduos
partilhavam da mesma alimentação, com consumo diário de açaí. Nesse cenário,
provavelmente a transmissão da doença ocorreu de maneira semelhante à de Abaetetuba.
Triatomíneos também foram encontrados em paneiros de açaí em pelo menos uma ocasião e
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15
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
provavelmente foram levados para a máquina e triturados. Já no episódio de Santarém, o
primeiro registrado no oeste do Pará, o alimento provável de contaminação foi o sumo da
bacaba, preparado nas mesmas condições do açaí (VALENTE et al., 2001). Já em 2006, ainda
em Santarém, na Vila de Mojuí dos Campos, um surto que acometeu 21 pessoas foi
investigada, concluindo-se novamente pelo envolvimento do sumo de bacaba na transmissão
(CRESPO et al., 2007).
Durante o ano de 2000, seis episódios, ainda inéditos, somando 30 casos, foram
registrados na região: três no Amapá (13 casos) e três no Pará (17 casos).
No Amapá, dois episódios ocorreram na cidade de Macapá, envolvendo 2 e 5 casos,
respectivamente. O terceiro episódio ocorreu na cidade de Santana, 6 casos com um 1 óbito.
Fator comum nesses episódios foi o consumo de açaí, uma vez que Macapá e Santana são
muito próximas à bacia do Marajó, maior produtora da fruta no Pará.
Os três episódios do Pará ocorreram em bairros do centro de Belém: o primeiro, com
9 casos no bairro da Pedreira, o segundo com dois casos no bairro do Marco e o terceiro com
6 casos no bairro do Reduto. Nesses cenários não foram encontrados triatomíneos que
pudessem ser incriminados na transmissão e não havia histórico de transfusão sangüínea.
Mais uma vez a similaridade epidemiológica residia no consumo de suco de açaí (VALENTE
et al., 2001, 2002).
Entre os anos de 2001 e 2002, na Bacia do Marajó, foram identificados 10 casos,
sendo 5 associados a um surto no município de Ponta de Pedras. Os pacientes, com sintomas
gerais de cefaléia, febre arrastada, eritema cutâneo, calafrios, tiveram inicialmente suspeita de
malária e dengue, mas foram finalmente diagnosticados como doença de Chagas aguda
(VALENTE et al., 2002). A investigação no local do agravo levou à coleta de 86 insetos,
distribuídos entre as espécies R. robustus, R. pictipes e P. geniculatus. Desses, 27
apresentaram T. cruzi nas fezes. O ecótopo principal desses insetos foram palmeiras do gênero
Orbignya dentre as quais 17 foram examinadas, 60% delas estando infestadas por
triatomíneos silvestres. Quinze animais silvestres foram capturados (5 D. marsupialis, 4 M.
cinerea, 4 P. guyanensis e 2 M. murina), 5 deles (33,3%) apresentando infecção por
tripanossomatídeos semelhantes ao T. cruzi. Adicionalmente, outros 5 casos de DCA esparsos
ocorreram em outros municípios do Marajó.
O primeir surto do Estado do Amazonas ocorreu em 2004, no município de Tefé,
num grupo de 9 pessoas que apresentaram quadro de febre intensa, edema de membros
inferiores e da face, com um dos pacientes evoluindo para um quadro de meningoencefalite.
Na ausência de vetores envolvidos diretamente nos domicílios dos pacientes, foi proposta a
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
transmissão pela via oral, sem definição do alimento ingerido (BORBOREMA et al., 2005;
LACERDA et al., 2005).
A partir da formalização de uma base de vigilância para doença de Chagas no Pará e
Amapá, entre 2005 e 2006, um número significativo de casos da doença foi detectado e
notificado. A distribuição geográfica parece abranger o nordeste e o oeste do Pará e a meso
região do Marajó e no estado do Amapá, região pertencente aos dois estados (Figura 1).
Os indícios epidemiológicos apontam que a hipótese de transmissão oral seria o
mecanismo alternativo mais importante na transmissão da doença de Chagas na Amazônia
brasileira. Os dados apresentados são de uma casuística pontual que deve ser levada em
consideração para uma grande subnotificação.
Figura 1. Distribuição geográfica da doença de Chagas aguda na Amazônia Brasileira 1968 - 2007
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17
Sebastião Aldo da Silva Valente
Introdução
Além da contaminação de alimentos não cozidos, como os sumos do açaí e da
bacaba, pelas fezes de triatomíneos infectados, a presença de formas metacíclicas de T. cruzi
na secreção de glândulas anais do gambá Didelphis marsupialis, animal com hábitos tanto
silvestres, como peri-urbanos, não pode ser descartada como mais um elemento a favorecer a
transmissão em alguns desses episódios (LENZI 1984; NAIFF et al., 1987). O mecanismo
tradicional de contaminação por contato com formas metacíclicas provenientes de fezes de
triatomíneos parece não ser o mais freqüente na região, diante da existência de numerosos
episódios com evidências, de transmissão oral.
Ao contrário dos surtos eventuais registradas em Teutônia (RS) e Catolé do Rocha
(PB), aquelas que vêm ocorrendo na Amazônia brasileira apresentam freqüência regular e
representam referência importante na epidemiologia regional da doença de Chagas.
Como apresentado, após a descrição do primeiro surto de doença de Chagas na
região Amazônica brasileira por SHAW et al., (1969), quase uma centena de outros surtos
envolvendo mais de 500 pessoas já foram descritos, em sua maioria associados à
possibilidade da via oral (VALENTE et al., 1999a; COURA et al., 2002a).
Nos demais estados da região Norte a prevalência é muito escassa. Em Roraima e
Rondônia, ainda não foram diagnosticados casos agudos, apesar de um recente inquérito
sorológico realizado em Roraima revelar soro prevalência de 1,4% em duas populações
compostas predominantemente de imigrantes. Os achados de colônias de T. maculata na
região não detectaram infecção por tripanossomas (LUITGARDS-MOURA et al., 2005). Por
outro lado, ainda nos estados de Roraima e Rondônia, DRUMOND & MARCOPITO (2006)
identificaram a doença de Chagas como causa de 3 óbitos entre os anos de 1981 e 1998, em
pessoas naturais de Rondônia e nenhum óbito em nativos de Roraima.
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18
Diversidade genética do T. cruzi
Sebastião Aldo da Silva Valente
2. DIVERSIDADE GENÉTICA DO T. CRUZI
A população de T. cruzi é extremamente heterogênea e formada por um variado pool
de amostras, clones ou cepas oriundas do ciclo enzoótico (milhares de reservatórios
mamíferos e uma centena de triatomíneos) e do ciclo domiciliar que inclui o homem. Quando
analisadas à luz de diferentes marcadores, apresentam e apontam para a presença de pelo
menos duas linhagens populacionais com características biológicas, imunológicas,
bioquímicas, farmacológicas, de virulência e de distribuição epidemiológica também muito
distinta (BRENER & GAZZINELLI, 1997; FERNANDES et al., 1998; MILES et al., 2003).
Essa variabilidade há muito conhecida, já fora observada por Carlos Chagas
(CHAGAS, 1909) em diferenças morfológicas do parasita, as quais ele classificara na ocasião
como formas largas e finas do T. cruzi. Mais tarde, esses dados foram muito bem estudados
por BRENER, (1973), e outros parâmetros, como aqueles relacionados a diferentes respostas
imunológicas, foram descritos (NUSSENZWEIG et al., 1963) e NUSSENZWEIG & GOBL,
(1966).
A utilização de populações de T. cruzi clonadas e não-clonadas evidencia a
heterogeneidade do parasita e revela que as linhagens, na verdade, são constituídas de subpopulações com amplas características (POSTAN et al., 1986, FINLEY & DVORAK, 1987).
Analisando perfis bioquímicos num grupo de seis isoenzimas (ASAT: aspartato
aminotransferase, ALAT: alanina aminotransferase, G6PD: glicose-6-fosfato dehidrogenase,
MDH: malato dehidrogenase, GPI: glicose fosfato isomerase e PGM: fosfoglicomutase)
MILES et al., (1977) identificaram inicialmente dois padrões bem definidos de populações de
T. cruzi que foram agrupados como zimodemas: Z1 associado a mamíferos, principalmente
marsupiais, e triatomíneos silvestres e Z2 ligado ao ciclo doméstico.
Posteriormente, estudando um grupo maior de amostras dentro de um repertório mais
extenso de enzimas, MILES et al., (1981a,b, 1983) ratificaram os estudos anteriores e
descreveram um novo padrão (Z3) relacionado com mamíferos terrestres que vivem em tocas
no chão como o Dasypus novemcinctus e Monodelphis brevicaudata e co-habitam com
triatomíneos da espécie Panstrongylus geniculatus. Os mesmos autores observaram que,
eventualmente, isolados pertencentes a Z1 e Z3 poderiam infectar ocasionalmente o homem
no Estado do Pará. Nenhum isolado do tipo Z2 foi descrito na região Norte.
A análise de 15 loci de enzimas propostas por TIBAYRENC et al., (1986), em mais
de uma centena de isolados, ampliou a margem de agrupamentos para 43 zimodemas que eles
denominaram de clonets que seriam os componentes de uma população clonal e que
apresentariam um perfil semelhantes para um grupo específico de marcadores genéticos. A
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19
Diversidade genética do T. cruzi
Sebastião Aldo da Silva Valente
complexidade na interpretação desses estudos filogenéticos não permitiu estabelecer uma
correlação com os zimodemas propostos por MILES et al., (1980).
Seqüências não-conhecidas de DNA, quando amplificadas por PCR com iniciadores
representados por fragmentos de oligonucleotídeos aleatórios (ramdom amplified polymorphic
DNA - RAPD), permitiram identificar o polimorfismos existente entre isolados do parasito. A
utilização de iniciadores aleatórios é vantajosa, pois dispensa o conhecimento prévio da
seqüência a ser amplificada.
Nessa abordagem, um único conjunto de primers aleatórios é usado para
amplificação de PCR gerando perfis complexos que podem ser usados para construir árvores
genéticas. O estudo da estrutura genômica de isolados de T. cruzi por análise de RAPD
apresentou altos níveis de semelhança entre linhagens que pertencem ao mesmo zimodema
como o Z1 sugerindo que este parece ser um grupo geneticamente distinto bem definido
suportado pelo RAPD, (TIBAYRENC et al., 1993; STEINDEL et al., 1993).
Os estudos já disponíveis sobre diversidade genética em vários níveis consideram
que o genoma de T. cruzi é notavelmente flexível e sua estrutura diplóide pode permitir que
esse parasita tenha uma população de estrutura clonal e reprodução assexuada (TIBAYRENC
et al., 1990). Achados sustentam a hipótese de troca genética de T. cruzi nos isolados da
América Central e do Sul e sugerem que essa troca aconteça durante a transmissão silvestre e
ele contribui para a geração de diversidade de fenótipos e genótipos nesse parasita, também
comprovado por RAPD (CARRASCO et al., 1996; GAUNT et al., 2003)
Os genes de mini-exon estão envolvidos na maturação de mRNA presente em todos
os tripanosomatideos. Esses genes são organizados em repetições do tipo tandem de 100 a
200 unidades. Cada repetição é constituída por uma região transcrita que contém um exon
altamente conservado de 39 nucleotídeos, uma região de intron moderadamente conservado
de 50-110 bp e uma região não transcrita altamente variável em tamanho e sucessão que
dependem da espécie do tripanossomatideo (DE LANGE et al., 1984; AGABIAN, 1990).
Igualmente para os genes de rRNA, a ocorrência de sucessivas repetições no gene de splicead
leader
(SL) com diferentes graus de conservação fazem desse gene um referencial de
importância para a taxonomia e diagnóstico.
O gene de rRNA do T. cruzi demonstrou que, basicamente, as populações do parasito
poderiam ser dividas em duas. A seqüência de 100 pb disposta na extremidade 3’ gene do
RNAr 24Sα é dimórfica e tem sido usada como alvo para identificação de linhagens de T.
cruzi. Utilizando a amplificação por PCR dessa seqüência de 88 cepas e clones, foram obtidos
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Diversidade genética do T. cruzi
Sebastião Aldo da Silva Valente
produtos separados em grupos: grupo 1 de 125 pb, grupo 2 de 110 pb e produtos dos dois
grupos 1/2.
A região intergênica do gene de mini-exon mostra igualmente dimorfismo entre as
cepas do protozoário. Ao se juntar a tipagem de isolados tanto pelo gene de mini-exon, quanto
pelo ribossômico, houve uma concordância entre ambos os genótipos. Após a análise de 38
cepas, foram definidas duas linhagens (rDNA e mini-exon linhagem 1 e linhagem 2).
Curiosamente, amostras com perfil rDNA grupo 1/2 apresentaram no mini-exon perfil de
linhagem 1.
A interpretação desses achados, somados com os resultados obtidos na análise de
RAPD (SOUTO et al., 1996), possibilitou visualizar e dividir esses isolados nas duas grandes
linhagens filogenéticas: 1 e 2. Quando comparadas aos padrões de zimodemas propostos por
MILES et al., (1977), a linhagem 1 correspondia ao zimodema 2 e a linhagem 2 ao zimodema
1. O grupo Z3 não se agrupou às linhagens 1 e 2.
Um estudo de associação do dimorfismo dessas linhagens com os ciclos de
transmissão do T. cruzi no ambiente doméstico e silvestre e morbidade da doença de Chagas
foi desenvolvido com isolados de quatro regiões geográficas distintas: estado do Amazonas,
como área não endêmica, e estados de Minas Gerais, Paraíba e Piauí, reconhecidas regiões
endêmicas (FERNANDES et al., 1998). Nesse estudo, sugeriu-se que a linhagem 1 estaria
associada ao homem na transmissão da doença de Chagas nas áreas endêmicas (Minas Gerais,
Paraíba e Piauí), enquanto a linhagem 2 estaria associada ao ciclo silvestre do T. cruzi
(Amazonas).
Resultados muito semelhantes em que se utilizou um número maior de amostras (157
isolados do homem, mamíferos e triatomíneos silvestres de 12 estados brasileiros) foram
obtidos com o mesmo protocolo e permitiram que ZINGALES et al., (1998) agrupassem os
isolados em dois grupos, ratificando a associação da linhagem 1 com o ciclo doméstico,
estando presentes no ciclo silvestre as duas linhagens.
As pesquisas epidemiológicas em vários estados brasileiros como também na
Colômbia e Bolívia indicam que a linhagem 1 predomina no ciclo doméstico, sendo
principalmente isolada de pacientes chagásicos, enquanto a linhagem 2 está presente,
sobretudo, no ciclo silvestre (FERNANDES et al., 1998; ZINGALES et al., 1998).
As metodologias moleculares têm uma vantagem considerável sobre as isoenzimas
por requerer uma quantidade de parasitas muito menores.
O terceiro grupo isoenzimático de T. cruzi, denominado como zimodema 3 (Z3)
(MILES et al., 1980), foi descrito na Amazônia, associado com o ciclo silvestre de
transmissão e pela infecção de tatus, marsupiais terrestres, espécies de triatomíneos raramente
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Diversidade genética do T. cruzi
Sebastião Aldo da Silva Valente
circulantes no meio de humanos (BARRETT et al., 1980; MILES et al., 1981a; POVOA et
al., 1984). O gene de mini-exon não serviu para agrupar o Zimodema 3 em qualquer linhagem
(FERNANDES et al., 1998, 2001).
Estabelecido o consenso de que T. cruzi abrigava duas grandes linhagens
filogenéticas, durante as comemorações do aniversário da descoberta da doença de Chagas
(1999), foi proposta e acatada uma nova nomenclatura para as linhagens. Assim
convencionaram-se as denominações de T. cruzi I (zimodema I, linhagem 2) associada ao
ciclo silvestre e T. cruzi II (zimodema 2, linhagem 1) associada ao ciclo doméstico. O
zimodema 3 pertencente ao ciclo silvestre permaneceu com a denominação original.
(RECOMENDATIONS, 1999).
Estudos mais detalhados de tipagem com a utilização de isolados provenientes do
ciclo silvestre foram impulsionados com a iniciativa de organismos ambientais de reproduzir
em cativeiro espécies ameaçadas de extinção para depois reintroduzi-las no seu ambiente
original. O transporte de animais entre áreas geográficas pode trazer conseqüências
imprevisíveis para o ciclo silvestre da doença de Chagas, desde que infectados com o T.
cruzi. Este fato foi observado num grupo de primatas com testes sorológicos positivos para
anticorpos anti T. cruzi (Centro de Primatologia do Rio de Janeiro) (LISBOA et al., 2004).
Detectou-se também que micos-leão-dourados (Leontopithecus) infectados apresentaram
isolados tipados molecularmente como T. cruzi II.
Estudos mais amplos têm referido que, dentro desses 2 grandes grupos ou linhagens
filogenéticas, uma extensa heterogeneidade pode ser vista, corroborando, pois a diversidade
genética já comprovada dentro da distribuição geográfica e ecológica dos ciclos de
transmissão do T. cruzi. Nesse sentido utilizando a metodologia de eletroforese de enzimas
(22 loci gênicos diferentes) e RAPD com 20 iniciadores aleatórios, BRISSE et al., (2000),
após analisarem 50 cepas de T. cruzi, propuseram que parte dessas cepas se agrupariam num
grupo de T. cruzi I e as demais seriam distribuídas em 5 subgrupos 2a, 2b, 2c, 2d, 2e. No
subgrupo 2a inser-se-iam as cepas de Z3; no subgrupo 2b as cepas T. cruzi II; no subgrupo 2c
as cepas com perfis isoenzimáticos mistos (Z3 e Z1); no subgrupo 2d, T. cruzi II oriundos da
Bolívia e no subgrupo 2e, cepas híbridas (CL).
A associação de gravidade da doença somente com as cepas de T. cruzi II nas regiões
consideradas endêmicas merece reflexão quando se interpretam os resultados de trabalhos
realizados por AÑEZ et al., (2004) na Venezuela. Numa mesma área em que circulam as duas
linhagens, em uma situação ocorria infecção aguda, com apresentação de formas clínicas
variáveis, e enquanto os quadros mais severos apresentavam infecção com parasitas
caracterizados como T. cruzi I. O comprometimento cardíaco de gravidade considerável em
pacientes dessa linhagem chegava a ser 3 vezes maior nesses casos do que naqueles com
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Diversidade genética do T. cruzi
Sebastião Aldo da Silva Valente
infecção comprovada pelo T. cruzi II, divergindo de outros trabalhos que os portadores de T.
cruzi I teriam sintomatologia mais branda. Enfatizam, ainda, que a caracterização do parasita
diferente de T. cruzi II não é de utilidade prognóstica e os aspectos ligados ao parasita e
hospedeiro devem ser levados em consideração para se entender a diversidade de sintomas e a
evolução clínica da doença.
Apesar do extenso conhecimento que já se tem sobre esse parasita, o maior volume
de informações são com isolados das áreas endêmicas. Uma análise mais detalhada das cepas
amazônicas permitiria mais esclarecimentos sobre as linhagens de T. cruzi circulantes na área,
sobretudo como elas se comportam nos numerosos surtos de doença de Chagas que vêm
ocorrendo nessa região. Um minucioso estudo da diversidade genética, a partir da utilização
de marcadores moleculares disponíveis, com as amostras de T. cruzi isoladas de pacientes,
reservatórios e vetores silvestres poderia identificar e caracterizar a origem desses ciclos e
garantir entendimento de sua epidemiologia de transmissão.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Objetivos
3. OBJETIVOS
3.1. OBJETIVO GERAL
Estudar os surtos de doença de Chagas aguda ocorridas no Pará e Amapá entre 1995
e 2005 por meio de marcadores epidemiológicos, imunoparasitológicos e moleculares;
3.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS
•
Sistematizar as histórias epidemiológicas dos surtos de doença de Chagas agudas
ocorridas no Pará e Amapá no período proposto, com a perspectiva de buscar fatores
comuns que estejam envolvidos potencialmente com a transmissão;
•
Avaliar a soro-prevalência dos contatos intradomiciliares dos casos índices e dos
vizinhos da comunidade;
•
Estudar a fauna triatomínea presente nas comunidades onde ocorreram os surtos;
•
Identificar potenciais reservatórios do T. cruzi pela capturas por armadilhas e
isolamento dos parasitos a partir de hemoculturas e/ou xenodiagnóstico;
•
Estudar a diversidade genética (Tipagem pelo gene de mini-exon e por RAPD) dos
parasitos circulantes nos diversos surtos isolados a partir de casos humanos,
triatomíneos e reservatórios, avaliando a similaridade dos genótipos.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1. DADOS GERAIS DO ESTUDO
4.1.1. Municípios ou localidades
As investigações de casos agudos de doença de Chagas atendidos pelo Laboratório
de Doença de Chagas do Instituto Evandro Chagas foram desenvolvidas em municípios do
Pará e Amapá. As áreas de estudo foram escolhidas em função de casos-índices identificados.
Os municípios se encontram descritos na Figura 2 e Tabela 3, assim como os dados
geográficos e população.
Figura 2. Distribuição geográfica dos surtos de doença de Chagas aguda no Pará e Amapá entre os anos de 1995
e 2005
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
Tabela 3. Distribuição geográfica dos surtos de doença
de Chagas aguda no Pará e Amapá entre os anos de 1995 e 2005
UF
Município
1
AP
SUAP1. Mazagão
PA
Bairro/2Localidade
Ano de ocorrência
N de casos
Rio Bispo2
1996
17
SUAP2. Macapá
Buritizal1
2002
10
SUAP3. Santana
Provedor1
2003
4
SUPA1. Afuá
S. Antônio2
1993
5
SUPA2. Abaetetuba
Vila de Beja2
1998
11
SUPA3. Belém
Pedreira1
1999
12
SUPA4. Bagre
Centro1
2001
7
SUPA5. Barcarena
Santa Lúcia1
2001
6
SUPA6. Santarém
Pau DArco2
2001
13
SUPA7. Bragança
Flexeira2
2002
10
SUPA8. Belém
Telégrafo1
2003
9
SUPA9. Ananindeua
D. Industrial1
2004
17
Total
121
4.1.2. Visitas às áreas de estudo
Os estudos foram realizados entre os anos de 1995 e 2005, sendo realizadas duas
excursões anuais a cada uma das localidades descritas no item posterior 5.1, permanecendo-se
um período entre 12 e 21 dias. A equipe foi composta por 3 profissionais para a coletas de
animais e triatomíneos. As secretarias de saúde locais a visitaram às residências, realizaram
anamnese e coleta de sangue da população envolvida. Quando detectado um caso agudo, esse
eram encaminhados por meio de procedimentos de Tratamento Fora de Domicílio (TFD) para
complementação de diagnóstico e tratamento específico no Instituto Evandro Chagas.
4.1.3. Trabalhos com a população humana
Os procedimentos adotados nos trabalhos com os pacientes e/ou comunidades foram
submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisas do IEC (Anexo 1). Discutiu-se os objetivos e a
metodologia a aplicar (Figura 3) e necessidade de anuência individual livre de consentimento
para coleta de sangue e informações, pelo preenchimento de uma Ficha Epidemiológica
(Anexo 2) e assinatura do Termo de consentimento livre esclarecido (Anexo 3).
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
4.1.4. Detecção de casos agudos
Pacientes procedentes da rede do SUS e/ou Ra rede privada em municípios do Pará e
Amapá com suspeita de doença de Chagas foram avaliados clínica e epidemiologicamente e
preenchendo-se fichas e questionários próprios do Instituto Evandro Chagas. As principais
informações objetivavam identificar se o caso era isolado ou se parte de um possível surto.
Figura 3. Discussão dos objetivos do trabalho com as comunidades
4.1.5. Coleta de material e diagnóstico laboratorial
As amostras de sangue foram coletadas sempre que possível por punção venosa em
volume entre 10 e 15 ml. Nos menores de 5 anos, a coleta foi realizada com papel de filtro por
punção digital, sendo todos os materiais de coletas como seringas, agulhas e lancetas
descartáveis.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
4.1.6. Exames parasitológicos
4.1.6.1. Pesquisa de T. cruzi em gota espessa
Coletado o sangue, uma gota foi colocada em lâmina para confecção de gota espessa
e posteriormente corada pelo Giemsa. O exame foi realizado em microscópio ótico com
objetiva de 40X, observando-se no mínimo 500 campos por 3 técnicos.
4.1.6.2. Exame das amostras pelo QBC® System Quantitative Buffy Coat
Foram utilizados 4 capilares por paciente seguindo os procedimento de coleta de
sangue, preenchimento e leitura de acordo com as recomendações do fabricante. Os capilares
foram examinadas exaustivamente na faixa de leitura recomendada por 3 técnicos.
4.1.6.3. Hemocultura
Foram utilizados 4 tubos de meio bifásico de Hoff´s por paciente semeando-se 200
µl de sangue por tubo. A leitura das hemoculturas foi feita a partir de 28 dias da semeadura
até 90 dias quando foram descartados. Na hipótese de crescimento de tripanossomas, estes
eram repicados para meios líquidos RPMI 1640 e/ou meio LIT para obtenção de massa
parasitária. Os meios de cultura são descritos no Anexo 4.
4.1.6.4. Xenodiagnóstico artificial
Dez ml de sangue heparinizado foram colocados em ampolas de vidro munidas de
uma membrana de borracha que permitia que ninfas de triatomíneos em jejum de 60 dias
tivessem acesso ao sangue. O sistema foi adaptado a um banho maria que mantinha as
ampolas aquecidas a uma temperatura entre 37 e 39oC, estimulando a alimentação dos
triatomíneos. Utilizaram-se espécies de Rhodnius prolixus, Triatoma infestans e
Panstrongylus megistus, 20 ninfas de 5 estágios por paciente, mantidas no insetário do
Instituto Evandro Chagas para esse trabalho. O exame do conteúdo intestinal dos triatomíneos
foi feito com 30 e 60 dias após a alimentação.
4.1.7. Sorologia
A amostragem em cada população foi definida pelos cálculos estatísticos dos
Softwares Stat Calc versão 4.0 e Epi Info 5.0 que levam em consideração o número de casos
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
em uma população e o impacto do agravo dentro dos grupos afetados de acordo com o
tamanho da comunidade com a aplicação da fórmula para cálculo de população infinita:
N= (1,96)2.p.q/L2 cuja a razão 1, 962 é a probabilidade de distribuição normal do
evento; p: probabilidade do evento existir; q: probabilidade do evento não existir (1-p); L:
erro aceitável de 2%. Considerou-se que a repercussão dos casos agudos nas comunidades
levari a um número mínimo de pelo menos 10% dos moradores investigados sorologicamente,
além de todos os indivíduos que procuravam por demanda espontânea. Na área rural, esses
surtos ocorreram em comunidades com 200 a 500 habitantes. A seleção da amostragem foi
sempre acima da recomendada pelos cálculos estatísticos como apresentado na tabela 4.
Tabela 4. Pesquisa sorológica em municípios onde ocorreram surtos
de doença de chagas nos estados do Pará e Amapá entre os anos de 1995 e 2005
Pop. IBGE No de Pop.
% de infectados
Pop.
% pop
Município
Município casos Local
na pop. local
Estudada
estudada
Abaetetuba/PA 119.152
11
1687
0,65
1184
70,18
5
2487
0,2
1094
43,98
16
3890
0,41
687
17,66
Ananindeua/PA 393.569
17
2867
0,6
337
26,18
Barcarena
76.069
6
812
0,73
321
39,53
Belém/PA
1.280,614 2
635
0,31
75
11,81
5
3635
0,13
743
20,44
6
3298
0,18
1135
34,41
Bragança
100.924
7
355
1,97
175
49,29
Afuá/PA
29.505
5
108
4,6
97
89,81
Bagre/PA
13.708
7
135
5,18
97
71,85
P. Pedras/PA
18.694
10
1189
0,84
913
76,78
Santarém/PA
262.538
10
236
4,23
126
53,38
Macapá
283.308
10
2387
0,41
296
12,4
Santana/AP
80.439
4
794
0,5
532
67
Total
2.658,520 121
24.515 0,49
7.812
31,86
Triagem por hemaglutinação indireta e imunofluorescência indireta (IFI) qualitativo (1/40), confirmação por
IFI quantitativa e exames complementares.
Foram seguidos ainda os procedimentos para estudos sorológicos para doença de
Chagas propostos no Manual de Normas Técnicas do MS/FNS utilizando-se dois testes
qualitativos de diferentes princípios (BRASIL, 1994). Foram usados: a hemaglutinação
indireta – HAI (IgG)- (kit Hemacruzi 96, Ref. 35.066, Biomérieux) e a imunofluorescência
indireta (IFI) como teste padrão ouro de confirmação - (kit Imunocruzi, Biomérieux ref.
35051) com titulação de soros para a pesquisa de IgG e IgM anti-T. cruzi.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
As diluições utilizadas nos dois testes foram de 1:20 até 1:1280, e consideradas
aceitáveis como soros reagentes, o cut off de 1:40 para os dois testes como recomenda o
fabricante. Os procedimentos dos testes sorológicos encontram-se descritos nos Anexos 5 e 6.
4.1.8. Tratamento e seguimento de casos
Os casos confirmados foram encaminhados ao Ambulatório do Laboratório de Doença
de Chagas, em Belém, para tratamento específico. Para o estudo de seguimento deste trabalho
foram selecionadas os surtos: SUPA2 Abaetetuba, SUPA9 Ananindeua, SUPA5 Barcarena,
SUPA3 Belém e SUPA7 Bragança que possuíam dados mais organizados e consistentes.
Adicionalmente foi analisado o surto SUAP1 do Mazagão, Amapá, cujos resultados se
encontram descritos no artigo submetido à publicação. Anexo 7.
Nos surtos de Abaetetuba, Ananindeua, Barcarena, Belém e Bragança, os pacientes
foram acompanhados em 4 momentos: antes do tratamento, com 6 meses, 1 ano e mais de 2
anos de tratamento. No surto de Mazagão, os pacientes foram acompanhados em 5 intervalos:
antes do tratamento, com 6 meses, 1 ano, 5 anos e 7 anos de tratamento.
5. ESTUDO DE RESERVATÓRIOS SILVESTRES
5.1. CAPTURA E IDENTIFICAÇÃO DE ANIMAIS SILVESTRES
Os procedimentos com os animais silvestres tiveram autorização do IBAMA (Anexo
9) e foram submetidos ao Comitê de Ética em Pesquisa com Animais do Instituto Evandro
Chagas (Anexo 10).
Para o procedimento de captura, foram utilizadas armadilhas dobráveis nas
dimensões 50x20x19 cm (comprimento, altura e largura) fabricadas em arame fosco com peso
de 2 kg. Frutas como abacaxi, banana, milho em espigas e pasta de amendoim foram
utilizados como isca.
As armadilhas num total de 100 foram ordenadas entre 300 e 500 m dos domicílios,
em trilhas naturais ou construídas, com a abertura voltada para a trilha, distantes 15 m entre si.
Revisão diária foi realizada para recolher os animais capturados e troca das iscas a cada dois
dias, dependendo do período das excursões.
Os animais capturados foram identificados no Instituto Evandro Chagas baseando-se
na chave taxonômica de PETERSON & PINE, (1982).
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
5.2. COLETA DE SANGUE DOS ANIMAIS
Animais capturados foram tratados inicialmente com sulfato de atropina 0,05 mg/kg
de peso pela via subcutânea ou intramuscular e posteriormente sedados com aplicação de
Cloridrato de ketamina 12 mg/kg e numa segunda opção com fenobarbital sódico (Sagatal®,
RHODIA, 10 mg/ml, diluição 1:20 ml em soro fisiológico), 0,2 ml/kg de peso. Foi realizada
em seguida a punção da veia radial ou punção cardíaca, com seringas e agulhas descartáveis
de calibre fino 21X5 mm.
5.3. HEMOSCOPIA E HEMOCULTURA
As amostras de sangue obtidas foram semeadas no próprio local, em meios de cultivo
bifásico (3 tubos por animal), e processados os exames parasitológicos (gota espessa e exame
pelo QBC® System Quantitative Buffy Coat).
5.4. XENODIAGNÓSTICO
Utilizou-se uma caixa por animal, com 10 ninfas de III e IV estágio de R. prolixus, T.
infestans ou P. megistus mantidas em insetário. As caixas foram identificadas com os dados
do animal (espécie, sítio de origem e data da realização do exame) e presas ao animal por 20
minutos ou pelo tempo necessário até o completo repasto sangüíneo que era inferido pelo
aumento do volume abdominal em até 4 vezes. No final da coleta, todos os animais foram
identificados com anéis apropriados ou tatuados e devolvidos ao seu sítio de captura original.
Os triatomíneos foram mantidos em condições do laboratório (24 e 28oC), e o conteúdo
intestinal examinado em 30 e 60 dias com auxílio de pinça para a compressão do abdômen e
coleta do conteúdo intestinal. O material foi diluído em solução salina e antibiótico, para
pesquisa das formas de tripanossomas em microscopia óptica. O material positivo foi
semeado nos meios de cultura já descritos para isolamento e futura identificação e
caracterização do parasito.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
6. ESTUDO ENTOMOLÓGICO
6.1. COLETA DE TRIATOMÍNEOS SILVESTRES EM PALMEIRAS
Inicialmente foi utilizada a metodologia descrita por NOIREAU et al., (1999), um
modelo simples de armadilha que utiliza copos plásticos de 12 cm de altura por 8 cm de
largura, tendo no interior camundongo albino adulto ou pinto de uma semana. A boca do
frasco deve ser fechada com tela de arame de malha de 2 mm, quando se usam camundongo,
ou tela de nylon ao quando se usam pintos. Em volta do frasco foi colocada fita adesiva dupla
face de 5 cm. de largura (ADERE e 3M) com uma das extremidades voltadas para cima da
tela. As armadilhas, em número de cinco por palmeira ou outro ecótopo foram colocadas na
copa de palmeiras ou em ecótopos previamente selecionados, de preferência do gênero
Orbygnya, localizadas mais próximas dos domicílios humanos, que apresentavam copa que
ofereça frutos, palha e epífitas, condições que ofereciam satisfatória proteção e abrigo ou
refúgio a pequenos animais. As armadilhas foram colocadas com auxílio de escadas de dois
lances (altura total de 7,80 metros) construída em fibra de vidro e alumínio de peso leve para
deslocamento na mata. Quando a altura da palmeira foi muito superior à da escada, utilizou-se
o auxílio de cintos de segurança apropriados para escalar postes. O tempo de permanência das
armadilhas na árvore foi de no mínimo 2 dias, com exame diário para verificar a captura de
triatomíneos e substituição dos animais cansados e famintos por outros mais saudáveis. Os
triatomíneos são atraídos pelo gás carbônico emitidos pelos animais e, quando tentam se
alimentar nesses animais, ficam colados na fita adesiva.
As armadilhas de fita adesiva que capturaram triatomíneos em palmeiras serviram de
referencial para que as árvores fossem selecionadas para posterior dissecção, procurando-se
restringir ao mínimo possível o número de palmeiras dissecadas (MILES et al., 1981b).
A área imediatamente próxima da palmeira selecionada foi limpa e no chão colocado
um plástico branco, sobre o qual foi realizada a dissecção. As palmeiras foram cortadas com
motosserras (Sthil, modelo 08) e a dissecção com outra de modelo 010 e com auxílio de
terçados e facões, luvas de raspa de couro e pinças de vários tamanhos. Insetos coletados
foram acondicionados em frascos plásticos, um para cada palmeira, com tampa perfurada para
permitir ventilação satisfatória, etiquetados o nome científico e vulgar da palmeira e do inseto
coletado (quando possível), data e local onde foi efetuada a coleta.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
6.2. COLETA COM ARMADILHAS LUMINOSAS
Foi utilizado o modelo básico de SONTWOOD, (1978) (Pensilvania Trap), de
tamanho reduzido para facilitar transporte e instalação. Esta armadilha é provida de fonte
luminosa de luz branca fluorescente de 15 W, com dispositivo alternativo de 12 e 120 volts,
para ser alimentada por bateria automotiva e gerador portátil, respectivamente. É constituída
por três lâminas verticais de alumínio, de 12 por 50 cm., presas a cobertura plana, quadrada,
do mesmo material, e dispostas radialmente de modo a formar três ângulos de 120o
contornando a lâmpada. Na borda inferior, as lâminas se acoplam à abertura de um funil,
envolvido por um saco de pano coletor dos espécimes atraídos pela luz. Cordas de nylon
foram utilizadas para suspender as armadilhas até o local de sua instalação, copas de
palmeiras ou árvores, sendo ligadas no horário entre 19:00 e 22:00 h. por um período de no
mínimo 10 dias consecutivos.
6.3. IDENTIFICAÇÃO DOS ESPÉCIMES COLETADOS
Para a identificação foram utilizados os critérios taxonômicos estabelecidos por
LENT & WYGODZINSKY, (1979). Os insetos foram identificados no Laboratório de
Doença de Chagas do Instituto Evandro Chagas em Belém.
6.4. EXAME DO CONTEÚDO INTESTINAL DOS TRIATOMÍNEOS
Os exemplares coletados foram levados ao laboratório e separados para: (i)
acondicionamento em baldes plásticos apropriados com objetivo de se estabelecerem em
colônias úteis a trabalhos experimentais e (ii) processo de desinfecção em uma solução
própria e processamento do conteúdo intestinal. Por compressão do abdômen foi realizada a
dissecção da ampola retal e retirada do conteúdo intestinal. O material obtido foi diluído em
solução mista, solução salina + antibiótico, específica para esse fim e examinado: (i) a fresco
entre lâmina e lamínula e (ii) em esfregaços corados pelo Giemsa. Eventuais parasitos foram
identificados sob microscopia óptica (40x). As soluções usadas nos procedimentos desses
itens encontram-se descritas no Anexo 8.
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Material e Métodos
7. ISOLAMENTO E CULTIVO IN VITRO
7.1.
ISOLAMENTO
DE
PACIENTES,
DE
ANIMAIS
SILVESTRES
E
DE
TRIATOMÍNEOS SILVESTRES
Os parasitos obtidos de amostras de sangue de pacientes e animais silvestres, assim
como de triatomíneos, foram cultivados em meio liquido LIT e/ou RPMI1640 suplementado
com 10% de soro fetal bovino inativado a 55°. Quando os cultivos in vitro apresentaram
crescimento exponencial (7 a 10 dias), 2 ml foram transferidos para garrafas de cultura de
com meio LIT e/ou RPMI1640 para a produção de massa parasitária. Esse cultivo foi
realizado num volume final de 20 ml e o meio suplementado com até 20% de soro fetal
bovino inativado e mantido a 28°C por 7 a 10 dias com agitação eventual dos frascos que
eram examinados diariamente em microscópio invertido para se avaliar o crescimento até
atingir a concentração de 109 formas epimastigotas para extração de DNA total. Uma alíquota
desse meio, rica em formas epimastigotas, foI mantida criopreservada em nitrogênio líquido
na proporção de 1,8 ml do meio e 0,2 ml de glicerol seguindo os procedimentos descritos por
MILES, (1993).
8. EXTRAÇÃO DE DNA
Utilizou-se o kit da AMERSHAM PRODUTO 27-5237-01 obedecendo-se ao
protocolo do fabricante nas seguintes etapas:
Lise de células: Num tubo de 1,5 ml, foram colocados 1 ml de uma cultura na fase log
1,5x106, células, adicionados 600 µl de PBS e a mistura centrifugada a 13.000-16.000 rpm
por 5 min mantendo 20-40 µl de pellet. O sobrenadante foi desprezado e o sedimento agitado
2X no vórtex e repetido o passo anterior. Foram acrescentados 600 µl de solução de lise de
célula, agitando-se o tubo por inversão com auxílio de uma micropipeta. A seguir, a mistura
foi incubada a 37oC, acrescentados 3 µl de Rnase e a amostra misturada por inversão e
incubada a 37oC por 30 min. Foram então acrescentados 200 µl de solução de precipitação,
misturado vigorosamente no vórtex e processada centrifugação a 13.000 rpm por 3 min.
Precipitação do DNA: O sobrenadante com o DNA foi transferido para outro tubo de 1,5 ml
contendo 600 µl de isopropanol a 100%. A amostra foi misturada por inversão até se
visualizarem as linhas brancas correspondentes ao DNA precipitado. A amostra foi
centrifugada a 13.000 rpm por 1 min, o sobrenadante descartado e o pellet lavado com 600 µl
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Material e Métodos
de etanol a 70%. O pellet de DNA foi seco por 15 minutos e acrescentados 100 µl de solução
de hidratação ao sedimento.
A integridade do DNA extraído foi verificada por corrida em gel de agarose a 0,8%
em TBE (0,09 M Tris-borato; 0,002 M EDTA pH 8,0).
9. TIPAGEM GENOTÍPICA DAS CEPAS DE TRIPANOSSOMAS PELO GENE DE
MINI-EXON
As cepas de referência (TCI X10Cl1, TCII ESMERALDO CL2, Z3 CAN III CL1 e
T. rangeli R1625) usadas foram fornecidas pelo Laboratório de Epidemiologia Molecular do
Departamento de Medicina Tropical do Instituto Oswaldo Cruz (IOC) e as demais amostras
correspondem aos isolados de tripanossomatídeos que circulam nos surtos descritos nessa tese
(Anexo 11).
Os isolados obtidos foram tipados inicialmente pelo gene de mini-exon por meio de
um PCR multiplex, (FERNANDES, et al., 2001). Essa reação amplifica especificamente uma
parte do espaçador não-transcrito desse gene distinguindo as duas principais linhagens de T.
cruzi¸ identificando T. cruzi Z3 e T. rangeli.
A reação foi constituída por 100 pmol de cada iniciador, 150 μM de dNTPs, num
tampão de 10 mM de Tris-HCl (pH 8,3), 1,5 mM de MgCl2, 25 mM de KCl, 0,1 mg/mL de
albumina bovina e 2,5 U de Amplitaq GoldTM DNA Polimerase (Cetus Perkin Elmer ®).
Aproximadamente 10 ng de DNA genômico foram acrescentados e as reações foram feitas
num volume final de 50 μL com água Miliq Ultra pura. Os iniciadores apresentam as
seguintes seqüências:
Tabela 5. Iniciadores do gene de Mini-exon
Padrão/gene
No pares de bases
Seqüência
TCI
200 pb
5’-ACACTTTCTGGCGCTGATCG
TCII
250 pb
5’-TTGCTCGCACACTCGGCTGCAT
Z3:
150 pb
5’-CCGCGCACAACCCCTATAAAAATG
TR
100 pb
5’-CCTATTGTGATCCCCATCTTCG
EXON
5’-TACCAATATAGTACAGAACTG
As reações foram processadas num termociclador GeneAmp ® PCR Instrument
System 9600 (Perkin-Elmer) com o perfil térmico consistindo de um passo inicial de 5
minutos a 95ºC, seguidos de 34 ciclos de 30 segundos a 94ºC, 30 segundos a 55ºC e 30
segundos a 72ºC, com uma extensão final de 10 minutos a 72ºC.
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35
Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
Os produtos amplificados foram submetidos à eletroforese em gel de agarose 2%,
corados com brometo de etídio e visualizados sob luz ultravioleta. Os géis foram fotografados
com foto documentador de imagem de gel BIORAD UNIVERSAL HOOD 03350®.
10. TIPAGEM POR RAPD
Foram estudados pela análise de DNA polimórfico amplificado aleatoriamente
(RAPD) isolados em trios de cepas obtidos do homem, mamíferos e triatomíneos silvestres de
5 surtos ocorridos nos municípios de Ananindeua, Bragança, Abaetetuba, Belém e Barcarena,
sendo as cepas previamente tipadas com o gene de mini-exon.
Os oligonucleotídeos decaméricos (Tabela 6) usados para amplificar o DNA
genômico dos isolados possuem seqüência arbitrária [kit Ready-To-Go™ RAPD Analysis Kit
(Pharmacia Biotech)]. As reações de RAPD foram feitas segundo as recomendações do
fabricante em 25 μl de volume final que continha Amplitaq™ DNA polimerase, 0.4 mM de
cada dNTP, 2.5 μg de BSA, 3mM de MgCl2, 30mM KCl e 10 mM de Tris (pH 8.3) e 20ng de
DNA genômico. As reações foram feitas num termociclador GeneAmp® PCR Instrument
System 9600 (Perkin-Elmer) com o seguinte perfil térmico: 1 ciclo de 95°C, 5 min e 45 ciclos
de 95°C, 1 min; 36°C, 30 seg; 72°C, 2 min.
Tabela 6. Oligonucleotídeos usados na análise de RAPD.
Oligonucleotídeos
Seqüência
RAPD 1
5’-GGTGCGGGAA-3’
RAPD 2
5’-GTTTCGCTCC-3’
RAPD 3
5’-GTAGACCCGT-3’
RAPD 4
5’-AAGAGCCCGT-3’
RAPD 5
5’-AACGCGCAAC-3’
RAPD 6
5’-CCCGTCAGCA-3’
Os produtos de amplificação foram primeiramente analisados em géis de agarose a
2% em tampão TBE 1X, corados com brometo de etídeo, visualizados sob luz UV e
documentados com filme Polaroid®. Os produtos foram aplicados em géis de poliacrilamida
GeneGel Excel 12.5/24 Kit (Pharmacia Biotech), separados por eletroforese no GenePhor
Electrophoresis Unit (Pharmacia Biotech) e corados pela prata segundo os protocolos do
PlusOne® DNA Silver Staining Kit (Pharmacia Biotech). Os géis foram lavados com água e
secos à temperatura ambiente. Os fragmentos foram medidos por comparação com o
marcador de peso molecular de 100 pb (Pharmacia Biotech). A interpretação dos resultados
foi feita de acordo com os dendrogramas e matrizes geradas pelas análises fenéticas,
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Material e Métodos
observando primeiramente a discriminação entre os isolados dentro de um mesmo surto e,
depois, a similaridade entre os isolados de diferentes surtos.
11. ANÁLISE FENÉTICA
As análises dos perfis de restrição foram feitas com métodos numéricos. Com base na
presença e ausência de bandas se construíram matrizes de 1 e 0 respectivamente, que
continham as unidades taxonômicas (cepas) e os caracteres (número de bandas no RAPD). Se
uma cepa apresentava uma banda atribuía-se 1, ao passo que, nas cepas nas quais não existia
essa mesma banda, atribuía-se 0. Essa matriz foi analisada com o programa NTSYS-pc
Versão 2.1 (Exeter Software), utilizando-se o Coeficiente de Jaccard (J). Esses coeficientes
geram matrizes de similaridade que, por sua vez, são analisadas pelo método não-ponderado
de agrupamento aos pares por médias aritméticas (UPGMA) que produzem fenogramas.
Quadro 2. OTU : Unidade Taxonômica Operacional
OTU
y
OTU
x
1
1
a
0
b
0
c
d
CS = a + d / a+ b + c + d
J = a/a+b+c
As árvores geradas pelo coeficiente de Jaccard foram submetidas à análise de
“bootstrap” para avaliar estatisticamente o nível de consistência da topologia da árvore. A
topologia é consistente se o grupo aparece em mais do 75% das árvores geradas durante uma
análise de 1000 repetições. A análise de “bootstrap” foi feita com o programa “Free Tree”
(PAVLICEK et al., 1999).
12. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS
Para calcular o tamanho das amostras foram utilizados os softwares Stat Calc e o
Bioestat versão 3.0. Para os resultados obtidos foram realizadas comparações de proporção
usando o programa Epi Info Ver 2000; foi usado um nível de significância de 5% (p<0,05).
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37
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
13. RESULTADOS
13.1. CASUÍSTICA DOS SURTOS DE DCA E ESTUDOS NA POPULAÇÃO HUMANA
No período de estudos foram detectados pelo IEC e pela rede do SUS 53 surtos sendo 42
no Pará (79,24%) e 11 no Amapá (20,75%). Esses surtos representaram 268 casos agudos: 61 no
Amapá (22,76%) 7 surtos em Macapá com 35 casos agudos, 2 em Santana com 9 casos e 1 surto
no Mazagão com 17 casos (esse surto foi objeto de um estudo em separado). No Pará foram
identificados 207 casos agudos (77,23%), com a seguinte distribuição: Abaetetuba (6 surtos com
40 casos agudos), Afuá (1 surto com 5 casos); Ananindeua (4 surtos com 27 casos), Bagre (1 surto
com 7 casos), Barcarena (1 surto com 6 casos), Belém (26 surtos com 86 casos), Bragança (2
surtos com 13 casos), Ponta de Pedras (1 surto com 10 casos) e Santarém (1 surto com 13 casos).
Os surtos, no Amapá e no Pará, ocorreram predominantemente entre os meses de julho e
dezembro (n=52), sobretudo no mês de outubro (n=35). Fora desse período, ocorreu um surto no
mês de fevereiro no Amapá e uma no mês de abril no Pará. Dessa casuística, (Tabela 7) foram
selecionados inicialmente 12 surtos ocorridos no Pará e Amapá, num total de 121 casos agudos
para realização dos estudos de análise, por apresentarem informações consistentes relacionadas às
pesquisas parasitológicas, sorológicas e epidemiológicas.
Tabela 7. Surtos de doença de Chagas aguda que ocorreram
no Pará e Amapá ocorridos entre os anos de 1995 a 2005
UF
MUNICÍPIO
SURTOS DETECTADOS
No DE CASOS
AP
Macapá
07
35
Mazagão
01
17
Santana
02
09
Abaetetuba
06
40
Afuá
01
05
Ananindeua
04
27
Bagre
01
07
Barcarena
01
06
Belém
26
86
Bragança
02
13
Ponta de Pedras
01
10
Santarém
01
13
53
268
PA
TOTAL
As análises descritas nesta tese não correspondem a todos os surtos ocorridos, mas para
um grupo deles, referidos na tabela 8 como surtos estudados por possuírem dados mais
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38
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
completos na história epidemiológica, de diagnóstico e seguimento. Nos demais surtos, os
resultados apresentados compõem análise preliminar disponível no banco de dados do Laboratório
de Doença de Chagas do IEC.
Tabela 8. Surtos de doença de Chagas aguda selecionados
para os estudos no Pará e Amapá – 1995 a 2005
UF
MUNICÍPIO
CÓDIGO DO SURTO
No DE CASOS
AP
Macapá
Mazagão
Santana
Abaetetuba
Afuá
Ananindeua
Bagre
Barcarena
Belém
ME01. Macapá
1
ME02. Mazagão
ME03. Santana
2
ME04. Abaetetuba
ME05. Afuá
2
ME06. Ananindeua
ME07. Bagre
2
ME08. Barcarena
2
ME09. Belém
ME10. Belém
2
ME11. Bragança
ME12. Santarém
10
17
6
15
05
14
07
6
12
09
07
13
PA
Bragança
Santarém
TOTAL
121
1
2
Surto de Mazagão, Estado do Amapá selecionado para estudo. Surtos de Abaetetuba, Ananindeua, Barcarena,
Belém e Bragança, estado do Pará selecionados para estudos. Pacientes seguidos por um período ≥ 2 anos por exames
clínicos, parasitológicos e sorológicos.
13.2. EXAMES PARASITOLÓGICOS: PESQUISA DE T. CRUZI EM GOTA ESPESSA (GE),
PESQUISA DE T. CRUZI PELO QBC® SYSTEM QUANTITATIVE BUFFY COAT,
HEMOCULTURA E XENODIAGNÓSTICO ARTIFICIAL
A pesquisa parasitológica nesses surtos foi direcionada para um grupo de 423 pessoas
relacionadas com suspeita clínica (n=153) e seus contatos diretos (familiares, n=81) e vizinhos
(n=189) nos municípios citados. Cento e vinte um indivíduos (121/423 – 28,6%) apresentaram
pelo menos um teste parasitológico positivo (Figura 4).
Figura 4. A. T. cruzi visualizado no QBC® System. B. T. cruzi visualizado em esfregaço.
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39
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Entre os 121 pacientes positivos nos testes parasitológicos aplicados, a seguinte
segmentação foi obtida: 44,62% com gota espessa (54/121); 91,73% com QBC® (111/121); 81%
com xenodiagnósticos (98/121) e 60% com hemoculturas (73/121). Tabela 9. Todos os indivíduos
parasitológicamente positivos eram sintomáticos para doença de Chagas aguda. Existem
diferenças estatisticamente significativas no percentual de positividade das amostras estudadas.
Em ordem decrescente a maior positividade foi com o QBC, Xenodiagnóstico, Hemocultura e
Gota Espessa.
Exame padrão
GE
(44,22%)
Xeno (81%)
QBC (91,73)
Município
Macapá
Mazagão
Santana
Abaetetuba
Afuá
Ananindeua
Bagre
Barcarena
Belém
Bragança
Santarém
Total
Comparação
QBC (91,73%)
Xeno (81%)
Hemocultura (60%)
GE (44,22%)
QBC (91,73)
Hemocultura (60%)
Hemocultura (60%)
p-value
P=0,000000
P=0,000000
P=0,014
P=0,00000
P=0,014
P=0,000416
P=0,00000
χ21gl
61,89
34,25
5,98
34,25
5,93
12,46
32,74
Tabela 9. Pesquisa parasitológica em municípios onde ocorreram
Surtos de doença de Chagas nos estado do Pará e Amapá – 1995 a 2005
*Pop.
No
GE
QBC
Xeno
o
o
de casos +/N (%)
Estudada
+/N (%)
+/No(%)
48
10
5/10(50)
10/10(100)
8/10(80)
26
17
6/17(35,3)
14/17(82,3)
14/17(82,3)
27
6
2/6(33,3)
5/6(83)
6/6(100)
96
15
9/15(60)
15/15(100)
12/15(80)
16
5
3/5(60)
4/5(80)
4/5(80)
42
14
5/14(35,7)
14/14(100)
11/14(78,5)
21
7
4/7(57,1)
6/7(85,7)
6/7(85,71)
19
6
2/6(33,3)
6/6(100)
5/6(83,3)
34
12
5/12(41,7)
12/12(100)
9/12(75)
27
9
4/9(44,4)
8/9(88,8)
7/9(77,7)
23
7
3/7(42,8)
7/7(100)
5/7(71,4)
44
13
6/13(46,1)
10/13(76,92)
11/13(84,6)
423
121
54/121(44,6) 111/121(91,73) 98/121(81)
Hemo
+/No(%)
7/10(70)
8/17(47)
5/6(83,33)
7(46,66)
3/5(60)
9/14(64,3)
5/7(83,3)
4/6(66,6)
7/12(58,3)
5/9(55, 5)
3/7(42,8)
10/13(76,9)
73/121(60)
*Familiares diretos e/ou vizinhos com possível associação com o surtos.
13.3. SOROLOGIA
A pesquisa sorológica incluiu uma amostragem determinada anteriormente que reuniu
um grupo de 3633 pessoas distribuídas nos municípios em estudo. Em números globais, no teste
de triagem HAI, foram detectados inicialmente 4,40% dos indivíduos (160/3633) positivos na
sorologia. Esses soros, quando testados pela IFI para a pesquisa de IgG anti-T. cruzi,
apresentaram positividade de 3,19% (116/3633), enquanto 3,02% dos indivíduos (110/3633)
__________________________________________________________________________________________
40
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
apresentaram testes positivos para anticorpos IgM anti-T. cruzi, todos apresentando
sintomatologia e confirmados com os testes parasitológicos. Nas comunidades entre contatos e/ou
familiares nenhum apresentava sintomatologia. Os resultados detalhados dos estudos realizados
por município encontram-se na tabela 10.
Tabela 10. Pesquisa sorológica em municípios onde ocorreram surtos
de doença de Chagas nos estados do Pará e Amapá, entre os anos de 1995 e 2005
Pop. IBGE
Município
Casos
(n)
HAI
IgG
IgM
Exa +(%)
Exa +(%)
Exa +(%)
Macapá
283.308
10
2387 (0,4)
60/296 (12,4)
16/296 (5,4)
9/296 (3)
10/296 (3,4)
Mazagão
13.913
17
26(65,4)
26/26(100)
15/26 (57,7)
9/26 (34,6)
6/26 (23,)
Santana
80.439
6
794 (0,75)
77/532 (67)
9/532 (1,7)
9/532 (1,7)
6/532 (1,1)
Abaetetuba
119.152
15
3890 (0,4)
61/687 (17,7)
21/687 (3)
16/687 (1,9)
15/687 (2,)
Afuá
29.505
5
108 (4,6)
75/97 (89,8)
5/97 (5,1)
5/97 (5,1)
5/97 (5,)
Ananindeua 393.569
14
2867 (0,5)
112/337 (11,7)
18/337 (5,3)
14/337 (4,1)
14/337 (4,)
Bagre/PA
13.708
7
135 (5,2)
78/107 (79,2)
11/107(10,3)
7/107 (6,5)
7/107 (6,5)
Barcarena
76.069
6
812 (0,7)
85/321 (39,5)
9/321 (2,8)
6/321 (1,8)
6/321 (1,8)
Belém
1.280,614
12
1635 (0,7)
39/743 (45,4)
19/743 (2,5)
12/ 743 (1,6)
12/743(1,6)
9
635 (1,4)
14/186 (29,3)
11/186 (6)
9/186 (4,8)
9/186 (4,8)
Bragança
100.924
7
355 (1,9)
86/175 (49,3)
175/11 (6,3)
7/175 (4)
7/175 (4)
Santarém
262.538
13
236 (5,5)
135/126 (53,4)
126/15(11,9)
13/126(10,3)
13/126(10,3)
Total
2.633,739
121
13880 (0,5)
848/3633 (23,3) 160/3633(4,4)
116/3633(3,2)
110/3633(3)
Triagem por hemaglutinação indireta e imunofluorescência indireta (IFI) qualitativo (1/40), confirmação por IFI
quantitativa e exames complementares.
Município
Pop.Local/
% de infectados
Amos. Calc./
Estudada(%)
13.4. TRATAMENTO E SEGUIMENTO DE CASOS AGUDOS
Todos os pacientes diagnosticados (N=121) foram tratados conforme o protocolo de
tratamento específico e acompanhados pelo tempo mínimo de dois anos. A partir desse prazo
temporal, dentro de cada surto houve perda de contato com alguns pacientes. Por outro lado, foi
possível fazer o seguimento dos exames laboratoriais em 4 cortes de tempo: antes de tratar, 6
meses, 1 ano e acima de 2 anos após tratamento em cinco surtos corridos nos municípios de: (i)
Abaetetuba (15 pacientes), (ii) Ananindeua (14 pacientes), (iii) Barcarena (6 pacientes), (iv)
Belém (12 pacientes), (v) Bragança (7 pacientes) e (vi) Mazagão (17 pacientes); esse surto
acompanhado em 5 cortes de tempo: antes de tratar, 6 meses, 1 ano, 5 anos e 7 anos após
tratamento.
__________________________________________________________________________________________
41
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
13.5. SURTO DE ABAETETUBA
Nesse surto, todos os 15 indivíduos sintomáticos (Figura 5) antes de iniciar o tratamento
apresentaram pelo menos um exame parasitológico positivo - 60% de positividade (9/15) na gota
espessa, 100% (15/15) no QBC®, 80,0% (12/15) no xenodiagnóstico e 46,6 % (7/15) na
hemocultura.
Nos demais intervalos após o tratamento, todos os exames parasitológicos apresentaram
resultados negativos. Quadro 3, Gráficos 1.
Figura 5. Comunidade ribeirinha onde ocorreu surto de doença de Chagas aguda em Abaetetuba
__________________________________________________________________________________________
42
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
* Quadro 3. Acompanhamento de exames parasitológicos dos
pacientes de Abaetetuba em 4 intervalos de tempo
Antes de tratar
Paciente
GE/QBC
XEN/CUL
ABA 01
POS/POS
POS/NEG
ABA 02
NEG/POS
POS/NR
ABA 03
POS/POS
POS/NR
ABA 04
NEG/POS
POS/POS
ABA 05
POS/POS
POS/NR
ABA 06
POS/POS
NR/POS
ABA 07
NEG/POS
NR/POS
ABA 08
POS/POS
NR/POS
ABA 09
NEG/POS
POS/POS
ABA 10
NEG/POS
POS/NR
ABA 11
POS/POS
POS/POS
ABA 12
POS/POS
POS/POS
ABA 13
POS/POS
POS/NR
ABA 14
POS/POS
POS/NR
ABA 15
NEG/POS
POS/NR
* Constam somente os exames que apresentem pelo menos um resultado
positivo nos demais intervalos com 6 meses, 1 e 2 anos de tratamento
Gráfico 1. Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de Abaetetuba
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GE
QBC
XENO
CUL
Antes de Tratar
POS
NEG
NR
A sorologia diagnóstica realizada antes do tratamento mostrou que todos os indivíduos
(15/15) com sintomatologia compatível com DCA apresentavam anticorpos IgM anti-T. cruzi
(IFI) com títulos variando entre 1/40 e 1/640. Doze dos quinze pacientes (80% - 12/15) foram
reativos na sorologia para a pesquisa de IgG com títulos variando entre 1/40 a 1/320 e todos
(15/15) apresentaram HAI reagente.
Após seis meses de tratamento, dois pacientes apresentaram IgM anti-T. cruzi positivos
com título de 1/40 e os demais negativos. Para IgG todos os pacientes apresentavam títulos entre
__________________________________________________________________________________________
43
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
1/40 até 1/160, sendo todas reagentes em HAI. Com um ano de tratamento, nos títulos de IgM
todos apresentaram resultados negativos e os títulos de IgG variaram de 1/40 até 1/640 entre 14
pacientes, sendo em um paciente negativo. O teste de HAI permaneceu reativo em 66,66%
(10/15) dos pacientes e 33,33% não reagentes (5/15). Acima de dois anos de tratamento todos os
títulos de IgM permaneceram negativos. Quanto à IgG anti-T. cruzi, 6,6% (1/15) dos pacientes
apresentaram títulos negativos e os demais tiveram os títulos variando entre 1/40 e 1/160. Na
HAI, 46,6% (7/15) apresentaram títulos não-reagentes e os demais pacientes ainda reativos.
Quadro 4, Gráficos 2 e 3.
Quadro 4. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Abaetetuba em 4 intervalos de tempo
Antes de tratar
6 Meses
1 ano
2 anos
Paciente
IgG/IgM
HAI
IgG/IgM
HAI
IgG/IgM
HAI
IgG/IgM
HAI
ABA 01 1:80/1/1:80 +
1:160/NEG +
1:80/NEG +
1:40/NEG NREA
ABA 02 1:40/1:80
+
1:80/NEG +
NEG/NEG NREA
NEG/NEG +
ABA 03 NEG/1:80
+
1:40/NEG +
1:40/NEG +
1:40/NEG NREA
ABA 04 NEG/1:160 +
1:160/NEG +
1:80/NEG +
1:40/NEG NREA
ABA 05 1:40/1:80
+
1:80/1:40
+
1:40/NEG NREA
1:40/NEG NREA
ABA 06 1:40/1:160 +
1:40/NEG +
1:80/NEG +
1:80/NEG +
ABA 07 NEG/1:320 +
1:160/NEG +
1:40/NEG +
1:80/NEG +
ABA 08 1:40/1:40
+
1:80/NEG +
1:160/NEG +
1:80/NEG NREA
ABA 09 1:40/1:80
+
1:40/1:40
+
1:40/NEG +
1:40/NEG NREA
ABA 10 1:80/1:640 +
1:80/NEG +
1:640/NEG +
1:40/NEG +
ABA 11 1:160/1:640 +
1:160/NEG +
1:80/NEG +
1:80/NEG NREA
ABA 12 1:40/1:160 +
1:80/NEG +
1:40/NEG NREA
1:40/NEG +
ABA 13 1/80/1:80
+
1:40/NEG +
1:80/NEG NREA
1:40/NEG NREA
ABA 14 1:320/1:320 +
1:160/NEG +
1:80/NEG +
1:160/NEG +
ABA 15 1:40/1:160 +
1:160/NEG +
1:40/NEG NREA
1:80/NEG +
Gráfico 2. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Abaetetuba, em 4 intervalos de tempo
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
IgG
IgM
HAI
IgG
Antes de tratar
IgM
HAI
IgG
6 Meses
REA
NREA
1/40
IgM
HAI
1 Ano
1/80
1/160
1/320
1/640
1/1280
IgG
IgM
2 Anos
NEG
__________________________________________________________________________________________
44
HAI
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Gráfico 3. Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no surto de Abaetetuba
__________________________________________________________________________________________
45
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
13.6. SURTO DE ANANINDEUA
Nesse surto, os 14 indivíduos sintomáticos em fase pré-tratamento (Figura 6)
apresentaram exames parasitológicos positivos, sendo 35,71% (5/14) na gota espessa e 100%
(14/14) no QBC®. O xenodiagnóstico apresentou 78,57% de positividade (11/14) e a hemocultura
teve 71,42% (10/14) de positividade. Com seis meses de tratamento 21,4% (3/14) apresentavam
xenodiagnóstico positivo e foram tratados novamente. Os demais pacientes nesse intervalo e nos
seguintes após o tratamento tiveram os exames parasitológicos com resultados negativos. Quadro
5, Gráfico 4.
Figura 6. À esquerda, residência de pacientes no surto de Ananindeua. À direita, dois dos pacientes com diagnóstico
positivo de fase aguda da doença de Chagas.
*Quadro 5. Acompanhamento de exames parasitológicos dos
pacientes de Ananindeua em 4 intervalos de tempo
Antes de tratar
Paciente
GE/QBC
XEN/CUL
XEN/CUL
ANA 01
POS/POS
POS/POS
POS/NEG
ANA 02
POS/POS
POS/NEG
NEG/NEG
ANA 03
NEG/POS
POS/NEG
POS/NEG
ANA 04
NEG/POS
POS/POS
NEG/NEG
ANA 05
NEG/POS
POS/POS
POS/NEG
ANA 06
NEG/POS
NEG/POS
NEG/NEG
ANA 07
NEG/POS
POS/POS
NEG/NEG
ANA 08
POS/POS
NEG/POS
NEG/NEG
ANA 09
NEG/POS
POS/POS
NEG/NEG
ANA 10
POS/POS
POS/NEG
NEG/NEG
ANA 11
POS/POS
POS/POS
NEG/NEG
ANA 12
NEG/POS
POS/POS
NEG/NEG
ANA 13
NEG/POS
POS/NNEG
NEG/NEG
ANA 14
NEG/POS
NEG/POS
NEG/NEG
* Constam somente os exames que apresentem pelo menos um resultado
positivo nos demais intervalos com 6 meses, 1 e 2 anos de tratamento
__________________________________________________________________________________________
46
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Gráfico 4. Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de Ananindeua
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GE
QBC
XENO
CUL
GE
Antes de tratar
QBC
XENO
CUL
6 meses
POS
NEG
NR
O diagnóstico sorológico dos indivíduos com sintomatologia compatível de DCA revelou
no teste de IFI, 64,28% (9/14) dos pacientes foram IgM anti-T. cruzi positivos, títulos variando
entre 1/40 e 1/640. Para anticorpos IgG anti-T. cruzi 57,14% (8/14) dos pacientes foram positivos
com títulos entre 1/40 a 1/320. O teste de HAI apresentou 78,57% de positividade (11/14). Seis
meses após o tratamento, 2 pacientes (14,28%) ainda apresentavam títulos de IgM positivos. Os
pacientes apresentavam IgG com títulos reativos entre 1/40 e 1/160. O teste de HAI foi reagente
para todos os pacientes.
Um ano após o tratamento, a IFI por pesquisas de IgM anti-T. cruzi apresentou resultados
negativos, enquanto a mesma técnica, por ocasião da pesquisa de IgG, mostrou resultados
variando de 1/40 e 1/160. A HAI revelou apenas 57,14% (8/14) dos pacientes como positivos.
Dois anos após o tratamento, um paciente apresentou título de IgM positivo em vigência de
malária por P. falciparum e todos apresentaram IgG com títulos variando entre 1/40 e 1/160. Na
HAI, 7 pacientes apresentaram resultados não reativos. Quadro 6, Gráficos 5 e 6.
Quadro 6. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Ananindeua em 4 intervalos de tempo
Paciente
ANA 01
ANA 02
ANA 03
ANA 04
ANA 05
ANA 06
ANA 07
ANA 08
ANA 09
ANA 10
ANA 11
ANA 12
ANA 13
ANA 14
Antes de tratar
IgG/IgM
HAI
1:80/1:40
+
NEG/NEG +
1:40/NEG +
NEG/NEG +
1:40/1:80
NREA
NEG/1:160 NREA
1:40/1:40
+
1:80/1:40
+
NEG/1:320 +
1:40/1:640 +
1:160/NEG +
NEG/1:160 +
NEG/1:80 NREA
1:320/NEG +
6 Meses
IgG/IgM
1:80/1:80
1:40/NEG
1:40/1:80
1:40/NEG
1:80/NEG
1:80/NEG
1:40/NEG
1:40/NEG
1:40/NEG
1:80/NEG
1:80/NEG
1:160/NEG
1:160/NEG
1:80/NEG
HAI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1 ano
IgG/IgM
1:80/NEG
1:40/NEG
1:80/1:NEG
1:160/NEG
1:80/NEG
1:40/NEG
1:40/NEG
1:80/NEG
1:80/NEG
1:40/NEG
1:160/NEG
1:40/NEG
1:80/NEG
1:40/NEG
HAI
+
NREA
+
+
+
NREA
NREA
+
+
NREA
+
NREA
NREA
+
2 anos
IgG/IgM
1:40/NEG
1:40/NEG
1:160/1:320
1:40/NEG
1:80/NEG
1:40/NEG
1:80/NEG
1:40/NEG
1:40/NEG
1:160/NEG
1:80/NEG
1:40/NEG
1:80/NEG
1:80/NEG
HAI
NREA
NREA
+
NREA
+
NREA
+
NREA
NREA
+
+
NREA
+
+
__________________________________________________________________________________________
47
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Gráfico 5. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Ananindeua, em 4 intervalos de tempo
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
IgG
IgM
Antes de tratar
HAI
IgG
IgM
HAI
6 Meses
IgG
IgM
HAI
1 Ano
IgG
IgM
HAI
2 Anos
REA NREA 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 NEG
Gráfico 6. Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no surto de Ananindeua
__________________________________________________________________________________________
48
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
13.7. SURTO DE BARCARENA
Seis pessoas, todas sintomáticas, (Figura 7) apresentaram antes do tratamento, exame
parasitológico de gota espessa positivo em 33,33% (2/6) e 100% (6/6) no QBC®. Quando
examinados pelo xenodiagnóstico, 83,33% foram positivos (5/6) e a hemocultura foi positiva em
66,66% dos casos (4/6). Após seis meses de tratamento e nos outros cortes temporais, todos os
exames parasitológicos foram negativos. Quadro 7, Gráfico 7.
Figura 7. À esquerda, residência de pacientes do surto de Barcarena. À direita, dois dos pacientes com diagnóstico
positivo para fase aguda da doença de Chagas.
*Quadro 7. Acompanhamento de exames parasitológicos dos pacientes de
Barcarena em 4 intervalos de tempo
Antes de tratar
Paciente
GE/QBC
XEN/CUL
BAR 01
NEG/POS
POS/POS
BAR 02
NEG/POS
POS/POS
BAR 03
NEG/POS
POS/NEG
BAR 04
POS/POS
POS/POS
BAR 05
NEG/POS
POS/NEG
BAR 06
POS/POS
NEG/POS
* Constam somente os exames que apresentem pelo menos um resultado positivo nos
demais intervalos com 6 meses, 1 e 2 anos de tratamento
__________________________________________________________________________________________
49
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Gráfico 7. Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de Barcarena
7
6
5
4
3
2
1
0
GE
QBC
XENO
CUL
Antes deTratar
POS
NEG
NR
A sorologia diagnóstica demonstrou positividade para IgM em 100% dos pacientes (6/6),
enquanto a pesquisa de IgG foi positiva em 83,33 (5/6) dos indivíduos sintomáticos com títulos
entre 1/40 a 1/160. Todos foram reagentes no teste de HAI.
Seis meses após o tratamento, nenhum paciente apresentou IgM positiva. Os títulos de IgG
variaram de 1/40 a 1/160 entre os seis pacientes. No teste de HAI, todos os pacientes foram
reagentes.
Um ano após o tratamento, a pesquisa de IgM continuava negativa em todos os pacientes
e os títulos de IgG permaneceram em níveis entre 1/40 e 1/160. Na HAI 50% (3/6) dos pacientes
foram não-reagentes.
Dois anos após o tratamento, a pesquisa de IgM permanecia negativa em todos os
pacientes. Os títulos de IgG permaneciam positivos entre 1/40 e 1/160 e os testes de HAI se
revelaram negativos em 2 indivíduos. Quadro 8, Gráficos 8 e 9.
Quadro 8. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Barcarena em 4 intervalos de tempo
Antes de tratar
6 Meses
1 ano
2 anos
Paciente
IgG/IgM
HAI
IgG/IgM
HAI
IgG/IgM
HAI
IgG/IgM
HAI
BAR 01 1:80/1:80
+
1:80/NEG +
1:40/NEG +
1:160/NEG +
BAR 02
NEG/1:40
+
1:80/NEG
+
1:80/NEG
+
1:40/NEG
NREA
BAR 03
1:160/1:160 +
1:80/NEG
+
1:40/NEG
NREA
1:80/NEG
+
BAR 04
1:40/1:80
+
1:160/NEG +
1:160/NEG +
1:40/NEG
+
BAR 05
1:80/1:80
+
1:80/NEG
+
1:80/NEG
NREA
1:40/NEG
NREA
BAR 06
1:40/1:80
+
1:40/NEG
+
1:80/NEG
NREA
1:80/NEG
+
__________________________________________________________________________________________
50
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Gráfico 8. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Barcarena, em 4 intervalos de tempo
7,00
6,00
5,00
4,00
3,00
2,00
1,00
0,00
IgG
IgM
HAI
IgG
Antes de tratar
IgM
HAI
IgG
6 Meses
REA
NREA
1/40
1/80
IgM
HAI
IgG
1 Ano
1/160
1/320
1/640
IgM
HAI
2 Anos
1/1280
NEG
Gráfico 9. Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no surto de Barcarena
__________________________________________________________________________________________
51
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
13.8. SURTO DE BELÉM
Entre os 12 pacientes (Figura 8) identificados como agudos, 5 (41,66%) apresentaram
exame de gota espessa positivo, enquanto no teste de QBC® todos (12 - 100%) apresentaram
resultados positivos. O xenodiagnóstico apresentou 75% de positividade (9/12) e a hemocultura
foi positiva em 58,33% (7/12) dos testes efetuados. Nos demais intervalos pós-tratamento, todos
os exames parasitológicos apresentaram resultados negativos. Quadro 9, Gráfico 10.
Figura 8. À esquerda, residência de pacientes do surto de Belém. À direita, três dos pacientes com diagnóstico
positivo para fase aguda de doença de Chagas.
* Quadro 9. Acompanhamento de exames parasitológicos dos pacientes de
Belém em 4 intervalos de tempo
Antes de tratar
Paciente
GE/QBC
BEL 01
POS/POS
BEL 02
NEG/POS
BEL 03
NEG/POS
BEL 04
NEG/POS
BEL 05
NEG/POS
BEL 06
POS/POS
BEL 07
POS/POS
BEL 08
NEG/POS
BEL 09
NEG/POS
BEL 10
NEG/POS
BEL 11
POS/POS
BEL 12
POS/POS
XEN/CUL
POS/NEG
POS/NR
POS/NR
POS/POS
POS/NEG
NEG/POS
NEG/POS
NEG/POS
POS/POS
POS/NEG
POS/POS
POS/POS
* Constam somente os exames que apresentem pelo menos um resultado positivo nos
demais intervalos com 6 meses, 1 e 2 anos de tratamento
__________________________________________________________________________________________
52
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Gráfico 10. Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de Belém
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GE
QBC
XENO
CUL
Antes de Tratar
POS
NEG
NR
Por ocasião do diagnóstico sorológico, todos os pacientes se mostraram IgM anti-T. cruzi
positivos (12/12 – 100%) com títulos variando entre 1/40 e 1/640, caracterizando a fase aguda da
doença, e títulos de IgG positivos em 83,33% (10/12) com títulos entre 1/40 e 1/320. O teste de
HAI na fase pré-tratamento apresentou resultados reativos em todos os pacientes. Aos seis meses
após o tratamento, todos os pacientes apresentavam títulos de IgM negativos, e essa característica
se estendeu pelos dois outros cortes temporais (1 e 2 anos). Os títulos de IgG se mantinham entre
1/40 e 1/320. Os testes de HAI permaneceram todos reagentes.
Com um ano de tratamento, os títulos de IgG variavam entre 1/40 e 1/160, e os testes de
HAI um foi negativo e os demais reagentes. Os pacientes apresentaram, após 2 anos de
tratamento, anticorpos de IgM todos negativos. Para IgG, os anticorpos apresentaram títulos entre
1/40 e 1/160. A HAI se revelou negativa em dois pacientes. Quadro 10, Gráficos 11 e 12.
Quadro 10. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Belém em 4 intervalos de tempo
Paciente
BEL 01
BEL 02
BEL 03
BEL 04
BEL 05
BEL 06
BEL 07
BEL 08
BEL 09
BEL 10
BEL 11
BEL 12
Antes de tratar
IgG/IgM
HAI
1:80/1:80
+
1:40/1:40
+
1:40/1:160 +
NEG/1:80
+
1:40/1:80
+
1:80/1:160 +
NEG/1:320 +
1:160/1:640 +
1:160/1:320 +
1:80/1:160 +
1:80/1:80
+
1:320/1:320 +
6 Meses
IgG/IgM
1:40/NEG
1:80/NEG
1:40/NEG
1:160/NEG
1:160/NEG
1:80/NEG
1:80/NEG
1:160/NEG
1:40/NEG
1:80/NEG
1:320/NEG
1:160/NEG
HAI
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
1 ano
IgG/IgM
1:40/NEG
1:80/NEG
1:160/NEG
1:60/NEG
1:40/NEG
1:40/NEG
1:40/NEG
1:80/NEG
1:80/NEG
1:40/NEG
1:160/NEG
1:80/NEG
HAI
+
+
+
+
NREA
+
+
+
+
+
+
+
2 anos
IgG/IgM
1:40/NEG
1:40/NEG
1:40/NEG
1:80/NEG
1:160/NEG
1:80/NEG
1:40/NEG
1:80/NEG
1:80/NEG
1:160/NEG
1:40/NEG
1:40/NEG
HAI
+
+
+
+
+
NREA
+
+
NREA
+
+
+
__________________________________________________________________________________________
53
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Gráfico 11. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Belém, em 4 intervalos de tempo
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
IgG
IgM
HAI
IgG
1 Antes de tratar
IgM
HAI
IgG
6 Meses
REA
NREA
1/40
IgM
HAI
1 Ano
1/80
1/160
1/320
1/640
1/1280
IgG
IgM
2 Anos
NEG
Gráfico 12. Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no surto de Belém
__________________________________________________________________________________________
54
HAI
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
13.9. SURTO DE BRAGANÇA
Sete pessoas acompanhadas nesse surto (Figura 9) apresentaram exame de gota espessa
positivo em 42,85% (3/7) e 100% (7/7) no QBC®. O xenodiagnóstico apresentou 71,42% de
positividade (5/7) e a hemocultura foi positiva em 42,85% (3/7) dos positivos. Nos intervalos
seguintes pós tratamento, todos os exames parasitológicos negativaram. Quadro 11, Gráfico 13.
Figura 9. À esquerda, residência de pacientes no surto de Bragança. À direita, coleta de sangue de um dos pacientes
com diagnóstico positivo para fase aguda de doença de Chagas.
* Quadro 11. Acompanhamento de exames parasitológicos dos pacientes de
Bragança em 4 intervalos de tempo
Antes de tratar
Paciente
GE/QBC
XEN/CUL
BRA 01
POS/POS
POS/NEG
BRA 02
NEG/POS
POS/NR
BRA 03
NEG/POS
POS/NR
BRA 04
NEG/POS
POS/POS
BRA 05
NEG/POS
POS/NR
BRA 06
POS/POS
NR/POS
BRA 07
POS/POS
NR/POS
* Constam somente os exames que apresentem pelo menos um resultado positivo nos
demais intervalos com 6 meses, 1 e 2 anos de tratamento
__________________________________________________________________________________________
55
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Gráfico 13. Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de Bragança
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GE
QBC
XENO
CUL
Antes de tratar
POS
NEG
NR
Os testes de IFI foram positivos nos 7 pacientes, com os títulos de IgM variando de 1/40
e 1/160. Já os títulos de IgG foram positivos em 4 (57,14%) com títulos entre 1/40 e 1/80. No
ensaio de HAI todos apresentaram resultados reativos.
Com seis meses do tratamento, todos os pacientes apresentaram títulos de IgM negativos
que permaneceram negativos até os dois anos após o tratamento. Os títulos de IgG variaram entre
1/40 e 1/80. Os testes de HAI foram todos reagentes.
Com um ano de tratamento, os títulos de IgG variaram de 1/40 até 1/80. Todos os testes
de HAI permaneciam reativos. Aos dois anos após o tratamento, os títulos de IgG variaram entre
1/40 e 1/160. Em três pacientes o ensaio de HAI foi negativo, permanecendo positivo nos outros.
Quadro 12 e Gráficos 14 e 15.
Quadro 12. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Bragança em 4 intervalos de tempo
Antes de tratar
6 Meses
IgG/IgM
HAI
IgG/IgM
BRA 01
1:80/1:160
+
1:40/NEG +
BRA 02
NEG/1:80
+
BRA 03
1:80/1:160
BRA 04
Paciente
1 ano
IgG/IgM
HAI
1:80/NEG +
1:40/NEG
+
1:40/NEG +
1:40/NEG +
1:40/NEG
NREA
+
1:80/NEG +
1:40/NEG +
1:40/NEG
NREA
NEG/1:80
+
1:40/NEG +
1:80/NEG +
1:80/NEG
NREA
BRA 05
1:40/1:160
+
1:40/NEG +
1:80/NEG +
1:80/NEG
+
BRA 06
NEG/1;180 +
1:80/NEG +
1:40/NEG +
1:160/NEG +
BRA 07
1:40/1:40
1:40/NEG +
1:80/NEG +
1:80/NEG
+
HAI
IgG/IgM
>2 anos
HAI
+
__________________________________________________________________________________________
56
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Gráfico 14. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Bragança, em 4 intervalos de tempo
8
7
6
5
4
3
2
1
0
IgG
IgM
Antes de Tratar
HAI
IgG
IgM
HAI
6 Meses
IgG
IgM
HAI
1 Ano
IgG
IgM
HAI
2 Anos
REA NREA 1/40 1/80 1/160 1/320 1/640 1/1280 NEG
Gráfico 15. Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no surto de Bragança
__________________________________________________________________________________________
57
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
13.10. SURTO DE MAZAGÃO
O surto de Mazagão foi um marco que, pela primeira vez, reuniu dados epidemiológicos
que confirmaram a proposta de transmissão oral da doença de Chagas. Acometeu 17 indivíduos
(Figura 10) com sintomatologia própria de doença aguda e os exames parasitológicos que
antecederam o tratamento apresentaram 100% (17/17) de positividade. sendo 35,29% (6/17) na
gota espessa e 94,11% (16/17) no QBC®. O xenodiagnóstico apresentou 82,35% de positividade
(14/17) e a hemocultura teve 41,17% (7/17) de positividade. Com seis meses, um ano, e cinco
anos de tratamento, todos os pacientes negativaram, com exceção de um que, desde o início,
apresentou alergia ao benzonidazol e teve suspenso o tratamento por várias vezes. No quinto ano
esse paciente, que apresentou sorologia positiva para HIV, teve um xenodiagnóstico positivo,
tratou novamente, agora com nifurtimox, tem exame parasitológico como todos os demais
pacientes após o sétimo ano de tratamento. Quadro 13, Gráfico 16.
Figura 10. Ambiente de transmissão e pacientes num surto de doença de Chagas familiar no Mazagão-AP.
__________________________________________________________________________________________
58
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
*Quadro 13. Acompanhamento de exames parasitológicos dos pacientes
de Mazagão em 5 intervalos de tempo
Antes de tratar
Paciente
GE/QBC
XEN/CUL
XEN/CUL
A 5209
A 5219
A 5210
A 5211
A 5220
A 5221
B 5222
B 5200
B 5201
B 5198
B 5199
B 5202
C 5203
C 5205
C 5206
C 5208
C 5258
NEG/NEG
NEG/POS
POS/POS
NEG/POS
NEG/POS
POS/POS
NEG/POS
NEG/POS
POS/POS
NEG/POS
POS/POS
NEG/POS
NEG/POS
NEG/POS
POS/POS
NEG/POS
POS/POS
POS/NEG
POS/ NEG
POS/ NEG
POS/POS
POS/ NEG
POS/ NEG
NEG/NEG
POS/ NEG
POS/POS
POS/ NEG
POS/POS
POS/POS
NEG/ NEG
POS/POS
POS/POS
POS/POS
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
POS/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
NEG/NEG
* Constam somente os exames que apresentem pelo menos um resultado positivo
nos demais intervalos com 6 meses, 1 e 2 anos de tratamento
Gráfico 16. Acompanhamento de exames parasitológicos positivos dos pacientes de Mazagão
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
GE
QBC
XENO
CUL
Antes de tratar
POS
NEG
Antes de iniciar o tratamento, os pacientes apresentaram no teste de IFI IgG 47,05%
(8/17) de positividade para IgG (títulos variando entre 1:40 e 1:320) e 35,29% (6/17) de positivos
__________________________________________________________________________________________
59
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
para IgM anti-T. cruzi com títulos variando entre 1:40 e 1:640. O teste de HAI apresentou 47,05%
de positividade (8/17).
Com seis meses de tratamento, 88,23% (15/17) dos pacientes apresentavam IgG com
títulos reativos entre 1/40 e 1/640. O teste de IgM foi negativo em todos os indivíduos, enquanto o
teste de HAI foi reagente para todos os pacientes.
Um ano após o tratamento, a IFI para IgM anti-T. cruzi permaneceu negativo, enquanto a
pesquisa de IgG foi positiva em 70,58% (12/17) dos pacientes com resultados variando de 1/40 e
1/320. A HAI foi positiva em 70,58% (12/17) dos pacientes.
Com cinco anos de tratamento, todos os pacientes apresentaram IFI IgG e IgM e HAI
negativos, com exceção do paciente que contraiu o HIV e havia interrompido o tratamento no
passado. Ele apresentou IgG e IgM com títulos respectivos de 1:320 e 1:80, além de HAI positivo.
Após tratar novamente, com sete anos, ele e os demais pacientes apresentaram todos os testes
sorológicos negativos . Quadro 14, Gráficos 17 e 18.
Quadro 14. acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Mazagão em
5 intervalos de tempo
Antes de tratar
6 Meses
IgG/IgM
HAI
IgG/IgM
HAI
IgG/IgM
HAI
IgG /IgM
HAI
A 5209
1:80/NEG
+
1:80/ NEG
+
1:40/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
A 5219
NEG/NEG
NREA
1:40/NEG
+
NEG/NEG
NREA
NEG/NEG
NREA
A 5210
1:80/1:320
+
1:80/NEG
+
1:80/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
A 5211
NEG/NEG
NREA
1:40/NEG/
+
1:40/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
A 5220
NEG/NEG
NREA
1:40/NEG
+
1:40/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
A 5221
NEG/NEG
NREA
NEG/NEG
+
NEG/NEG
NREA
NEG/NEG
NREA
A 5222
NEG/1:40
+
1:80/NEG
+
1:40/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
B 5200
NEG/1:40
+
1:80/NEG
+
1:40/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
B 5201
NEG/1:320
+
1:80/NEG
+
1:40/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
B 5198
1:40/1:640
+
1:40/NEG
+
1:80/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
B 5199
1:160/NEG
+
1:80/NEG
+
1:40/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
B 5202
NEG/NEG
NREA
1:80/NEG
+
NEG/NEG
NREA
NEG/NEG
NREA
B 5203
NEG/NEG
NREA
1:40/NEG
+
NEG/NEG
NREA
NEG/NEG
NREA
C 5205
1:320/NEG
+
NEG/NEG
+
1:40/ NEG
+
1:320/1:80
REA
C 5206
1:320/NEG
NREA
1:40/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
NEG/NEG
NREA
C 5208
1:320/1:40
NREA
1:80/ NEG
+
1:80/ NEG
+
NEG/NEG
NREA
C 5258
1:320/NEG
NREA
1:640/NEG
+
1:320/NEG
+
NEG/NEG
NREA
Paciente
1 ano
5 anos
* Constam somente os exames que apresentem pelo menos um resultado positivo nos
demais intervalos com 6 meses, 1 e 2 anos de tratamento
__________________________________________________________________________________________
60
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Gráfico 17. Acompanhamento de exames sorológicos dos pacientes de Mazagão, em 5 intervalos de tempo
18
17
16
15
14
13
12
11
10
9
8
7
6
5
4
3
2
1
0
IgG
IgM
HAI
IgG
Antes de Tratar
REA
IgM
HAI
6 Meses
NREA
IgG
IgM
HAI
1 Ano
1/40
1/80
1/160
IgG
IgM
HAI
IgG
5 Anos
1/320
1/640
IgM
HAI
7 Anos
NEG
Gráfico 18. Resumo dos resultados parasitológicos e sorológicos observados no surto de Mazagão
__________________________________________________________________________________________
61
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
14. CAPTURA DE ANIMAIS
14.1. CAPTURA E IDENTIFICAÇÃO DE ANIMAIS SILVESTRES
Os mamíferos foram capturados nas localidades onde os surtos de DCA ocorreram:
Abaetetuba, Ananindeua, Barcarena, Belém e Bragança, no Estado do Pará, e no município de
Mazagão, no Estado do Amapá. Foram capturados 145 mamíferos silvestres, sendo 132 da ordem
Didelphimorpha (Marsupialia) representados por 4 espécies e 13 mamíferos da ordem Rodentia,
todos de uma única espécie. Tabela 11.
Da Ordem Didelphimorpha, foram capturados 75 Didelphis marsupialis, 34 Philander
opossum, 21 Marmosa cinerea, e 2 Marmosa murina; da Ordem Rodentia, foram 13 Proechimys
guayanensis. Foram capturados56 animais em Abaetetuba, 7 em Ananindeua, 40 em Barcarena, 5
em Belém, 25 em Bragança e 12 em Mazagão. Figura 11.
Figura 11. A. Didelphis marsupialis; B. Philander opossum; C. Marmosa cinerea: mamíferos
mais capturados nos estudos dos surtos.
__________________________________________________________________________________________
62
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Tabela 11. Mamíferos coletados e taxa de infecção para T. cruzi nas
áreas de ocorrência de surtos nos estados do Pará e Amapá entre 1995 a 2005
Municípios
D. marsupialis
P. opossum
M. cinerea
M. murina
Cap/Exa
Cap/Exa
Pos(%)
Cap/Exa Pos(%)
Cap/Exa Pos(%) Cap/Exa Pos(%)
Pos(%)
P. guyanensis
Abaetetuba 21/21
16(76,2) 23/23
18(78,2)
7/7
5(71,4)
─
─
5/5
3(60)
Ananindeua 7/7
5(71,4)
─
─
─
─
─
─
─
Barcarena
23/23
16(69,6) 5/5
4(80)
6/5
3(60)
─
─
6/6
3(50)
Belém
5/5
3(60)
─
─
─
─
─
─
─
─
Bragança
13/13
9(69,2)
6/6
4(66.6)
4/4
1(25)
─
─
2/2
1(50)
Mazagão
6/6
3(50)
─
─
4/4
2(50)
2/2
1(50)
─
─
Total
75/75
52(69,33) 34/34
26(76,4)
21/21
11(52,38 )
2/2
1(50)
13/13
7(53,84)
─
14.2. PESQUISA DE T. CRUZI PELO SISTEMA QBC® E EM GOTA ESPESSA (GE)
O teste do QBC revelou uma positividade de 68,96% (145/100), estando infectados com
tripanossomas 69,33% dos D. marsupialis (52/75), 70,58% dos P. opossum (24/34), 61,90% das
M. cinerea (13/21), 100% das M. murina (2/2) e 69,23% dos P. guyanensis (9/13). Na GE, 37,3%
(28/75) dos exemplares de D. marsupialis coletados apresentaram resultados positivos; 47,05%
dos P. opossum (16/34); 42,85% das M. cinerea (9/21); 50% das M. murina (1/2) e 38,46% dos P.
guyanensis (5/13).
14.3. XENODIAGNÓSTICO E HEMOCULTURA
Xenodiagnóstico: positivo em 64% (48/75) dos D. marsupialis; 58,82% (20/34) dos P.
opossum; 52,38% (11/21) das M. cinerea; 50% (1/2) das M. murina e 65,53% (8/13) dos P.
guyanensis. Quanto à hemocultua, foram obtidos os seguintes índices de positividade: D.
marsupialis 54,66% (41/75); P. opossum 67,64% (23/34); M. cinerea 47,61% (10/21); M. murina
50% (1/2) e P. guyanensis 53,84% (7/13). Os resultados compilados na tabela 12.
Tabela 12. Presença de tripanossomas em mamíferos silvestres coletados
nos estados do Pará e Amapá entre os anos de 1995 e 2005
Hospedeiro
No de Gota espessa
animais Pos
%Pos
QBC®
Pos
75
34
21
2
28
16
9
1
37,3
47,05
42,85
50
13
145
5
59
38,46
40,68
%Pos
Xenodiagnóstico
Pos
%Pos
Hemocultura
Pos
%Pos
52
24
13
2
69,33
70,58
61,90
100
48
20
11
1
64
58,82
52,38
50
41
23
10
1
54,66
67,64
47,61
50
9
100
69,23
68,96
8
88
65,53
60,68
7
82
53,84
56,55
Didelphimorpha
D. marsupialis
P. opossum
M. cinerea
M. murina
Rodentia
P. guyanensis
Total de animais
__________________________________________________________________________________________
63
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
15. ESTUDO ENTOMOLÓGICO
Foram capturados nas localidades em que ocorreram os surtos (Abaetetuba, Ananindeua,
Barcarena, Belém, Bragança e Mazagão), 1022 triatomíneos de cinco espécies: R. pictipes
(n=737); R. robustus (n=83); R. milesi (n=64); P. geniculatus (n=98) e P. lignarius (n=40).
15.1. COLETA DE TRIATOMÍNEOS EM PALMEIRAS
174 palmeiras de 5 espécies foram examinadas nos diferentes municípios. A espécie
Schelea martiana (urucuri) representou 38,5% (67/174) das examinadas; Orbgnya speciosa
(babaçu) 19,54% (34/174); Maximiliana regia (inajá) 21,83% (38/174); Elaeis melanoccoca
(dendê) 10,917% (19/174) e Oenocarpus bacaba (bacaba) 9,19% (16/174). Tabela 13.
O índice de infestação de triatomíneos nessas palmeiras foi de 61,19% (41/67) para S.
martiana; 64,70% (22/34) para O. speciosa; 50% (19/38) para M. regia; 57,89% (11/19) para E.
melanoccoca; e 75% (12/16) para O. bacaba.
Tabela 13. Palmeiras como principais ecótopos de triatomíneos
em municípios dos estados do Pará e Amapá, 1995-2005
Espécie
Investigadas
Positivas
%Positiva
S. martiana - Urucuri
67
41
61,19
O. speciosa - Babaçu
34
22
64,70
M. regia - Inajá
38
19
50
E. melanoccoca - Dendê
19
11
57,89
O. bacaba - Bacaba
16
12
75
Total
174
105
60,34
As palmeiras regionais (Figura 12, Tabela 14) foram os principais ecótopos das 5
espécies de triatomíneos coletados. A espécie S. martiana (urucuri) abrigava 33,03% (247/747))
dos exemplares de triatomíneos coletados; M. regia (Inajá) 24,63% (184/747); O. speciosa
(babaçu) 21,95% (164/747); E. melanoccoca (dendê) 11,91% (89/747) e ; O. bacaba (bacaba)
8,43% (63/747).
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64
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Tabela 14. Distribuição dos triatomíneos coletados em 5 espécies de
palmeiras em municípios dos estados do Pará e Amapá, 1995-2005
ESPÉCIE
R. pictipes
R. robustus R. milesi
P. geniculatus
P. lignarius Total (%)
S. martiana
(Urucuri)
213
14
─
12
8
247(33,06)
M. regia
(Inajá)
149
12
─
13
10
184(24,63)
O. speciosa
(Babaçu)
82
8
58
10
6
164(21,95)
E. melanoccoca
78
(Dendê)
7
─
4
─
89(11,91)
O. bacaba
(Bacaba)
55
8
─
─
─
63(8,43)
Total Geral
577
49
58
39
24
747(100)
Figura 12. Coleta de triatomíneos em palmeiras
Barcarena foi o município com maior número de coletas de triatomíneos em todos os
métodos com 432 exemplares, enquanto nos demais locais, foram coletados: 269 insetos em
Abaetetuba; 197 em Bragança; 68 em Mazagão, 41 em Belém, 15 em Ananindeua.
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65
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
15.2. COLETA DE TRIATOMÍNEOS EM ARMADILHAS LUMINOSAS
Um total de 177 triatomíneos de 4 espécies foi coletado com armadilhas de luz (Figura
13). Rhodnius pictipes representou 68,92% (122/177) dos insetos coletados; R. robustus 12,99%
(23/177); P. geniculatus 12,43% (22/177) e P. lignarius 5,65% (10/177). Nenhum exemplar de R.
milesi foi capturado com armadilhas luminosas. Barcarena foi o município com maior número de
exemplares coletados (n=105) enquanto nos demais locais foram coletados: 32 em Abaetetuba; 14
em Bragança; 13 em Belém, 10 em Mazagão e 3 em Ananindeua. Tabelas 14 e 15.
Figura 13. Coleta de triatomíneos em armadilhas luminosas
Noventa e oito triatomíneos foram coletados em sítios diferentes das palmeiras e das
armadilhas de luz. Esses insetos foram trazidos por moradores sem definição do ecótopo.
15.3. EXAME DO CONTEÚDO INTESTINAL DOS TRIATOMÍNEOS
A taxa de infecção geral observada por meio da pesquisa de tripanossomas no conteúdo
intestinal desses triatomíneos foi de 51,81% em R. pictipes (271 positivos dos 523 examinados
dos 737 coletados); 70,14% em R. robustus (47 positivos em 67 examinados dos 83 coletados);
33% em R. milesi (14 positivos em 42 examinados dos 64 coletados); 51,47% em P. geniculatus
(35 positivos em 68 examinados dos 98 coletados) e 27,27% em P. lignarius (6 positivos em 22
examinados dos 40 coletados).
A taxa de triatomíneos infectados por municípios foi de 53,18% em Abaetetuba
(117/220); 40% em Ananindeua (6/15); 59,85% em Barcarena (164/274); 31,03% em Belém
(9/29); 27,73% em Bragança (33/119)e 67,69% em Mazagão (44/65).
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66
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Tabela 15. Triatomíneos capturados em diferentes ecótopos no Pará e Amapá entre os anos de 1995 e 2005
Município
R. pictipes n=737
R. robustus n=83
R. milesi n=64
P. geniculatus n=98
P. lignarius n=40
Total
Ar. luz Palm. Outros Ar. luz Palm. Outros Ar. luz Palm. Outros Ar. luz Palm. Outros Ar. luz Palm. Outros
Abaetetuba, PA
16
180
12
11
14
4
─
─
─
3
8
8
2
5
6
269
Ananindeua, PA
─
─
─
─
─
─
─
─
─
3
7
5
─
─
─
15
Barcarena, PA
78
239
11
12
24
7
─
─
─
9
14
19
6
13
─
432
Belém, PA
6
10
3
─
─
─
─
─
─
5
4
5
2
6
─
41
Bragança, PA
14
90
12
─
11
─
─
58
6
─
─
─
─
─
─
197
Mazagão, AP
8
58
─
─
─
─
─
─
─
2
─
─
─
─
─
68
Total
122
577
38
23
49
11
─
58
6
22
39
37
10
24
6
1022
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67
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Tabela 16. Taxa de infecção de triatomíneos coletados em localidades dos estados Pará e Amapá entre os anos de 1995 a 2005
R. pictipes
Municípios
R. robustus
R. milesi
P. geniculatus
P. lignarius
Total
Cap/Exa
Pos(%)
Cap/Exa
Pos(%)
Cap/Exa
Cap/Exa
Cap/Exa
Pos(%)
Cap/Exa
Pos(%)
Cap/Exa
Pos(%)
Abaetetuba, PA
208/175
86 (49)
29/24
21(87)
─
─
19/13
8(61)
13/8
2(25)
269/220
117(53,18)
Ananindeua, PA
─
─
─
─
─
─
15/15
6(40)
─
─
15/15
6(40)
328/205
126(61)
43/35
22(63)
─
─
42/25
14(56)
19/9
2(22)
432/274
164(59,85
Belém, PA
19/15
3(20)
─
─
─
─
14/9
4(44)
8/5
2(40)
41/29
9(31,03)
Bragança, PA
116/65
14(21)
11/8
4(50)
64/42
14(33)
6/4
1(25)
─
─
197/119
33(27,73)
Mazagão, AP
66/63
42(67)
─
─
─
─
2/2
2(100)
─
─
68/65
44(67,69)
737/523
271(51,81)
83/67
47(70,14)
64/42
14(33)
98/68
35(51,47)
40/22
6(27,27)
1022/722
373(51,66)
Barcarena, PA
Total
____________________________________________________________________________________________________________________________________________
68
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
16. ISOLAMENTO E CULTIVO IN VITRO
16.1. ISOLAMENTO DE TRIPANOSSOMAS EM AMOSTRAS DE PACIENTES,
ANIMAIS E TRIATOMÍNEOS
Foram obtidos 48 isolados de tripanossomas a partir de hemocultivo com sangue
humano: 10 de Abaetetuba; 7 de Ananindeua; 1 de Barcarena; 21 de Belém, 1 de Bragança e
8 de Mazagão.
A partir de amostras de mamíferos, foram obtidos 16 isolamentos, sendo 14 de
Didelphis marsupialis, 1 de Philander opossum e 1 de Marmosa cinerea. A procedência
desses isolados está assim distribuída: 5 a partir de mamíferos capturados em Abaetetuba, 5
em Barcarena, 2 em Ananindeua, 2 em Belém e 2 em Bragança.
A partir de triatomíneos silvestres, 33 isolados foram caracterizados como T. cruzi I:
24 amostras obtidas de R. pictipes, 6 de R. robustus e 3 de P. geniculatus. A procedência
desses isolados está assim distribuída: 7 de Abaetetuba, 2 de Ananindeua, 13 de Barcarena, 2
de Belém, 4 de Bragança e 5 de Mazagão
17. TIPAGEM GENOTÍPICA DAS CEPAS DE TRIPANOSSOMAS PELO MINIEXON
17.1. TIPAGEM DE ISOLADOS DE PACIENTES
De 48 isolados de origem humana, 42 foram caracterizados como T. cruzi I (TcI) e 6
como pertencentes ao Z3 de T. cruzi. Apenas nos município de Ananindeua, no Pará, e no
município de Mazagão, no Amapá, foram encontrados ambos os genótipos. Anexo 12.
17.2. TIPAGEM DE ISOLADOS DE ANIMAIS SILVESTRES
Todos os 16 isolados de animais silvestres: 14 amostras obtidas de D. marsupialis, 1
de P. opossum e 1 de M. cinérea foram caracterizados como T. cruzi I: Anexo 13.
17.3. TIPAGEM DE ISOLADOS DE TRIATOMÍNEOS SILVESTRES
Trinta e três isolados de triatomíneos silvestres: 24 amostras obtidas de R. pictipes, 6
de R. robustus e 3 de P. geniculatus foram caracterizados como T. cruzi I: Anexo 14.
No município de Mazagão, no Amapá, dois isolados de R. pictipes foram
caracterizados como Tc I e um como Z3. Em dois isolados ocorreu uma superposição de Tc I
e Trypanosoma rangeli. Figura 14.
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69
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Figura 14. Gel de Mini-exon com caracterização de isolados do surto de
Mazagão. Isolados dos pacientes 1 e 2 com perfil de TcI; Isolados de pacientes 3 a
8 com perfil de Z3; Isolados de R. pictipes 9 e 10 perfis de Z3 e T. rangeli; R.
pictipes 11 perfil de Z3 e R. pictipes 12 e 13 perfil de TcI.
17.4. ANÁLISE FENÉTICA POR RAPD
Foi analisada a relação de similaridade dos clones circulantes em cinco surtos de
doença de Chagas Aguda (Abaetetuba, Ananindeua, Barcarena, Belém e Bragança) por
RAPD. Foram usados isolados representativos de humanos, mamíferos e triatomíneos dos 5
surtos. Bandas com tamanhos variando entre 300pb e 2.5Kb foram identificadas (Figura 15).
Dentre os seis primers usados, o RAPD-1 e RAPD-5 foram aqueles que detectaram maior
polimorfismo entre os isolados, porém outros quatro "primers" diferentes foram de utilidade
para melhorar a discriminação entre os isolados (Figura 15).
A variabilidade exibida pelos isolados foi independente dos genótipos dos mesmos
(TC I ou Z3). Além da discriminação dos isolados pela presença ou ausência de bandas,
observaram-se também diferenças na intensidade dos fragmentos, a qual foi independente da
quantidade de DNA molde adicionado à reação. A análise fenética do padrão de RAPD por
surto revela que os isolados provenientes de humano, mamífero e inseto são heterogêneos e
rapidamente diferenciáveis entre eles pela observação do perfil de amplificação aleatória. Na
análise fenética, as bandas com o mesmo peso molecular nos diferentes isolados foram
consideradas como o mesmo caractere de amplificação.
Os fenogramas por surtos (Figura 16) gerados a partir das matrizes de similaridade
obtidos com o coeficiente de Jaccard mostraram que os três isolados apresentam valores de
similaridade ao redor de 0,35 e que não é uma relação clara entre os isolados circulantes em
cada surto. Em adição, a análise fenética por primer demonstrou uma extensa variabilidade
entre os isolados circulando nos diferentes surtos (Figura 16). Essa heterogeneidade tampouco
mostrou relação com o genótipo dos parasitos.
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70
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Figura 15. Seis géis de RAPD com isolados representativos de humanos, mamíferos e triatomíneos dos 5 surtos. Bandas com tamanhos variando entre 300pb e
2.5Kb Dentre os seis “primers” usados, o RAPD-1 e RAPD-5 foram aqueles que detectaram maior polimorfismo entre os isolados.
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71
Sebastião Aldo da Silva Valente
Resultados
Figura 16. Fenogramas por surtos gerados a partir das matrizes de similaridade obtidos com o coeficiente de
Jaccard mostraram que os três isolados apresentam valores de similaridade ao redor de 0,35.
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72
Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
18. DISCUSSÃO
O crescente aumento do número de casos agudos de doença de Chagas na Amazônia
Brasileira parece indicar que essa região seria a nova fronteira e um desafio para se entender a
doença e seus aspectos ecológicos e epidemiológicos. O ciclo enzoótico do T. cruzi está
presente em toda a região, e a fauna triatomínica diversificada habita predominantemente em
palmeiras que ocupam uma vasta área do território amazônico (BARRETT & GUERRERO
al., 1991).
Apesar das evidências de mudanças no comportamento dos triatomíneos silvestres
como fonte primária na origem de casos agudos, aparentemente se dissocia do raciocínio
epidemiológico a picada de vetores como origem da principal da via de transmissão da doença
de Chagas que vem ocorrendo na região pelas surtos em episódios familiares. Nessas formas
de apresentação da doença, a transmissão pelo mecanismo tradicional por contaminação por
meio de contato com formas metacíclicas provenientes de fezes de triatomíneos, não é o mais
freqüente na região e cabe a oportuna introdução de novas propostas, linhas de trabalho e
metodologias de pesquisas no tocante à dinâmica populacional, estudo de dispersão,
epidemiologia e balanço ecológico dos vetores silvestres, capazes de esclarecer essa hipótese
de veiculação da doença na Amazônia Brasileira.
Neste trabalho analisamos 6 surtos de DCA na região Amazônica procurando
elucidar aspectos parasitológicos, sorológicos, potenciais vetores e mamíferos silvestres
existentes no sítio da epidemia, assim como a tipagem molecular dos T. cruzi isolados.
Quando da descrição dos primeiros casos de DCA em Belém, SHAW et al., (1969)
observaram nesse surto acometimento familiar com sintomatologia clínica, exames
parasitológicos e sorológicos positivos típicos de fase aguda. Esse mesmo cenário foi
encontrado no estudo em Mazagão, estado do Amapá numa comunidade formada por 26
pessoas de 4 famílias entre os quais 17 apresentaram sintomas de fase aguda confirmados
depois com exames parasitológicos. De maneira semelhante ao surto de Belém, ali os
pacientes também não exibiram porta de entrada, não se ausentaram do município e não havia
colonização de triatomíneos nos domicílios. Após investigação epidemiológica, especulou-se
também a possibilidade de transmissão alimentar coletiva a partir de um alimento
contaminado.
Posteriormente, entre 1970 e 1980, foram reconhecidos 22 casos agudos a maioria
composta por achados isolados com quadro típico de envolvimento de vetores silvestres e
relatados posteriormente por vários autores no Pará, Amapá Amazonas e Acre, compilados
por BARATA et al., (1988). O Pará e o Amapá apresentam a maior casuística de DCA da
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73
Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
região, independentemente da forma de transmissão que lá ocorre, certamente, pela atuação
do Instituto Evandro Chagas, pioneiro na pesquisa da doença na região.
A partir de 1990, o Instituto Evandro Chagas promoveu uma mudança no
direcionamento de linhas de trabalho e, como Centro de Referência Regional, insistiu na
formação de mão-de-obra especializada, mantendo um serviço básico de vigilância,
conseguindo detectar um grande número de casos, mudando o paradigma de região indene e
expondo a emergência e peculiaridades regionais da enfermidade.
Estudos sobre a doença de Chagas aguda nas áreas endêmicas identificaram que a
ocorrência acontecia no verão, entre os meses agosto e dezembro, fenômeno talvez associado
à atividade vetorial nas áreas de transmissão com triatomíneos domiciliados (LARANJA et
al., 1956; DIAS, 1982). De maneira semelhante, na Amazônia, a freqüência de casos agudos
também se concentra no mesmo período, sazonalidade de difícil explicação, considerando que
não ocorre na região espécies domiciliadas.
Na estação seca da Amazônia, os colonos derrubam e queimam as matas para
preparar o plantio nas roças e extrativismo, o que facilitaria a dispersão de vôo de
triatomíneos e sua atração pela luz das casas, fato registrados por LAINSON et al., (1979) e
VALENTE et al., (1998a) no Pará e por NAIFF et al., (1998) em Manaus, AM.
Apesar de a associação da via oral ser importante historicamente na casuística da
região, não existem estudos conclusivos que quantifiquem essa forma de transmissão.
LAINSON et al., (1980) comprovavam experimentalmente esta hipótese quando
contaminaram uma variedade de alimentos com formas de cultura de T. cruzi, obtendo 100%
dos camundongos infectados. No surto de Mazagão, o depoimento dos moradores das 4
famílias sobre o alimento vinculado na suspeição de transmissão está voltado para o suco de
açaí, o único de consumo comum entre os infectados. É provável, entretanto, que, de alguma
maneira, ocorra o envolvimento de triatomíneos e/ou reservatórios infectados no entorno das
habitações humanas para que ela seja consumada. Nos surtos que acompanhamos, a hipótese
de transmissão pela via oral seria a mais viável, considerando que o comportamento de
triatomíneos aqui envolvidos é bem distinto da situação observada por COURA et al., (1994;
1995) em Barcelos com R. brethesi envolvido diretamente com a transmissão vetorial dos
casos ali detectados.
Os surtos de DCA, objetos deste trabalho no Pará, ocorreram em municípios da
mesorregião do nordeste do estado (Abaetetuba e Bragança) e mesorregião Metropolitana de
Belém (Ananindeua, Barcarena e Belém). No Amapá, o surto descrito ocorreu no município
do Mazagão. Todos os municípios dos dois estados estão inseridos no estuário ribeirinho e
recebem grande influência da região do Marajó e do nordeste do Pará, onde se concentram a
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74
Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
casuística da doença de Chagas aguda do Pará e Amapá e as maiores produtoras de açaí da
Amazônia. Essa estação também coincide com a safra do açaí, fruto nativo da área de várzea,
que alcança sua máxima produção nesse período (ROGEZ, 2000). Sobre esse alimento, a
discussão de seu envolvimento na transmissão da doença de Chagas é assunto muito
controverso, considerando que o consumo vem de séculos, enquanto a sua relação com a
possível transmissão é relativamente recente. Há de se levar em conta também que o estudo
sistematizado da doença na região é bem recente, sendo prioridade outras enfermidades bem
mais prevalentes na região.
Para as comunidades do nordeste do Pará, por força cultural e necessidade de
subsistência, principalmente em populações de baixa renda, a dificuldade na obtenção de
alimentos torna o consumo eventual de caça, cada vez mais raro, pela destruição das matas e
pela fiscalização dos órgãos ambientais, condicionando o consumo quase obrigatório do açaí
pelo menos 2 vezes ao dia, em substituição ao tradicional arroz e feijão.
O transporte dos frutos e o modo de extração da polpa para preparo do suco e sua
comercialização com higiene, absolutamente precária, contribuem para a transmissão de
muitas doenças, inclusive com a hipótese da doença de Chagas. Uma iniciativa importante
para a mudança desse tratamento dado ao açaí foi apresentada pelo Ministério da Saúde do
Brasil que, durante o encontro em que estabeleceu o Consenso Brasileiro de Doença de
Chagas, propôs a criação de um programa para se estabelecerem boas práticas na produção do
produto in natura (BRASIL, 2005), depois ratificada em outra reunião específica para o
assunto (BRASIL, 2007).
O perfil epidemiológico desse modo de transmissão foi proposto para o surto
autóctone do Mazagão. Ali, numa comunidade bem fechada, o sítio enzoótico presente nas
cercanias, o depoimento dos moradores e os hábitos alimentares das famílias afetadas
direcionaram o raciocínio epidemiológico da transmissão para a possibilidade de ingestão do
suco do açaí contaminado com formas viáveis de T. cruzi. Esse alimento consumido in natura
foi o que apresentou as características mais prováveis de contaminação. Como mostrado em
outra seção deste trabalho na série histórica entre os anos de 1968 e 2007 observa-se
claramente não só o crescimento do número de surtos e casos, como também a sua
distribuição temporal é regular na região.
18.1. DIAGNÓSTICO PARASITOLÓGICO E SOROLÓGICO
Considerada indene para doença de Chagas, a Amazônia por muito tempo não teve
um estudo de avaliação sistemática dos casos de doença de Chagas. Deve-se ressaltar aqui os
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75
Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
trabalhos de alguns autores que se detiveram em analisar com mais cuidado as possibilidades
de transmissão na região, entre os quais citamos os trabalhos de SHAW et al., 1969;
LAINSON, et al., (1979), RODRIGUES et al., (1988); COURA et al., (1994, 1995, 1997,
2002a); (VALENTE et al., 1999b; 2006, PINTO et al., 2004)
Achados esporádicos da enfermidade culminavam, quando muito, em investigações
pontuais para delimitar a extensão da infecção e tratar dos casos clínicos. A casuística entre os
estados da região é bem distinta, bem como as apresentações clínicas e os aspectos soroepidemiológicos que permeiam a transmissão.
O Inquérito Sorológico Nacional, realizado na Amazônia Brasileira entre 1975 e
1979 por CAMARGO et al., (1984) revelou os seguintes percentuais de soro-prevalência: 0%
no Amapá, 0,3% em Roraima, 0,4% em Rondônia, 0,6% no Pará, 1,9% no Amazonas e 2,4%
no Acre.
O diagnóstico dos casos detectados também se comporta de maneira muito diversa.
No estado do Amazonas, inquéritos sorológicos realizados por COURA (1997) no município
de Barcelos submetendo 886 amostras a testes de ELISA c IFI apresentaram soro prevalência
inicial de 13,2% de positividade (COURA et al., 1999). Mais tarde, essas mesmas amostras
submetidas a teste com antígenos mais específicos a positividade caiu pela metade, 6,8%.
Esses índices sorológicos se reportaram a comunidades de habitantes ribeirinhos que
trabalhavam com a extração da piaçava em cujas árvores se abrigavam colônias numerosas de
R. brethesi (COURA et al., 1994, 1995, 2002a).
Qualquer pesquisa sorológica realizada na Amazônia enfrentará variados graus de
dificuldade logo no primeiro momento, em função de os antígenos disponíveis no mercado
serem preparados a partir do extrato de cepas que não são próprias da região. GUTIERREZ et
al., (2004) realizando pesquisa sorológica em 638 indivíduos em regiões da Colômbia, com
transmissão ativa de doença de Chagas, e utilizando 3 testes imunoenzimáticos e o teste de
imunoflourescência com frações de antígenos distintos encontraram discordância apreciável
entre os métodos aplicados. Mesmo quando foi aplicado o PCR para confirmação dos
positivos, essa metodologia também teve rendimento limitado. Um outro obstáculo a superar
seriam os resultados falsos-positivos proporcionados por reações cruzadas com as
leishmanioses, endêmicas na região (FRANK et al., 2003) e ainda os resultados inconclusivos
observados em anticorpos de titulação muito baixa (UMEZAWA et al., 2004). Esses
problemas foram detectados por COURA et al., (1994; 1995) nos inquéritos de Barcelos e,
provavelmente, naquelas localidades, seriam casos crônicos de doença de Chagas originados
de T. cruzi I caracterizado por menor morbidade e baixa parasitemia quando comparado com
T. cruzi II, habitualmente encontrado em áreas endêmicas tradicionais (FERNANDES et al.,
__________________________________________________________________________________________
76
Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
1998). Os investigadores que agora trabalham na Amazônia recomendam sempre a execução
de duas técnicas de diferentes princípios e se possível utilizando antígenos a partir de cepas
regionais de modo a se conseguirem resultados satisfatórios no diagnóstico sorológico.
Por outro lado, os testes parasitológicos aplicados nessas populações apresentaram
resultados muito baixos e praticamente não se observou sintomatologia clínica apreciável.
Bem mais tarde, já em 2003, dois indivíduos foram a óbito com miocardiopatia
atribuída à doença de Chagas crônica. Em 2005, mais três casos, dessa vez crônicos, foram
referidos naquela região (ALBAJAR et al., 2003; Xavier et al., 2006).
Estudos que reúnem casuística de fase aguda da doença de Chagas são escassos.
Tomamos para efeitos comparativos a experiência venezuelana na análise de 59 casos agudos
com 15,53% de casos assintomáticos e detectados em pesquisa sorológica. Enquanto isso, os
testes parasitológicos para doença de Chagas apresentaram positividade para gota espessa
34%, xenodiagnóstico 61% e hemocultura 53%, (AÑEZ et al., 1999).
Nossa casuística é o dobro da venezuelana e, no trabalho realizado os testes de
diagnóstico parasitológicos utilizados para detecção dos 121 casos agudos apresentaram
percentuais de positividade de 44,62% com gota espessa; (54/121); 91,73% com QBC®
(111/121); 81% com xenodiagnósticos (98/121) e 60% com hemoculturas (73/121). A
pesquisa sorológica possibilitou observar ainda que, da amostragem selecionada em 3633
pessoas das localidades em estudo, no teste de triagem HAI foram detectados 4,40% dos
indivíduos (160/3633) positivos. Na pesquisa de IFI para pesquisa de IgG anti-T. cruzi, esse
número caiu para 3,19% (116/3633) de positividade e 3,02% (110/3633) de indivíduos
positivos para pesquisa de anticorpos IgM anti-T. cruzi. Apesar de uma concordância
satisfatória entre os indivíduos com exame parasitológico e sorológicos, sobretudo entre
indivíduos que apresentavam sintomatologia clínica, ocorreram casos em que indivíduos com
exame parasitológico positivo tiveram pesquisa de IgM negativo, justificado talvez pela
precocidade do diagnóstico parasitológico sem tempo de formação de anticorpos específicos,
porém, o mais provável é que a deficiência dos antígenos disponíveis para a detecção de fase
aguda seja uma realidade para o cenário amazônico. O Ministério da Saúde está preocupado e
pediu ajuda da comunidade científica na reunião de especialistas na Reunião Anual de
Pesquisa Aplicada em Doença de Chagas em 2007, para viabilizar a solução desse problema
(RECOMENDAÇÕES, 2006).
Nos exames sorológicos, atendemos as recomendações de GUTIERREZ et al.,
(2004) e, apesar das limitações das técnicas citadas por (FRANK et al., 2003), (UMEZAWA
et al., 2004), a pesquisa de anticorpos totais por hemaglutinação foi um método importante
para triagem e auxiliar de seguimento dos casos, enquanto a pesquisa de anticorpos IgM e IgG
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
anti-T. cruzi foi de grande utilidade para confirmação de diagnóstico, principalmente naqueles
pacientes com exame parasitológico negativo e doença de curso prolongado.
O marcador sorológico IgG anti-T. cruzi detectado pela IFI, quando livre das reações
cruzadas, apresenta maior sensibilidade na detecção de positividade em relação aos exames
parasitológicos na fase crônica (LUQUETTI & CASTRO, 1997), entretanto perde na
especificidade. Na fase aguda, tem pouco valor diagnóstico quando usado isoladamente,
porém é muito útil para decidir o tratamento de suspeitos enquanto se aguardam técnicas
parasitológicas indiretas como hemocultura e xenodiagnóstico de resultados demorados em
vigência de pesquisa direta negativa.
As combinações de resultados sorológicos, à luz de variados tipos de antígenos,
inclusive com cepas regionais e parasitológicos, poderiam aumentar a sensibilidade na
detecção de casos agudos. O que vimos nos nossos estudos mostram similaridade com aqueles
obtidos na Venezuela e também com os surtos ocorridos em outras localidades como
Teutônia, (COURA 1966), Catolé do Rocha (SHYKANAI-YASUDA, 1991), Navegantes
(STEINDEL et al., 2008) e com os surtos regionais SHAW et al., (1969), PINTO et al.,
(2001; 2004). Entretanto apresenta uma significativa diferença com aqueles alcançados por
COURA et al., (1994, 1995; 2002b) no Amazonas.
18.2.
SEGUIMENTO
DOS
CASOS
COM
TESTES
PARASITOLÓGICOS
E
SOROLÓGICOS
Na fase aguda da doença, os trabalhos de seguimento são escassos na comprovação
da eficácia terapêutica. A revisão de COURA & CASTRO (2002) aponta dificuldades como
tipo de casuística, critérios de avaliação e tempo excessivamente prolongado para avaliação
satisfatória e análise de dados.
Preconiza-se que o seguimento de pacientes diagnosticados e tratados na fase aguda
seja realizado com exames sorológicos e parasitológicos seriados e regulares com um
acompanhamento a longo prazo. A cura clínica, objeto de controvérsias, seria alcançada
naqueles indivíduos com testes negativos persistentes ou desaparecimento parasitológico e
com títulos de declínio progressivo em pelo menos três diluições nos testes sorológicos
(BRASIL, 2005). Esses princípios adotados atualmente são muito vulneráveis a diversas
situações próprias das técnicas sorológicas, como sensibilidade dos testes aplicados e
discordância de resultados entre indivíduos tratados (GALVÃO et al., 1993, LUQUETTI &
CASTRO, 1997); sorologia positiva persistente e prolongada em pacientes cujos exames
parasitológicos são constantemente negativos; sorologias negativas cujos pacientes
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
apresentam exame parasitológico positivo (SALOMONE et al., 2003) e dificuldades inerentes
à própria natureza dos antígenos utilizados nos testes sorológicos e dos diferentes estados
imunitários pelos quais esses pacientes passam.
Os seis surtos estudados, num total de 71 pacientes, somente um (entre os 17
pacientes do surto de Mazagão) apresentou teste parasitológico positivo. Ele teve intolerância
ao benzonidazol e depois se infectou com o vírus HIV no quinto ano de avaliação do
tratamento quando foi tratado novamente com nifurtimox. Os demais negativaram os exames
parasitológicos como é descrito na literatura (COURA & CASTRO, 2002). Quanto à análise
temporal de seguimento dos exames tanto parasitológicos, quanto sorológicos, somente os
pacientes do surto do Mazagão que foram avaliados até 7 anos apresentam hoje os testes
parasitológicos e sorológicos negativos. Por outro lado, os pacientes dos surtos de Abaetetuba
(15), Ananindeua (14), Barcarena (6), Belém (12) e Bragança (7) que somaram 54 foram
acompanhados por pouco mais de 2 anos e todos ainda exibem sorologia positiva com títulos
entre 1:40 e 1/160. Nesse ínterim, a sua avaliação clínica não justificou o novo tratamento de
nenhum dos pacientes e espera-se que, no final de sete anos de acompanhamento, eles possam
alcançar a cura.
Não há uma explicação razoável que justifique a presença persistente e prolongada
dos anticorpos IgG anti-T. cruzi pós tratamento da fase aguda. ANDRADE et al., (1988)
observaram que células dendríticas do baço de camundongos mantinham-se infectadas muitos
tempo após a cura.
Supõe-se também que anticorpos, quando frente a açúcares como o galactosil,
estimulam a formação de proteínas com epítopos comuns com os antígenos e contribuem de
maneira expressiva para a freqüente ocorrência de reações cruzadas nos testes sorológicos,
sobretudo aqueles que utilizam antígenos totais (GALVÃO et al., 1993). A persistência ou
não dos anticorpos IgG não garante a cura nem exclui o paciente de um acompanhamento
mais prolongado. Em adição, tem-se que se ter em mente que a presença de IgG positiva em
indivíduos tratado significa que, a rigor, a doença não se curou.
18.3. COLETA E CARACTERIZAÇÃO DE ANIMAIS SILVESTRES
Pelo menos 110 espécies de mamíferos de sete ordens (Arthiodactyla, Carnívora,
Chiroptera Didelphiamorphia, Primata, Rodentia e Xenarthra) são reservatórios do T. cruzi,
atuando num ciclo silvestre amplamente distribuído em ecótopos representados por buracos
no chão e em pedras, ocos de árvores, bromélias e copas de palmeiras em matas primárias e
secundárias, altiplanos andinos e charcos, serradas, campos abertos, caatingas, floresta
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
Amazônica e Atlântica da América do Sul, Central e do Norte (MILES et al., 2003).
O ciclo enzoótico do T. cruzi foi referido já nos estudos iniciais da doença por
CHAGAS, (1924a,b) quando identificou tripanossomas em macacos Chrysothrix sciureus no
Estado do Pará. Posteriormente os trabalhos de DEANE et al., (1961b, 1964b, 1964c, 1967) e
já nos idos de 1970 MILES et al., (1981a,b), PÓVOA et al., (1984) contribuíram com
informações importantes sobre a fauna de mamíferos envolvidos na enzootia.
Na Amazônia Brasileira, o ciclo do T. cruzi é predominantemente silvestre (MILES
et al., 1978, 1981, 1983, 2003, VALENTE et al., 1999b; COURA 2000, COURA et al.,
2002a; DIAS et al., 2002a), com achados eventuais de mamíferos domésticos (porcos), na
região do Marajó, e silvestres (marsupiais), em praticamente toda a região, alguns infectados e
encontrados muitas vezes no domicílio ou no entorno das habitações humanas (VALENTE et
al., 1998a; LUITGARDS-MOURA et al., 2005).
O conceito de transmissão oral da doença de Chagas está intimamente relacionado ao
ambiente enzoótico natural e primário do T. cruzi (COURA, 1997). Nesse ciclo, triatomíneos
e mamíferos silvestres partilham ecótopos naturais, cujo sangue constitui sua fonte alimentar.
Considerando que os mamíferos reservatórios de T. cruzi (marsupiais, edentados e roedores)
são também insetívoros, eles eventualmente, se alimentam de triatomíneos naturalmente
infectados e acredita-se que assim se mantenha o ciclo do parasito em natureza, por via
digestiva. A contaminação via formas tripomastigostas metacícilicas presentes nas fezes
estaria dificultada pela espessura e pelagem do tegumento dos animais. Outra forma de
transmissão seria a eliminação pelas glândulas anais de didelfídeos das formas infectantes do
T. cruzi (DEANE et al., 1984; LENZI 1984; NAIFF et al., 1987; JANSEN et al., 1999). Essas
alternativas de contaminação pelo T. cruzi poderiam de alguma maneira estar associadas com
os surtos de doença de Chagas que vêm ocorrendo no Brasil, tanto nas áreas rurais, como
agora também em áreas urbanas, por ingestão de alimentos contaminados com excretas de
triatomíneos e/ou de animais infectados (MILES et al., 2003; SHIKANAI-YASUDA et al.,
1991; VALENTE et al., 1999a, 2006; STEINDEL et al., 2008).
A fauna de mamíferos capturadas nas investigações dos surtos de DCA nesta tese,
reuniu a captura de 145 espécimes: 75 exemplares de D. marsupialis, 34 de P. opossum, 21 de
M. cinerea, 2 M. murina e 13 de P. guyanensis. A taxa de infecção alcançada é elevada com
os diferentes exames aplicados com média de 68,96% (100/145) para o teste parasitológico
QBC® que se mostrou o mais sensível e coincide com dados de LAINSON et al., (1979) e
MILES et al., (1981b) no Pará e bem superior aos evidenciados em piaçabais localizados na
margem esquerda do Rio Negro. COURA et al., (2002a) consideram que a baixa parasitemia
poderia se dever aos limitadores faunísticos naturais daquela região representados
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
provavelmente pela grande extensão entre as margens dos rios, verdadeiras barreiras
hidrográficas, influindo na distribuição e dispersão de mamíferos (WALLACE, 1979) tanto
no Rio Amazonas, como nos seus afluentes como no Rio Negro (AVILA-PIRES 1964).
É possível que dezenas de espécies de mamíferos deixassem de ser capturadas em
virtude do tamanho de nossas armadilhas e que tenhamos selecionado animais de pequeno
porte. Acrescenta-se a esse fato a predominância de área de várzea inundável nos sítios de
coleta que impossibilitava o acesso da equipe aos possíveis abrigos de animais maiores. No
levantamento realizado por SILVA et al., (2001), na Amazônia Brasileira, pelo menos 311
espécies de mamíferos de dez ordens foram descritas, entretanto o conhecimento detalhado da
diversidade de mamíferos em regiões da Amazônia Brasileira que atuam com reservatórios da
doença de Chagas é escasso.
A coleta dos mamíferos neste estudo, em matas secundárias e de capoeira, aponta
para o homem invadindo esses sítios para morar ou explorar os recursos extrativistas,
expondo-se à contaminação acidental pelo T. cruzi (LAINSON et al., 1979; MILES et al.,
1981a,b, TEIXEIRA et., al 2001). Nossos resultados revelaram que 51,72% (75/145) dos
animais coletados apresentaram elevada taxa de infecção para T. cruzi como P. opossum e D.
marsupilais que se abrigam revelando taxas respectivas de 70,58% (24/34) e 69,33% (52/75).
Esses animais se movimentam entre o ambiente silvestre e o peridomicílio em busca de
alimento e de alguma forma pode participar dos processos de contaminação. Há de se
considerar também que muitas comunidades ribeirinhas consomem esses mamíferos, abrindo
assim opções de transmissão do T. cruzi com possíveis casos agudos como ocorre no Pará e
Amapá, sem depender da colonização domiciliar dos vetores (VALENTE et al., 2006).
Um estudo mais detalhado sobre a manutenção dos ciclos e a dinâmica de
transmissão destes tripanossomas entre mamíferos silvestres e triatomíneos na região já
realizados pontualmente por diversos autores (MILES et al., 1983; COURA 2000; MARCILI
et al., 2003; FERNANDES et al., 2001; MAIA DA SILVA et al., 2004) deveriam ser
encorajados na região.
18.4. COLETA E CARACTERIZAÇÃO DE TRIATOMÍNEOS SILVESTRES
Além dos mamíferos silvestres, uma fauna de triatomíneos composta por vinte e uma
espécies foi levantada por GALVÃO et al., (2003) na Amazônia Brasileira, distribuídas em
vários ecótopos. As espécies mais numerosas, as do gênero Rhodnius, apresentam a
distribuição geográfica relacionadas diretamente com a dispersão das diferentes espécies de
palmeiras, seus abrigos preferenciais. Com algumas exceções de habitats seletivos, no caso da
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
espécie de R. brethesi que se abriga seletivamente em palmeira de piaçava, outros
triatomíneos como R. prolixus são versáteis e infestam palmeiras como Cocus nucífera,
Oenocarpus bataua, Atallea butyracea e Atallea elegas na América do Sul e Central
(GAUNT & MILES, 2000; ABAD-FRANCH et al., 2004). Comportamento semelhante
apresentam R. robustus e R. pictipes, como comprovamos em nosso trabalhos. Abrigam-se na
Amazônia em palmeiras comuns como de urucuri, inajá, dendê, bacaba e babaçus.
Nesta tese os triatomíneos foram capturados em diversos sítios onde ocorreram
DCA: R. pictipes; R. robustus; R. milesi; P. geniculatus e P. lignarius com diferentes taxas de
infecção por T. cruzi, sendo o principal ecótopo de coleta as palmeiras que possuem
importância na economia regional e na sobrevivência dos ribeirinhos, pois suas palmas
servem de cobertura para residências, as fibras de matéria-prima para a confecção de
utensílios como cestas, peneiras, esteiras e chapéus, enquanto os frutos e seus derivados são
consumidos tanto pelas comunidades, como pelos animais domésticos. Diante dessa
importância, a coleta dos triatomíneos em palmeiras foi realizada, sobretudo com as
armadilhas de fita adesiva descrita por NOIREAU et al., (1999), e um número restrito de
árvores foi selecionado para dissecação.
A proximidade dessas palmeiras das residências é um fato preocupante, considerando
que a infestação de triatomíneos foi significativa, com uma média de 9,7 triatomíneos
coletados por palmeira. Quando comparados com os estudos já realizados na região, podemos
observar semelhança de resultados com relação às espécies de R. robustus, R. pictipes e P.
lignarius (LAINSON et al., 1979; MILES et al., 1981a,b,. Por outro lado, P. geniculatus foi a
espécie, que em nossos trabalhos, foi coletado predominantemente em palmeira e em
armadilhas de luz. Essa espécie apresenta a maior dispersão geográfica nas Américas do Sul e
Central, habitando regiões distintas e, mesmo formando colônias pequenas, já foi referida em
abrigos de porcos no Marajó, Pará (VALENTE et al., 1998a) e encontrado de ninfas na
estrada Barcelos–Caurés periferia de Barcelos (comunicação pessoal) em assentamentos
agrícolas e um variado elenco de ecótopos naturais, ora vivendo em buracos no chão com
tatus, ora em palmeiras e também invadindo e colonizando o peridomicílio (RYCKMAN,
1986; GAUNT & MILES, 2000; CARRASCO et al., 2005). Nas regiões trabalhadas não
coletamos nenhum exemplar de R. brethesi, espécie de importância em Barcelos no estado do
Amazonas que se abriga em palmeiras de piaçava e ataca os trabalhadores que exploram a
fibra dessa palmeira (COURA et al., 1994, 1995, 2002a; MASCARENHAS et al., 1991).
Outra fonte de captura foram as armadilhas luminosas colocadas próximo das
residências, sendo o rendimento dessa metodologia muito comprometido pelo seu furto.
Todavia serviu como um parâmetro importante para verificar que insetos adultos infectados,
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
principalmente no verão, voam para dentro das casas atraídos pela luz e famintos à procura de
fonte alimentar. Eles podem contribuir para ocorrência de casos isolados ou cair em utensílios
domésticos e contaminar alimentos, originando surtos descritos na região, (PINTO et al.,
2004; VALENTE et al., 1999b, 2006).
Com a divulgação dos trabalhos e instalação de postos de informações de
triatomíneos nas localidades, 98 exemplares de 4 espécies de triatomíneos foram entregues
e/ou coletados pelos moradores em sítios diferentes das palmeiras e armadilhas de luz,
indicando a eficiência do trabalho de vigilância epidemiológica comunitária.
Em todos os métodos de coleta, a taxa de infecção por tripanossomas no conteúdo
intestinal desses triatomíneos foi elevada e em conformidade com os trabalhos já referidos na
região (LAINSON et al., 1979; MILES 1981a,b, 1983; COURA et al., 2002a), corroborando
para a presença do ciclo do T. cruzi como importante fonte primária de infecção para a
ocorrência de casos agudos na região, independente da maneira de transmissão.
A coleta considerável de triatomíneos às proximidades dos domicílios, a elevada taxa
de infecção por T. cruzi nos incentivam a especular sobre a sua importância que, mesmo sem
domiciliação, participariam da transmissão da doença por meio dos surtos que vêm crescendo
na região. Para essa forma de apresentação da transmissão da doença, parece caber a oportuna
introdução de novas propostas, linhas de trabalho e metodologias de pesquisas no tocante à
dinâmica populacional, estudo de dispersão, epidemiologia e balanço ecológico dos vetores
silvestres, à luz da nova situação ecológica em que se encontra a Amazônia Brasileira.
O plano de trabalho para a doença de Chagas na Amazônia recomendou em
encontros recentes (ROJAS et al., 2005) que seja realizada uma atualização na lista de
mamíferos passíveis de infecção pelo T. cruzi. É proposta a adoção de estudos
multidisciplinares e de parcerias com grupos que atuem em sistemática e ecologia de
mamíferos utilizando metodologias básicas de exames parasitológicos e/ou moleculares,
quando possíveis, com atenção especial para marsupiais e roedores pelas suas características
sinantrópicas e ambivalentes.
18.5. A VARIABILIDADE E A DIVERSIDADE GENÉTICA DO T. CRUZI
A população de T. cruzi é extremamente heterogênea e formada por um grandes
número de cepas oriundas do ciclo enzoótico (milhares de reservatórios mamíferos e de uma
centena de triatomíneos) e do ciclo domiciliar que inclui o homem. Quando analisadas à luz
de diferentes marcadores, essas cepas apresentaram perfis distintos e apontam para a presença
de uma população com características biológicas, virulência, imunológicas, bioquímicas,
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
farmacológicas, formas clínicas e distribuição epidemiológica muito distinta (BRENER &
GAZZINELLI, 1997; FERNANDES et al., 1998; MILES et al., 2003).
MILES et al., (1977, 1981a,b, 1983) identificaram três padrões isoenzimáticos de T.
cruzi que foram agrupados como zimodemas: Z1, Z2 e Z3. O Z2 estava ligado ao ciclo
domiciliar infectando animais domésticos, à doença de Chagas aguda e à cardiopatia
chagásica crônica, enquanto Z1 e Z3 relacionavam-se ao ciclo silvestre. Os mesmos autores
observaram que eventualmente Z1 e Z3 também poderiam infectar homem no Estado do Pará,
mas nenhum isolado do tipo Z2 humano autóctone foi descrito na região Norte.
STEINDEL et al., (1995) caracterizaram isolados de triatomíneos e animais
silvestres cuja maioria, 92%, apresentou perfil de Z1 próprio do ciclo silvestre do T. cruzi,
mas um pequeno número de isolados apresentaram perfis duplos de Z1+Z2. Embora o estado
de Santa Catarina tenha ocorrência muito rara de doença de Chagas, o tipo Z2 representaria
uma oportunidade de domiciliação, ainda que remota.
Mais tarde, utilizando os marcadores de mini-exon, gene ribossômico e RAPD,
SOUTO et al., (1996), FERNANDES et al., (1998) e ZINGALES et al., (1998) ratificaram os
achados isoenzimáticos; num encontro (RECOMENDAÇÕES, 1999), aprovou-se uma nova
denominação para dois grupos principais de T. cruzi: Z1 seria Tc I e Z2 seria Tc II. Mantevese a denominação de Z3.
Utilizando o gene de mini-exon, pela primeira vez foi analisado o perfil genotípico
de um número considerável de isolados relacionados à transmissão de surtos de doença de
Chagas ocorridos em cinco surtos do Pará e um do Amapá envolvendo o trinômio
humanos/mamíferos silvestres/triatomíneos silvestres. Os resultados da tipagem revelaram
entre os 48 isolados de origem humana, 42 tiveram o perfil de Tc I e 6 como perfil de Z3 de T.
cruzi. Apenas nos municípios de Ananindeua, no Pará, e no município de Mazagão, no
Amapá, foram encontrados ambos os genótipos Tc I e Z3 num mesmo surto. Os isolados dos
mamíferos silvestres (14 D. marsupialis, 1 P. opossum e 1 de M. cinerea) revelaram que
todos exibiam o perfil de Tc I. Para os 33 isolados de triatomíneos silvestres, 31 foram
caracterizados como Tc I (24 amostras obtidas de R. pictipes, 6 de R. robustus e 3 de P.
geniculatus) e 2 apresentaram superposição de perfis de Tc I e T. rangeli.
Tentativas da utilização dos marcadores para fornecer subsídios e uma melhor
compreensão de epidemiologia foram propostas por Miles et al., (1977) em três áreas
geográficas distintas de transmissão da doença de Chagas. Foram caracterizadas mais de 300
amostras de T. cruzi oriundas da Venezuela, região de não-ocorrência de formas clínicas de
mega-síndromes; da região Amazônica onde a ocorrência da doença de Chagas é ocasional e
do Centro Oeste e Sudeste do Brasil, reconhecidas áreas endêmicas com predominância de
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
manifestações clínicas das mega-síndromes. Pelos resultados obtidos, observou-se que na
Venezuela e na Amazônia Brasileira os zimodemas predominantes foram o Z1 e Z3, como
observamos em nossos resultados, enquanto nas regiões Centro Oeste e Sudeste do Brasil o
zimodema predominante foi o Z2 associado diretamente com as formas clínicas variadas e
exibidas no curso da doença de Chagas, ainda não presentes na Amazônia Brasileira.
A variabilidade apresentada nos nossos estudos, caracterizando-se os isolados pelo
gene de mini-exon, mostrou claramente a presença, como esperada, de dois genótipos de T.
cruzi: Tc I e Z3 e T. rangeli.
Entre os surtos estudadas, a do Mazagão envolveu 17 pessoas de três das quatro
famílias que habitavam uma comunidade bastante fechada e reclusa no Rio Bispo composta
por 26 pessoas. Foi possível caracterizar genótipos de T. cruzi isolados de oito pacientes e de
cinco triatomíneos. O emprego do gene de mini-exon (FERNANDES et al.,, 1998) revelou
que as infecções nos pacientes se deu pelos genótipos T. cruzi Z3 em duas famílias e
genótipos mistos de Z3 e Tc I na terceira família. Entre os triatomíneos, os isolados foram
identificados como Tc I, Z3 e amostras mistas de Z3 com T. rangeli. O encontro de infecções
mistas nesse tipo de transmissão foi observado por STEINDEL et al., (2008) na
microepidemia de Santa Catarina. Quando isolados de T. cruzi do homem, apresentaram perfil
típico de Tc II, enquanto os isolados de animais silvestres apresentaram perfis de Tc I e dos
triatomíneos perfis mistos de Tc I e Tc II.
No surto de Ananindeua, município da área metropolitana de Belém, em uma das
comunidades onde ocorreu o surto com uma população de mais de três mil pessoas, foram
detectados entre os isolados de humanos genótipos de Tc I e Z3. Nos demais surtos em
Abaetetuba, Barcarena, Belém e Bragança o mini-exon não revelou variabilidade.
A variabilidade e a associação entre genótipos como Z1 e Z3 no ciclo silvestre de
isolados de humanos e mamíferos e/ou triatomíneos silvestres que verificamos nos surtos do
Pará e Amapá já foram referidas também por vários autores na América do Sul. Na Guiana
Francesa e Chile, DEDET et al., (1985) e APT et al., (1987) encontraram Z1 no ambiente
silvestre. Na Colômbia WIDMER et al., (1985) referiram somente Z1 tanto no ciclo silvestre,
como no homem. Os autores deduziram que o ciclo domiciliar não era exclusivo com cepas
caracterizadas como Z2 fora das regiões endêmicas. Análise de isolados de T. cruzi na
Colômbia, entre hospedeiros em bases eco-geográficas distintas, foram tipados como Z1 que
circulava, tanto no ciclo domiciliar, quanto no ciclo silvestre, por outro lado Z3 era exclusivo
de T. cruzi do ciclo silvestre SARAVIA et al., (1987). Resultados semelhantes foram
observados na Argentina por MONTAMAT et al., (1992) que interpretaram não haver uma
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
correlação fechada para perfis isoenzimáticos em áreas onde os ciclos silvestres e domésticos
se sobrepunham com transmissão ativa.
Ainda estudando um grupo de 14 isolados colombianos de diferentes procedências,
CUERVO et al., (2002), utilizando um PCR multiplex com gene de mini-exon como alvo
(FERNANDES et al., 2001), observaram que um grupo de 10 amostras apresentavam perfil
de T. cruzi I, duas com perfil de Z3 e duas como T. rangeli. Essas mesmas amostras, quando
submetidas a outros marcadores relacionados ao gene ribossômico (CUPOLILLO et al., 1995,
FERNANDES et al., 1999a) apontaram que os isolados identificados pelo mini-exon como
um único grupo de TCI derivavam para dois subgrupos, enquanto Z3 permanecia como um
grupo separado e T. rangeli permanecia inalterado. A caracterização de populações de T. cruzi
de pacientes do surto de DCA em Santa Catarina mostrou que os 9 isolados de humanos
apresentaram perfil Tc II, enquanto as duas amostras isoladas de T. tibiamaculata
apresentaram perfil misto Tc I e Tc II e duas amostras isoladas de didelfídeos foram Tc I
(STEINDEL et al., 2008).
É possível que haja um relacionamento entre origem geográfica de isolados de T. cruzi
e seus hospedeiros, como o Z3 oriundo da mesma região de floresta tropical, (Tumaco,
Colômbia Sudoeste), porém de hospedeiros mamíferos distintos. Esse achado indica a
existência de ciclos independentes envolvendo hospedeiros específicos dentro do mesmo
ecótopo (FERNANDES et al., 1999b) e pode justificar a presença de genótipos diferentes
entre os isolados de humano no surto de Ananindeua, no Pará, e entre humanos e triatomíneos
silvestres no surto de Mazagão, no Amapá.
A heterogeneidade dos isolados de T. cruzi que observamos em nossos estudos
provavelmente relaciona-se também à sua biogeografia e à capacidade dos hospedeiros
(vertebrados e triatomíneos) em selecionar cepas ou clones que podem predominar dentro de
um ciclo ou de vários subciclos silvestres, substituindo populações originais por outras com
perfis distintos (D'ALESSANDRO et al., 1984, Travi et al., 1994), porém circulando somente
no ambiente silvestre.
18.6. ESTUDO DA VARIABILIDADE DE ISOLADOS DE SURTOS DO PARÁ E
AMAPÁ
PELO
MARCADOR
DE
RAPD
(RANDOM
AMPLIFICATION
OF
POLYMORPHIC DNA)
DNA amplificado com iniciadores de seqüências aleatórias (RAPD) permitiu
identificar o polimorfismo existente entre isolados. Quando observamos a variabilidade dos
isolados analisados pelo gene de mini-exon, foi possível visualizar genótipos distintos entre
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
isolados humanos de Ananindeua, no Pará (Tc1 e Z3) em Mazagão, no Amapá, entre isolados
de humanos (Tc1 e Z3) e entre triatomíneos (Tc1 e T. rangeli). Entretanto, nos demais surtos,
todos os isolados foram tipados como Tc1. Esses isolados foram então analisados pelo RAPD,
gerando perfis complexos que poderiam ser usados para tirar conclusões de proximidade
genética.
A análise da relação de similaridade dos clones circulantes em cinco surtos de
doença de Chagas aguda (Abaetetuba, Ananindeua, Barcarena, Belém e Bragança) por RAPD,
representados por isolados de humanos, mamíferos e triatomíneos gerou bandas com
tamanhos variando entre 300pb e 2.5Kb. Dentre os seis primers usados, o RAPD-1 e RAPD-5
detectaram acentuado grau de polimorfismo entre os isolados caracterizados inicialmente
como Tc I pelo mini-exon.
A estrutura genômica de isolados de T. cruzi, quando analisada por RAPD, mostrou
níveis altos de semelhança entre linhagens do mesmo zimodema como o Z1, sugerindo que
este parece ser um grupo geneticamente bem definido. Porém o polimorfismo genético
encontrado por perfis de RAPD é pouco reprodutível, podendo ser utilizado para identificação
intragrupo (TIBAYRENC et al., 1993; STEINDEL et al., 1993). A variabilidade exibida pelos
isolados entre os surtos no Pará não dependeu da sua origem genotípica (TC I ou Z3). Além
da discriminação dos isolados pela presença ou ausência de bandas, observou-se também
diferenças na intensidade dos fragmentos, sem dependência da quantidade de DNA, molde
adicionado à reação.
A análise fenética do padrão de RAPD por surto revela que os isolados provenientes
de humano, mamífero e inseto são heterogêneos e rapidamente diferenciáveis entre eles pela
observação do perfil de amplificação aleatória. Na análise fenética, as bandas com o mesmo
peso molecular nos diferentes isolados, foram consideradas como sendo o mesmo caractere de
amplificação.
As análises dos fenogramas por surtos gerados a partir das matrizes de similaridade e
obtidos com o coeficiente de Jaccard mostraram que os três isolados apresentam valores de
similaridade ao redor de 0,35 e que não é uma relação clara entre os isolados circulantes em
cada surto. Em adição, a análise fenética por primer demonstrou uma extensa variabilidade
entre os isolados que circulam nos diferentes surtos. Essa heterogeneidade tampouco mostrou
relação com o genótipo dos parasitos.
O extenso conhecimento que se tem do parasita foram obtidos da caracterização de
isolados procedentes das áreas tradicionalmente endêmicas. Analisar um maior número de
cepas amazônicas (Tc1 e Z3) poderia fornecer informações que talvez permitisse entender seu
comportamento nos numerosos surtos de doença de Chagas que vêm ocorrendo na região, que
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
se espressam clinicamente desde casos oligo e poli sintomático até quadros brandos a severos
de DCA (PINTO et al., 2004). Um minucioso estudo da diversidade genética, utilizando os
atuais marcadores moleculares disponíveis, com as amostras de T. cruzi que tivemos
oportunidade de analisar reforça a tese de como são complexos os intrincados aspectos
epidemiológicos que afetam o homem quando ele perturba o ciclo enzoótico do T. cruzi.
Uma preocupação adicional que cerca a doença seria a introdução do genótipo Tc II,
ainda não referido na Amazônia. A reprodução de espécies ameaçadas de extinção em
cativeiro e depois reintrodução no seu ambiente original poderiam mudar de maneira
significativa os ciclos epidemiológicos da doença de Chagas, transportando geograficamente
ciclos de um lugar para o outro com implicações na transmissão da doença. Esse fato foi
observado quando 198 primatas, entre animais introduzidos no Centro de Primatologia do Rio
de Janeiro, e de outros ali nascidos, apresentaram testes sorológicos positivos para antocorpos
anti-T. cruzi. Detectou-se também que 4 amostras de micos-leão-dourado (Leontopithecus)
apresentaram genótipos ompatíveis com o T. cruzi II, (LISBOA et al., 2004).
A sensível melhora das notificações, a casuística dos surtos no Pará, Amapá e
Amazonas nos 5 últimos anos proporcionou a detecção em torno de 60 casos agudos por ano.
Não obstante, a rota epidemiológica daqueles surtos sugerirem a ingestão de alimentos
contaminados com formas de T. cruzi, sendo o suco de açaí o principal suspeito, em nenhum
dos surtos até então investigados, foi possível a demonstração direta do flagelado no suco
ingerido. É provável que a ingestão ocorrera em período bem anterior às investigações.
Entretanto, estudos de caso-controle feitos pela SVS/IEC em Abaetetuba, Cachoeira do Arari
e Barcarena e pela SVS e Secretaria de Saúde do Amazonas em Coari, concluem pelo
envolvimento do açaí na transmissão desses surtos, dados discutidos em 2007 em Reunião de
Especialistas em Uberaba, quando se considerou que esse tipo de contaminação na Amazônia
guarda uma relação muito semelhante com os episódios envolvendo o caldo de cana na
transmissão do surto no Estado de Santa Catarina (STEINDEL et al., 2008).
Nos surtos que apresentamos foi caracterizada a autoctonia de todos os pacientes
envolvidos, porque nenhum deles ausentara-se do estado para regiões endêmicas nem tinham
sido submetidos a transfusões de sangue nos últimos 2 anos.
Nenhuns dos pacientes que acompanhamos apresentavam porta de entrada. Os casos
foram caracterizados como agudos, apoiados nos exames parasitológicos e marcadores de
IgM positivos na maioria dos casos, além de sintomatologia típica de fase aguda. No
seguimento pelo tempo mínimo de 2 anos de evolução do tratamento, foi de bom prognóstico
com reversão parasitológica e recuo dos títulos sorológicos, mas sem assegurar que os
pacientes estejam realmente curados.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Discussão
Nos estudos com mamíferos concluiumos que esses participam ativamente na
manutenção do ciclo epizoótico do T. cruzi. Quanto à participação dos triatomíneos, as
pesquisas entomológicas realizadas nas áreas de ocorrência dos surtos não se detectou
colonização de triatomíneos de nenhuma espécie nos domicílios dos pacientes, mas registrou
a presença constante em ciclos silvestres e em ecótopos muito próximo do domicílio humano.
A variabilidade dos genótipos indica heterogeneidade tanto entre os principais grupos
identificados pelo gene de mini-exon (Tc1, Z3 e T. rangeli), como dentro dos grupos
visualizadas pelo RAPD.
Os surtos estudados têm uma característica comum, e o melhor investigado, o de
Mazagão, teve diagnóstico, tratamento dos pacientes e investigação epidemiológica rápidas. O
isolamento e modo de vida dos pacientes facilitaram a formulação da hipótese de transmissão
pela via oral, baseando-se nas argumentações: i) ausência de vetores colonizando os
domicílios, mas presentes nas cercanias e diariamente coletados quando se utilizaram
armadilhas luminosas; ii) os casos ocorrendo de forma simultânea e coletiva com as famílias
partilhando de um alimento não-cozido comum, o açaí, que preparado em condições precárias
de higiene nos induz a associá-lo com a transmissão; iii) os resultados obtidos nos estudos
parasitológicos e sorológicos, na captura de animais e no levantamento triatomínico e a
genotipagem dos isolados ajudaram na sustentação da hipótese.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Conclusões
19. CONCLUSÕES
Os estudos sistemáticos dos surtos de doença de Chagas aguda na região Amazônica
nos levaram às seguintes conclusões:
•
Os pacientes detectados nos surtos foram todos parasitologicamente positivos em pelo
menos um dos testes aplicados.
•
Exames de concentração em capilares como o QBC®, apresentaram maior positividade
para a pesquisa de tripanossomas do que a gota espessa e xenodiagnóstico.
•
A sorologia foi difícil de ser interpretada, pois entre os 121 casos parasitologicamente
positivos 16 pacientes apresentaram sorologia negativa e a positividade de IgM não foi
um bom marcador de doença de Chagas aguda. É possível que com a precocidade do
diagnóstico não tenha havido tempo suficiente para a formação de anticorpos
específicos. A impossibilidade de se ter um antígeno obtido a partir de cepas regionais
também pode ter contribuído para a ocorrência desse fenômeno.
•
A discordância entre a IFI e a hemaglutinação foi pequena, mas ocorreram em 3 casos
dos 121 estudados.
•
Depois de tratados os pacientes apresentaram desaparecimento da parasitemia patente.
•
A evolução para cura foi observada por diminuição dos títulos da sorologia com
perspectiva de efetiva negativação após sete anos nos pacientes do surto de Mazagão.
Nos demais surtos uma avaliação, por tempo mais prolongado, se faz necessária.
•
Mamíferos silvestres infectados estavam presentes em todos os sítios mantendo a
enzootia. O principal mamífero foi D. marsupialis com 69,33% (52/75) de infecção
para T. cruzi.
•
Triatomíneos infectados estavam presentes em todos os focos e as espécie como R.
pictipes, R. pictipes e P. geniculatus foram encontrados em sítios muito próximos do
domicílio humanos e podem ser incriminados na transmissão.
•
Um dos surtos observado em Mazagão (AP) teve um importante agrupamento familiar
todos febris com suspeita inicial de malária e com pesquisa de plasmódio negativa
depois foram confirmados como positivos para doença de Chagas.
•
Nesse surto do Amapá foi proposta a hipótese de transmissão por um meio de
contaminação comum como a via oral e o suco de açaí foi o único alimento
encontrado associado a este grupo.
•
A tipagem de mini-exon mostrou a existência de TC I e TC Z3. T. rangeli também foi
evidenciado na região.
•
A tipagem de RAPD gerou uma diversidade tão grande que não foi possível chegar a
qualquer conclusão exceto a diversidade existente.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
21. ANEXOS
Anexo 1. Submissão do Projeto de estudos ao Comitê de Ética em Pesquisas do Instituto
Evandro Chagas
__________________________________________________________________________________________
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 2. Ficha Epidemiológica Aplicada nos estudos com a população humana
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 3. Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
Protocolo de Pesquisa:
ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DAS AMOSTRAS DE TRYPANOSOMA CRUZI
ISOLADOS NOS SURTOS DE DOENÇA DE CHAGAS OCORRIDAS NO PARÁ E AMAPA
Você está sendo convidado(a) a participar do projeto de pesquisa acima citado. O documento abaixo
contém todas as informações necessárias sobre a pesquisa que estamos fazendo. Sua colaboração
neste estudo será de muita importância para nós, mas se desistir a qualquer momento, isso não
causará nenhum prejuízo a você.
Eu, (nome e profissão) ............................................................................................................ residente e
domiciliado
na
.....................................................................................................................................................,
RG
.................................................. , e inscrito no CPF/MF ........................................................ nascido(a)
em _____ / _____ /_______ , abaixo assinado(a), concordo de livre e espontânea vontade em
participar como voluntário(a) do projeto ESTUDO DA DIVERSIDADE GENÉTICA DAS
AMOSTRAS DE TRYPANOSOMA CRUZI ISOLADOS NOS SURTOS DE DOENÇA DE
CHAGAS OCORRIDAS NO PARÁ E AMAPA
Declaro que obtive todas as informações necessárias, bem como todos os eventuais esclarecimentos
quanto às dúvidas por mim apresentadas.
4.1. Objetivo geral
Estudar os surtos de doença de Chagas ocorridas no Pará e Amapá entre 1992 e 2002 através de
ferramentas epidemiológicas, imunoparasitológicas e moleculares;
4.2. Objetivos específicos
•
•
•
•
•
Definir as histórias epidemiológicas dos surtos de doença de Chagas ocorridas no Pará e
Amapá no período proposto com a perspectiva de se buscar fatores de risco de transmissão, a
partir do estudo de casos índices;
Avaliar a soro-prevalência dos contatos intradomiciliares dos casos índices e dos vizinhos da
comunidade;
Estudar a fauna triatomínea presente nas comunidades aonde ocorreram os surtos;
Identificar potenciais reservatórios do T. cruzi através de capturas por armadilhas e isolamento
dos parasitos a partir de hemoculturas e/ou xenodiagnóstico;
Estudar a diversidade genética (Tipagem pelo gene de mini-exon e por RAPD) do parasito
circulante nos diversos surtos, isolado a partir de casos humanos e triatomíneos e reservatórios
infectados com tripanossomas, avaliar sua associação, interdependência e extensão de
diversidade entre os isolados e verificar se há alguma predominância entre cepas oriundas do
ciclo silvestre envolvidas nos surtos;
Você está sendo convidado a participar deste estudo, pois faz parte de comunidades onde
ocorreu ou tem indicadores epidemiológicos que possibilitam a ocorrência de casos agudos de doença
__________________________________________________________________________________________
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
de Chagas. Você está doando uma alíquota de seu sangue para que possamos realizar os testes de
diagnósticos adequados como os exames parasitológicos e sorológicos.
Estou ciente que:
I)
O estudo se faz necessário para que se desenvolvam diagnósticos precoces para a doença
de Chagas de fase aguda.
II)
Essa coleta de sangue será feita exclusivamente para este estudo e em nada influenciará a
minha saúde; não vai me causar nenhum problema, exceto o pequeno incômodo no
momento da coleta para a coleta de sangue (introdução da agulha para retirada do
sangue). Os riscos da retirada de sangue são eventualmente um pequeno hematoma local
(rouxidão), algum desconforto e, raramente, tontura. Todo o material utilizado é estéril,
atóxico e descartável.
III)
Serão coletados 10 ml de sangue. Posso ser reconvocado para novas doações, caso
necessário. Nos casos positivos o material será guardado na soroteca do Instituto
Evandro Chagas para futuros estudos.
IV)
Quando detectado um caso agudo de doença de Chagas receberei todo o tratamento
específico e acompanhamento da doença gratuitamente.
V)
Tenho a liberdade de desistir ou de interromper a colaboração neste estudo no momento
em que desejar, sem necessidade de qualquer explicação.
VI)
A desistência não causará nenhum prejuízo à minha saúde ou bem estar físico.
VII) Os resultados obtidos durante este trabalho serão mantidos em sigilo, mas concordo que
sejam divulgados em publicações científicas, desde que meus dados pessoais não sejam
mencionados.
VIII) Caso eu desejar, poderei pessoalmente tomar conhecimento dos resultados, ao final desta
pesquisa
( ) Desejo conhecer os resultados desta pesquisa.
( ) Não desejo conhecer os resultados desta pesquisa.
Este estudo visa um maior conhecimento sobre a doença de Chagas na região visando elaborar
estratégias mais eficientes de controle. É provável que o voluntário em questão não seja
beneficiário direto destes avanços.
_________________________________________________________________________________
Este projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética do Instituto Evandro Chagas na
Coordenação do Dr. Manoel do Carmo Pereira Soares, Instituto Evandro Chagas. Rodovia BR 316,
Km7 s/n. Bairro Levilândia, Ananindeua, PA. CEP 67.030-070. Fone 91-3214-22237.
Quaisquer dúvidas, que possam ocorrer com relação a esse estudo, poderão ser contatados:
Dr. Sebastião Aldo da Silva Valente – Laboratório de Doença de Chagas – Instituto Evandro Chagas.
Rodovia BR 316, Km7 s/n. Bairro Levilândia, Ananindeua, PA. CEP 67.030-070. Fone 91-3214-2107.
Belém, ____ de _____________ de 200__.
( ) Voluntário ...................................................................................................
Testemunha 1 : _______________________________________________
Nome / RG / Telefone
Testemunha 2 : ______________________________________________
Nome / RG / Telefone
Coordenador: ________________________________________
Impressão digital
__________________________________________________________________________________________
115
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 4. Meios de Cultura
Meio Bifásico de Hoff´s
O meio ágar-sangue bifásico será usado no isolamento primário e cultivo de estoques,
apresentando a seguinte composição:
Difco bacto ágar-sangue base
14g.
BBL tripticase peptona
5g.
Oxoid L 28 ágar purificado
3g.
Cloreto de sódio (ANALAR)
6g.
Água destilada
1.000 ml.
Sangue inativado de coelho
0,5 ml por tubo.
Durante os trabalhos de campo serão utilizados tubos de sistema a vácuo (BDH), a inoculação
sendo feita através da tampa, conforme preconizado por MILES et al., (1993).
Meio monofásico – RPMI 1640 (GIBCO)
Este meio requer os seguintes componentes: RPMI 1640 (Gibco, BRL, Paisley,
Scotland) suplementado com 0,5% (w/v) tripticase (BBL), 0,5% (w/v) HEPES, 0,03M hemin,
10% (v/v) SBF inativado, 2 mM de glutamato de sódio, 2 mM de piruvato de sódio e
antibióticos. Preparadas como segue: solução de tripticase estéril concentrada 100X (0,175
g/ml autoclavada), HEPES (1M, esterilizada a filtro) e HEMIN (2,5 mg/ml em 0,01M NaOH,
autoclavado). Adicionar 2,8 ml de tripticase, 2 ml de HEPES e 0,8 ml para cada 100 ml de
solução estoque de RPMI 1640, junto com 10 ml de SBF, 1 ml de 200 mM de glutamato de
sódio, 200 mM de piruvato de sódio (com penicilina, estreptomicina, concentração final 250
UI/ml e 250 μg/ml, respectivamente). As soluções de glutamina, piruvato e antibióticos é
esterilizada em filtro, antes da adição. Para acondicionar os meios, são utilizados frascos
plásticos de 50 ml, descartáveis (Falcon, USA). A adição de 5-fluorocytosine (100 μg/ml) e
gentamicina (100 μg/ml) é utilizada para evitar o crescimento de fungos e bactérias.
MEIO DE L.I.T
MEIO I
Infusão de fígado (Difco)
Triptose
Água destilada
MEIO II
NaCl
KCl
Na2 HP04 anidro
Glicose
Água destilada
MEIO III
Solução de hemoglobina
Soro bovino fetali
Solução antibiótica
6,0 g
10,0 g
700 ml
8,0 g
0,8 g
13,0 g
2,0 ml
700 ml
40 ml
100 a 200 ml
10 ml
SOLUÇÃO ANTIBIÓTICA
Penicilina cristalina 500.000 1 frasco; Estreptomicina 1g 1frasco; Água estéril 10 ml
Misturar os 3 meios, completar para 2.200 ml com água destilada. Esterilizar por filtração em
Seitz.
SOLUÇÃO DE HEMOGLOBINA
Lavar hemácias de boi 3 vezes com salina. Lisar 1 volume de papa com 9 volumes de água
destilada. Congelar durante uma noite. Descongelar a 37°C.
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116
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 5. Técnica de Hemaglutinação Indireta
Este método utiliza hemácias de aves estabilizadas e sensibilizadas com antígenos totais de
Trypanosoma cruzi (antígenos solúveis), que são aglutinadas quando colocadas em contato
com diluições de soros de pacientes chagásicos.
Amostra: Soro obtido a partir de punção venosa ou de coleta digital em tubos capilares. Não
utilizar plasma, nem amostras contaminadas, turvas ou hemolisadas.
Procedimentos
A - Teste Qualitativo - Para triagem de amostras:
Usar uma cavidade por amostra, incluindo os controles positivo e negativo, a cada série de
testes.
1) Em tubos de ensaio, diluir a 1/40 as amostras a ensaiar e os soros controle (R3 e R4) em
diluente de soros R2A; Ex.: 10 μl da amostra + 0,4ml de R2A;
2) Transferir 50 μl da diluição de cada amostra e dos soros controle R3 e R4 para as cavidades
respectivas da microplaca;
3) Homogeneizar bem a suspensão de hemácias (R1), por agitação delicada do frasco, e
adicionar 25 μl a cada cavidade;
4) Para perfeita homogeneização, imprimir à placa vibração mecânica, batendo com os dedos
nas bordas, seguidamente por 3 a 4 minutos. Deixá-la em repouso por 1 hora, à temperatura
ambiente (cerca de 250C, em local isento de vibrações);
5) Leitura - efetuada ao final da incubação.
Interpretação
REAÇÃO POSITIVA: Véu uniforme de hemácias recobrindo toda a cavidade, podendo estar,
às vezes, parcialmente retraído nas bordas.
REAÇÃO FRACAMENTE POSITIVA: Véu pouco nítido, apresentando pequeno depósito de
hemácias no fundo da cavidade.
REAÇÃO NEGATIVA: Botão compacto de hemácias no fundo da cavidade.
Obs.: O título do soro positivo (R3) deverá ser confirmado por ensaio quantitativo, conforme
descrito no esquema geral do teste quantitativo.
Em algumas populações, com certa freqüência os soros apresentam aglutininas naturais da
classe IgM que podem causar aglutinação inespecífica. A adição de 2-mercaptoetanol (2ME)
às diluições de soros aqui indicadas, inativa anticorpos IgM e afasta essa interferência.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 6. Técnica de Imunofluorescência Indireta para doença de Chagas
Procedimento:
1. Separar as lâminas já fixadas com antígeno de T. cruzi, secar em estufa a 37oC, por 5
minutos, dentro de uma câmara úmida. Marcar as amostras com os números dos soros
respectivos, em cada fileira de orifícios da lâmina.
2. Preparo das diluições em PBS: no primeiro orifício da placa colocar 200 μl de PBS; nos
demais, 100 μl. Retirar do primeiro orifício 20 μl de PBS e desprezar. Em seguida, colocar 20
μl do soro a ser testado no primeiro orifício e agitar bem, usando a micropipeta.
3. Retirar 100 μl da primeira diluição e colocar no orifício seguinte, agitar e retirar 100 μl e
assim proceder, sucessivamente, nos orifícios restantes. Deixar os 100 μl no último orifício.
4. Colocar 20 μl de PBS nas lâminas onde está fixado o antígeno e deixar em repouso durante
5 minutos à temperatura ambiente. Retirar o PBS com a pipeta e substituir pelas diluições nos
orifícios. Geralmente se usam as seguintes diluições: 1:10, 1:20, 1:40, 1:80, 1:160, 1:320,
1:640 e 1:1280. Em seguida, levar as lâminas úmidas à estufa a 37oC, onde devem
permanecer por 30 minutos.
5. Retirá-las, em seguida, lavá-las com jatos suaves de PBS e imergi-las nesse mesmo tampão
por 10 minutos. Retirar e lavar com jatos suaves de água destilada, e imergi-las em água
destilada, por mais cinco minutos.
6. Retirar as lâminas da água destilada, secá-las e colocar 10 μl do conjugado preparado com
anti-IgG ou anti-IgM e Azul de Evans. Levar em câmara úmida para estufa a 37oC, durante 30
minutos.
7. Retirar as lâminas da estufa, lavar com jatos de PBS e imergi-las em PBS por 10 minutos.
Secar as lâminas, montar com glicerina e observar em microscópio apropriado para
imunofluorescência.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 7. Artigo submetido e aceito para publicação
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Analysis of an acute Chagas disease outbreak in the Brazilian Amazon: human
cases, triatomines, reservoir mammals and parasites
Sebastião Aldo da Silva Valente1 Vera da Costa Valente 1, Ana Yecê das Neves Pinto1, Mª de
Jesus Barbosa César,2 Marivaldo Picanço dos Santos 2, Clóvis Omar Sá Miranda2 Patrícia
Cuervo3, Octavio Fernandes3
Summary
A outbreak of acute Chagas disease was observed in Mazagão, Amapá, Brazilian
Amazon in 1997. Among the 26 inhabitants, 17 presented prolonged fever and
general symptoms compatible with acute Chagas disease (65.3% - 17/26). All of
them were submitted to parasitological (direct search of parasites, haemoculture and
xenodiagnosis) and serological tests (indirect haemagglutination and indirect
immunofluorescence). All of the 17 symptomatic patients were positive in, at least,
one parasitological test (100% - 17/17) and 11 (64.7% - 11/17) were IgM or IgG antiT. cruzi positive. All the asymptomatic patients were negative in the parasitological
tests (100% - 9/9) and only one presented IgG anti-T. cruzi antibodies in low titers
(1/40) (11.1% - 1/9). None of them were IgM anti-T. cruzi positive (0% - 9/9). Sixty
eight triatomine bugs were captured in the vicinity of the dwellings (66 Rhodnius
pictipes and 2 Panstrongylus geniculatus). Forty five insects were infected with T.
cruzi (43 R. pictipes and 2 P. geniculatus – 66.1% - 45/68). Thirteen trypanosomatid
strains were isolated: 8 from humans and 5 from R. pictipes. Four were genotyped as
T. cruzi I (two from humans and two from R. pictipes) and 7 as T. cruzi Z3. (6 from
humans and one from R. pictipes). Two protozoan stocks from R. pictipes were
composed of two different parasite species: T. cruzi Z3 and T. rangeli. The
appropriate treatment was established for all 17 patients and a drastic decrease in
the parasitemia was observed in 16 of them (94.1% - 16/17) during the follow-up
period (six months, one year, 5 and 7 years). The serological tests were negative in
all the 17 patients 7 years post treatment. This outbreak revealed the overlap of
different genotypes in the same ecotope, raises the possibility of transmission
1
SVS – Instituto Evandro Chagas, Belém, PA. 2Secretaria de Saúde do Estado do Amapá, Macapá, AP.
Instituto Oswaldo Cruz, Fiocruz, Rio de Janeiro, Brasil.
Endereço para correspondência: Rodovia BR 316, KM 7, S/Nº, CP 50, CEP 67.030-070 Ananindeua, Pará,
Brasil. Telefones (005591)3214-2106 e 3214-2107. Email: [email protected]
3
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
mediated by the oral route and shows the need for early therapeutic intervention for
better patient management of acute Chagas disease in the Brazilian Amazon.
Keywords: acute Chagas disease, outbreak, oral transmission, Amazon, T. cruzi.
Introduction
Since the success achieved in vector control the number of acute cases of
Chagas disease has declined and morbidity is primarily due to the chronic infection.
However, simultaneous outbreaks of acute Chagas disease (ACD) have been
reported in different regions of Latin America, probably following transmission by
alternative routes1.
The first such recorded Brazilian outbreak of ACD occurred in Teutônia,
southern Brazil, in the sixties, affecting simultaneously 17 patients of the same
family, of whom 5 died.2,3 The transmission was attributed to contaminated food
offered in a local school. New ACD episodes were also described in other regions
such as in Catolé do Rocha, northeastern Brazil, where 26 individuals were infected
as shown by positive parasitological and serological tests. The ingestion of sugar
cane juice was proposed as the transmission route.4 In 2005, 8 cases of ACD were
identified in Santa Catarina, southern Brazil. Three of them died and again, sugar
cane juice was incriminated as the infection source.5
In the Amazon region, the first ACD cases were registered in the forties in
French Guyana,6 while in the Brazil the first records were in the sixties, occurring in
Pará state. In this outbreak 4 members of the same family were infected. As no
triatomine bugs were found, the oral route was proposed as the source of infection.7,8
At least six hundred cases of ACD have since been registered in the Brazilian
Amazon, leading to its characterization as an emerging disease in the region. The
ACD outbreaks involved from one to six families suggesting that transmission may
have arisen from the same source.9-13 The causative parasites were typed as
belonging to T. cruzi I (zymodeme 1), associated with the sylvatic cycle and
therefore, the ACD cases were considered as a zooantroponosis.
A outbreak of ACD affecting 17 individuals belonging to three families from
Mazagão municipality, Amapá state, Brazilian Amazon that occurred in 1997 is
described herein in detail showing aspects related to the human cases, triatomines
and the involved parasites.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Case histories and methods
Study areas and patients
The outbreak occurred in October 1997, in the locality of Rio Bispo, Mazagão
municipality, Amapá State, Brazil (S 00º 41’ 14.9” W 051º 38’ 46.1” – Figure 1). The
study included all of the 26 inhabitants from solely four families living in the locality: A
(8 members), B (6 members), C (7 members) and D (5 members). The first case was
identified accidentally when a thick blood smear test was made from one patient to
determine if the prolonged fever was due to the presence of malaria parasites.
Trypomastigote forms were found in the peripheral blood and this result led to the
investigation of ACD in all the other inhabitants of the village. The patients diagnosed
as ACD cases were treated with benzonidazole (Rochagan®, Roche –5 mg/kg of
weight) during 60 days. In the case of allergy to the drug, nifurtimox was
implemented (Lampit®, Bayer - 8 mg/kg of weight) for 45 days. Clinical data and
laboratory (serology, direct search for the parasite, xenodiagnosis and/or
haemoculture) were used in follow-ups, carried out at six months, one year, 5 and 7
years post-treatment.
Diagnosis of ACD: direct search for the parasite, xenodiagnosis,
haemoculture and serology
Blood smears were obtained from all the individuals, stained with Giemsa and
examined under the light microscope searching for trypomastigote forms. The QBC®
test (Quantitative Buffy Coat System, Malaria Diagnostic Kit, Becton Dickinson, USA)
was also used.
Xenodiagnosis was carried out using 20 third instars nymphs of Triatoma
infestans per patient. The nymphs had not been fed for 60 days and were placed on
the patients arms and left for 20 minutes, or until the meal was considered
completed.14
One hundred µl of total blood were placed in 6 tubes of biphasic Hoff’s
medium,14 providing a total of 600 µl of cultivated blood.
Serology was performed using the indirect haemagglutination test (IH) and
indirect imunofluorescence (IIF). In the latter, anti-human IgM and IgG labelled with
fluorescein (BIOLAB, São Paulo) were used. For IH, a titre of 1:40 was tested and for
IIF sera dilutions up to 1:1280 were tested. The reference value for both tests was a
negative result at the 1:40 dilution.
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Capture of sylvatic reservoirs
Fifty wire traps were used for capturing sylvan mammals, potentially acting as
T. cruzi reservoirs. Fruits were used as bait and the traps placed 100 m distant from
the households, with at least a distance of 20 m between the traps. The traps were
examined every day during 15 days to collect the captured mammals and change
baits.
Triatomine survey
Search for triatomines was conducted in all residences of the village. Two light
traps (fluorescent lamp), placed over the extracting machine of açaí juice and on the
table of the community kitchen were also used. Four other traps were placed 20m
from each residence. The survey also included the search of the annexes and
possible natural ecotopes in the vicinity of the village.
Molecular characterization of trypanosomatid isolates
Genomic DNA from the isolates was extracted using a commercial kit
(AMERSHAM). A multiplex PCR that amplifies the non-transcribed region of the miniexon gene was used for the molecular typing.15 Amplified products were submitted to
2% agarose gel electrophoresis, stained with ethidium bromide and visualized under
UV light. T. cruzi I, II, Z3 and T. rangeli DNAs were used as positive controls.
Results
Description of the ACD cases and parasitological tests:
The first confirmed ACD case was a child of thirteen years (family A) who
presented with prolonged fever with chills, headache, joint and muscular pain
suggesting malaria. The thick smear for Plasmodium sp. was negative however, and
new symptoms appeared: cutaneous itching exanthema of both legs, face and
abdomen accompanied by leg edema. A new examination of the peripheral blood for
haemoparasites revealed circulating trypomastigote forms. As sixteen more
individuals in the village were presenting fever (6 relatives of the index case and 10
other neighbours), ACD investigation was carried out on all residents of the locality.
Of these 16 patients, 5 had parasites morphologically similar to T. cruzi in their
peripheral blood. All patients had never been out of the region, indicating the cases
as autochthonous. The QBC test confirmed the six cases that were positive on direct
examination (index case and 5 more), and demonstrated circulating trypanosomes in
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
10 other patients. Fifteen of the suspected patients were submitted to xenodiagnosis
and 14 were positive. One of them had been negative for the blood smear and QBC
test. (Table 1, Figure 3).
Considering the results of the three tests (blood smear, QBC and
xenodiagnosis) 17 ACD cases were diagnosed, distributed among the 26 members
of the 3 families inhabitanting the village (Table 1, Figure 3)
Eleven patients were submitted to hemoculture and 8 stocks were isolated for
further molecular typing.
One of the residents, shown a triatomine collection, identified these insects as
those that entered his dwelling at night attracted by light.
Serology for Chagas disease – one month before treatment implementation:
Twenty six individuals were tested for the presence of IgM and IgG anti-T. cruzi (IIF
test). Six (6/26 – 26.1%) patients were IgM anti-T. cruzi positive and 9 (9/26 – 34.6%)
presented circulating IgG anti-T. cruzi. The 11 patients that were serologically
positive, either IgM or IgG anti-T. cruzi, (3 from family A, 4 from B, 4 from C – 11/26)
showed positive results in at least one of the parasitological tests. Six patients were
positive for the parasitological tests and presented all serological tests negative. The
concordance of the results of the two serological methods used was 100% at this
stage (Table 1, Figure 3).
Post-treatment laboratory follow-up:
Seventeen ACD confirmed cases were treated (7 from family A, 6 from B and
4 from C). The first follow-up was performed after 6 months of treatment. All patients
were parasitologically negative by direct blood test, QBC, xenodiagnosis and in vitro
culture. Detection of IgM anti-T. cruzi was unsuccessful in all patients. Fifteen (15/17
– 88.2%) were IgG anti-T. cruzi positive with titres ranging from 1:40 to 1:640. Two
patients presented discordant results in the serological tests, being negative on IIF
and positive in IH (Figure 3).
On the second evaluation, 1 year after treatment, all IgM anti-T. cruzi were
negative. Twelve patients still presented IgG anti-T. cruzi with titres ranging from 1:40
to 1:320 (Figure 3)
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Anexos
The third evaluation was made 5 years post-treatment. One patient was
positive in the xenodiagnosis and the IgM anti-T. cruzi gave a positive result (1:80)
having previously been negative. The IgG anti-T. cruzi continued to be positive
(1:320) confirming the results obtained on the first and second evaluation posttreatment. This patient was again treated and showed positive anti-HIV serology
(data not shown). All the other patients were negative for the parasitological and
serological tests (Figure 3)
The last follow-up took place 7 years after treatment. All patients were
negative for all parasitological and serological tests (Figure 3).
Capture of sylvatic mammals:
Six Didelphis marsupialis and six Marmosa sp. were captured in the vicinities
of the region where the outbreak took place. Fifty percent of these animals were
revealed to be infected with protozoa morphologically similar to T. cruzi when blood
samples were submitted to direct search of parasites after Giemsa staining (3
Didelphis marsupialis and 3 Marmosa sp.).
Triantomine survey and collection:
Three triatomines, identified as R. pictipes were collected in hammocks. One
of them was positive for flagellate forms similar to T. cruzi. No triatomine colonies
were found in the residences or in the house annexes. Six specimens of R. pictipes
were also captured in the light traps placed in the communal kitchen (Figure 2) .
Five of them were infected with trypanosomes (5/6 – 83.3%). The light traps
placed in the peridomestic habitat, captured 4 triatomines: two R. pictipes and two P.
geniculatus, which were all infected with trypanosomes. Those placed in the village
neighborhood, captured 55 R. pictipes. Thirty-five of these were also infected (35/55
– 63.6%). In total, 45 out of 68 captured triatomines were infected with
trypanosomatid protozoa similar to T. cruzi (45/68 – 66.2%).
Molecular characterization:
Eight trypanosomatid isolates were obtained and characterized - 8 from
humans (3 from family A, 4 from B and one from C) and 5 from R. pictipes. The three
stocks from family A were characterized as Z3 (either TCIIa or IIc, which are not
distinguished by the mini-exon method). Among the 4 isolates from family B, two
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
were typed as T. cruzi I and two as Z3. The only isolate from family C was genotyped
as T. cruzi Z3. Among the 5 R. pictipes isolates, two were T. cruzi I, one was typed
as Z3 and two presented mixed-infection molecular profiles: Trypanosoma rangeli
and T. cruzi Z3.
Discussion
The appropriate epidemiological and laboratory investigation of this ACD
outbreak in Mazagão, Brazilian Amazon, provided fast and reliable diagnosis of the
cases, leading to early therapeutic intervention.
The geographical isolation of the patients, the way of living of the involved
families and the simultaneous association of the cases with the alimentary habit of
consuming a regional fruit juice (açaí) supports the putative oral transmission of the
parasite. The absence of evidence of triatomine bites and lack of intradomiciliary
triatomine colonies supports this hypothesis.
Indeed, triatomine bugs were found in the vicinity of the village, as vectors
maintaining the enzootic cycle of American trypanosomiasis, and also in the
communal kitchens, probably attracted by the electric lights.7,10 It is interesting to find
the presence of all the stakeholders of the epidemioogical cycle of Chagas disease in
the same microarea. In Mazagão, triatomines, wild reservoirs and humans were
encountered infected with T. cruzi comprising the entire scenario for American
trypanosomiasis and the presence of Chagas disease.
Experimentally, it has been shown that a wide variety of foodstuffs
contaminated with epimastigotes of T. cruzi are a source of infection for 100% of
laboratory mice fed with these contaminated foods (Lainson et al., 1980) and several
ACD outbreaks have been associated with putative oral transmission and
epidemiologically linked to the ingestion of açaí juice potentially contaminated with T.
cruzi.10,13.Nevertheless, this hypothesis was not formally proven due to difficulties in
isolating the parasites from the açaí.11
Recently, oral transmission involving sugar cane juice was incriminated in one
outbreak with 24 cases in southern Brazil.5 In the same manner, oral transmission
has been considered in ACD outbreaks in Equador,16 Colombia17,18 and Venezuela.19
Out of the 26 inhabitants of Rio Bispo, Mazagão, 17 presented ACD
confirmed, by at least one parasitological test.20,21
However, the detection of circulating IgM anti-T. cruzi (IIF), a potential marker
of acute phase, and/or IgG (IIF and IH) was only achieved in 64.7% of the ACD
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
cases, demonstrating that during this phase it is not possible to predict the presence
of antibody. This could be attributed to the different antigenic stimulus mediated by
distinct parasite strains, or mediated by the infection timeframe. Independent of the
cause, serology for ACD patients is still a problem to be overcome.22,23
In this outbreak, treatment of ACD cases resulted in clearance of circulating
parasites and progressive reduction of the IgG anti-T. cruzi titers leading to
serologically negative results in 7 years. This is coherent with the expectations for
treatment of Chagas disease defined by PAHO.13,24 Only one patient turned out to be
positive in parasitological tests 5 years post-treatment. This patient never presented
negative results in serological tests before (second and third follow-ups - 6 months
and 1 year, respectively), demonstrating that, indeed, he was so far not cured.25 In
addition, this patient was HIV positive (data not shown), which could explain the reactivation of the disease with circulating parasites.26
The stocks isolated from humans and triatomines involved in this outbreak (T.
cruzi I, T. cruzi Z3 and T. rangeli) are typical of the Brazilian Amazon.27-29 The miniexon method does not distinguish TCIIa from TCIIc, and classifies both as Z3 but we
presume that the isolates are most likely to be TCIIa, previously associated with
human infections. The overlap of T. cruzi and T. rangeli infection of humans is
described in the Amazon region.15 In addition the T. cruzi genotypes found in this
outbreak are typical of the sylvatic cycle of T. cruzi, corresponding to the scenario of
the outbreak in which human dwellings are close to the primary forest.30,31 Probably,
the richness of the biodiversity, including sylvan mammals and triatomines, in this
village, maintains the circulation of the different genotypes in the environment.32
The existence of regular and seasonal ACD outbreaks in the Brazilian
Amazon, probably caused by oral transmission, reveals the needs to implement
alternative control measures for Chagas disease. Malaria is endemic in the region
and health care service is already structured for its early diagnosis and treatment.
This same infrastructure could be used for ACD diagnosis. The training of
microscopists and health agents for identifying T. cruzi in thick blood smears and in
triatomine bugs could act as a surveillance system. After early detection of putative
ACD cases, epidemiological and therapeutic interventions should take place.
Orientation concerning contamination of raw food, such as açaí juice, should be
given to the population in order to avoid episodes of ACD outbreaks. Prolonged
febrile cases with negative thick blood smears for Plasmodium, should be considered
and used as indicative for starting ACD laboratory investigation, enabling a better
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Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
patient management, such as early diagnosis and treatment, and the avoidance of
future higher morbidities.
Acknowledgement
Secretaria de Vigilância em Saúde- SVS, CR/FNS-AP, Secretaria de Estado
de Saúde do Amapá, Secretaria Municipal de Saúde do Mazagão and European
Committee Latin American for Research on Triatomines – ECLAT for financial
support. F.S Gomes, A. Freitas, R.N Almeida, R.B Nascimento and JM Nascimento
for technical support. To Dr. Marinete Póvoa for the revision of the manuscript in
English.
The works with humans populations were appropriately approved by the
Committee of Ethics (Instituto Evandro Chagas). The capture of mammals and the
experiments carried out involving these animals were appropriately approved by the
environmental authorities (IBAMA, Brazil) and by the Committee of Animal Ethics
(Instituto Evandro Chagas).
Conflict of interest: none
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supports a long coexistence of parasite lineages and their sympatric vectors. Mol
Ecol 2007; 16: 3361−3373.
30. Fernandes O, Mangia R, Lisboa C, Pinho A, Morel C, Zingales B, Campbell D,
Jansen A. The complexity of the sylvatic cycle of Trypanosoma cruzi in Rio de
Janeiro state (Brazil) revealed by the non-transcribed spacer of the mini-exon
gene. Parasitology 1999; 118: 161−166.
31. Coura JR, Junqueira ACV, Fernandes O, Valente SAS, Miles MA. Emerging
Chagas disease in Amazônian Brazil. Trends Parasitol 2002b; 18: 171−176.
32. Santos SS, Cupolillo E, Junqueira A, Coura JR, Jansen A, Sturm NR, Campbell
D, Fernandes O. The genetic diversity of Brazilian Trypanosoma cruzi isolates
and the phylogenetic positioning of zymodeme 3, based on the internal
transcribed spacer of the ribosomal gene. Ann Trop Med Parasitol 2002; 96:
755−764.
__________________________________________________________________________________________
131
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Table 1. Acute Chagas disease cases and the results of parasitological tests.
Families
N
With
Direct
individuals
symptomes
examination +
A
8
7/8
2/8
6/8
6/6*
3
B
6
6/6
2/6
6/6
5/6
4
C
7
4/7
2/7
4/7
3/3*
1
D
5
0/5
0/5
0/5
0/0*
0
Total
26
17
6
14
14
8
•
QBC +
Xeno +
Parasite
Isolation
Six out of the 7 family A members and 3 out of 4 family C members with
symptoms were submitted to the xenodiagnosis. None of the family D
members were submitted to this test since they did not presented symptoms.
Figure 1. Geographical location of the Village Rio Bispo in the municipal district of Mazagão,
State of Amapá, Brazil where the acute Chagas disease outbreak took place.
__________________________________________________________________________________________
132
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Figure 2. The communitary kitchen showing the conditions of the açaí juice preparation. 1A. The
Family seating around the table where the tools used for açai juice extraction are exposed. In the
yellow rectangle area is the apparatus for the açaí maceration (amplified n 1B). The arrows
determine the possible sequence of the events that allowed an eventual contamination of the
açaí juice with triatomine fecal material when the vector is attracted by the light.
Figure 3. Indirect Immunofluorescence Test results for detection of IgM (red square or circle) and
IgG (blue square or circle) anti-T. cruzi in the patients belonged to the four families (A, B, C e D).
In green is shown the values for the families of the patients. The stippled line is the title, whose
results above the line are positives. The patients in the square were parasitologically positives in,
at least, one of the tests (Indirect blood test, QBC, xenodiagnosis and in vitro culture). The circles
correspond to the patients parasitologically negatives. Stars represent the patients who had
discordant results between Indirect Immunofluorescence Test and haemagglutination.
__________________________________________________________________________________________
133
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 8. Preparo de soluções salinas para dissecação de triatomíneos
•
Solução de Hibitane® (Zeneca)
Gluconato de clorohexedine a 5%
Sache de 10 ml q.s.p.
•
1 litro de água destilada.
Solução Mista:
Solução 1
(bicloreto de mercúrio - HgCl2
cloreto de sódio - NaCl
HCl concentrado
Etanol absoluto
Água destilada
Solução de antibióticos 2
Penicilina
Gentamicina
5-fluorcitosina 1mg/ml, diluída em água
destilada e protegida da ação da luz)
0,025 g
0,65 g
0,125 ml
25 ml
75 ml)
5.000.000 UI,
40 mg/ml
5 ml
__________________________________________________________________________________________
134
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 9. Autorização do IBAMA
__________________________________________________________________________________________
135
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 10. Protocolo do Comitê de Ética em Pesquisas com Animais do Instituto
Evandro Chagas.
__________________________________________________________________________________________
136
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 11. ISOLADOS DE TRIPANOSSOMATÍDEOS OBTIDOS EM SURTOS DE
DOENÇA DE CHAGAS NOS ESTADOS DO PARÁ E AMAPÁ – 1995 A 2005
MUNICÍPIO
HOMEM
MAMÍFEROS
TRIATOMÍNEOS
Abaetetuba
10
5
7
Ananindeua
7
2
2
Barcarena
1
5
13
Belém
21
2
2
Bragança
1
2
4
*Mazagão, AP
8
0
5
48
16
33
Total
__________________________________________________________________________________________
137
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 12. ISOLAMENTOS DE PACIENTES EM
SURTOS NO PARÁ E AMAPÁ
ORIGEM GEOGRÁFICA
CÓDIGO DA AMOSTRA
TIPAGEM
Abaetetuba
5152-H9DMG
Tc1
Abaetetuba
6492-H18MJSF
Tc1
Abaetetuba
6493-H19AFF
Tc1
Abaetetuba
6495-H20JBFF
Tc1
Abaetetuba
6499-H21RNM
Tc1
Abaetetuba
6500-H22SPF
Tc1
Abaetetuba
6503-H23JBPF
Tc1
Abaetetuba
6567-H25DSP
Tc1
Abaetetuba
10213-H42TSB
Tc1
Abaetetuba
10290-H44 MNSM
Tc1
Ananindeua
11149-H45 ERSC
Tc1
Ananindeua
11189-H46 MJRR
Tc1
Ananindeua
11206-H47ESC
Tc1
Ananindeua
11209-H48MASS
Tc1
Ananindeua
11214-H49CASS
Tc1
Ananindeua
12350-H54WSC
Z3
Ananindeua
11267-H59 MAFF
Tc1
Barcarena
11875-H56MFFM
Tc1
Belém
S/N-H1MHS
Tc1
Belém
2087-H2MGA
Tc1
Belém
3395-H6JFSF
Tc1
Belém
5107-H8TSSES
Tc1
Belém
5929-H15ON
Tc1
Belém
6408-H17NCC
Tc1
Belém
8513-H31FPN
Tc1
Belém
8566-H32SAG
Tc1
Belém
8759-H33VCFC
Tc1
Belém
8760-H34AJAM
Tc1
Belém
8761-H35AMC
Tc1
Belém
10113-H41VLS
Tc1
Belém
10251-H43WAAL
Tc1
Belém
11228-H50JRMR
Tc1
Belém
11228-H51JRMR
Tc1
Belém
12156-H53LBS
Tc1
Belém
10269-H58RML
Tc1
Belém
8514-H66MPC
Tc1
Belém
8515-H67NPM
Tc1
Belém
8517-H68KMGF
Tc1
Belém
12156-H75LBS
Tc1
Bragança
11905-H52CWSP
Tc1
Mazagão
5199-H10RBS
Tc1
Mazagão
RBS/5202-H10-1 RBS
Tc1
Mazagão
RBS/5200-H11 RBS
Z3
Mazagão
5208-H12MBS
Z3
Mazagão
5211-H13EDS
Z3
Mazagão
5211-H14EDS1
Z3
Mazagão
5211-H15LSS
Z3
Mazagão
5222-H1MJPS
Z3
__________________________________________________________________________________________
138
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 13. ISOLAMENTOS DE ANIMAIS EM
SURTOS NO PARÁ E AMAPÁ
ORIGEM
CÓDIGO DA
GEOGRÁFICA
AMOSTRA
Abaetetuba
HOSPEDEIRO
TIPAGEM
5165-M14
D. marsupialis
Tc1
Abaetetuba
5792-M17
D. marsupialis
Tc1
Abaetetuba
5792-M22
D. marsupialis
Tc1
Abaetetuba
5838-M19
P. opossum
Tc1
Abaetetuba
2161-M9
D. marsupialis
Tc1
Ananindeua
ANA/03-M1
D. marsupialis
Tc1
Ananindeua
2077-M6
D. marsupialis
Tc1
Barcarena
BAR/33-M2
D. marsupialis
Tc1
Barcarena
5302-M15
M. cinerea
Tc1
Barcarena
5300-M21
D. marsupialis
Tc1
Barcarena
2161-M8
D. marsupialis
Tc1
Barcarena
5665-M16
D. marsupialis
Tc1
Belém
598-M5
D. marsupialis
Tc1
Belém
5827-M18
D. marsupialis
Tc1
Bragança
BRAG/22-M3
D. marsupialis
Tc1
Bragança
BRAG/26-M4
D. marsupialis
Tc1
__________________________________________________________________________________________
139
Sebastião Aldo da Silva Valente
Anexos
Anexo 14. ISOLAMENTOS DE TRIATOMÍNEOS EM
SURTOS NO PARÁ E AMAPÁ
ORIGEM
CÓDIGO DA
GEOGRÁFICA
AMOSTRA
Abaetetuba
HOSPEDEIRO
TIPAGEM
5155-B31
R. pictipes
Tc1
Abaetetuba
7081-B20
R. pictipes
Tc1
Abaetetuba
7084-B21
R. pictipes
Tc1
Abaetetuba
7089-B22
R. pictipes
Tc1
Abaetetuba
2039-B13
R. robustus
Tc1
Abaetetuba
583-B29
R. pictipes
Tc1
Abaetetuba
611-B30
R. pictipes
Tc1
Ananindeua
5290-B17
P. geniculatus
Tc1
Ananindeua
5291-B18
P. geniculatus
Tc1
Barcarena
50-B3
R. pictipes
Tc1
Barcarena
51-B4
R. pictipes
Tc1
Barcarena
52-B5
R. pictipes
Tc1
Barcarena
66-B6
R. pictipes
Tc1
Barcarena
83-B7
R. pictipes
Tc1
Barcarena
124-B8
R. robustus
Tc1
Barcarena
141-B10
R. pictipes
Tc1
Barcarena
149-B11
R. pictipes
Tc1
Barcarena
7301-B25
R. pictipes
Tc1
Barcarena
7312-B26
R. pictipes
Tc1
Barcarena
7343-B27
R. pictipes
Tc1
Barcarena
5184-B15
R. robustus
Tc1
Barcarena
2083-B14
R. robustus
Tc1
Belém
5275-B16
P. geniculatus
Tc1
Belém
7095-B24
R. pictipes
Tc1
Bragança
10-B1
R. robustus
Tc1
Bragança
18-B2
R. pictipes
Tc1
Bragança
132-B9
R. robustus
Tc1
Bragança
7090-B23
R. pictipes
Tc1
Mazagão
198-B12
R. pictipes
Z3+T. rangeli
Mazagão
198-B13
R. pictipes
Z3+T. rangeli
Mazagão
198-B14
R. pictipes
Z3
Mazagão
198-B15
R. pictipes
TcI
Mazagão
198-B16
R. pictipes
TcI
__________________________________________________________________________________________
140
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