Universidade do Estado do Rio de Janeiro
Centro Biomédico
Faculdade de Ciências Médicas
Andréa Fernandes Emiliano da Silva
Estudo das alterações cardiovasculares e metabólicas em modelo
experimental de programação metabólica: efeito de extrato da casca
de uva Vitis vinífera
Rio de Janeiro
2011
Andréa Fernandes Emiliano da Silva
Estudo das alterações cardiovasculares e metabólicas em modelo experimental
de programação metabólica: efeito de extrato da casca de uva Vitis vinífera
Tese apresentada, como requisito parcial para
obtenção do título de Doutora, ao Programa
de Pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental, da Universidade do Estado do
Rio de Janeiro.
Orientadora: Profª. Dra. Angela de Castro Resende
Coorientador: Profº.Dr. Roberto Soares de Moura
Rio de Janeiro
2011
CATALOGAÇÃO NA FONTE
UERJ/REDE SIRIUS/BIBLIOTECA CB-A
S586
Silva, Andréa Fernandes Emiliano da.
Estudo das alterações cardiovasculares e metabólicas em
modelo experimental de programação metabólica : efeito de
extrato da casca de uva Vitis vinífera / Andréa Fernandes
Emiliano da Silva. - 2011.
143 f.
Orientadora : Angela de Castro Resende.
Coorientador : Roberto Soares de Moura.
Tese (Doutorado) –
Universidade do
Estado do
Rio de
Janeiro, Faculdade de Ciências Médicas. Pós-graduação em
Fisiopatologia Clínica e Experimental.
1. Uva - Uso terapêutico - Teses. 2. Hipertensão Tratamento alternativo - Teses. 3. Resistência à insulina Teses. 4. Estresse oxidativo - Teses. 5. Metabolismo Regulação - Teses. I. Resende, Angela de Castro. II. Moura,
Roberto Soares de. III. Universidade do Estado do Rio de
Autorizo apenas para fins acadêmicos e científicos, a reprodução total ou parcial desta tese desde que
citada a fonte.
_____________________________________________
Assinatura
_____________________
Data
Andréa Fernandes Emiliano da Silva
Estudo das alterações cardiovasculares e metabólicas em modelo experimental
de programação metabólica: efeito de extrato da casca de uva Vitis vinífera
Tese apresentada, como requisito parcial para
obtenção do título de Doutora, ao Programa de
Pós-graduação em Fisiopatologia Clínica e
Experimental, da Universidade do Estado do Rio
de Janeiro.
Aprovada em 29 de março de 2011.
Banca Examinadora:
Profª Dra. Ângela de Castro Resende (Orientadora)
Faculdade de Ciências Médicas - UERJ
Profª Dra.Tatiana Marlowe Cunha Brunini
Faculdade de Ciências Médicas - UERJ
Profª Dra. Josely Correa Koury
Instituto de Nutrição - UERJ
Profª Dra. Claudia Lucia Martins da Silva
Instituto de Ciências Biomédicas - UFRJ
Prof. Dr. Gilson Teles Boaventura
Instituto de Nutrição - UFF
Rio de Janeiro
2011
DEDICATÓRIA
Aos garotos da minha vida
Julio Antônio e João Gabriel,
Por simplesmente existirem.
Dando ao meu mundo um sabor especial.
AGRADECIMENTOS
...À Deus por estar sempre presente na minha caminhada e por várias vezes me
carregar no colo.
...A minha orientadora Ângela Resende.
Mulher incrível, que consegue juntar
capacidade com humildade. Consegue entender seus alunos, suas necessidades e
suas batalhas. Obrigada pela parceria e cumplicidade. Ah! Também pelos biscoitos com
pepitas de chocolate!
...Ao meu coorientador Roberto Soares de Moura.
...A nossa Amada Tânia Tano (in memorian), pessoa de incrível sutileza e alegria.
Estava sempre com um sorriso embutido no rosto e uma palavra doce na boca. Sua
falta é, e sempre será, sentida em nossos corações....
...Ao meu marido Julio Antonio e ao meu filho João Gabriel, companheiros e amigos em
todas as horas. Pelas horas cedidas para a realização deste trabalho, pelos domingos
compartilhados no laboratório, pela paciência e parceria para que este dia se
realizasse.
...Agradeço as risadas e as boas “tiradas” do João, que me faz gargalhar em todos os
momentos.
...A minha mãe Cecília e meu pai Antonio (in memorian) que me ensinaram que tudo
que iremos levar na nossa vida é o que somos e o que realizamos. Fazer o correto
sempre! Obrigada!.
...Aos meus irmãos Cícero, Sérgio, Rotterdam, Sonia, Katia, Sueli e Joseli, por me
lembrarem sempre: O que sou e quem sou.
...Aos companheiros do laboratório: Lucia, Taline, Ana Paula, Marcelo, Carlos, Michelle.
...As meninas super poderosas: Lenize (docinho), Cris (lindinha) e Paola (florzinha),
amigas do riso e do choro, pelo colo e pelas gargalhadas que compartilhamos.
...Grazi , Vivi e Talita pela amizade e pelo plantão conjunto no Lab.
...Ao Prof. Antonio Claudio e a Profa. Tatiana Brunini pela amizade e força necessárias
ao dia-a-dia.
...As meninas maravilhosas da Profa. Tatiana Brunini, que estavam sempre solícitas:
Nathalia, Marcela, Monique, Mariana, Cristiane.
...Ao Laboratório da Profa. Tereza Cristina: Simone, Renata, Amanda.
...A minha cara e querida Andreza, meu muito obrigada!
...A profa. Ana Donato, com quem aprendi a engatinhar e andar na pesquisa.
...Ao meu querido Nelcir: Pelo carinho, companheirismo nos domingos e feriados de
plantão no biotério, e principalmente pelas palavras de apoio, que serão guardadas
junto com o seu “Que isso Andréa...Eu carrego as caixas....” E quantas caixas meu
amigo...
...Ao meu amigo Anicet: Palavras certas no momento preciso.
...As minhas amigas Lídia e Simone: Pelos ouvidos e palavras doces de afeto e
conforto, tantas vezes recorridas nesta caminhada.
...A doce Amélia: Que com um sorriso no rosto sempre tinha uma solução.
... Ao laboratório do Professor Gilson e seus alunos maravilhosos, principalmente Aline
e Julio. Muito Obrigada!
... A todos que, de alguma forma, colaboraram para a realização desta tese. Muito
Obrigada!
O mundo me intriga,
E não posso imaginar que este relógio exista
E não haja relojoeiro.
Voltaire
RESUMO
SILVA, Andréa Fernandes Emiliano da. Estudo das alterações cardiovasculares e
metabólicas em modelo experimental de programação metabólica: efeito de
extrato da casca de uva Vitis vinífera. 2011.143 f.Tese (Doutorado em Fisiopatologia
Clínica e Experimental) – Faculdade de Ciências Médicas, Universidade do Estado do
Rio de Janeiro, Rio de Janeiro, 2011.
Estudos epidemiológicos e experimentais têm sugerido que fatores de risco
cardiovasculares podem ser parcialmente atribuídos às influências do ambiente em que
vive o indivíduo, e que a nutrição materna influencia na programação de alterações
metabólicas e cardiovasculares no indivíduo adulto e que caracterizam a síndrome
metabólica (SM). Em contrapartida, estudos prévios de nosso laboratório demonstram
que o extrato da casca de uva Vitis labrusca (GSE) possui efeito vasodilatador, antihipertensivo e antioxidante. Desta forma, o objetivo deste estudo foi avaliar o efeito do
tratamento oral com GSE (200mg/kg/dia), sobre as alterações cardiovasculares e
metabólicas e estresse oxidativo observados na prole adulta (fêmea e machos) com 3 e
6 meses, cujas mães foram submetidas a uma dieta rica em gordura (hiperlipídica)
durante a lactação. Quatro grupos de ratas foram alimentados com dietas
experimentais: controle (7% de gordura); controle + GSE (7% de gordura + GSE),
hiperlipídica (24% de gordura); hiperlipídica + GSE (24% de gordura + GSE) durante a
lactação. Após o desmame, todos os filhotes passaram a ser alimentados com uma
dieta controle e foram sacrificados aos 3 ou 6 meses de idade. A pressão arterial
sistólica (PAS) foi medida por pletismografia de cauda e o efeito vasodilatador da
acetilcolina (ACh) foi avaliado em leito arterial mesentérico (LAM) perfundido. Foram
avaliados o peso corporal, adiposidade (intra-abdominal e gonadal), níveis plasmáticos
de colesterol total, triglicerídeos, glicose e insulina, e a resistência à insulina (RI) foi
calculada pelo índice de HOMA IR. As expressões do IRS-1, Akt e GLUT-4 foram
determinadas em músculo soleus. O dano oxidativo, níveis de nitritos e a atividade das
enzimas antioxidantes: superóxido dismutase, catalase e glutationa peroxidase foram
dosados no plasma e homogenato de LAM. A PAS e tecido adiposo foram aumentados
nas proles adultas de ambos os sexos e idades do grupo hiperlipídico e revertidos pelo
tratamento com o GSE. A resposta vasodilatadora à ACh em LAM não foi diferente
entre os grupos de ambos os sexos, mas foram reduzidas com o envelhecimento. Nas
proles fêmeas e machos do grupo hiperlipídico também foram observados o aumento
dos níveis de triglicerídeos, de glicose e RI em ambas as idades e foram reduzidos pelo
GSE. No grupo hiperlipídico houve redução nas expressões de IRS-1, Akt e GLUT-4 e
o GSE reverteu estas expressões. Os níveis plasmáticos de malondialdeído estavam
aumentados e os níveis de nitrito diminuídos no grupo hiperlipídico, de ambos os sexos
e idades e foram revertidos pelo GSE. As atividades das enzimas antioxidantes no
plasma e no mesentério foram reduzidas no grupo hiperlipídico e restauradas pelo
GSE. Em conclusão, O GSE parece proteger as proles fêmeas e machos, cujas mães
foram expostas a uma dieta hiperlipídica durante a lactação, dos fatores de riscos
cardiovasculares, proporcionando uma fonte alternativa nutricional para a prevenção da
SM.
Palavras-chave: Extrato da casca de uva. Hipertensão. Resistência á insulina.
Estresse oxidativo. Programação do desenvolvimento.
ABSTRACT
Epidemiological and experimental studies have suggested that cardiovascular risk
factors can be partly attributed to the influences of the environment in which the
individual lives, and that maternal nutrition influences the programming of metabolic and
cardiovascular diseases in adults characterizing the metabolic syndrome. On the other
hand, previous studies from our laboratory show that the skin extract of grape Vitis
labrusca (GSE) has antihypertensive, antioxidant and vasodilator effects. Thus, the aim
of this study was to evaluate the effect of oral treatment with GSE (200mg/kg/day) on
the cardiovascular and metabolic disorders and oxidative stress observed in adult
offspring (female and male) at 3 or 6 months whose mothers were fed a high fat diet
(HF) during lactation. Four groups of rats were fed experimental diets: control (7% fat),
control + GSE (7% fat + GSE), diet (24% fat), HF + GSE (24% fat + GSE) during
lactation. After weaning, all pups have become fed a control diet and were sacrificed at
3 or 6 months of age. Systolic blood pressure (SBP) was measured by plethysmography
and the vasodilator effect of acetylcholine (ACh) was studied in perfused mesenteric
arterial bed (MAB). We determined the body weight, adiposity, plasma total cholesterol,
triglycerides, glucose, insulin, and insulin resistance was calculated by HOMA IR. The
expression of IRS-1, Akt and GLUT-4 were determined in soleus muscle. Oxidative
damage, nitrite levels and antioxidant enzyme activity: superoxide dismutase, catalase
and glutathione peroxidase were measured in plasma and homogenate of mesentery
bed. The SBP and adipose tissue were increased in adult offspring of both sex and ages
of the HF group and reversed by treatment with GSE. The vasodilator response to ACh
was not different between groups of both sex, but was reduced by aging. In offspring
females and males of the HF group were also observed increased levels of triglycerides,
glucose and insulin resistance in both ages and those changes were reduced by GSE.
HF group showed a reduction in expression of IRS-1, Akt and GLUT-4 which was
reversed by GSE. The malondialdehyde levels were increased and nitrite levels were
decreased in the HF group of both sex and ages and those changes were reversed by
GSE. The activities of antioxidant enzymes in plasma and mesentery were lower in HF
group and restored by the GSE. In conclusion, GSE appears to protect the female and
male offspring whose mothers were exposed to a high fat diet during lactation, against
the cardiovascular risk factors, providing an alternative source of food for the prevention
of metabolic syndrome.
Keywords: Grape skin extract. Hypertension. Insulin resistance; Oxidative stress.
Developmental programming.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Quadro 1 - Componentes da Síndrome Metabólica..............................................
20
Figura 1 - Sinalização celular mediada pela insulina...........................................
25
Figura 2 - Diagrama da formação do superóxido e das enzimas antioxidantes...
34
Figura 3 - Foto da Vitis vinifera............................................................................
37
Figura 4 - Estrutura química de alguns polifenóis ...............................................
39
Figura 5 - Esquema do sistema de perfusão do LAM de rato.............................
47
Figura 6 - Consumo materno da ração, do líquido e peso materno....................
54
Figura 7 - Evolução do peso em proles fêmeas e machos de 3 e 6 meses........
55
Figura 8 - Gordura das proles fêmeas e machos com 3 e 6 meses...................
56
Figura 9 - Pressão arterial sistólica de proles fêmeas e machos........................
57
Figura 10 - Resposta vasodilatadora da acetilcolina (ACh) em proles fêmeas e
machos com 3 e 6 meses...................................................................
58
Figura 11 - Níveis séricos de estradiol em proles fêmeas de 3 e 6 meses...........
59
Figura 12 - Níveis séricos de colesterol total, de HDL e de triglicerídeos em
proles fêmeas e machos com 3 e 6 meses........................................
61
Figura 13 - Níveis de glicose, insulina e resistência à insulina em proles fêmeas
e machos com 3 e 6 meses................................................................
63
Figura 14 - Expressões de IRS-1, Akt e Glut 4 em músculo soleus de proles
machos com 3 e 6 meses...................................................................
65
Figura 15 - Níveis de MDA em amostras de plasma nas proles fêmeas e
machos com 3 e 6 meses...................................................................
66
Figura 16 - Níveis de nitrito em amostras de plasma nas proles fêmeas e
machos com 3 e 6 meses...................................................................
67
Figura 17 - Atividade das enzimas SOD, da Catalase e da Glutationa em
amostras de plasma de proles fêmeas e machos com 3 e 6 meses..
69
Figura 18 - Níveis de MDA em amostras de vasos mesentérios de proles
fêmeas e machos com 3 e 6 meses..................................................
70
Figura 19 - Níveis de nitrito em amostras de vasos mesentérios de proles
fêmeas e machos com 3 e 6 meses...................................................
71
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
4-HNE –
4-Hidroxi-nonenal
ACh –
Acetilcolina
Akt –
Tirosina quinase A
Ang II –
Angiotensina II
Apo –
Apoliproteínas
C–
Controle
C+GSE –
Controle + extrato de casca de uva
C6H1206 –
Glicose
Ca2+ –
Cálcio
CaCl2.2H2O –
Cloreto de cálcio dihidratado
CE –
Colesterol Ester
CL –
Colesterol livre
CO2 –
Gás Carbônico
DNA –
Ácido desoxirribonucleico
DOCA –
Deoxicorticosterona
EDHF –
Fator hiperpolarizante derivado do endotélio
EDTA –
Ácido etilenodiamino tetra-acético
EGF –
Fator de Crescimento Epidérmico
eNOS –
Óxido nítrico sintase
ERO –
Espécie Reativa do Oxigênio
ET1 –
Endotelina-1
FC –
Fator de correção
GHS –
Glutationa
GLUT4 –
Transportador de glicose tipo 4
GMPc –
Guanosina monofosfato cíclico
GR –
Glutationa redutase
GSE –
Extrato de casca de uvas vitis viniferas
GSH-Px –
Glutationa peroxidase
GTP –
Guanosina trifosfato
H–
Hiperlipídico
H+GSE –
Hiperlipídico + extrato de casca de uva
H2O2 –
Peróxido de hidrogênio
HA –
Hipertensão arterial
HDL –
Lipoproteina de alta densidade
HOMA –
Homeostasis model Assessment
IF-6 –
Fator de crescimento ligado a proteína 6
IGF –
Fator de crescimento semelhante à insul
IL1 –
Interleucina 1
IMC –
Índice de massa corporal
iNOS –
Óxido nítrico sintase induzida
IP3 –
Trifosfato de inositol
IRS –
Receptor de insulina
KCl –
Cloreto de potássio
KH2PO4 –
Fosfato de potássio monobásico
LAM –
Leito arterial mesentérico
LDL –
Lipoproteína de baixa densidade
L-Name –
Nitro-L-arginina metil éster
LP –
Lipoproteínas
MDA –
Malondialdeído
MgSO4 –
Sulfato de magnésio
Na2HCO3 –
Bicarbonato de sódio
NaCl –
Cloreto de sódio
NADPH –
Nicotinamida adenina dinucleótido fosfato
NCEP-ATP III –
Third report of the National Cholesterol Education Program
Expert Panel on detection evaluation and treatment of High
Blood Cholesterol in Adults.
NE –
Norepinefrina
NED –
N-Naftil etilenodiamida
NG –
Nitroglicerina
nNOS –
Óxido nítrico sintase neuronal
NO –
Óxido nítrico
.
O2- –
Ânion superóxido
O2 –
Oxigênio
.
OH- –
Radical hidroxil
OMS –
Organização Mundial de Saúde
.
ONOO- –
Peroxinitrito
PA –
Pressão arterial
PAD –
Pressão arterial diastólica
PAS –
Pressão arterial sistólica
PBS –
tampão fosfato
PDGF –
Fator de crescimento derivado de plaquetas
PKB –
Proteína quinase B
PKC –
Proteína quinase C
PI 3-K –
Fosfatidilinositol 3- quinase
QM –
Quilomicrons
RI –
Resistência à insulina
ROOH –
Hidroperóxidos orgânicos
ROS –
Éspecie reativa de oxigênio
SHR –
Rato espontaneamente hipertenso
SM –
Síndrome metabólica
SOD –
Superóxido dismutase
SOD1 –
Superóxido dismutase cobre zinco
SOD2 ou MnSOD– Superóxido dismutase manganês
SOD3 ou ecSOD–
Superóxido dismutase extracelular
SRAA –
Sistema renina-angiotensina-aldosterona
TBARS –
Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
TCA –
Ácido tricloroacético
TG –
Triglicerídeos
TNF –
Fator de necrose tumoral
TNFα –
Fator de necrose tumoral alfa
TTG –
Teste de tolerância à glicose
VLDL –
Lipoproteína de muito baixa densidade
VSMC –
Célula do músculo liso vascular
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ............................................................................................ 16
1
REVISÃO DA LITERATURA.................................................................... 17
1.1 Programação metabólica.......................................................................
17
1.2 Síndrome metabólica ............................................................................. 19
1.3. Obesidade................................................................................................ 21
1.4 Resistência à insulina............................................................................
24
1.5 Hipertensão.............................................................................................
26
1.6 Endotélio e Disfunção Vascular ...........................................................
28
1.7 Estresse oxidativo..................................................................................
30
1.8 Sistema de defesa antioxidante............................................................
33
1.9 Extrato da casca de uva (Grape Skin Extract - GSE)..........................
35
OBJETIVOS .............................................................................................
41
2.1 Objetivo específico.................................................................................
41
3
MATERIAL E MÉTODOS........................................................................
42
3.1 Preparação do extrato hidroalcoólico de cascas de uvas viníferas..
42
3.2 Animais utilizados e dieta experimental ..............................................
42
3.3 Medida da pressão arterial por pletismografia de cauda....................
45
3.4 Isolamento do leito arterial mesentérico (LAM) de rato......................
46
3.5 Medida da reatividade do LAM às substâncias vasoativas................
46
3.6 Dosagens séricas...................................................................................
48
3.7 Atividade das enzimas antioxidantes..................................................
49
3.8 Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)......................
50
3.9 Medida de nitrito.....................................................................................
51
3.10 Dosagem de proteínas (Bradford)........................................................
52
3.11 Western Blotting.....................................................................................
52
3.12 Análise estatística..................................................................................
53
4
RESULTADOS.........................................................................................
54
4.1 Parâmetros maternos durante a lactação............................................
54
4.2 Efeito do GSE sobre o peso corporal...................................................
55
2
4.3 Adiposidade............................................................................................
56
4.4 Pressão arterial sistólica......................................................................
57
4.5 Resposta vasodilatadora da acetilcolina (ACh)................................... 58
4.6 Estradiol..................................................................................................
59
4.7 Perfil lipídico.........................................................................................
60
4.8 Glicemia e Resistência à insulina.........................................................
62
4.9 Expressão de IRS-1, Akt e Glut4:........................................................
64
4.10 Análise do dano oxidativo- Substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) pela medida de MDA no plasma ...................
66
4.11 Nitrito no plasma ....................................................................................
67
4.12 Análise da atividade enzimática antioxidante no plasma..................
68
4.13 Análise do dano oxidativo- Substâncias reativas ao ácido
tiobarbitúrico (TBARS) pela medida de MDA no mesentério............
70
4.14 Níveis de nitrito no mesentério.............................................................
71
4.15 Análise da atividade enzimática antioxidante no mesentério............
72
DISCUSSÃO.............................................................................................
74
REFERÊNCIAS........................................................................................
83
APÊNDICE - Metabolic disorders and oxidative stress programming in
offspring of rats fed a high-fat diet during lactation: effects of a Vinifera
grape skin extract...................................................................................... 110
.
16
INTRODUÇÃO
A alimentação materna pode influenciar na saúde do feto, tanto no período intrauterino como na lactação, determinando assim a saúde da prole na fase adulta. A
nutrição pré- e pós-natal causa efeitos tanto imediatos quanto em longo prazo no
desenvolvimento e isso tem implicações importantes na incidência de doenças nas
proles adultas. Sendo que são nos períodos críticos do desenvolvimento onde ocorre a
programação metabólica. A programação metabólica é um conceito definido por um
processo em que um insulto, ocorrido em um período crítico de desenvolvimento,
resulta em alterações permanentes na estrutura e/ou funções de órgãos e/ou nas
funções metabólicas. Evidências demonstram que o desenvolvimento da síndrome
metabólica pode ter origem em alterações ocorridas na gestação e durante o início da
vida pós-natal.
Em contrapartida, dados sugerem um efeito benéfico do hábito de beber vinho
moderadamente em pacientes diabéticos, assim como, em animais de experimentação
e ainda que o óxido nítrico (NO) deva participar significativamente nos efeitos benéficos
do vinho. Recentemente, demonstramos que o extrato de cascas de uvas viníferas, rico
em polifenóis, apresenta importante efeito vasodilatador e anti-hipertensivo mediados
pela via NO-GMPc e liberação do fator hiperpolarizante derivado do endotélio(EDHF),
além de uma ação anti-oxidante (Soares de Moura et al 2002; Madeira et al, 2005).
Como a via NO-GMPc, o EDHF e a propriedade anti-oxidante também participam da
modulação da reatividade da musculatura lisa vascular a agentes vasoativos e pressão
arterial, consequentemente é provável que exista um possível efeito protetor do extrato
da casca de uva (GSE) sobre as alterações cardiovasculares e metabólicas observadas
na prole de animais submetidos a dieta com alto teor de gordura.
.
17
1 REVISÃO DA LITERATURA
1.1 Programação metabólica
Atualmente, o aumento da incidência de obesidade, diabetes e morte por
doenças cardiovasculares não é mais característica de países do primeiro mundo,
fazendo parte também do cotidiano de países em desenvolvimento como o Brasil
(IBGE, 2010).
Estudos epidemiológicos e experimentais têm sugerido que os fatores de risco
cardiovasculares
(hipertensão,
dislipidemia,
obesidade
e
hiperglicemia)
que
caracterizam a síndrome metabólica, e que são em parte atribuídos a influências do
ambiente em que vive o indivíduo, podem ser adquiridos precocemente no período
gestacional e pós-natal (Langley & Jackson, 1994; Armitage et al., 2004; Stocker et al.,
2005).
Num ambiente gestacional adverso, fetos humanos e de outros mamíferos
respondem a falta de nutrientes com mudanças permanentes em sua estrutura e seu
metabolismo a fim de lhes possibilitar a sobrevivência (Stocker et al, 2005). Tais
modificações benéficas num primeiro momento, levam ao surgimento de uma gama de
doenças na vida adulta, incluindo hipertensão arterial, acidente vascular cerebral e
doença arterial coronariana, afetando diretamente órgãos-alvo como os rins, o cérebro
e o coração, caracterizando assim, o processo de programação fetal (Barker & Clark,
1997; Langley-Evans et al, 1996, 2003). A hipótese da programação fetal propõe que
estas desordens cardiovasculares e metabólicas derivam de adaptações do feto em
resposta à má nutrição materna que altera permanentemente as características do
crescimento, metabolismo e fisiologia pós-natal (Bakker, 1998; Stocker et al., 2005).
Desta forma, a nutrição materna deve influenciar a evolução da gravidez e determinar a
saúde do feto (McArdle et al., 2006). Entretanto, o ambiente nutricional durante o
período de desenvolvimento na vida pós-natal também pode programar distúrbios
18
funcionais. Dessa forma, o termo programação do desenvolvimento é preferencialmente
utilizado (Armitage et al., 2005).
Esta noção de que as doenças crônicas no adulto têm suas origens em
alterações biológicas e fisiológicas precoces na vida, lançou nos últimos anos o desafio
de compreender a gênese do processo que enfoca a nutrição materna como ponto
primordial na saúde do indivíduo. O estudo dos efeitos da nutrição materna na
programação do desenvolvimento e conseqüentemente sobre o desenvolvimento de
fatores de riscos metabólicos e cardiovasculares na prole tem sido amplamente descrito
e utiliza modelos animais de manipulação da dieta materna durante a gravidez e
lactação (Armitage et al., 2005).
Inúmeros trabalhos que utilizam tais modelos
experimentais apontam para a importância de uma programação do desenvolvimento
no aparecimento de alguns distúrbios funcionais. Assim, o consumo aumentado de
gordura na gestação e lactação é capaz de induzir o aparecimento de hipertensão
arterial, hiperglicemia, resistência à insulina, aumento da massa de gordura e
alterações no perfil lipídico na prole (Langley & Jackson, 1994; Taylor et al., 2004;
Armitage et al., 2005). Do mesmo modo, a restrição protéica ou consumo aumentado
de gordura em ratas durante a gestação e lactação pode causar disfunção renal e
hipertensão arterial na prole, com acentuada redução do número de glomérulos na
prole adulta do sexo masculino (Almeida et al., 2005; Armitage et al., 2005).
No entanto, a exposição materna a dietas experimentais, com restrição protéica
ou alto teor de gordura, durante a gestação e lactação parece conferir uma proteção
adaptativa minimizando as patologias observadas em grupos que são expostos a essas
dietas apenas no período de lactação.
Esta proteção adaptativa conhecida como
“resposta adaptativa preditiva”, sugere que o feto no útero prevê o ambiente em que ele
é susceptível de nascer e adapta-se a fim de obter uma vantagem competitiva no futuro
(Fernandez-Twinn e Ozanne, 2010).
Vários trabalhos relatam a exposição com dieta hiperlipídica em ratas nos
períodos de gestação e lactação, porém poucos trabalhos investigaram o papel da
exposição a esta dieta apenas no período da lactação sobre possíveis alterações
cardiovasculares e metabólicas da prole na fase adulta (Khan et al,2005).
A dieta
materna durante o período de lactação, entretanto, deve ser crucial porque uma
19
maturidade significativa ocorre na vida precoce. Isto é mais marcante em espécies
como os roedores que sofrem uma maturidade rápida da maior parte dos sistemas e
órgãos após o nascimento (Armitage et al., 2005). Poucas evidências relatam que uma
dieta rica em gordura durante apenas o período de lactação predispõe ao aumento da
pressão arterial, disfunção endotelial, e alteração da homeostasia da glicose na prole
adulta (Khan et al., 2004). Em contraste com o período gestacional, a ingestão de
energia materna durante o período de lactação é maior quando ratas são alimentadas
com dieta rica em gordura (Khan et al., 2003). Portanto, o aumento da ingestão de
energia e gordura durante o período de lactação deve influenciar o fenótipo da prole
adulta que é característico da síndrome metabólica.
1.2 Síndrome metabólica e modelo experimental
O conceito da síndrome metabólica (SM) existe há pelo menos 80 anos. Em
1920, Klin, um clínico sueco, foi o primeiro a descrever sobre um conjunto de distúrbios
metabólicos formado por hipertensão, hiperglicemia e gota (Cameron et al, 2004).
Em 1936, Himmsworthe, um médico inglês, ao observar que um grupo de
pacientes era mais resistente à insulina exógena, deu início ao conceito da resistência à
insulina.
Vague também demonstrou uma estreita relação entre as anormalidades
metabólicas tais como: diabetes tipo II, hiperlipidemia, hiperuricemia e o tipo andróide.
Reaven, em 1980, introduziu o conceito de síndrome X, onde incluía resistência à
insulina (RI), hiperglicemia, hipertensão, baixos níveis de colesterol HDL e triglicerídeos
elevados, que a partir de 1998 foi chamada de SM. Desta forma, as terminologias
síndrome de resistência à insulina e/ou síndrome X passaram a ser utilizadas
indistintamente e, mais tarde, definiu-se como SM. É interessante notar que Reaven
não fez menção à obesidade como um componente da SM, o que ele reconheceu
apenas em publicação posterior (Reaven, 1994). Isso se deve ao fato de que mesmo
aqueles sem excesso de peso podem ter resistência à insulina e SM, sendo algumas
vezes até mais resistentes à insulina que os obesos.
20
A SM é um transtorno complexo representado por um conjunto de fatores de
risco que predispõe a uma elevada morbi-mortalidade cardiovascular (I Diretriz
Brasileira de diagnóstico e tratamento da Síndrome Metabólica, 2005; Day, 2007). A
prevalência da SM vem aumentando dramaticamente a nível mundial nas últimas
décadas, atingindo 24% da população adulta. Esta prevalência é ainda maior entre
homens e mulheres mais velhos, chegando a 42% entre indivíduos com idade superior
a 60 anos. A SM parece ser a maior responsável por eventos cardiovasculares na
população (VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão, 2010), aumentando a mortalidade
geral em cerca de 1,5 vezes e a cardiovascular em cerca de 2,5 vezes (Weiss et al,
2004).
Ao longo dos anos vem se tentando um consenso em relação aos pontos de
corte dos componentes da SM. A definição do National Cholesterol Education Program
Adult Treatment Panel III (NCEP ATP III) foi desenvolvida para uso clínico e não exige a
comprovação de resistência à insulina.
Devido a sua simplicidade, é a definição
recomendada pela I Diretriz Brasileira de Diagnóstico e Tratamento da Síndrome
Metabólica (2005).
Segundo o NCEP-ATP III, a SM representa a combinação de pelo menos três
componentes descritos no Quadro 1.
Quadro1. Componentes da Síndrome Metabólica
Componentes
Níveis
Obesidade abdominal por meio de circunferência
abdominal
Homens
> 102 cm
Mulheres
> 88 cm
Triglicerídeos
> 150 mg/dL
HDL Colesterol
Homens
< 40 cm
Mulheres
< 50 cm
Pressão arterial
>130x85 mmHg
Glicemia jejum
> 110 mg/dL
Fonte: Executive Summary of the Third Report on NCEP
21
Atualmente, acredita-se que diversos eventos estejam associados à gênese da
SM e contribuiriam para a instalação das alterações características. No entanto, existem
fatores chaves, tais como predisposição genética, hipertensão, obesidade visceral e
resistência à insulina (RI).
Recentemente, o principal desequilíbrio na dieta materna que é mais comumente
observado em populações ocidentais é a ingestão excessiva de gordura, conhecida
como “Western diet” (Armitage et al., 2004). Embora, já seja bem reconhecida, a ligação
entre dieta rica em gordura saturada com a doença cardiovascular em adultos (Watts et
al., 1994), pouco se sabe sobre os efeitos da nutrição materna rica em gordura, na
“programação do desenvolvimento” e conseqüentemente sobre o desenvolvimento de
doença cardiovascular na prole adulta.
Estudos relatam que uma dieta contendo uma quantidade elevada de gordura na
gravidez, predispõe a prole ao desenvolvimento de doença cardiovascular. A exposição
de ratas a uma dieta rica em gordura saturada (Langley-Evans et al., 1996; Koukkou et
al., 1998; Siemelink et al., 2002; Khan et al., 2003,2004; Armitage et al., 2005) ou
colesterol (Palinski et al., 2001), durante a gravidez e lactação resulta em
características da SM, disfunção vascular e lesões aterogênicas, em animais adultos
alimentados com dieta balanceada padrão.
Portanto, este modelo experimental de
“programação do desenvolvimento” tem sido extensamente utilizado para o estudo dos
componentes da SM e mecanismos envolvidos na sua gênese. Os estudos demonstram
que as características fenotípicas e metabólicas desses animais cujas mães foram
alimentadas com dieta hiperlipídica revelam uma importante utilização deste modelo
para a elucidação dos mecanismos envolvidos na progressão ou resistência para o
desenvolvimento de diabetes mellitus do tipo II e componentes da SM.
1.3 Obesidade
A obesidade nas últimas décadas aumentou de forma alarmante no Brasil e no
mundo, atingindo caráter epidêmico na sociedade moderna (IBGE, 2010). Tornou-se
22
um grave problema de saúde pública por estar associada a outras entidades mórbidas
crônicas incluindo doença arterial coronariana, diabetes e dislipidemia (Bray, 2004).
O tecido adiposo evoluiu para armazenar energia de forma eficiente para os
períodos de restrição calórica. O grande excesso calórico comum em muitas dietas
ocidentais negou a necessidade dessa função racional, deixando o tecido adiposo
incapaz de lidar com este aumento da carga. Um excesso de tecido adiposo aumenta o
risco de alterações em uma série de condições, incluindo a doença arterial coronariana,
hipertensão arterial, dislipidemias, diabetes tipo II, e até mesmo câncer (Fontaine et al.
2003; Peeters et al. 2003; Solomon and Manson, 1997; WHO 2000).
Atualmente, acredita-se que existam quatro fatores principais associados à
gênese da obesidade: determinantes genéticos, fatores ambientais, comportamento
alimentar e redução do exercício (Gurevich-Panigrahi et al, 2009). No entanto, o
completo entendimento da sua fisiopatologia permanece sem resposta. Portanto, a
gênese da obesidade é multifatorial, sendo o desequilíbrio entre a ingestão e o gasto de
energia um fator crucial. Frutas, verduras e grãos integrais estão sendo substituídos por
alimentos facilmente acessíveis e ricos em gordura saturada, açúcar e carboidratos refinados.
O excesso de lipídio acarreta de forma mais precoce este desequilíbrio, levando a um
remodelamento adverso do tecido adiposo (Keller and Lemberg, 2003), reforçando a
demonstração clássica de Welber J (2003) de que a dieta hiperlipídica está diretamente
relacionada com a indução da obesidade.
O tecido adiposo não é apenas um fornecedor e armazenador de energia, mas
pode ser considerado como um órgão endócrino por secretar diversas substâncias
denominadas adipocinas, como leptina, resistina, visfatina, vaspina e adiponectina
responsáveis por várias ações na homeostasia e em diferentes estados patológicos,
como na SM (Fonseca-Alaniz et al., 2006). A leptina suprime o consumo alimentar e
estimula o gasto energético (Welber J, 2003); a adiponectina age como fator protetor
para doenças cardiovasculares, aumenta a sensibilidade insulínica e estudos mostram
que em adipócitos de ratos, in vitro, uma redução de 60% na expressão de
adiponectina resultou em um aumento significativo da RI (Fonseca-Alaniz et al, 2006); a
resistina modula a ação da insulina hepática e, possivelmente, desempenha um papel
na manutenção dos níveis da glicemia em jejum (Banerjee et al, 2004), enquanto a
23
visfatina, uma adipocina predominante no tecido adiposo visceral, parece desempenhar
um papel importante na regulação da homeostase glicêmica, ao se ligar ao receptor de
insulina, "mimetizando" a sua sinalização intracelular (Fukuhara et al., 2005). Os níveis
séricos dessas adipocinas são elevados em humanos e animais com excesso de
adiposidade (Calabro et al., 2009), com exceção da adiponectina que é reduzida na
presença de obesidade e da resistência à insulina (Lihn et al., 2005; Sharma e
Tarnopolsky, 2005; Trujillo e Scherer, 2005).
Uma das teorias para explicar a relação da gordura visceral com a RI propõe que
o influxo de ácidos graxos liberados pela adiposidade intra-abdominal seria responsável
pela maior síntese de triglicerídeos, pelo aumento da gliconêogenese hepática e
consequente hiperinsulinemia compensatória e RI (Fonseca-Alaniz et al., 2006).
Evidências sustentam esta teoria, uma vez que o desenvolvimento da obesidade
associada a SM parece promover a incapacidade dos adipócitos em seqüestrar
adequadamente o excesso de lipídios, resultando na redistribuição destes em outros
tecidos. O aumento de resistina e citocinas pelo tecido adiposo associado a uma
redução do hormônio sensibilizador de insulina, a adiponectina, contribui para a RI no
músculo e fígado (Fonseca-Alaniz et al, 2006).
O ambiente nutricional e hormonal durante a gravidez e lactação influenciam
fortemente na programação de apetite ao longo da vida e dos gastos de energia na
prole (Plagemann, 2006). Além disso, os mecanismos hormonais, neuronais e
autócrinos que contribuem para a manutenção do equilíbrio de energia se desenvolvem
durante este período, reforçando a importância do ambiente perinatal na determinação
da programação de sensibilidade ou resistência à obesidade. A obesidade materna
durante a gestação e a lactação, parece influenciar no fenótipo a longo prazo da prole,
predispondo-os a desenvolver o aumento da adiposidade, acompanhado por mais
níveis de leptina e de glicose na vida adulta (Srinivasan et al, 2006; Tamashiro et al
2009). O ambiente pós-natal pode até mesmo modificar a genética, levando proles de
ratas controle a desenvolverem a obesidade quando amamentadas por ratas com
predisposição genética à obesidade (Levin e Govek, 1998; Schroeder, 2010).
24
Devido a sua importância como componente da SM, a obesidade tem sido objeto
de intenso estudo, porém devido ao caráter multifatorial a gênese desse distúrbio ainda
não é bem compreendida.
1.4 Resistência à insulina
A prevalência de diabetes mellitus, especialmente do tipo II, vem crescendo
rapidamente em todo o mundo (Amos AF et al, 1997; Kim, 2010; Lardizabal &
Deedwania, 2010; Kaul, 2010). É uma das principais causas de cegueira, doença renal
terminal e amputações, além de causar grande impacto nos custos da saúde e aos
indivíduos afetados por essa doença (King H et al, 1998; Lardizabal & Deedwania,
2010; Tessier, 2010; Kaul, 2010). A obesidade central ou visceral é um importante fator
predisponente ao diabetes e à hipertensão arterial (McFarlane et al, 2001; Sowers et al,
2001). A hipertensão pode estar associada a RI e risco aumentado de desenvolver
diabetes tipo II (Bramlage et al; 2004; The Diabetes Control and Complications Trial,
2003; Griess et al; 2000).
A insulina é um hormônio polipeptídico anabólico produzido pelas células β do
pâncreas, cuja síntese é ativada pelo aumento dos níveis circulantes de glicose e
aminoácidos. Após as refeições, a insulina age em vários tecidos periféricos, tais como
o fígado, o músculo, o coração e o tecido adiposo, e nestes locais promove aumento da
captação de glicose sanguínea e da síntese protéica, além de diminuir a produção
hepática de glicose, via diminuição da gliconeogênese e glicogenólise, e reduzir a
lipólise e a proteólise (Saltiel & Kahn, 2001; Ouyang,2010; Yuan, 2010).
A RI é definida como uma resposta diminuída às ações biológicas da insulina e
isso significa uma menor ação da insulina não apenas no metabolismo dos
carboidratos, como também seu papel no metabolismo dos lipídeos, sendo a marca da
RI, a hiperinsulinemia (Meerarani et al., 2006; Nigro et al., 2006). Além disso, com o
prejuízo na ação da insulina, quadro freqüentemente encontrado em obesos, poderia
haver também a ativação de fatores pró-inflamatórios, aumento da produção das
25
espécies reativas de oxigênio (EROs), redução da disponibilidade de óxido nítrico (NO)
e baixa regulação de vias de sinalização intra-celulares (Robert et al., 2009).
A RI na obesidade é caracterizada por alterações na via de transmissão do sinal
da insulina (figura 1), com redução da concentração e da atividade quinase do receptor
de insulina, da concentração e da fosforilação de dois substratos de receptor de insulina
(IRS): IRS-1 e IRS-2. A RI é caracterizada ainda por alterações da atividade da
fosfatidilinositol 3- quinase (PI 3-K), translocação do transportador GLUT4 e da
atividade das enzimas intracelulares (Pessin
& Saltied, 2000). Estudos têm
demonstrado que as anormalidades nas respostas metabólicas na sinalização do
receptor de insulina são em parte decorrentes do aumento da atividade do sistema
renina-angiotensina-aldosterona nos tecidos insulino-sensíveis (Bramlage et al., 2004;
Griess et al., 2000) e do aumento das EROs (Evans, 2007).
Receptor
da insulina
Glicose
GLUT 4
Metabolismo da glicose
Síntese proteica / lipídica / glicogênio
Expressão gênica
Crescimento celular
Diferenciação
Expressão gênica
Figura 1 – Mecanismo de sinalização de insulina em células musculares (Adaptado de Saltiel & Kahn,
2001).
26
Na hipertensão, as características fenotípicas musculares que predispõem à RI
são: diminuição do transporte da glicose mediado pela insulina, diminuição da atividade
da glicogênio sintase, aumento do estresse oxidativo, aumento do tecido adiposo,
diminuição das fibras musculares esqueléticas sensíveis à insulina, diminuição da
geração de NO, hipertrofia vascular e aumento da vasoconstricção (Kim J-a et al, 2006).
Atualmente é amplamente conhecido o papel da RI como elo entre a obesidade
de distribuição central, intolerância à glicose, hipertensão arterial, dislipidemia e
distúrbios da coagulação (DeFronzo et al,1991; Reaven,1994; Gurevich-Panigrahi et al,
2009; Kim, 2010).
A utilização de modelos experimentais para entender o envolvimento e o
mecanismo do aumento da glicose e a RI pode ser uma importante ferramenta no
entendimento desta doença na SM. Contudo, apesar de vários estudos demonstrarem o
desenvolvimento da RI e o aumento de glicose em proles cujas mães foram expostas à
dieta hiperlipídica durante a gravidez e a lactação (Armitage et al, 2005; Khan et al.,
2003, 2004, 2005), não é completamente entendido o mecanismo do desenvolvimento
da RI na SM.
1.5 Hipertensão
A hipertensão arterial (HA) caracteriza-se pela presença de níveis de pressão
arterial (PA) elevados. Esta patologia ocorre quando a pressão arterial sistólica (PAS) é
igual ou maior que 140 mm Hg e a pressão arterial diástolica (PAD) encontra-se igual
ou superior a 90 mm Hg. Inquéritos de base populacional realizados em algumas
cidades do Brasil mostram prevalência de HA (>140/90 mmHg) de 23,3% a 43,9% (VI
Diretrizes Brasileiras de Hipertensão, 2010). A elevação da pressão arterial representa
um fator de risco independente, linear e contínuo para doença cardiovascular
(Lewington et al; 2002) com custos elevados, decorrentes de suas complicações, tais
como: doença cerebrovascular, doença arterial coronariana, insuficiência cardíaca,
27
insuficiência renal crônica e doença vascular periférica. No Brasil, em 2003, 27,4% dos
óbitos foram decorrentes de doenças cardiovasculares, atingindo a 30% em 2007. A
principal causa de morte em todas as regiões do Brasil é o acidente vascular cerebral,
acometendo as mulheres em maior proporção (VI Diretrizes Brasileiras de Hipertensão,
2010). Embora a idade e o sexo não estejam diretamente relacionados à SM, alguns
trabalhos citam a contribuição dos mesmos para o desenvolvimento de parâmetros
associados a SM. Vasan et al (2001) sugerem que a pressão arterial aumenta
linearmente com a idade. Em indivíduos jovens, a hipertensão decorre mais
freqüentemente da elevação na pressão diastólica, enquanto a partir da sexta década o
principal componente é a elevação da pressão sistólica (Franklin et al; 2005). O risco
relativo de desenvolver doença cardiovascular associado ao aumento da pressão
arterial aumenta com o avanço da idade, aumentando assim o seu risco absoluto
(Lewinton et al, 2002).
A prevalência global de hipertensão entre homens (26.6%) e mulheres (27%)
sugere que sexo não é um fator de risco para hipertensão.
Estimativas globais
sugerem taxas de hipertensão mais elevadas para homens até os 50 anos e para
mulheres a partir dos 60 anos (Kearney et al, 2005; Kim et al, 2011).
A presença de fatores de risco cardiovascular ocorre mais comumente na forma
combinada (Wilson et al, 1997; O'Gorman et al, 2010). Além da predisposição genética,
fatores ambientais podem contribuir para uma agregação de fatores de risco
cardiovascular em famílias com estilo de vida pouco saudável (Knuiman, 1996;
O'Gorman et al, 2010). Em amostras da nossa população, a combinação de fatores de
risco entre indivíduos hipertensos parece variar com a idade, predominando a
inatividade física, o sobrepeso, a hiperglicemia e a dislipidemia (VI Diretrizes Brasileiras
de Hipertensão, 2010), sendo que a obesidade aumenta a prevalência da associação
de múltiplos fatores de risco (Vanhala et al, 1998; Li et al, 2010).
A pressão arterial elevada, um dos critérios para a SM, tem sido associada a
mudanças na função das células endoteliais e na reatividade do músculo liso vascular a
agentes constritores. A “disfunção endotelial”, que é caracterizada por um impedimento
da vasodilatação dependente de endotélio (Sotomayor et al., 1999; Flammer & Lüscher,
2010), contribui para a manutenção da resistência vascular periférica elevada e
28
favorece o início prematuro da aterogênese (Dillon & Villa, 2000). A disfunção endotelial
está comumente associada com a hipertensão, hiperglicemia, dislipidemia e contribui
para a etiologia da doença cardiovascular (Heitzer et al., 2001), no entanto a
hipertensão pode estar dissociada da disfunção endotelial (Khan et al; 2003).
Em estudos experimentais, ratos adultos provenientes de uma prole submetida à
dieta rica em gordura animal (20%) durante o período de gestação e lactação
desenvolveram hipertensão, comparados aos animais que receberam dieta balanceada
no mesmo período (Khan et al., 2003, 2004). Da mesma forma, utilizando uma dieta
materna suplementada com gordura saturada de origem vegetal (10% de óleo de coco),
Langley-Evans (1996) mostrou um aumento da pressão arterial sistólica da prole.
Entretanto, a ingestão materna de ácido graxo polinsaturado (10% de óleo de milho)
não resultou em elevação da pressão, indicando que certos ácidos graxos devem ser
mais deletérios que outros.
Evidências experimentais demonstram que, assim como a hipertensão, a dieta
materna rica em gordura animal também produz disfunção endotelial na prole adulta,
medida pelo relaxamento dependente de endotélio reduzido, em artérias mesentéricas
(Khan et al., 2003), assim como em artéria aorta (Armitage et al., 2004). A redução da
biodisponiblidade do NO está associada à disfunção endotelial e pode explicar em parte
a elevação da pressão arterial neste modelo (Khan et al., 2005).
1.6 Endotélio e disfunção vascular
O endotélio é uma camada única e contínua de células organizadas em forma de
fuso que separa o sangue da parede vascular e do interstício. O fluxo sanguíneo com a
sua força de cisalhamento (“shear stress”), atua sobre as células endoteliais através de
uma cascata de eventos que conduzem a produção de NO, pela enzima NO-sintase
endotelial (eNOS) (Bahia et al., 2006).
A importância do endotélio no processo de vasodilatação foi descrita por
Furchgott e Zawadzki (1980), que demonstraram que a remoção mecânica ou química
29
do endotélio impedia a vasodilatação induzida pela acetilcolina (ACh) em artérias
isoladas
de
coelho,
concluindo
que
o
endotélio
produzia
uma
substância
vasodilatadora, denominada de fator de relaxamento derivado do endotélio (EDRF).
Estudos posteriores, realizados com o objetivo de identificar a natureza química do
EDRF (Ignarro et al., 1987) constataram que tal fator se tratava do NO.
O NO é produzido pelo endotélio pela ação da enzima eNOS que converte o
aminoácido L-arginina a NO + L-citrulina, catalisando a oxidação de cinco elétrons com
a participação de NAD(P)H/NADP+ e do complexo cálcio/calmodulina (Malinski., 2005).
O relaxamento da musculatura lisa vascular induzido pelo NO é mediado principalmente
pela ativação da enzima guanilato ciclase solúvel muscular, que por sua vez, transforma
GTP em GMPc. O aumento dos níveis de GMPc no interior das células musculares
lisas, promove a diminuição da entrada de Ca2+ para a célula, a inibição da liberação de
Ca2+ do retículo endoplasmático e o aumento do seqüestro de Ca2+ para o retículo
endoplasmático, causando assim, redução da concentração de Ca2+ citosólico e
conseqüente relaxamento vascular (Rapopport & Murad, 1983).
A função do NO é regular o tônus vascular pela ação vasodilatadora sobre as
células musculares lisas e de inibição da atividade plaquetária e da proliferação das
células musculares lisas da parede vascular (Ramachandran et al., 2002) sendo
fundamental na modulação da PA (Flammer & Lüscher, 2010).
Além do NO, o endotélio produz outras substâncias vasodilatadoras, como as
prostaglandinas vasodilatadoras e o fator hiperpolarizante derivado do endotélio
(EDHF), assim como, substâncias vasoconstritoras, como a angiotensina II (Ang II) e
endotelina (Bahia et al., 2006; Flammer & Lüscher, 2010).
Vários estudos demonstram que a remoção do endotélio aumenta a resposta a
uma variedade de agentes vasoconstrictores, tanto em preparações vasculares de
animais normotensos como hipertensos, indicando que estas células exercem um papel
inibitório sobre a função contrátil do músculo liso vascular (Callera et al., 2004; Flammer
& Lüscher, 2010).
Em condições fisiológicas, o endotélio é responsável pela manutenção do tônus
vascular e da homeostase intravascular. Atua conservando o fluxo sanguíneo laminar,
preservando a fluidez da membrana plasmática, pois inibe a adesão de monócitos e
30
neutrófilos à camada endotelial e conseqüentemente a proliferação e migração celular,
controlando a resposta inflamatória (Bahia et al., 2006; Flammer & Lüscher, 2010).
Em contrapartida, evidências crescentes atribuem à disfunção endotelial, um
papel importante na fisiopatologia da hipertensão (Suzuki et al., 1995; Taddei et al.,
1996; Félétou et al, 2010), já que contribui para elevada resistência periférica,
favorecendo a ocorrência de complicações cardiovasculares (Sotomayor et al, 1999;
Félétou et al, 2010). Dentre os principais fatores que contribuem para a etiologia da
disfunção endotelial, grande destaque tem sido dado ao estresse oxidativo (Dai & Dai,
2010).
1.7 Estresse oxidativo
As espécies reativas de oxigênio (EROs) e de nitrogênio são produzidas de
forma contínua pelas células como parte de seus processos metabólicos. Em condições
patológicas, o estresse oxidativo representa um desequilíbrio entre a formação e
remoção destas espécies, decorrente da diminuição dos antioxidantes endógenos ou
ainda do aumento da geração de espécies oxidantes (Touyz, 2004; Victor & Rocha,
2007; Ďuracková, 2010).
As EROs são derivadas do metabolismo do oxigênio encontradas no ambiente e
em todos os sistemas biológicos (Touyz & Shiffrin, 1999; Loukides et al., 2011). No
sistema cardiovascular, EROs exercem um papel fisiológico essencial, mantendo a
integridade cardíaca e vascular. No entanto, as EROs também possuem um papel
fisiopatológico na disfunção cardiovascular associado a condições como hipertensão,
diabetes, aterosclerose (Landmesser & Harrison, 2001; Zalba et al., 2001; Ďuracková,
2010). As principais EROs nestes processos são.O2-, H2O2, OH.e a espécie reativa de
nitrogênio, peroxinitrito (ONOO-).
Fisiologicamente, as EROs são produzidas de uma maneira controlada em
baixas concentrações e funcionam como moléculas de sinalização regulando
contração-relaxamento da célula do músculo liso vascular (VSMC) (Rao and Berk,1992;
31
Cosentino et al., 1994; Zafari et al., 1998; Touyz, 2005; Ďuracková, 2010). As EROs são
indispensáveis em muitos processos bioquímicos, incluindo sinalização intracelular,
diferenciação celular, apoptose (Ghost 1998) e defesa contra microorganismos (Bae e
cols.1997; Lee e cols. 1998).
Em condições patológicas, a produção aumentada de EROs, caracterizando um
estado de estresse oxidativo, leva a disfunção endotelial, contratilidade aumentada,
crescimento da VSMC e apoptose, migração de monócito, peroxidação lipídica,
inflamação, deposição aumentada de proteínas da matriz extracelular e dano de DNA,
contribuindo para o dano vascular na doença cardiovascular (Rao & Berk, 1992;
Harrison, 1997; Landmesser & Harrison, 2001; Zalba et al., 2001; Schafer and Buettner,
2001; Mendes et al., 2009;Touyz et al., 2011). Estudos descrevem que as EROs em
altas concentrações podem agir tanto diretamente através da oxidação do DNA e/ou
modulando a expressão gênica, quanto indiretamente pela oxidação de lipídeos,
induzindo
apoptose
e
influenciando
outras
moléculas
importantes
para
o
desenvolvimento (Luo et al, 2006). Os mecanismos de defesa antioxidantes mantêm a
sobrevivência dos organismos contra o estresse oxidativo.
As EROs são produzidas em quantidades variadas nos diferentes tecidos e são
regulados por anti-oxidantes como as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase e
glutationa peroxidase além de vitaminas anti-oxidantes e outras moléculas pequenas
(Stralin et al, 1995; Halliwell, 1999; Channon & Guzik, 2002; Ďuracková, 2010). Sob
condições normais, a taxa de produção de EROs é equilibrada pela taxa de eliminação.
Vários tipos celulares, incluindo células endoteliais, células do músculo liso,
fibroblastos, e macrófagos residentes, produzem EROs, cuja principal fonte é a enzima
NADPH oxidase.
A NOS, a principal enzima responsável pela produção de NO,
também é capaz de gerar O2-. A ação cooperativa de NO e O2- resulta na formação de
peroxinitrito (ONOO-), um poderoso oxidante de proteínas. O ONOO- pode,
posteriormente, protonar-se na presença de íon hidrogênio (H+), originando o radical
hidroxil (HO.) que é altamente reativo e tóxico, aumentando efetivamente a ação tóxica
do NO e do O2- (Touyz, 2011).
Outras fontes enzimáticas capazes de gerar EROs compreendem a xantina
oxidase, citocromo p450 e enzimas da cadeia respiratória mitocondrial. Entretanto, a
32
contribuição destas enzimas para a geração de EROs é relativamente menor quando
comparada com a NADPH oxidase (Touyz, 2004; Touyz, 2011). A NAD(P)H oxidase é
regulada por agentes vasoativos (Ang II, ET-1, trombina e serotonina), citocinas (IL-1,
TNF α), fatores de crescimento (PDGF, IGF-1, EGF) e forças mecânicas. Entretanto,
dos fatores vasoativos que estimulam a ativação da NAD(P)H oxidase, a Ang II parece
ser um dos mais importantes na vasculatura (Touyz, 2011).
Todos os componentes celulares são suscetíveis à ação das EROs, porém a
membrana celular é um dos mais atingidos em decorrência da peroxidação lipídica, que
acarreta alterações na estrutura e na permeabilidade da mesma (Victor & Rocha, 2007).
As membranas das células e organelas contêm grandes quantidades de ácidos
graxos poliinsaturados. A fluidez da membrana está relacionada com a presença de
cadeias insaturadas dos fosfolipídios e do colesterol e danos desta camada lipídica
tendem a diminuir a fluidez da membrana. O ataque de algumas espécies reativas que
abstraem um átomo de hidrogênio do grupo metileno das cadeias de ácidos graxos
poliinsaturados inicia o processo de peroxidação lipídica (Halliwell & Guitteridge, 1991;
Victor & Rocha, 2007).
Os radicais de carbono formados dessa maneira podem reagir espontaneamente
com o oxigênio, formando radicais peroxila que propagam a cadeia de peroxidação
lipídica abstraindo átomos de hidrogênio para formar hidroperóxidos e novos radicais de
carbono, levando à oxidação de muitas moléculas e ácidos graxos (Jialal & Grundy,
1992; Sarkar, 2010).
Muitos biomarcadores vem sendo utilizados para avaliar o estresse oxidativo,
tais como, malondialdeído (MDA), dienos conjugados, gases etano e pentano,
isoprostanos, 4-hidroxi-nonenal (4-HNE), carbonilação de proteínas e modificações no
DNA (Foucaud et al, 2010; Moler, 2010).
Os mecanismos envolvidos na programação da SM pelo desequilíbrio da dieta
materna são provavelmente multifatoriais e complexos. Em revisão, Reilly & Rader
(2003) incluem o estresse oxidativo como biomarcador da SM.
Foram observadas
correlações significativas entre níveis plasmáticos maternos e fetais de antioxidantes e
marcadores do estresse oxidativo, sugerindo que os níveis de estresse oxidativo
materno podem ser transferidos para o feto (Arikan et al., 2001). Reforçando esta
33
hipótese, estudos em modelo animal, mostram que a hipertensão observada na prole
induzida pela restrição calórica de ratas durante a gravidez e lactação, é reduzida com
o tratamento da superóxido dismutase (Franco et al.,2007) e com vitamina C e E
(Franco et al., 2003) .
A ingestão excessiva e crescente de nutrientes, particularmente de refeições
com alto teor calórico e de ácidos graxos que são pró-oxidantes (Willcox et al, 2004)
devem resultar numa programação de desenvolvimento adversa e podendo contribuir,
pelo menos em parte, para o aumento da epidemia da SM. Entretanto, não existem
evidências de que estados de excesso nutricional durante a gestação e lactação
possam causar um aumento do estresse oxidativo durante estes períodos críticos do
desenvolvimento, podendo ser este um dos principais responsáveis pelas alterações
que levariam à programação do desenvolvimento.
Dessa forma, nossa hipótese é de que em ratas submetidas à dieta hiperlipídica,
durante a lactação, o estresse oxidativo gerado, consiste numa explicação potencial
para o desenvolvimento da obesidade, hipertensão e alterações metabólicas na prole
adulta.
1.8 Sistema de defesa antioxidante
Para se proteger e evitar os danos causados pelas EROs, o organismo
desenvolveu vários mecanismos de defesa, potenciais de neutralização das ações das
EROs, chamados de antioxidantes. Os antioxidantes podem ser classificados como
enzimáticos e não enzimáticos conforme a estrutura do agente antioxidante. O sistema
enzimático é o primeiro a agir, evitando o acúmulo de O2- e de H2O2 e é formado por
diversas enzimas, destacando-se a superóxido-dismuase (SOD), catalase e glutationa
peroxidase (GSH-Px). Os antioxidantes não enzimáticos são exógenos em sua maioria.
Os principais são: vitaminas lipossolúveis (vitamina A, E e betacarotenos), vitaminas
hidrossolúveis (Vitamina C e Vitaminas do complexo B) e os oligoelementos (zinco,
cobre, selênio, magnésio, etc.). Com exceção da Vitamina E, que é um antioxidante
34
estrutural da membrana, os agentes antioxidantes se encontram no meio intracelular
(Ferreira & Matsubara, 1997; Kojo, 2004; Valko, 2007).
A SOD é o maior sistema de defesa da célula vascular. Em mamíferos existem
três isoformas: a SOD-cobre-zinco (SOD1) está presente principalmente no citosol,
SOD-manganês (Mn SOD, SOD2) está localizada primariamente na mitocôndria e a
SOD extracelular (ecSOD, SOD3) (Paravicini & Touyz, 2008). Esta enzima tem papel
antioxidante, pois catalisa a dismutação do ânion .O2- em H2O2 e O2, na presença do
próton H+ (Figura 2) (Ross & Moldeus, 1991; Acharya et al., 1991; Valko, 2007).
A Glutationa Peroxidase (GSH-Px) tem ação fundamentalmente citosólica e
catalisa a redução do H2O2 e peróxidos orgânicos através da utilização da glutationa
(GSH) que atua como co-substrato da glutationa peroxidase, com propriedade de
doador de elétrons, a qual poderá ser regenerada através da glutationa redutase (GR)
com a transferência do hidrogênio do NADPH (Marsella et al, 2005; Valko, 2007;
Paravicini & Touyz, 2008).
A catalase é uma hemeproteína citoplasmática, localizada nos peroxissomas e
também no citosol, que catalisa a redução do H2O2 a H2O e O2 (Figura 2). A catalase é
muito efetiva em níveis altos de estresse oxidativo e protege as células da produção de
H2O2. A suplementação de catalase exógena previne a oxidação de GSH mediada pelo
H2O2 (Ferreira & Matsubara, 1997;Heck et al,2010).
35
Figura 2. Diagrama demonstrando a redução univalente do oxigênio, na presença de um elétron
livre, formando O2- e a ação das enzimas antioxidantes SOD, catalase e glutationa peroxidase.
Adaptado de Toyuz, 2004.
1.9 Extrato da casca de uva (Grape Skin Extract - GSE)
O consumo de vinho tinto tem sido relacionado ao menor número de mortes por
isquemia coronariana (St.Leger, em 1970). Esta idéia foi ampliada em 1992, quando
Serge Renaud observou que a maioria dos países que consumia uma quantidade
elevada de gordura saturada estava positivamente relacionada com alta mortalidade
por doença cardíaca coronária, mas que, entretanto, esta associação não era
observada na França, que mesmo consumindo grandes quantidades de gordura
saturada, apresentavam baixa mortalidade por doença cardíaca. Esta relação ficou
conhecida como “Paradoxo Francês” e foi atribuída ao consumo elevado de vinho e à
dieta mediterrânea (Renau s. & Lorgeril., 1992). A partir deste paradoxo, diversos
autores vêm demonstrando que o consumo prolongado de vinho tinto em doses
36
moderadas é benéfico para a saúde (Pérez-Jiménez, 2008; Saleem, 2010; Shukla,
2010).
Vários trabalhos sugerem que o uso moderado de vinho, apresenta uma série
de efeitos benéficos em relação à ocorrência de acidentes cardiovasculares. Da luz et
al (1999) demonstraram que o vinho tinto reduziu o número de placas ateroscleróticas
em coelhos que receberam uma dieta gordurosa sugerindo, que o vinho tinto tem
propriedades que inibem o processo aterosclerótico. O vinho parece também ter ação
na inibição da agregação plaquetária (Demrow et al, 1995), diminuição da oxidação da
lipoproteína de baixa densidade (LDL) (Hertog, 1993), efeito antioxidante (Frankel et al,
1993), redução da síntese de endotelina (Corder et al, 2001), aumento na expressão e
atividade da eNOS (Wallerath et al, 2003) e ação anti-hipertensiva (Soares de Moura et
al 2002). Estudos experimentais descrevem que o efeito cardioprotetor do vinho é
oriundo da presença significativa de polifenóis em sua composição, dentre os quais se
destacam o resveratrol e os flavanóides (Soares de Moura et al, 2004; Demrow et al,
1995; Frankel et al, 1993; Scalbert & Williamson, 2000).
Estudos epidemiológicos demonstram que há uma correlação inversa entre o
consumo de polifenóis e a incidência de riscos cardiovasculares (St Leger et al, 1979;
Renauld et al, 1992; Gronbaek et al., 2000). Os polifenóis naturais obtidos de várias
plantas têm mostrado importantes ações no sistema cardiovascular e devem ser uma
fonte potencial de novos compostos para o tratamento de doenças cardiovasculares e
metabólicas (Dohadwala et al. 2009). Entre os vários mecanismos cardioprotetores dos
polifenóis podemos citar a redução da agregação plaquetária, efeitos antioxidantes,
aumento da produção de fatores vasodilatadores (NO, EDHF e prostaciclinas), inibição
dos vasoconstrictores (endotelina-1) em células endoteliais e inibição de fatores próangiogênicos (fator de crescimento endotelial vascular e metaloproteinase-2) em células
musculares (Seifried et al., 2007; Stoclet et al, 2004, Soares de Moura et al, 2004). O
resveratrol tem a capacidade de diminuir as taxas de colesterol-LDL, que se deposita
na parede das artérias. Esta substância também aumenta o nível de colesterol-HDL que
se liga as partículas de gordura impedindo a formação de placas de ateroma,
diminuindo os riscos de doenças cardiovasculares (Bhat et al, 2001). Estudos sugerem
que os polifenóis possuem papel protetor contra desordens relacionadas a idade
37
(doenças neurodegenerativas), inflamação, diabetes, doenças cardiovasculares (Brown
et al; 2009 ; Baur et al, 2006; Fan et al, 2007; Kris-Etherton et al, 2008), câncer, bem
como a capacidade de previnir eventos celulares que predispõem à aterosclerose e
doença arterial coronariana (Katiyar et al, 2008; Iwamoto et al, 2000).
O extrato das sementes da Vitis vinifera mostrou ter um efeito preventivo contra o
desenvolvimento do câncer (Vanzo, 2008), e em modelo de camundongo obeso
exposto a uma dieta hiperlipíidica (Park e col., 2008) foram observados a redução da
obesidade, dos níveis de triglicerídeos e do colesterol-total.
A partir das evidências, sugerindo que o consumo moderado de vinho exerce um
efeito cardioprotetor, nosso laboratório resolveu investigar os possíveis efeitos
benéficos de um extrato obtido da casca de uva Vitis vinifera (figura 3) livre de álcool.
Figura 3. Foto da Vitis vinifera
Nossos estudos prévios sugerem que o extrato da casca de uva Vitis vinifera
(GSE), largamente utilizada no Brasil para a produção de vinho, produz efeito
vasodilatador dependente de endotélio e mediado por NO-GMPc e pelo EDHF (Soares
de Moura et al., 2002; Soares de Moura et al., 2004; Madeira et al., 2005). Além disso,
demonstramos que o GSE produz efeito anti-hipertensivo em diferentes modelos
38
experimentais de hipertensão, assim como efeito antioxidante (Soares de Moura et al.,
2002). Recentemente observamos que o GSE estimula a liberação de NO em células
coronárias em cultura (Madeira et al., 2009) e diminui a RI, em ratas grávidas com préeclampsia induzida por L-NAME (De Moura et al., 2007).
O GSE é um extrato hidro-alcoólico da casca de uvas viníferas, Vitis vinifera, rico
em polifenóis. Estes são importantes para a pigmentação, reprodução, crescimento e
para proteção contra patógenos nas plantas (Zern & Fernández, 2005). Dentre os
alimentos de origem natural onde os polifenóis são encontrados temos frutas e
vegetais, sendo as uvas viníferas os mais ricos.
Os polifenóis podem ser definidos como substâncias aromáticas, de origem
natural, contendo uma ou mais hidroxilas. Eles são agrupados em duas categorias,
designadas flavonóides e não-flavonóides. Os flavonóides compreendem a maioria dos
polifenóis derivados da casca da uva vinífera, e são definidos como compostos que
contêm um sistema formado por três anéis, sendo que dois são aromáticos
(Waterhouse, 2005).
De acordo com o grau de oxidação, os flavonóides podem ser classificados em
diversas subclasses, sendo as três maiores, as dos flavanóis (ex: catequina e
epicatequina);
flavonóis
(ex:
quercetina
e
kaempferol)
e
antocianinas
e/ou
antocianidinas (ex: malvidina e delfinidina). Os não flavonóides são classificados em
ácidos hidroxinâmicos (ex: vescaligina) e estilbenos (ex: ácido caféico), ácidos
benzóicos (ex: ácido gálico), taninos hidrolizáveis (ex: vescaligina) e estilbenos (ex:
resveratrol) (figura 4) (Waterhouse, 2005).
39
Flavonóides
Flavanol (Catequina)
Flavonol (Quercetina)
Antocianina (Cloreto de
malvidina)
Não-flavonóides
Ácidos hidroxinâmicos (Ácido caféico)
Ácidos benzóicos (ácido gálico)
Estilbenos (resveratrol)
Figura 4. Estrutura química de alguns polifenóis.
40
A concentração total de polifenóis nas uvas viníferas, extraídos pelo método de
Follin-Ciacalteau, pode variar entre 1,2 e 4,1 g/Kg (Mattivi et al., 2002). Acredita-se,
ainda, que a concentração das substâncias presentes nas uvas, variam de acordo com
o tipo de uva, solo onde são cultivadas, os métodos de cultivo e condições climáticas
como exposição a luz solar (Ryan & Revilla, 2003; Zafrilla et al., 2003).
Recentemente estudos químicos mostraram que o GSE é rico em antocianinas
como a peonidina-3-O-glicosídeo, petunidina-3-O-glicosídeo, malvidina-3-O-glicosídeo e
malvidina-3-(6-O-trans-p-cumaril)-5-O-diglicosídeo (Soares de Moura et al., 2011 artigo
submetido). Todos estes compostos, já foram previamente descritos em diferentes
espécies de Vitis spp. (Garcia-Beneytez et al., 2003; Flamini, 2003; Wang et al., 2003).
Com o objetivo de ampliar nossos conhecimentos sobre os mecanismos dos
efeitos benéficos do extrato da casca de uvas (GSE), sobre as doenças
cardiovasculares e metabólicas em um modelo experimental de programação do
desenvolvimento, estudamos o papel do período de lactação e os efeitos do tratamento
com o GSE sobre a programação cardiovascular, metabólica e o possível estresse
oxidativo na prole adulta (machos e fêmeas), de ratas submetidas à uma dieta
hiperlipídica na lactação.
41
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Comparar um estudo “in vitro” e ‘in vivo’’ das alterações cardiovasculares,
metabólicas e do estado oxidativo relacionadas à idade (3 e 6 meses) e ao gênero
(machos e fêmeas) na prole adulta de animais submetidos à dieta rica em gordura
animal (24%), durante a lactação. Avaliamos o efeito do tratamento com extrato da
casca da uva (GSE) (vitis vinífera) durante o período de lactação sobre as alterações
observadas na prole adulta.
2.1 Objetivos específicos
•
Investigar o efeito do GSE sobre o peso corporal e adiposidade;
•
Avaliar o efeito do GSE sobre o desenvolvimento da hipertensão e possíveis
alterações da função endotelial;
•
Determinar os níveis plasmáticos de triglicerídeos e colesterol total e avaliar o efeito
do GSE sobre esses parâmetros;
•
Investigar o efeito do GSE sobre a glicemia, insulina plasmática e expressão de
proteínas da cascata de sinalização da insulina em músculo esquelético;
•
Investigar o efeito do GSE sobre o dano oxidativo medido pelos níveis de
malondialdeído e a defesa antioxidante pela medida da atividade das enzimas SOD,
CAT e GPx em plasma e vasos mesentéricos;
•
Avaliar o efeito do GSE sobre os níveis de nitrito plasmático e vascular.
42
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Preparação do extrato hidroalcoólico de cascas de uvas viníferas (GSE)
A uva Vitis vinifera foi obtida de plantações selecionadas localizadas no estado
do Rio Grande do Sul.
As uvas foram lavadas em água corrente e as cascas
separadas da polpa. Aproximadamente 100g de cascas secas de Vitis vinifera foram
extraídos por uma solução aquosa a 100 ° C com agitação ocasional por cerca de 120
minutos. A solução foi, então, introduzida em uma coluna com resina de troca iônica
(catiônica). A resina foi lavada seqüencialmente por EtOH, EtOH: H2O (1:1) e H2O. A
fração de H2O foi descartada. As frações etanólica e hidroalcoólica foram colocadas
juntas e evaporadas sob vácuo a 60 ° C. A solução concentrada foi então, seca por um
vaporizador (temperatura de entrada de 190 ° C e de saída de 85 ° C). O extrato obtido
no processo é um pó fino solúvel em H2O, que tem cerca de 30% de polifenóis totais de
acordo com o Folin-Ciocalteau.
3.2 Animais utilizados e dieta experimental
Todas as experiências foram aprovadas pelo Comitê de Ética de Experiências
Animais da Universidade do Estado do Rio de Janeiro (N0. CEA/025/2010).
Ratas Wistar normotensas, nulíparas, com três meses de idade, foram mantidas
no Biotério do Departamento de Farmacologia e Psicobiologia/ IBRAG/ UERJ, em
temperatura média de 23º C e com ciclo de luminosidade de 12hs (claro e escuro). Os
animais tiveram livre acesso à ração industrializada específica para ratos (NUVILAB®).
Após o acasalamento, na proporção de 3 fêmeas para um macho (da mesma espécie),
a gravidez foi detectada por meio de esfregaço vaginal (Marcondes e col, 2002). Um dia
após o nascimento, a prole foi ajustada para oito animais, para prevenir uma variação
no crescimento neonatal através da disponibilidade de ingestão de leite durante
amamentação, e quando possível foi igualado o número de ratos (4 machos e 4
43
fêmeas). As ratas foram alimentadas com livre acesso à ração e água durante a
lactação com uma dieta controle (dieta padrão para ratos) ou dieta hiperlipídica (dieta
experimental contendo 20% de banha animal e 4 % de óleo). Ambas as dietas (Tabela
01) foram balanceadas por nutricionista baseado na AIN-93G (Reeves e col., 1993) do
laboratório de Nutrição Experimental (Instituto de Nutrição da UFF). Dessa forma, as
ratas foram divididas em 4 grupos experimentais:
a) Grupo Controle (C): receberam dieta padrão para ratos durante a lactação;
b) Grupo C+GSE: receberam dieta padrão para ratos na lactação e concomitantemente
200 mg/ kg de GSE dissolvidos em 35 ml de água/dia.
c) Grupo hiperlipídico (H): receberam dieta experimental durante a lactação;
d) Grupo H+GSE: receberam dieta experimental na lactação e concomitantemente 200
mg/ kg de GSE dissolvidos em 35 ml de água/dia.
Dietas
Nutrientes (Unid/Kg dieta) Controle Hiperlipídica
Caseina (g)
251,16
226,74
Amido (g)
478,5
330
Glicose (g)
100
100
Óleo de milho (g)
70
43
Banha animal (g)
200
Fibras(g)
50
50
Mistura de minerais* (g)
35
35
mistura de vitaminas* (g)
10
10
L-cistina (g)
3
3
Colina (g)
2,5
2,5
Energia (kcal)
% Carboidratos
% Proteínas
% Gordura
3636,8
58,9
23,8
17,3
4614,9
35,7
16,9
47,4
* A mistura de minerais e vegetais segue
as recomendações para roedores da AIN-93G.
Tab.1 – Composição das dietas padrão e hiperlipídica.
44
As proles (machos e fêmeas) de matrizes dos grupos C e H foram divididas,
após o desmame (21 dias de vida) nos seguintes grupos:
a) Grupo Controle: prole cuja matriz recebeu dieta padrão e que foram sacrificadas aos
90 ou 180 dias de idade.
b) Grupo hiperlipídico: prole cuja matriz recebeu dieta hiperlipídica e que foram
sacrificadas aos 90 ou 180 dias de idade.
c) Grupo Controle + GSE: prole cuja matriz recebeu dieta padrão e tratamento com 200
mg/kg de GSE dissolvidos em 35 ml de água/dia, durante lactação e foram sacrificadas
aos 90 ou 180 dias de idade.
d) Grupo hiperlipídico + GSE: prole cuja matriz recebeu dieta hiperlipídica e tratamento
com 200 mg/kg de GSE dissolvidos em 35 ml de água/dia, durante lactação e foram
sacrificadas aos 90 ou 180 dias de idade.
A pressão das ratas foi aferida até a confirmação da gravidez, cessando assim
para que não promovesse um estresse por manipulação.
O consumo de ração e a ingesta de líquido das matrizes, assim como o seu peso
foram aferidos durante a lactação, a cada 2 dias, e o consumo (ração e líquido) diário
foi calculado fazendo a diferença da oferta (líquido/ração) pela sobra dividida pelo
número de animais (n) vezes dois (referente aos dias), então:
Ingesta (líquido/ração) = (Oferta – sobra)/2n
Após 24 horas do nascimento da prole (macho e fêmea), o comprimento rostroanal e a massa corporal dos filhotes foram aferidos semanalmente até os 90 ou 180
dias.
A medida indireta da pressão arterial foi realizada em proles (machos e fêmeas)
a partir de 45 dias de idade, durante 90 ou 180 dias.
A medida da glicemia de jejum foi realizada através de um pequeno furo na
extremidade distal da cauda (realizado com uma agulha descartável) na idade de 90 ou
180 dias de idade, e foi dosada com o auxílio de um medidor automático (ACCU CHECActive, Roche®), baseado na reação glicose-glicose oxidase.
45
Os animais foram anestesiados, com pentobarbital sódio intraperitoneal
(0,42mg/Kg), na idade de 90 ou 180 dias para coleta de sangue arterial através da
aorta abdominal em um tubo com anticoagulante (EDTA), e em seguida submetidos a
laparotomia onde foi retirado rapidamente o leito arterial mesentérico (LAM), gorduras
abdominal e gonadal e músculo sóleus das duas pernas. Os órgãos foram pesados e
corrigidos pelo peso do animal (órgão/peso do animal). O LAM foi utilizado para
avaliação da reatividade vascular logo após a sua retirada ou junto com os demais
tecidos e armazenado no freezer -80ºC (Thermo Scientific 991).
As amostras de sangue foram, imediatamente após a sua retirada, centrifugadas
(4ºC/10 min, a 3000 rpm) para obtenção do soro e foram armazenadas no freezer -20ºC
para as dosagens séricas.
A fim de minimizar qualquer manipulação na obtenção e análise dos dados, os
protocolos foram realizados com animais provenientes de pelo menos seis ninhadas (C,
H, C+GSE OU H+GSE).
3.3 Medida da pressão arterial por pletismografia de cauda
A medida da PAS (mm Hg) foi realizada nos animais (machos e fêmeas) dos
diferentes grupos experimentais, por método não invasivo de pletismografia de cauda
(Letica LE 5000). A medida foi realizada nos ratos acordados, três vezes por semana,
por meio de um garrote e de um sensor de pulso posicionados em torno da cauda do
animal. Estes foram conectados ao registrador, o qual insufla e desinsufla
automaticamente o garrote, e detecta o desaparecimento e o aparecimento da onda de
pulso na artéria caudal, e assim determina a PAS.
Foi realizado o treinamento prévio (duas semanas) dos animais para reduzir a
influência do estresse induzido pela manipulação do animal e as condições do
ambiente da sala de aferir pressão.
46
3.4 Isolamento do leito arterial mesentérico (LAM) de rato
Após o registro da PA, os ratos foram anestesiados para coleta de sangue
arterial através da aorta abdominal, e em seguida submetidos a laparotomia. O LAM foi
estendido para o exterior da cavidade abdominal e envolto em gaze umedecida com
solução nutriente de Krebs modificada (g/L), NaCl (Cloreto de Sódio) (6.9); KCl (Cloreto
de Potássio) (0.35); CaCl2.2H2O (Cloreto de Cálcio dihidratado) (0.44); MgSO4 (Sulfato
de Magnésio) (0.29); NaHCO3 (Bicarbonato de Sódio) (2.1); KH2PO4(Fosfato de
Potássio Monobásico) (0.16); C6H12O6 (Glicose) (2.0). Os ramos pancreático-duodenal,
íleo-cólico e cólico direito da artéria mesentérica superior foram ligados e seccionados.
O intestino delgado foi ligado e seccionado à altura do jejuno proximal e do íleo distal. A
artéria mesentérica superior foi isolada na sua origem, à altura da artéria aorta
abdominal e canulada com um tubo de polietileno (PE 50; Clay-Adams), de
aproximadamente 4 cm de comprimento, preenchida com solução de Krebs
heparinizada. Em seguida, o intestino delgado foi separado do leito vascular, cortandose rente à borda intestinal, e a preparação lavada com solução de Krebs modificada.
3.5 Medida da reatividade do LAM às substâncias vasoativas
Após o isolamento, a preparação vascular foi colocada em uma cuba (volume de
10 ml) e constantemente perfundida por meio da cânula inserida na artéria mesentérica
superior que foi conectada a uma bomba peristáltica (Lifecare Model 4, Abbott/Shaw). A
solução de Krebs, mantida à 37º C e aerada com mistura carbogênica (95% O2 e 5%
CO2) foi infundida à velocidade constante de 4ml/min e a pressão de perfusão
registrada continuamente em polígrafo (HP 8805B), por meio de um transdutor de
pressão (HP1280) (Figura 6).
47
Ligado ao polígrafo
(registro)
Transdutor de
pressão
Injeções
“in bolus”
Entrada
da água
LVM
Cuba
Escape do
Líquido de
Líquido de
perfusão
Saída da
água
Passagem
da água
Aquecimento do circuito
Perfusão
Bomba de
perfusão
Figura 5. Esquema do sistema de perfusão do leito arterial mesentérico isolado de rato (Carvalho,
LCRM; 2002).
Os experimentos foram precedidos de um período de 30 minutos de
estabilização da preparação, durante o qual a pressão de perfusão basal deve se
manter próxima de 20 a 40 mm Hg (Resende et al., 1998) e então, foram administradas
injeções de 120 µmol de KCl.
Em seguida, iniciou-se o período de sensibilização
vascular, no qual a norepinefrina (NE) foi adicionada à solução de perfusão, em
concentração suficiente (30 µM) para que a pressão de perfusão se mantivesse estável
em torno de 80-100 mm Hg. Logo após a obtenção de uma resposta pressora induzida
pela NE, testamos a capacidade do endotélio vascular de liberar NO, com a injeção de
ACh (1-100 pmol), a qual produz um efeito vasodilatador que é dependente da
liberação de NO pelas células endoteliais. A resposta vasodilatadora foi expressa em
termos de % de queda da resposta pressora induzida pela NE. As injeções “in bolus”
das substâncias utilizadas nos experimentos foram realizadas por meio de um injetor
acoplado ao sistema de perfusão, por meio de micro-seringas de 10 e 100 µl
(Hamilton). O intervalo entre as injeções foi de aproximadamente 5 minutos, permitindo
sempre o retorno e estabilização da pressão de perfusão aos níveis anteriores e as
injeções foram administradas em volumes que variam de 5 a 50 µl.
48
3.6 Dosagens séricas
3.6.1 Perfil lipídico
Os triglicerídeos totais, o colesterol total e a lipoproteína de alta densidade (HDL)
foram determinados através de kit comercial (Analisa®, Brasil) que se baseiam em
métodos enzimático-colorimétricos. As concentrações séricas foram expressas em
mg/dL.
3.6.2 Insulina
A dosagem da insulina foi realizada em plasma da prole (macho e fêmea) com
90 ou 180 dias, através de kit para diagnóstico de insulina (MP Biomedicals 125I RIA Kit).
O valores foram expressos em µUI\mL.
3.6.3 Análise da sensibilidade à insulina
O indicador da sensibilidade à insulina foi obtido através do índice de HOMA-IR
(Homeostasis Model Assessment) calculado pela fórmula: insulina de jejum (µUI/mL) x
glicose de jejum (mmol/L)/22,5 (Wallace, 2004).
49
3.6.4 Estradiol
O 17β-estradiol foi dosado através do kit comercial MP Biomedicals, LLC que se
baseia em método radioimunoensaio. As concentrações séricas foram expressas em
pg/dL.
3.7 Atividade das enzimas antioxidantes
A medida da atividade das enzimas antioxidantes SOD, catalase e GPx, foi
realizada em amostras de plasma e de vasos mesentéricos.
3.7.1 Medida da superóxido dismutase
O produto resultante da reação catalisada pela SOD é o H2O2 que deve ser
retirado do meio o mais rápido possível. Uma unidade de enzima é definida pela
quantidade transformada em 1 µmol de substrato por minuto. A atividade enzimática foi
estimada pela inibição da auto-oxidação da adrenalina medida espectrofometricamente
Ultrospec 2100 pro (480 nm). A adrenalina é oxidada pelo O2•- para formar um produto
róseo, adrenocromo. Esta padronização foi realizada utilizando a técnica descrita por
Bannister & Calabrese (1987) e adaptada para o tecido vascular.
Foram utilizados 20, 40 e 60µl da amostra (plasma) em cubetas separadas. Em
cada cubeta foi adicionado 20µl de catalase (0,0024g/ml de água destilada – C9322,
SIGMA) + 1940µl de tampão glicina (0,75g em 200ml de água destilada – 32ºC) + 34 µl
de NE (95 mg em 5ml de água destilada + 15µl/ml de HCl fumegante).
50
Para o cálculo foi utilizado o alfa da reta de cada amostra em todas as
concentrações utilizadas em planilha do excel. Os resultados foram expressos em mg
de proteína.
3.7.2 Medida da catalase
A catalase é uma hemeproteína que catalisa a degradação do H2O2. Na reação,
uma das moléculas de peróxido de hidrogênio é oxidada a oxigênio molecular e a outra
é reduzida à água. Este método mede a atividade da enzima produzida pelas células e
organelas em resposta a quantidade de H2O2, medido pelo espectrofotômetro.
Foram utilizados 20 µl de amostra de plasma em cubetas separadas (quartzo).
Em cada cubeta foi adicionado 1880µl de tampão fosfato (PBS) com peróxido de
hidrogênio (25ml de tampão para 40µl de H2O2). O comprimento de onda utilizado foi
240 nm e a leitura foi feita nos tempos 0, 30 e 60 segundos (Aebi, 1984).
3.7.3 Medida da glutationa peroxidase
A GPx é uma enzima selênio-dependente que catalisa a redução do H2O2 e
hidroperóxidos orgânicos (ROOH) para H2O e álcool, usando a glutationa (GSH) como
doador de elétrons. Ela está localizada tanto no citosol quanto na matriz mitocondrial. A
determinação da atividade da GPx foi realizada a partir da taxa de decaimento da
NADPH, determinada por espectrofotômetro, no comprimento de onda de 340 nm.
Foram utilizados 200 µl de plasma em cubetas separadas. Em cada cubeta foi
adicionado 1400 µl de tampão fosfato (PBS) com glutationa reduzida (GSH), glutationa
redutase (GR) e azida sódica (20 ml de tampão para 4 ml de GSH + 4ml GR + 1ml de
azida sódica) e incubada por 10 minutos. Em seguida, foi adicionado 200 µl de NADPH
e a leitura realizada por 3 minutos. Posteriormente a esta leitura foi adicionado 200 µl
de peróxido de hidrogênio e lido por 5 minutos. Esta padronização foi realizada
51
utilizando a técnica descrita por Flohé & Gunzler (1984) e adaptada para o tecido
vascular.
3.8 Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS)
Este método é utilizado para a avaliação do estado de oxidação dos ácidos
graxos em sistemas biológicos. O dano em lipídeos de membrana é determinado pela
formação de subprodutos da lipoperoxidação (malondialdeído-MDA), que são
substâncias reativas ao aquecimento do ácido tiobarbitúrico formadas durante a
peroxidação em sistemas de membranas e microssomos.
MDA reage com o TBA
gerando um produto colorido róseo lido em espectrofotômetro (532 nm). Esta
padronização foi realizada utilizando a técnica descrita por Draper e cols. (1990) e
adaptada para tecido.
Foram utilizados 200 µl de homogenato de vasos mesentéricos para 400 µl de
ácido tricloroacético (TCA). Para o plasma, foi utilizado 200 µl de amostra, diluídos em
600µl de TCA. As amostras foram centrifugadas por 10 min em 1000 rpm à 4ºC).
Separou-se 500µl do sobrenadante em um tubo de ensaio com tampa e adicionou
500µl de TBA (0,67%). Os tubos foram colocados em um banho seco (100ºC) por 30
minutos. Deixou-se esfriar por 5 minutos e posteriormente foi feita a leitura em
espectofotômetro Ultrospec 2100 pro (532 nm).
Para o cálculo foi utilizado:
-
Fator de Correção (FC) médio do TBA → FC = [nmol.TMP]
Abs. ptn
Abs. da amostra x FC médio = nmol de TBARS
-
nmol de TBARS ÷ quantidade de proteína da amostra (nmol de TBARS/mg de
-
proteína).
52
3.9 Medida de nitrito
Como o NO possui um tempo de meia vida muito curto, este é rapidamente
oxidado a nitrito e/ou nitrato pelo oxigênio. A determinação da produção deste radical é
mensurada pela formação do nitrito (NO2), um produto de degradação estável e não
volátil. A dosagem de nitrito pode ser realizada pelo método de Griess no qual o
princípio de reação é baseado na formação de um azo composto. Neste método, o
nitrito primeiramente reage com a sulfanilamida em meio ácido para formar um
composto intermediário, o sal diazônio. Em seguida, este sal reage com N-naftiletilenodiamina (NED) formando um composto azo estável de coloração púrpura, em
comprimento de onda de 540 nm (Green e cols., 1982; Sun e cols., 2003).
Para a reação, adicionou-se 100 µl da amostra em 50 µl da solução 1
(sulfanilamida 1% em solução de ácido fosfórico 2,5%). Após 10 minutos de espera
adicionou-se 50 µl da solução 2 (N-naftil-etilenodiamina 0,1% em solução de ácido
fosfórico a 2,5%). Em seguida, realizou-se a homogeneização e leitura a 540 nm em
espectrofotômetro Ultrospec 2100 pro. O resultado foi dado em µM (ou mMol)/ mg
proteína.
3.10 Dosagem de proteínas (Bradford)
As proteínas totais das amostras estudadas foram quantificadas através do
método de Bradford em placa de ELISA (Jamef®), utilizando a albumina bovina
(SIGMA®) (Bradford, 1976).
53
3.11 Western Blotting
A expressão do receptor de insulina (IRS-1), do GLUT-4 e da AKT foi avaliada
através do Western Blotting, em homogenato do músculo soleus. Os músculos isolados
de todos os grupos foram lavados com tampão salina fosfato gelado (PBS) e
homogeneizados com tampão de lise contendo PBS, triton X-100 (1 %), NaF (1 M),
NaPPi (100 mM), Na3VO4 (1 M), pepstatina (10 µg ml-1), leupeptina (10 µg ml-1) e
aprotinina (10 µg ml-1), seguido de centrifugação (13000 g por 20 min.) a 4ºC. A
concentração de proteína foi determinada pelo método de Elisa. Após desnaturação a
100ºC por 5 min, 30 µg de proteínas foram depositadas em um gel de poliacrilamida
NuPAGE® Novex Bis-Tris 10% (Invitrogen - CA), as proteínas separadas por
eletroforese (200V, 50mA por 45 minutos) e transferidas para membranas de
polivinilidina (15V, 328mA por 1 hora).
Foram utilizados anticorpos primário para IRS-1, AKT 1, 2 e 3, GLUT4 e tubulina
(Santa Cruz Biotechnology) na concentração de 1:1000. O procedimento para detecção
empregado, por sua vez, foi o sistema cromogênico Western Breeze (Invitrogen - CA).
Foi utilizado como padrão de peso molecular o Full-Range RainbowTM Moleular Weight
Marker (GE Healthcare – EUA).
As bandas foram quantificadas por densitometria, utilizando-se o programa
Adobe Photoshop 7.0.
3.12 Análise estatística
Todos os resultados foram analisados por meio de “One-way analysis of
variance” (ANOVA) utilizada para comparar diferenças entre os diversos grupos
experimentais, e “Two-way analysis of variance” para comparar a idade e o gênero, com
posterior uso do pós-teste Bonferroni, sendo consideradas significativas, quando o valor
de p<0,05. Foi utilizado o programa GraphPad prism 5.0.
54
4 RESULTADOS
4.1 Parâmetros maternos durante a lactação
A ingestão de ração e líquido e o peso materno foram avaliados durante o período de
lactação e nenhuma diferença foi observada entre os grupos experimentais para os
diferentes parâmetros (figura 6).
A
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
Consumo de Líquido (mL)
Consumo de Ração (g)
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
30
20
10
B
50
40
30
20
10
0
0
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
C
280
Peso (g)
260
240
220
200
180
Figura 6– Consumo materno de ração (A), líquido (B) e peso materno (C) dos grupos controle, controle+GSE,
hiperlipídico e hiperlipídico + GSE. Valores estão expressos em média + erro padrão (n=8 para todos os grupos).
55
4.2 Efeito do GSE sobre o peso corporal da prole (macho e fêmea) de animais
submetidos à dieta hiperlipídica durante a lactação.
O peso foi significativamente maior (p<0,05) nas fêmeas do grupo hiperlipídico
em relação ao controle no início do estudo (15 dias) e entre 60 e 90 dias. Entre 90 e
180 dias, nenhuma diferença foi observada entre os grupos. O aumento de peso
observado no grupo hiperlipídico (p<0,05) foi revertido pelo GSE (figura 7A). Os machos
do grupo hiperlipídico apresentaram um sobrepeso entre 120 e 150 dias de idade em
relação ao grupo controle, entretanto o GSE não modificou esta resposta (figura 7B).
O peso das proles fêmeas e machos de 6 meses foi maior que aos 3 meses (p<0,05).
O peso dos machos foi maior do que o das fêmeas (p<0,05).
.
A
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
500
400
Peso (g)
B
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
500
400
300
*
*
300
200
*
+
100
*
*
200
+
100
**
*
+
0
0
30
60
90
Dias
120
150
180
+
+
0
0
30
60
90
120
150
180
Dias
Figura 7– Evolução do peso de 3 e 6 meses das fêmeas (A) e dos machos (B) dos grupos controle, controle+GSE,
+
hiperlipídico e hiperlipídico + GSE (n=12 para todos os grupos). *p < 0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em
relação ao grupo hiperlipídico.
56
4.3 Adiposidade
A adiposidade determinada pelo peso seco da gordura intra-abdominal e
gonadal foi significativamente maior no grupo hiperlipídico de fêmeas (figura 8 A)
e machos (figura 8 B) com 3 e 6 meses (*p<0,05) em relação aos demais grupos
(figura 8). O GSE reduziu o aumento da adiposidade (+p<0,05) nas proles fêmeas e
machos com 3 e 6 meses. A adiposidade foi maior nas proles com 3 meses em
relação as proles de 6 meses (p<0,05). As fêmeas apresentaram maior
adiposidade que os machos (p<0,05).
A
% G o rd u ra C o rp o ra l
10
8
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
*
6
B
10
8
*
6
*+
*+
4
4
*
2
2
0
3 meses
6 meses
0
3 meses
*
+*
+
6 meses
Figura 8 – Gordura corporal das proles de fêmeas (figura A) e machos com 3 e 6 meses (figura B), dos grupos
controle, controle+GSE, hiperlipídico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em média + erro padrão, n= 8
+
para todos os grupos. *p < 0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em relação ao grupo hiperlipídico.
57
4.4 Pressão arterial sistólica
A PAS foi maior nos animais do grupo hiperlipídico, tanto de fêmeas como de
machos (figura 9 A e B; respectivamente) de 3 e 6 meses de idade, quando comparada
aos grupos controles (*p<0,05). O tratamento com GSE impediu o desenvolvimento da
hipertensão (grupo hiperlipídico + GSE) nos animais de 3 e 6 meses de idade de ambos
os sexos(+p<0,05). A PAS aumentou com a idade em ambos os sexos. A PAS das
fêmeas com 6 meses foi maior em relação aos machos (p<0,05), no entanto não houve
diferença entre fêmeas e machos com 3 meses.
200
Pressão (mmHg)
A
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
*
150
200
*
*
*
*
+
+
+
*
150
+
+
*
+
*
+
+
100
50
50
0
*
*
+
+
100
B
60
90
120
Dias
150
180
0
60
90
120
150
180
Dias
Figura 9 - Pressão arterial sistólica (mm Hg) de proles fêmeas (A) e machos (B) dos grupos controle, controle + GSE,
hiperlipídico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em média + erro padrão, n=12 animais por grupo. *p <
+
0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em relação ao grupo hiperlipídico
58
4.5 Resposta vasodilatadora da acetilcolina (ACh) em leito arterial mesentérico
(LAM)
Em preparações pré-contraídas com norepinefrina (30 uM), a ACh produziu uma
resposta vasodilatadora de maneira dose-dependente em fêmeas e machos com 3
(figura 10 A e B; respectivamente) e 6 meses (Figura 10 C e D; respectivamente),
sugerindo que a dieta hiperlipídica não modifica a função endotelial. Entretanto, houve
diferença das respostas da ACh entre os grupos de 3 e 6 meses indicando uma
redução da resposta vascular com a idade (p<0,05). Não houve diferença em relação
ao gênero.
0
Controle
Controle+ GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
% Dim inuição na PP
20
B
20
40
40
60
60
80
80
100
+
1
3
10
30
0
% D im in u içã o n a P P
0
A
100
C
20
100 1
10
3
30
100
D
0
20
**
40
40
60
60
80
80
100
1
3
30
10
ACh (pmol)
100
100
1
3
10
30
ACh (pmol)
100
Figura 10 - Resposta vasodilatadora da acetilcolina (ACh) em proles de fêmeas e machos com 3 (A e B;
respectivamente) e 6 meses (C e D; respectivamente), em leito arterial mesentérico (LAM) dos grupos controle,
controle+GSE, hiperlipidico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em média + erro padrão, n= 6 para todos
os grupos.
59
4.6 Estradiol
Os níveis séricos de estradiol da prole fêmea foram mensurados com o objetivo
de avaliar se a dieta hiperlipídica durante a lactação interfere com a secreção deste
hormônio na fase adulta. O grupo hiperlipídico em ambas as idades (3 meses e 6
meses) apresentou uma redução dos níveis de estradiol (*p<0,05) quando comparado
ao grupo controle (figura 11). O tratamento com GSE reduziu esta resposta. As proles
com 6 meses apresentaram níveis de estradiol mais elevados que as de 3 meses.
140
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
Estradiol (pg/ml)
120
100
80
*+
*
*+
*
60
40
20
0
3 meses
6 meses
Figura 11 – Níveis séricos de estradiol em prole de fêmeas com 3 e 6 meses dos grupos controle, controle+GSE,
hiperlipidico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em média + erro padrão, n= 6 para todos os grupos. *p <
+
0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em relação ao grupo hiperlipídico.
60
4.7 Perfil lipídico
Os níveis séricos de colesterol total na prole de fêmeas e machos com 3 e 6
meses (figura 12 A e B, respectivamente), assim como, de HDL (figura 12 C e D;
respectivamente) não foram diferentes entre os grupos. Entretanto, os níveis de
triglicerídeos da prole de fêmeas e machos de 3 e 6 meses (figura 12 E e F,
respectivamente) foram maiores no grupo hiperlipídico (*p<0,05) em relação aos
controles, sendo inibidos pelo tratamento com GSE (+p<0,05).
Os níveis de colesterol não foram significativamente diferentes em machos e
fêmeas em relação à idade; o mesmo foi observado com o HDL nas fêmeas, porém os
machos com 6 meses apresentaram níveis de HDL mais elevados quando comparados
as proles machos de 3 meses (p<0,05).
Os níveis de triglicerídeos estavam mais elevados nas proles de 3 meses em
relação as de 6 meses de ambos os sexos (p<0,05). As fêmeas apresentaram níveis
maiores de triglicerídeos em relação aos machos aos 3 meses de idade (p<0,05).
61
Colesterol total (mg/dl)
120
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
A
B
120
100
100
80
80
60
60
40
40
20
20
0
HDL (mg/dl)
80
60
60
40
40
20
20
0
0
160
140
Triglicerideos (mg/dl)
80
C
E
*
160
120
100
100
80
80
*
60
+
*
40
40
+
20
0
F
140
120
60
D
3 meses
6 meses
*+
*
*+
20
0
3 meses
6 meses
Figura 12 – Níveis séricos de colesterol total em proles de fêmeas e machos (A e B; respectivamente) com 3 e 6
meses, de HDL de fêmeas e machos (C e D, respectivamente) e de triglicerídeos de fêmeas e machos (E e F,
respectivamente) dos grupos controle, controle+GSE, hiperlipidico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em
+
média + erro padrão, n= 6 para todos os grupos. *p < 0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em relação ao
grupo hiperlipídico
62
4.8 Glicemia e resistência à insulina
Os níveis plasmáticos de glicose foram maiores no grupo hiperlipídico das proles
fêmeas e machos com 3 e 6 meses (figura 13 A e B; respectivamente) (*p<0,05) em
relação aos demais grupos. O GSE inibiu o aumento da glicemia (+p<0,05). A prole
fêmea com 3 meses apresentou maiores níveis de glicose em relação a prole de 6
meses (p<0,05) e não houve alteração nos machos em relação a idade. Os níveis de
glicose foram maiores nas fêmeas quando comparados com os machos (p<0,05).
Os níveis de insulina encontram-se aumentados no grupo hiperlipídico das proles de
fêmeas e machos com 6 meses quando comparados aos grupos controles (figura 13 C
e D; respectivamente) (*p<0,05). O GSE reduziu este aumento (+p<0,05) na prole de
fêmeas e machos com 6 meses de idade. Não houve diferença nos níveis de insulina
entre os diferentes grupos experimentais nas proles de fêmeas e machos com 3 meses
de idade.
As proles fêmeas e machos com 6 meses apresentaram níveis mais
elevados de insulina em relação as proles com 3 meses, assim como os machos em
relação as fêmeas (p<0,05).
A resistência à insulina determinada pelo índice de HOMA foi observada no grupo
hiperlipídico nas proles fêmeas e machos com 3 e 6 meses (figura 13 E e F;
respectivamente) em relação aos controles (*p<0,05) e o GSE normalizou a resposta
(+p<0,05). A RI aumentou com a idade em ambos os sexos (p<0,05), e foi maior nos
machos com 6 meses em relação as fêmeas da mesma idade (p<0,05). Não houve
diferença significativa entre machos e fêmeas de 3 meses.
63
180
160
Controle
Controle +GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
A
*
140
180
140
Glicose (mg/dl)
120
+
*
60
40
40
20
20
0
0
Insulina (µU/m l)
+
60
C
D
*
50
50
40
40
*
*+
30
30
+
20
*
20
10
10
0
0
14
14
12
*
12
E
F
10
10
H O M A -R I
+
80
60
60
*
100
+
80
8
8
*
+
*
3 meses
4
6 meses
0
*
*
2
+
2
+
6
6
0
*
120
100
4
B
160
+
3 meses
6 meses
Figura 13 – Níveis de glicose em proles de fêmeas e machos com 3 e 6 meses (A e B; respectivamente), insulina (C
e D) e resistência à insulina (E e F) dos grupos controle, controle+GSE, hiperlipidico e hiperlipídico+GSE. Valores
+
estão expressos em média + erro padrão, n= 6 para todos os grupos. *p < 0,05 em relação ao grupo controle e p <
0,05 em relação ao grupo hiperlipídico.
64
4.9 Expressão de IRS-1, Akt e Glut4
A expressão do substrato do receptor de insulina (IRS-1), da proteína Akt e do
transportador de glicose Glut-4 foi avaliada por western blotting em músculo soleus das
proles machos.
As expressões do IRS (figura 14 A), Akt (figura 14 B) e do Glut 4 (figura 14 C)
foram menores no grupo hiperlipídico nas proles machos com 3 e 6 meses (*p<0,05)
em relação aos demais grupos. O GSE foi capaz de aumentar a expressão de IRS-1,
Akt e Glut-4 aos níveis observados nos grupos controles (+p<0,05).
aumentou a expressão de IRS-1, Akt e Glut-4.
O fator idade
65
α-Tubulina
A
1,6
Controle
Controle + GSE 09
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
Expressão de IRS
(unidades arbitrárias)
1,4
1,2
1,0
*+
0,8
*
0,6
*
0,4
+
0,2
*
0,0
*+
Expressão de AKT
(unidades arbitrárias)
4
B
3
*
2
+
1
*
0
2,0
E xp re ssã o de G L U T 4
(u nid a de s arb itrá rias)
C
*+
1,5
1,0
*
*
*+
*
*
0,5
0,0
3 meses
6 meses
Figura 14– Expressões de IRS-1 (fig. A) , Akt (fig. B) e Glut 4 (fig.C) em músculo soleus de machos com 3 e 6 meses
dos grupos controle, controle+GSE, hiperlipidico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em média + erro
+
padrão, n= 6 para todos os grupos. *p < 0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em relação ao grupo
hiperlipídico.
66
4.10 Análise do dano oxidativo - Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS) pela medida de MDA no plasma
Os níveis plasmáticos da formação de subprodutos da peroxidação lipídica
(MDA) em proles fêmeas e machos de 3 e 6 meses (figura 15 A e B, respectivamente)
foram maiores no grupo hiperlipídico (*p<0,05) em relação aos demais grupos. O GSE
reduziu esta reposta (+p<0,05). Os níveis de MDA aumentaram com a idade em ambos
os sexos (p<0,05) e os machos apresentaram níveis de MDA maiores que as fêmeas
(p<0,05).
MDA (nmol TBA/mg proteínas)
4
3
A
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
B
4
*
3
*+
2
2
*
+
1
*
0
+
1
0
*
*+
Figura 15. Níveis plasmáticos de MDA em proles de fêmeas e machos com 3 e 6 meses (A e B; respectivamente)
dos grupos controle, controle+GSE, hiperlipidico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em média + erro
+
padrão, n= 8 para todos os grupos. *p < 0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em relação ao grupo
hiperlipídico.
67
4.11 Níveis de nitrito no plasma
Os níveis plasmáticos de nitrito (NO2) como medida indireta do NO estão
reduzidos no grupo hiperlipídico de machos e fêmeas de ambas as idades em relação
aos demais grupos (Figura 16 A e B) (*p<0,05). O tratamento com GSE aumentou
significativamente os níveis de NO2 do grupo hiperlipídico de ambos os sexos aos 3 e 6
meses de idade (p<0,05). Os níveis de NO2 foram maiores nas proles de machos e
fêmeas com 3 meses (p<0,05), e as fêmeas apresentaram valores maiores de NO2 que
os machos (p<0,05).
NO2(mMol/mg proteína)
0,8
0,6
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
A
0,8
B
0,6
+
0,4
0,4
+
0,2
*+
*
*
*
0,0
3 meses
6 meses
*+
0,2
0,0
3 meses
*
6 meses
Figura 16. Níveis plasmáticos de nitrito em proles de fêmeas e machos com 3 e 6 meses (A e B; respectivamente)
dos grupos controle, controle+GSE, hiperlipidico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em média + erro
+
padrão, n= 8 para todos os grupos. *p < 0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em relação ao grupo
hiperlipídico.
68
4.12 Análise da atividade enzimática antioxidante no plasma
Em amostras de plasma de proles fêmeas e machos com 3 e 6 meses, a
atividade da enzima superóxido dismutase (SOD) (figura 17 A e B) foi significativamente
menor no grupo hiperlipídico quando comparada aos grupos controles (*p<0.05) e o
tratamento com GSE reverteu a atividade da SOD (+p<0.05). Não houve diferença entre
as idades e o gênero.
A atividade da enzima catalase em amostras de plasma de animais de ambas as
idades e sexos (figura 17 C e D) também foi reduzida no grupo hiperlipídico, em relação
ao grupo controle (*p<0.05). O tratamento com o GSE aumentou a atividade desta
enzima. As fêmeas com 6 meses apresentaram atividade maior em relação a idade e
aos machos (p<0.05).
Apesar de ter sido observada uma tendência de redução da atividade da enzima
glutationa peroxidase nas proles fêmeas com 3 meses, esta só foi significativa aos 6
meses.
No entanto o GSE aumentou significativamente a atividade desta enzima
apenas na prole com 3 meses de idade (figura17 E). Nas proles de machos de ambas
as idades (figura 17 F) houve redução da atividade da glutationa peroxidase no grupo
hiperlipídico em relação aos demais grupos (p<0.05), e o tratamento com GSE
aumentou a atividade da enzima (p<0.05). Os machos com 6 meses apresentaram
atividade maior que os de 3 meses, e estes apresentaram maior atividade em relação
às fêmeas com 3 meses.
SOD (U/mg de proteína)
70
69
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
A
B
70
+
60
50
50
40
40
30
30
20
20
*
*
+
60
+
10
10
0
0
+
*
*
C
D
0,8
CATALASE (U/mg de proteína)
0,8
0,6
+
0,4
0,2
0,6
0,4
+
*
0,2
*
0,0
0,0
0,020
0,020
*+
*+
*
*
*
GPx (U/mg de proteína)
E
F
0,015
0,015
+
+
0,010
0,010
0,005
0,005
*
0,000
3 meses
6 meses
0,000
*+
*
3 meses
*
6 meses
Figura 17. Atividade das enzimas SOD de proles de fêmeas e machos (figura A e B; respectivamente), da catalase
(figura C e D; respectivamente) e da glutationa (fig. E e F; respectivamente) em amostras de plasma dos grupos
controle, controle+GSE, hiperlipidico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em média + erro padrão, n= 8
+
para todos os grupos. *p < 0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em relação ao grupo hiperlipídico
70
4.13 Análise do dano oxidativo - Substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico
(TBARS) pela medida de MDA no mesentério
Os níveis da formação de subprodutos da peroxidação lipídica (MDA) em proles
fêmeas e machos de 3 e 6 meses (figura 18 A e B, respectivamente) foram maiores no
grupo hiperlipídico (*p<0,05) em relação aos demais grupos. O GSE reduziu esta
resposta (+p<0,05). Os níveis de MDA aumentaram com a idade em ambos os sexos
(p<0,05) e os machos de 3 meses apresentaram níveis de MDA maiores que as fêmeas
da mesma idade (p<0,05).
A
M D A (nm ol T B A /m g proteínas)
1,4
1,2
1,0
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
1,4
*
1,0
+
0,8
*
0,6
0,6
0,4
*
0,2
0,0
*
1,2
*+
0,8
0,4
B
*+
0,2
*+
3 meses
+
6 meses
0,0
3 meses
6 meses
Figura 18. Níveis de MDA em amostras de mesentério de proles fêmeas e machos com 3 e 6 meses (A e B;
respectivamente) dos grupos controle, controle+GSE, hiperlipidico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em
+
média + erro padrão, n= 8 para todos os grupos. *p < 0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em relação ao
grupo hiperlipídico.
71
4.14 Níveis de nitrito no mesentério
Os níveis de NO2 estão reduzidos no grupo hiperlipídico de machos e fêmeas de
ambas as idades em relação aos demais grupos (Figura 19 A e B) (*p<0,05). O
tratamento com GSE aumentou significativamente os níveis de NO2
do grupo
hiperlipídico de ambos os sexos aos 3 e 6 meses de idade (p<0,05). Os níveis de NO2
foram maiores nas proles fêmeas com 3 meses quando comparados com as de 6
meses (p<0,05) e nas proles de machos não houve diferença em relação à idade. As
fêmeas de 3 meses apresentaram níveis maiores de NO2 quando comparadas com os
machos da mesma idade (p<0,05) e aos 6 meses os níveis de NO2 foram semelhantes
em ambos os sexos.
NO 2 (m M ol/m g proteína)
25
20
15
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
+
C
+
*
10
*
5
0
D
25
*
20
*+
15
+
10
.
**.
*
*+..+
+
* *..
*
5
3 meses
6 meses
0
3 meses
6 meses
Figura 19. Níveis de nitrito em amostras de mesentério de proles de machos e fêmeas com 3 e 6 meses (A e B;
respectivamente) dos grupos controle, controle+GSE, hiperlipidico e hiperlipídico+GSE. Valores estão expressos em
+
média + erro padrão, n= 8 para todos os grupos. *p < 0,05 em relação ao grupo controle e p < 0,05 em relação ao
grupo hiperlipídico.
72
4.15 Análise da atividade enzimática antioxidante no mesentério
Em amostras de mesentério das proles (fêmeas e machos) com 3 e 6 meses, as
atividades das enzima SOD (figura 20 A e B), catalase (figura 20 C e D) e glutationa
peroxidase (figura 20 E e F) foram significativamente menores no grupo hiperlipídico
quando comparadas aos grupos controles (*p<0.05) e o tratamento com GSE
aumentou as atividades das enzimas (+p<0.05).
Os níveis de SOD foram maiores nas proles com 6 meses em relação às de 3
meses (p<0.05), e os machos com 3 meses apresentaram níveis maiores que as
fêmeas da mesma idade (p<0.05).
Em relação a catalase, as fêmeas com 3 meses apresentaram atividade maior
que as fêmeas de 6 meses (p<0.05), já nos machos as proles de 6 meses
apresentaram atividade maior que as de 6 meses (p<0.05). A atividade da catalase foi
maior nas fêmeas com 3 meses em relação aos machos da mesma idade (p<0.05), no
entanto as proles de machos com 6 meses apresentaram atividade maior que as
fêmeas da mesma idade (p<0.05).
A atividade da glutationa peroxidase foi aumentada nos machos de 6 meses
comparada com a de 3 meses (p<0.05). Nas fêmeas não houve alteração da atividade
com a idade, no entanto as fêmeas de 3 meses apresentaram maior atividade em
relação aos machos da mesma idade(p<0.05).
73
S O D (U /m g d e p ro te ín a )
80
Controle
Controle + GSE
Hiperlipídico
Hiperlipídico + GSE
A
+
60
60
+
+
*
40
40
*
20
20
+
*
0
C a ta la s e (U /m g d e p ro te ín a )
C
1,0
D
0,8
0,8
*+
0,6
0,4
*
0
1,0
*+
0,6
*
*
0,4
*+
*
0,2
0,0
0,025
E
0,025
F
0,020
0,020
0,015
0,015
+
*+
0,010
0,005
0,000
*+
*
0,2
0,0
G P x ( U /m g d e p ro te ín a )
B
80
+
*+
0,010
*
3 meses
*
6 meses
0,005
0,000
*
*
3 meses
6 meses
Figura 20. Atividade das enzimas SOD em amostras de mesentério de proles de fêmeas e machos (fig.A e B), da
catalase (fig. C e D) e da glutationa (fig. E e F) dos grupos controle, controle+GSE, hiperlipidico e hiperlipídico+GSE.
Valores estão expressos em média + erro padrão, n= 8 para todos os grupos. *p < 0,05 em relação ao grupo
+
controle e p < 0,05 em relação ao grupo hiperlipídico
74
5 DISCUSSÃO
As características da SM na prole adulta de ratos alimentados com alto teor de
gordura podem ser adquiridas tanto no período pré-natal como durante a lactação (Guo
et al, 1995;. Khan et al, 2005; Nivoit et al, 2009). Este estudo avaliou o papel do período
de lactação e o efeito do tratamento com extrato de cascas de uvas Vitis vinífera (GSE)
nas alterações cardiovasculares e metabólicas e do estresse oxidativo em um modelo
animal de programação metabólica empregando alimentação rica em gordura durante a
lactação.
Nós mostramos que uma dieta rica em gordura durante a lactação imprime
alterações funcionais na prole adulta como: o estresse oxidativo, RI, aumento dos
níveis de triglicerídeos, um ganho discreto de peso, aumento da gordura corporal,
redução do estradiol (fêmeas) e hipertensão arterial, sem alterações na função
endotelial. Neste estudo demonstramos, pela primeira vez, os efeitos benéficos do
tratamento com GSE, sobre esse modelo de programação do desenvolvimento. O GSE
impediu a hipertensão e protegeu contra o estresse oxidativo, o ganho de peso
corporal, a redução do estradiol e a RI da prole adulta de mães alimentadas com uma
dieta rica em gordura durante a lactação.
A exposição à dieta rica em gordura durante a lactação foi associada com
aumento da PAS nas proles adultas, fêmeas e machos, de 3 e 6 meses. A indução da
hipertensão arterial em nosso estudo está de acordo com um estudo prévio que
demonstrou que proles oriundas de ratas que receberam dieta normal durante a
gravidez, mas que foram amamentadas por ratas que receberam dieta rica em gordura
durante a lactação, desenvolveram hipertensão na idade adulta (Khan et al., 2005).
Estudos em ratos geneticamente hipertensos também indicam que a pressão arterial
elevada pode, em parte, ser adquirida durante o período de lactação (Ashton et al,
2003; Cierpial e MacCarty, 1987).
O(s) mecanismo(s) envolvido(s) na programação da hipertensão neste modelo
não
são
ainda
compreendido(s).
Entretanto,
estudos
que
demonstraram
o
desenvolvimento de hipertensão na prole adulta de animais submetidos a dieta rica em
75
gordura na gravidez e lactação (Khan et al, 2003) ou em prole jovem de ratas obesas
(Samuelsson et al 2011), sugerem fortemente que a hipertensão está associada a uma
hiperatividade
simpática
persistente
e
adquirida
em
estágios
precoces
do
desenvolvimento. Esta hipótese é fundamentada por uma resposta cardiovascular
aumentada por “um estímulo estressante”, hipersensibilidade aos efeitos pressores
induzidos pela leptina e componente simpático aumentado da variabilidade da
freqüência cardíaca (Samuelsson et al, 2011).
O tratamento com GSE de ratas expostas a uma dieta hiperlipídica na lactação,
impediu o aumento da PAS da prole adulta de ambas as idades e gênero. Este efeito é
provavelmente mediado pelos fatores de relaxamento derivados do endotélio, uma vez
que nossos resultados anteriores mostraram que o GSE promove vasodilatação em
leito arterial mesentérico de rato mediada pelo NO, em combinação com EDHF
(Madeira et al, 2005) e induz a ativação da eNOS nas células endoteliais de artérias
coronárias em cultura (Madeira et al., 2009). O efeito anti-hipertensivo do GSE também
foi demonstrado pelo nosso grupo em diferentes modelos de hipertensão arterial
(Soares de Moura et al, 2002; 2007), mas o resultado do presente estudo sugere, pela
primeira vez, que o consumo de GSE durante a lactação confere proteção contra a
programação da hipertensão, na prole adulta, induzida por dieta rica em gordura.
Neste estudo, a vasodilatação em resposta à ACh não foi significativamente diferente
entre os grupos. No entanto, uma disfunção endotelial foi observada nas proles de
machos e fêmeas, de 6 meses de idade de todos os grupos comparados com as proles
de 3 meses. A disfunção endotelial caracteriza-se por vasodilatação reduzida e tem
sido relatada em pequenas artérias mesentéricas de proles (6 meses) de ratos normais,
mas que foram amamentados por mães expostas a dieta rica em gordura (Khan et al.,
2005) ou em artérias mesentéricas e femorais de proles fêmeas e machos adultas (6
meses) de ratas alimentadas com uma dieta rica em gordura durante a gravidez e
lactação (Khan et al, 2003;. Ghosh et al, 2001). No presente estudo, a observação de
que a disfunção endotelial está associada ao envelhecimento em todos os grupos era
esperado. Por outro lado, a ausência de disfunção endotelial nas proles de ambos os
sexos do grupo hiperlipídico não confirma os resultados obtidos em modelos de
programação por dieta hiperlipídica mencionados acima. Entretanto, as diferenças entre
76
nosso estudo e os resultados da literatura devem ser destacadas. Nos estudos citados
acima, o período de dieta rica em gordura (gravidez e lactação), ou a estratégia
diferente para se estudar o papel do período de lactação através da transferência da
prole, cujas mães foram alimentadas com uma dieta controle (durante a gestação) para
mães alimentadas com uma dieta rica em gordura (durante a lactação) podem,
provavelmente, imprimir diferenças na programação da função vascular. Além disso, a
função vascular foi estudada avaliando a tensão, em pequenas artérias mesentéricas e
femorais isoladas de rato, ao passo que em nosso estudo a função endotelial foi
avaliada em leito arterial. Em comum com o nosso estudo, achado anterior em leito
arterial mesentérico perfundido mostrou que as respostas vasodilatadoras dependentes
do endotélio à bradicinina e acetilcolina estão reduzidas no mesmo nível em ratos
adultos normotensos e ratos espontaneamente hipertensos (6 meses) em comparação
com as respostas em preparações de ratos jovens, caracterizando uma disfunção
endotelial com a idade (Ognibene et al., 2009). Em animais, assim como em humanos,
o aumento da idade reduz a habilidade do endotélio de induzir vasodilatação
dependente de endotélio in vitro e in vivo (Vanhoutte, et al., 2009). Isso tem sido
atribuído a um aumento da atividade da enzima arginase que compete com a eNOS
pelo substrato comum, o aminoácido L-arginina; a uma produção aumentada de
espécies reativas como o ânion superóxido, reduzindo a biodisponibilidade do NO e a
uma redução da expressão e/ou atividade da eNOS (Michel et al, 2010).
Curiosamente, o dano oxidativo avaliado pelos níveis de MDA em amostras de
plasma e mesentério foi maior nas proles de 6 meses de idade de todos os grupos
comparados com as proles de 3 meses, sugerindo que o dano vascular oxidativo pode
explicar, em parte, a disfunção endotelial com o envelhecimento (Matsumoto et al.,
2007). A dissociação entre o aumento da pressão arterial e função endotelial normal,
como observado na prole de fêmeas e machos aos 3 meses de idade do grupo
hiperlipídico vem reforçar relatos de que estes dois parâmetros não estão
invariavelmente ligados. Nas proles, outros mecanismos que não seja a redução de
relaxamento dependente do endotélio podem estar contribuindo para a hipertensão
arterial observada (Khan et al., 2003).
77
Há evidências crescentes que sustentam um papel para as EROs na patogênese
da hipertensão arterial sistêmica (Costa et al., 2009) e SM (Otani H, 2011). No entanto,
não existem dados sobre o papel do estresse oxidativo neste modelo de programação
do desenvolvimento. Nós mostramos o aumento dos níveis de MDA no plasma e
mesentério das proles de fêmeas e machos de ambas as idades, provenientes de mães
alimentadas com dieta rica em gordura. Além disso, a diminuição das atividades
enzimáticas antioxidantes (SOD, CAT e GPx) plasmáticas e tecidual foram também
observadas nas proles de ambos os sexos e idades, mostrando que o estresse
oxidativo, em comum com a hipertensão pode ter sua origem durante a lactação.
Reforçando esta hipótese, observamos uma redução nos níveis de nitrito no plasma e
mesentério das proles de fêmeas e machos do grupo hiperlipídico de ambas as idades,
indicando diminuição da biodisponibilidade de NO, o que pode explicar em parte o
aumento precoce (3 meses) da pressão arterial, uma vez que é amplamente conhecido
que o NO contribui para a manutenção da pressão arterial (Minami, 1995).
Neste estudo, o aumento dos níveis de MDA foi reduzido pelo GSE,
corroborando a ação antioxidante do extrato, previamente demonstrada pelo nosso
grupo, em ratos normais (Soares de Moura et al., 2002). O mecanismo do efeito
antioxidante ainda não está estabelecido, mas o aumento da defesa antioxidante pelo
GSE, como mostrado no mesentério e plasma, pode contribuir para este efeito levando
a um aumento da biodisponibilidade de NO.
O excesso de tecido adiposo caracteriza a obesidade, que está fortemente
associada à disfunção dos adipócitos, que desempenha um papel importante no
desenvolvimento da SM (Tsuda T, 2008). Proles nascidas de mães que receberam
dieta normal durante a gestação, mas que foram amamentadas por mães que
receberam dieta hperlipídica durante a lactação desenvolveram semelhanças
fenotípicas as do modelo atual, tais como aumento da adiposidade e hiperinsulinemia
na idade adulta (Khan et al., 2005). Este estudo e o nosso enfatizam a importante
influência da impressão fenotípica no período de lactação.
O GSE parece promover uma redução do ganho de peso, uma vez que o
aumento do peso corporal e adiposidade na prole do grupo hiperlipídico foram
impedidos pelo GSE. Park et al. (2008) demonstraram uma diminuição significativa no
78
peso corporal e adiposidade de camundongos C57BL/6J submetidos a dieta rica em
gordura e tratados com um extrato de semente de uva. Este efeito é provavelmente
mediado por polifenóis, como as antocianinas encontradas na casca da uva, já que um
estudo recente mostrou que esses polifenóis têm uma potência significativa na redução
da obesidade e melhoram a função dos adipócitos em camundongos C57BL/6J
alimentados com uma dieta rica em gordura (Tsuda et al., 2008).
Estes autores
demonstraram que as antocianinas induzem a expressão do gene da adiponectina em
adipócitos, cuja concentração plasmática e expressão gênica estão diminuídas em
obesos e na RI (Maeda et al 1996; Arita et al, 1999). Neste mesmo modelo animal,
Matsuzawa-Nagata et al (2008) quantificaram a expressão gênica de diversos
marcadores envolvidos no metabolismo dos ácidos graxos e no estresse oxidativo,
demonstrando que o aparecimento da RI e obesidade é precedida pelo aumento do
estresse oxidativo sugerindo que as EROS podem ser o evento chave inicial que
deflagra a obesidade e RI induzidas pela dieta rica em gordura.
Considerando que o GSE é rico em antocianinas e que apresentou um
importante efeito antioxidante nesse estudo, podemos sugerir que a prevenção do
ganho de peso pode ser em parte devido a sua propriedade antioxidante. Outra
possibilidade é que o GSE rico em antocianinas possa estar induzindo a expressão de
adiponectina em adipócitos e contribuindo para a prevenção da obesidade. Entretanto,
considerando a gênese multifatorial da obesidade, futuros estudos são necessários
para elucidar os mecanismos envolvidos nesse efeito.
A resistência dos tecidos periféricos à insulina é um dos principais fatores
patogênicos da SM, uma vez que a secreção de insulina pelas células β pancreáticas
representa o efeito hormonal mais determinante na manutenção do equilíbrio do
metabolismo dos carboidratos, lipídios e proteínas (Devaskar et al. 2007). Em nosso
estudo, a hiperglicemia e a hiperinsulinemia parecem ser induzidas pela dieta
hiperlipídica no período de lactação. Essas anormalidades em ambas as idades não
foram observadas em um modelo de troca de filhotes promovida a partir de mães
expostas a uma dieta controle para mães expostas a uma dieta hiperlipídica (Khan et al.
2005) com 6 meses.
Entretanto, os animais mais velhos desenvolvem um perfil
claramente anormal de glicose (Khan et al. , 2003). Reforçando os achados de
79
hiperglicemia e hiperinsulinemia, mostramos pela primeira vez neste estudo, uma
associação positiva entre a RI no grupo hiperlipídico de machos e a expressão reduzida
de proteínas da via de sinalização da insulina como o IRS, a Akt e o GLUT 4. Além
disso, com a idade ocorre aumento da expressão de todas as proteínas em todos os
grupos da prole de machos, o que ao lado de um aumento de secreção de insulina,
parece manter os níveis de glicose.
Demonstramos que o GSE diminuiu significativamente a glicemia e insulina nas
proles do grupo hiperlipídico, sugerindo um efeito anti-hiperglicêmico e antihiperinsulinêmico. A diminuição do peso corporal e da adiposidade induzida pelo GSE
poderia explicar em parte a melhoria da RI pelo extrato, já que atualmente acredita-se
que a obesidade pode levar à RI, intolerância à glicose e diabetes (Bastard et al., 2006).
Evidências crescentes mostram que o estresse oxidativo e a inflamação são as
principais causas da RI por interferir com a transdução do sinal da insulina (Evans,
2007). Portanto, a diminuição do peso corporal e a ação antioxidante do GSE podem
contribuir para a melhoria da RI na prole adulta de mães alimentadas com gordura.
No entanto, os mecanismos subjacentes à sensibilidade à insulina induzidos pelo
GSE ainda não estão estabelecidas. Ao estudarmos o efeito do GSE no sistema de
sinalização de insulina em ratos machos (com 3 e 6 meses), observamos que o GSE
promove um aumento no conteúdo do receptor de insulina (IRS-1), do GLUT-4 e da
AKT no músculo esquelético, sugerindo então, que o GSE reduziu a RI também pela
ativação da cascata de sinalização de insulina no tecido. Este achado corrobora com o
trabalho de Teixeira et al, 2011 (dados não publicados) que obteve resultados
semelhantes ao estudar o efeito do GSE em modelo de diabetes induzido por aloxano
em camundongos. O NO parece modular a sensibilidade à insulina, uma vez que
inibidores da NOS diminuem (Roy et al, 1998) e os doadores de NO aumentam o
transporte de glicose no músculo esquelético (Balon 1997). Além disso, o NO aumenta
a expressão de GLUT-4 no músculo esquelético por mecanismos dependentes de
GMPc e AMPK (Lira et al, 2007). Portanto, como o GSE parece estimular a síntese de
NO (Madeira et al, 2009) sugerimos que a sensibilidade à insulina induzida pelo
tratamento com o GSE também poderia ser mediada, em parte, pelo NO.
80
Os níveis de estradiol nas fêmeas cujas mães foram submetidas à dieta
hiperlipídica encontram-se significativamente menores em relação ao grupo controle,
podendo representar pelo menos em parte, uma explicação para as alterações
cardiovasculares e metabólicas observadas. O estradiol tem conhecido papel
cardioprotetor, uma vez que este hormônio parece aumentar os níveis de NO,
principalmente através do aumento da expressão da eNOS na parede vascular
(Toestes et al, 2003; White et al, 2010). Fitoestrogênios e moduladores seletivos de
receptor de estrogênio potencializam o relaxamento derivado do endotélio (Vanhoutte et
al., 2009). O estradiol também contribui para a redução da RI, provavelmente por
aumentar a expressão do Glut-4 e do IRS-1 (Ordóñez P, 2008). Além disso, estudos
clínicos e experimentais sugerem que o estradiol reduz os níveis de malondialdeído e a
carbonilação de proteínas plasmática e tecidual (Liu, 2010; Topçuoglu et al., 2009). Em
modelo experimental de deficiência de estrogênio, a terapia de reposição hormonal
reduz os níveis plasmáticos e teciduais de malondialdeído e carbonilação de proteínas,
e aumenta os níveis de glutationa, sugerindo um papel protetor do estrogênio sobre o
estresse oxidativo (Topçuoglu et al., 2009). Em nosso estudo, o tratamento com GSE
aumentou os níveis de estradiol sugerindo que o extrato possa interferir na secreção
deste hormônio. Embora não haja trabalhos que reforcem os resultados obtidos em
nosso modelo, recentemente foi demonstrado que, em modelo experimental de
hipertensão espontânea (SHR) com deficência de estrogênio, os polifenóis da uva
conferem proteção contra a hipertensão (Carlson et al. 2008).
O aumento nas concentrações plasmáticas de ácidos graxos livres é
normalmente associado com a RI (Frankel et al., 1996). Além disso, foi relatada uma
forte relação entre o acúmulo de triglicerídeos plasmático e intramuscular com a RI (Tao
et al., 2009). Em nosso estudo, além dos efeitos sobre a RI, a regulação do GSE sobre
desordens metabólicas como obesidade e acúmulo de triglicerídeos também foi
observada na prole adulta do grupo hiperlipídico em ambas as idades e gêneros,
indicando que o GSE poderia melhorar o distúrbio lipídico metabólico e obesidade,
através do aumento da sensibilidade à insulina. Provavelmente esse efeito se deve aos
polifenóis presentes no extrato, já que, em camundongos submetidos à dieta
hiperlipídica e tratados com polifenóis ou extrato de planta rico em polifenóis foram
81
observados redução dos níveis de triglicerídeos e da RI (Fukuchi e cols., 2008; Oliveira
et al., 2010).
82
6 CONCLUSÃO
Nós demonstramos que uma dieta rica em gordura durante a lactação imprime
alterações na pressão arterial, perfil lipídico e glicídico e no equilíbrio redox da prole
adulta. A administração de GSE protege a prole cujas mães foram expostas a uma
dieta hiperlipídica na lactação contra o desenvolvimento da hipertensão, ganho de
peso, hiperglicemia e RI. A síntese de NO, a ação antioxidante e o aumento da
sensibilidade à insulina induzidos pelo GSE podem contribuir para estes efeitos
benéficos do extrato. Estes estudos pré-clínicos abrem uma possibilidade para a
administração oral do GSE na prevenção da SM.
83
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111
APÊNDICE - Metabolic disorders and oxidative stress programming in offspring of rats
fed a high-fat diet during lactation: effects of a Vinifera grape skin extract
Metabolic disorders and oxidative stress programming in offspring of rats fed a high-fat
diet during lactation: effects of a Vinifera grape skin (ACH 09) extract
Andréa Fernandes Emiliano, M.Sca, Lenize Costa Reis Marins de Cavalho, M.Sca, Viviane da
Silva Cristino Cordeiroa, Cristiane Aguiar da Costa, M.Sca, Paola Raquel Braz de Oliveira,
M.Sca, Emerson Ferreira Queiroz, PhDc, Daniele Dal Col Moreirac, Gilson Teles Boaventura,
PhDb, Roberto Soares de Moura, MD PhDa, Angela Castro Resende, PhDa
a
Department of Pharmacology, Institute of Biology, Rio de Janeiro State University, RJ, Brazil
b
Department of Experimental Nutrition, Federal Fluminense University, RJ, Brazil
c
Department of Research, Development and Innovation, Aché Laboratories S.A., Rodovia
Presidente Dutra, km 222,2 Guarulhos-Brazil.
Running title: Effects of ACH09 on metabolic syndrome in rat
Sources of Funding: This work was conducted with grants from National Council of Scientific
and Technological Development (CNPq) and Rio de Janeiro State Research Agency (FAPERJ).
112
Abstract
This study examined the effect of Vitis vinifera grape skin ACH09 extract (ACH09)
on metabolic disorders and oxidative stress in adult offspring of rats fed a highfat diet (HF) during lactation. Four groups of female rats were fed: control diet (7%
fat); ACH09 (7% fat plus 200 mg/Kg/day ACH09 orally); HF (24% fat); HF+ ACH09
(24% fat plus 200 mg/Kg/day ACH09 orally) during lactation. From weaning
onwards, all female offspring were fed a control diet and sacrificed at 90 or 180
day old. Systolic blood pressure was increased in adult offspring of HF-fed dams
and ACH09 prevented the hypertension. Increased adiposity, plasma triglyceride,
glucose levels and insulin resistance were observed in offspring from both ages
and those changes were reversed by ACH09. The plasma oxidative damage
assessed by malondialdehyde levels was increased and nitrite levels decreased in
HF group of both ages, which were reversed by ACH09. In addition, ACH09
restored the decreased plasma and mesenteric arteries antioxidant activities of
superoxide dismutase, catalase and glutathione peroxidase in HF group. In
conclusion, ACH09 protected normally fed offspring of HF-fed dams during
lactation from phenotypic and metabolic characteristics of metabolic syndrome
providing an alternative nutritional resource for prevention of metabolic
syndrome.
Key words: grape skin extract; hypertension; insulin resistance; oxidative stress; developmental
programming
113
INTRODUCTION
The concept of developmental programming, first proposed by Barker and colleagues in
the 1990s1 has been demonstrated in human and animal studies and establishes a relationship
between an adverse intrauterine or early postnatal nutritional, metabolic, and hormonal
environment and predispositions for the development of diseases in later life.2-4 Animal studies
have shown that a maternal diet rich in animal fat during gestation leads to the development of an
offspring phenotype with the characteristics of the metabolic syndrome (MS), such as obesity,
insulin resistance, dyslipidemia and hypertension, even when offspring are reared on a normal
diet.5-7 However, few have investigated the role of the suckling period in inducing cardiovascular
and metabolic disorders in offspring of dams fed a fat-rich diet.8 Recent studies have suggested
that oxidative stress, the imbalance between pro- and antioxidants, could be an early event in the
development of chronic diseases related to obesity and liver disorders associated with MS.9-11
Oxidative stress has been also implicated in the etiology of many diseases including
cardiovascular disorders.12-13 However, little is known about the oxidative stress programming in
adult offspring of dams fed a fat-rich diet during lactation.
Natural polyphenols, obtained from many plants, have been shown to exert important
actions on the cardiovascular system and may be a potential source of new compounds to treat
metabolic and cardiovascular diseases.14 The beneficial effect of polyphenols may be due to many
actions as antioxidant15 that increases bioavailability of nitric oxide (NO), vasodilation or
antihypertensive properties.16-18 Previously we have demonstrated that an alcohol-free grape-skin
extract obtained from skins of Vitis labrusca, a vinifera grape largely used in Brazil to produce
red wine, induced an endothelium-dependent vasodilator effect mediated by NO in combination
114
with endothelium-derived hyperpolarizing factor (EDHF).19-20 Antihypertensive and antioxidant
effects of the grape-skin extract have also been demonstrated.19 However, there is no report about
the pharmacological activity of the vinifera grape skin extract on metabolic disorders and
oxidative stress of an experimental model of developmental programming. Therefore,
experiments were undertaken to determine the action of grape-skin extract on changes in
oxidative stress, cardiovascular and metabolic programming observed in adult female offspring
of dams fed a high-fat diet during lactation.
115
MATERIALS AND METHODS
Preparation of the grape-skin ACH09 extract
The dried and powdered skin fruits of Vitis vinifera L. (Vitaceae) were extracted by an
aqueous solution at 100°C with occasional shaking for about 120 minutes. The solution was then
introduced in a column with the ion-exchange resin (cationic). The resin was washed sequentially
by EtOH, EtOH: H2O (1:1) and H2O. The H2O fraction was discarded. The ethanolic and
hydroalcoholic fractions were placed together and evaporated under vacuum at 60°C, the
concentrated solution was then dried by spray-dryer (inlet temperature 190°C and outlet
temperature of 85°C). The extract obtained in the process is a fine powder soluble in H2O, which
has about 30% total polyphenols according to the Folin-Ciocalteau21 and 3% Malvidin-3-Oglucoside.22
LC/UV-DAD analysis of the grape-skin ACH09 extract
LC/UV analysis of the dried hydro-alcoholic grape skin extract was performed on a
Hewlett-Packard (Waldbronn, Germany) Series 1100 photodiode array detector (DAD) liquid
chromatography system. HPLC/UV/DAD with a Symmetry RP-18 column (4 µm; 250 x 3.9 mm
i.d.; Waters) using a MeOH-Water with 0.5% of formic acid, gradient (20:80 −>100:0) in 25 min.
The detection was performed at 210, 254 and 540 nm.
LC/UV/APCI-MSn analysis
116
LC/MSn was performed directly after UV-DAD measurements. A Finningan LCQ ion trap
(Finningan MAT, San Jose, CA, USA) with APCI interface was used with the following
conditions: capillary temp. 150°C; vaporizer temp. 370°C; positive mode; sheath gas flow: 60 psi
(1psi = 6894.76 Pa), corona needle current 5 µA. MSn experiment were performed by
programming dependent scan events. The first event was a full MS scan Mr (150.0-1500.0)
(MS1); during the second event the main ion recorded was isolated and selectively fragmented in
the ion trap (MS2). The collision energy was set to 15 eV.
Identification of the main compounds
Compound (1). UV (λmax) 522 nm; LC/APCI-MS (positive mode): m/z 463.1.13 [M]+, 301
[M-162]+. Compound (2). UV (λmax) 515 nm; LC/APCI-MS (positive mode): m/z 479.1 [M]+,
317 [M-162]+. Compound (3). UV (λmax) 524 nm; LC/APCI-MS (positive mode): m/z 493.13
[M]+, 331 [M-162]+. Compound (4). UV (λmax) 317, 532 nm; LC/APCI-MS (positive mode): m/z
801.22 [M]+, 639 [M-162]+, 493 [M-162-147]+, 331 [M-162-162-147]+.
LC-UV and LC-MS analysis sample preparation
HPLC analysis of the dried hydro-alcoholic grape skin extract: 10 mg of the extract was
dissolved in 1 mL MeOH/H2O (1:1) with 0.5% of formic acid (HPLC quality). The mixture was
filtered using a Millex-LCR syringe driven filter (0.45 µm). 20 µl was analysed by HPLC.
117
Animals and diet
All experiments on animals were reviewed and approved by the animal Care and Use
Committee of the Biology Institute of the Rio de Janeiro State University. Virgin female Wistar
rats 3 months aged were caged with one male rat at a proportion of 3:1. After mating, determined
by the presence of a vaginal plug, each female was placed in an individual cage with free access
to water and food until delivery. Within 24 hours of birth, excess pups were removed so that only
8 offspring were kept per cage to standardize milk availability during lactation. During the
weaning period (21 days), the dams had free access to standard diet (AIN 93) or high-fat diet
24% (20% animal lard and 4% corn oil) in a temperature-controlled room with 12-hour light/dark
cycle and allocated into four groups. The control group corresponding to female offspring from
dams fed the standard diet and allowed access to water (Control group: 7% fat; 90.9±1.8 kcal) or
ACH09 (ACH09 group, 200 mg/Kg/day) during weaning. Two other groups were fed a high fat
diet with access to water (HF group: 24 % fat; 106.0 ±1.9 kcal) or ACH09 (HF+ ACH09 group:
24 % fat; 106±2.1 kcal) during weaning (table 1). The dose of ACH09 was based on previous
studies19,23 that showed anti-hypertensive and antioxidant effects of the extract. From weaning
onwards, all offspring were fed ad libitum the standard maintenance diet (AIN 93). Maternal food
intake (g) was recorded daily in dams during weaning and no changes were observed between
groups (Control: 25±1.8; Control+ ACH09: 24.9±2; HF: 23±1.9; HF+ ACH09: 22.9±2.1). Food
consumption of dams was estimated by subtracting the amount of food left on the grid and
amount of spilled food from the initial weight of food supplied. During lactation, offspring body
weight (BW) was weekly recorded from 1 week of age (to avoid maternal rejection of the pups)
until animals were fully grown at 90 or 180 days old. The diets were elaborated by the
Department of Experimental Nutrition, Federal Fluminense University (RJ, Brazil) in accordance
118
with the standard recommendations for rodents in the maintenance state of American Institute of
Nutrition (AIN-93M).24
Arterial Pressure Measurement and Vascular Perfusion Studies
Systolic blood pressure (SBP) was measured in conscious rats by use of tail-cuff
plethysmopraphy (Letica 5000 device) once a week during 90 or 180 days.
Mesenteric arterial beds (MAB) of rats from the different groups were isolated according to the
method of McGregor (1965).25 Briefly, rats were anesthetized with sodium pentobarbital (ip, 0,42
mg/g), and the MAB was rapidly removed, cannulated and perfused at a flow rate of 4 mL/min
with physiological salt solution (PSS) by a peristaltic pump (Lifecare Model 4, Abbott/Shaw).
The PSS (composition, mM: NaCl 118, KCl 4.7, CaCl2 2.5, MgSO4 1.2, KH2PO4 1.2, NaHCO3
25, EDTA 0.026 and glucose 6.0) was bubbled with 95% O2/ 5% CO2 at 37°C. Perfusion pressure
(PP) was measured with a pressure transducer (HP 1280) connected to a preamplifier (HP 8805B)
and chart recorded (7754A; Hewlett-Packard, Lexington, MA, USA). Drugs were either
dissolved in PSS and perfused at the desired concentration or were administered as bolus
injections directly into the perfusion stream, close to the arterial cannula.
The preparations were left to equilibrate for 30 minutes, and then injections of 120 µmol
of KCl were administered every 10 minutes until consistent responses were obtained. After the
equilibration period, basal pressure (26 + 2 mm Hg; n = 48) was elevated (80–100 mm Hg) with
norepinephrine (NE; 30 µM) added to the perfusion solution.19 After the vasoconstrictive effect
of NE reached a constant plateau, acetylcholine (ACh, 1 – 100 pmol) was injected in order to
assess the endothelium-dependent response. The vasodilatory effect of ACh was expressed as a
percentage decrease of the pressor effect of NE.
119
Plasma Assays
Blood was collected from rats with 90 or 180 days. The animals were fasted for 6 hours,
and blood samples were then collected by cardiac punction in anesthetized animals. Glicemia was
determined with a glucometer (Accu–Chek Active, Roche, Manhein, Germany) and insulin
concentrations were determined with the Insulin 125I radioimmunoassay (RIA) Kit (MP
Biomedicals, LLC-Orangeburg, NY, USA). Homeostatic model assessment of insulin resistance
(HOMA-IR) was calculated from the real-time fasting serum glucose and fasting insulin
concentrations of different groups of rats using the mathematical HOMA-IR formula: HOMA-IR
= (fasting serum insulin in µU/mlxfasting serum glucose in mg/dl)/405. Plasma total cholesterol
(TC) and triglyceride (TG) levels were measured by a colorimetric assay (Analisa®, Belo
Horizonte, Brazil).
Malondialdehyde Assay
As an index of lipid peroxidation, we used the thiobarbituric acid reactive substances
(TBARS) method for analyzing malondialdehyde (MDA) as previously described.26 Briefly, the
samples from plasma and mesentery were mixed with 1 mL of 10% trichloroacetic acid and 1 mL
of 0.67% thiobarbituric acid. Subsequently they were heated in a boiling water bath for 30 min.
The absorbance of the organic phase containing the pink chromogen was measured
spectrophotometrically at 532 nm. MDA equivalents were expressed in nMol/mg protein.
120
Nitrite assay
Nitrite levels in plasma and mesentery homogenates were determined by a method based
on the Griess reaction.27 A total of 100 µL of sample was mixed with 100 µL of Griess reagent
(1% sulfanilamide in 5% phosphoric acid and 0.1% naphthylenediamide dihydrochloride in
water) and incubated at room temperature for 10 min followed by measuring the absorbance in a
plate reader at 550 nm (Bio-Rad Microplate Reader model 680, CA, USA). Nitrite concentrations
in the samples were determined from a standard curve generated by different concentrations of
sodium nitrite.
Superoxide Dismutase (SOD), Catalase (CAT), and Glutathione Peroxidase (GPx)
Activities.
Mesentery homogenates and plasma were used to determine SOD, CAT, and GPx
activities. SOD activity was assayed by measuring the inhibition of adrenaline auto-oxidation as
absorbance at 480 nm.28 CAT activity was measured in terms of the rate of decrease in hydrogen
peroxide at 240 nm.29 GPx activity was measured by monitoring the oxidation of NADPH at 340
nm in the presence of hydrogen peroxide.30 The total protein content in each sample was
determined using the Bradford method.31
Statistical Analyses
Vasodilatory responses were estimated as a percentage decrease in the maximal
vasopressor effect of NE on the isolated MAB, and expressed as percentage (%) decrease in PP.
Data are expressed as the mean values of n observations ± standard error of the mean. One-way
ANOVA plus Bonferroni tests were used to compare differences between experimental groups.
121
Two-way ANOVA plus Bonferroni tests were used to compare different ages between groups.
Values were taken to be significantly different when P < 0.05.
RESULTS
Isolation and Identification of the major’s constituents of the ACH09 extract
In order to rapidly identify the active principles in grape skin, the extract was analysed by
LC/UV/MS, with an atmospheric pressure chemical ionisation (APCI) interface.32 All
compounds showed the same UV spectra in the LC/UV/DAD analysis characteristic of
anthocyanins.33,34 Compounds 1, 2, 3 and 4 presented the molecular ions at m/z 463 [M]+, 479
[M]+, 493 [M]+, and 801 [M]+ (Fig. 1). All of them show a similar fragmentation pattern.
Compounds 1, 2 and 3 presents two signals corresponding to the molecular ion [M+] and the
fragment resulting from the loss of a glucose molecule [M-162]+, corresponding to the aglicon. In
the case of compound 4, the MS spectra shows the loss of one glucose and a fragment
corresponding to the loss of an p-coumarylglucoside moiety [M-308]+.35 According to these data
the compounds were identified as peonidin-3-O-glucoside (1), petunidin-3-O-glucoside (2)
malvidin-3-O-glucoside
(3)
and
malvidin-3-(6-O-trans-p-coumaryl)-5-O-diglicoside
(4),
previously described in different species of Vitis spp.35-37 This hypothesis was confirmed by the
comparison of retention time, UV and MS data in the LC/UV/MS analysis using commercial
available standards. Compounds 1-3 are always present in grape extracts, generally in high
concentrations, with the exception of 4 which can be found in low concentration.35
122
Effect of GSE on Body weight
We compared female offspring from the four groups with initial body weights (BW) at the
age of 7 days and during the period of experimental protocol until the ages of 90 or 180 days. The
BW of the HF group were greater compared with controls (P< 0.05, n = 10) at the beginning of
the study (15 days) and from 60 to 90 days (Fig. 2). After 90 until 180 days no difference was
observed between groups. In female offspring of HF group, adiposity as assessed by the
combined wet weight of intra-abdominal and gonadal fat was increased in HF group from both
ages compared with controls. Treatment of fat-fed dams with ACH09 during lactation reduced (P
< 0.05) the BW and adiposity indicating a protective effect of ACH09 against overweight (Fig.1).
Effect of GSE on Blood Pressure and Vascular Function
Blood pressure was significantly increased in HF group from the age of 60 to 180 days
compared with control group (P< 0.05, n=6) and GSE prevented the hypertension throughout the
duration of the experiment (Fig. 3).
Vasodilation in response to ACh was not significantly different between the groups at the
age of 90 and 180 days. However, the vasodilator response to ACh was lower (P< 0.05, n = 6) in
MAB of 180 day old offspring from the four groups as compared to those at 90 day old (Fig. 4).
Effect of GSE on Plasma Lipid Levels
There was a significant effect of maternal diet on the triglyceride levels. At 90 and 180
days, HF diet was associated with higher triglyceride concentrations than other groups (P<0.05,
table 2). Treatment of HF-fed dams with ACH09 prevented the increase of triglyceride
123
concentrations of 90 and 180-day-old offspring (P<0.05, table 2). There were no significant
differences between the groups on total cholesterol levels (table 2).
Effect of GSE on Plasma Levels of Glucose and Insulin
Plasma glucose levels were significantly lower in 180-day than 90-day-old offspring from
both control and ACH09 groups, which was associated with a significant increase in insulin
levels (P<0.05, table 2). Glucose levels was higher in HF diet than in control groups (P<0.05,
table 2) which was associated with increased insulin resistance measured by HOMA index.
However, the glucose levels in 180-day- were lower than that of 90-day-old offspring from fatfed dams, which was associated with an increase in insulin levels and HOMA index. Treatment
of HF-fed dams with ACH09 prevented the increase in glycemia in offspring at both ages
(P<0.05) which were associated with a decrease in insulin resistance to the same values as
control (90 days) or even smaller than control (180 days) suggesting that GSE prevents insulin
resistance in offspring from HF-fed dams.
Effect of GSE on Plasma and Mesentery MDA
The index of lipid peroxidation assessed by MDA was significantly higher (P < 0.05) in
the plasma and mesentery of HF groups (90 and 180 days) than in control groups (n = 6, Fig. 5).
The aging increased the levels of MDA in all groups (P < 0.05). Treatment of HF-fed dams with
ACH09 prevented the increase in the levels of MDA in HF+ACH09 groups of both ages (P <
0.05). Mesentery samples, but not plasma samples from control treated group showed no
significant difference in MDA levels from control animals.
124
Effect of GSE on Plasma and Mesentery Nitrite Content
Rats from HF group showed a lower level of nitrite compared to the control groups in
plasma and mesentery samples (Fig. 5). Nitrite levels were not modified by aging between the
groups. Treatment of HF-fed dams with ACH09 during lactation prevented the decrease in the
levels of nitrite in HF+ACH09 groups of both ages (n = 6, P < 0.05). Control treated group
showed no significant difference in MDA levels from control animals.
Effect of GSE on Plasma and Tissue Antioxidant Enzymes (SOD, CAT and GPx)
Vascular antioxidant defenses include enzymatic and nonenzymatic systems. SOD and
CAT are the most important antioxidant enzymes responsible for the oxidative balance in the
vessels, and these enzymes are generally regulated by oxidative stress. As shown in figure 6
SOD, CAT and GPx activities are reduced (p<0.05) in the plasma and mesentery homogenates of
the HF groups (90 and 180 days) when compared to control groups (n=6 for each group).
Treatment with ACH09 recovered the SOD, CAT and GPx activities in mesentery and SOD and
CAT activities in plasma of HF group (p<0.05) compared to non-treated HF group. The SOD
activity in mesentery and CAT activity in plasma were increased by aging in the different groups
(p<0.05). Control treated groups showed no significant difference in antioxidant activities from
control animals.
125
DISCUSSION
Features of the MS in adult offspring of fat-fed rats can be acquired both antenatally and
during suckling.4,8,38 This study evaluated the role of the suckling period and treatment with an
alcohol-free grape-skin extract (ACH09) in the induction of oxidative stress and cardiovascular
and metabolic dysfunction in an animal model employing fat feeding in lactation. We showed an
induction of oxidative stress, insulin resistance, increased triglycerides, a discrete gain of weight
and hypertension without changes in endothelial function. In this study we demonstrated, by the
first time, the benefits effects of treatment with ACH09, on this model of developmental
programming. ACH09 prevented the hypertension and protected against oxidative stress, insulin
resistance and gain of weight in adult offspring.
Exposure to the fat-rich diet during lactation was associated with raised SBP in adult
female offspring at 90 and 180 days. The induction of hypertension in our study is in accordance
with previous finding showing that the suckling of control animals with fat-fed dams leads to
adulthood elevation of blood pressure.8 Studies in genetically hypertensive rats have also implied
that raised blood pressure may, in part, be acquired during the suckling period.39,40 Treatment of
fat-fed dams with ACH09 during suckling prevented the increase in SBP of adult female
offspring of both ages. This effect is probably mediated by endothelium-derived relaxing factors,
since our previous findings showed that grape-skin extract induces vasodilation of mesenteric
arteries of the rat mediated by NO in combination with EDHF20 and induces eNOS activation in
porcine coronary artery.41 The anti-hypertensive effect of grape-skin extract has also been
demonstrated by our group in different models of hypertension,19,23 but the present result suggests
that consumption of ACH09 early during lactation confers protection against the insult of a fatrich diet in adult offspring.
126
In this study, the vasodilation in response to ACh was not significantly different between
the groups. However, an endothelial dysfunction was observed in 180-day-old offspring of all
groups compared with offspring at 90 days. In common with our present study, previous finding
in perfused mesenteric arterial bed has shown that the endothelium-dependent vasodilator
responses to bradykinin and ACh are reduced to the same degree in adult control and
spontaneously hypertensive rats (180 days) compared with responses in preparations from young
rats, characterizing an endothelial dysfunction.42 Interestingly, oxidative damage assessed by
plasma and mesentery levels of MDA was increased in 180-day-old offspring of all groups
compared with offspring at 90 days, suggesting that vascular oxidative damage may explain in
part the endothelial dysfunction with aging. The dissociation between increased BP and
endothelial function as observed in the female offspring at 90 days from HF group reinforce
many reports that these two parameters are not invariably linked. In the female offspring,
mechanisms other than failure of endothelium-dependent relaxation may contribute to the
hypertension observed.43
There is increasing evidence supporting a role for reactive oxygen species (ROS) in the
pathogenesis of MS.44 However, to our knowledge, there are no data on the role of oxidative
stress in this model of developmental programming. We showed increased levels of MDA in
mesentery and plasma of adult female offspring at 90 and 180 days from fat-fed dams.
Furthermore, decreased antioxidant enzymatic activities (SOD, CAT and GPx) were also
observed in female offspring showing that oxidative stress, in common with raised BP can
originate during suckling. Giving further support to this suggestion, decrease levels of nitrite was
detected in plasma and mesentery of female offspring indicating decreased NO bioavailability,
which can explain in part the early increase in BP, since it is largely known that NO contributes
to the maintenance of BP.45
127
At this point, we are unable to define a mechanism that leads to this developmental
priming of oxidative stress. Although relatively little is known about the role of oxidative stress
in postnatal growth, experimental studies have demonstrated that ROS is capable of modifying
the structure and functions of cellular proteins in defined ways (conformational changes by
oxidation of cysteine residues to form disulfide and cyclic sulfonamide covalent bonds) to
regulate signal transduction pathways and gene expression.46 Oxidative stress programming may
operate either directly through the modulation of gene expression or indirectly through the
adverse effects of oxidized molecules, such as lipids and proteins, at critical developmental
windows (prenatal or postnatal), therefore resetting/programming the susceptibility to the MS.46
Further studies are needed to investigate these priming mechanisms and to fully elucidate the
timing of events on the causal pathway to hypertension and metabolic disorders.
In this study the increased MDA levels were reduced by ACH09 which corroborates the
antioxidant action of grape-skin extract, previously demonstrated by our group in normal
condition.19 The mechanism underlying this effect is not yet established, but the increase in
antioxidant defense by ACH09, as shown in mesentery and plasma may contribute to this effect
leading to increase in NO bioavailability.
Excess adipose tissue characterizes the obesity that is strongly
associated with adipocyte dysfunction which plays an important role in the
development of MS. Control offspring suckled by fat-fed dams produces phenotypic
similarities to the present model, such as increased adiposity and hyperinsulinemia in adulthood.8
This study and ours emphasize the important phenotypic induction influences of the suckling
period. ACH09 has an antiobesity effect, since the increase in body weight and adiposity in
offspring of HF group was prevented by ACH09. This effect is probably mediated by
128
polyphenols such as anthocyanins found in grape skin since recent evidence has
shown that these polyphenols have a significant potency of antiobesity and
ameliorate adipocyte function in C57BL/6 mice fed a high fat diet.47 Taking
into account the multifactorial genesis of obesity future studies are necessary
to elucidate the exact mechanisms involved in this effect.
Resistance of peripheral tissues to insulin is one of the key pathogenic factors of the MS,
since secretion of insulin by β pancreatic cells represents the most determinant hormonal effect in
the maintenance of metabolic balance of carbohydrates, lipids and proteins.48 In the present
model, hyperglycemia and hyperinsulinemia appears to be induced in the suckling period. These
abnormalities at both ages were not observed in a model of cross fostered pups from control-fed
dams to fat-fed dams at 180 days8 but older animals develop a clearly abnormal glucose profile.43
We found that ACH09 significantly decreased blood glucose and insulin in female offspring of
HF group suggesting an anti-hyperglycemic and anti-hyperinsulinemic effect. The decrease of
body weight and adiposity induced by ACH09 could explain in part the improvement of insulin
resistance by the extract, since it now appears that obesity is associated with insulin resistance,
impaired glucose tolerance and even diabetes.49 Increasing evidences show that oxidative stress
and inflammation are the main causes of insulin resistance by interfering with insulin signal
transduction.50 Therefore the antioxidant action of ACH09 may contribute to the improvement of
insulin resistance in adult offspring of fat-fed dams. However, the mechanisms underlying the
ACH09-induced insulin sensitivity are not yet established. NO seems to modulate insulin
sensitivity, since NO-synthase inhibitor decreases51 and NO donors increase glucose transport in
skeletal muscle.52 Therefore, as the grape-skin extract seems to stimulate NO synthesis, we
129
suggest that the increased insulin sensitivity induced by ACH09 treatment could be mediated, at
least in part by NO.
Increased plasma free fatty acid concentrations are typically associated with many insulinresistant states.53 Furthermore, it has been reported a strong relationship between accumulation of
plasma and intramuscular triglyceride and insulin resistance.54 In our study, besides the effects on
insulin resistance, the regulations of ACH09 on lipid metabolic disorder such as obesity and
triglycerides accumulation were also observed in adult offspring of HF group at both ages
indicating that GSE might improve metabolic lipid disorder and obesity through increasing
insulin sensitivity.
One limitation of this study is that we have not considered other biomarkers of oxidative
damage, such as, the isoprostane production level useful as a specific, sensitive and chemically
stable index of free radical generation and also the carbonylation of proteins which is a distinctive
feature of cellular redox signaling by peroxiredoxins, tyrosine phosphatases, and kinases and
transcription factors (p53, NFkB, Nrf2).55 Further studies should be carried out using those
methods. Finally, increasing evidences show that inflammatory biomarkers and oxidative stress
pathways are up-regulated in liver and adipose tissues before the onset of insulin resistance and
obesity induced by HF diet in mice.56 It would be interesting to examine this hypothesis in the
present experimental model and evaluate the possible oxidant and inflammatory-regulating
mechanisms of ACH09.
CONCLUSIONS
In conclusion, the present study provides further support for the early postnatal
environment playing a critical role in programming later life oxidative stress, metabolic disorders
and hypertension. These data emphasize the importance of a balanced diet during lactation and
130
the consequences for incidence of chronic diseases if an unhealthy diet is consumed during this
period. We have demonstrated that administration of ACH09 protected normally fed offspring of
HF-fed dams during lactation from hypertension, gain of weight, hyperglycemia and insulin
resistance. The NO synthesis and antioxidant action induced by ACH09 may contribute to these
benefic effects of ACH09. Administration of ACH09 may offer a promising natural new trend for
the treatment and prevention of MS. Further studies are being undertaken to explain fully the
mechanism(s) of the glucose and lipid metabolism regulating activities of ACH09.
131
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138
FIGURE LEGENDS
Figure 1 – HPLC profile from grape skin ACH09 extract and the structures of the four identified
anthocyanins.
Figure 2 - Effects of ACH09 on body weight evolution (A) in offspring during lactation and after
weaning until 180 days old. Total fat mass (B) at 90 and 180 day old offspring of control or high
fat-fed dams during suckling. Data are means ± SEM, n=10 for all groups. *Significantly
different from the Control and ACH09 groups (P < 0.05). +Significantly different from the
corresponding HF group (p< 0.05).
Figure 3 - Effect of ACH09 on systolic blood pressure (mm Hg) in offspring of control or high
fat-fed dams during suckling. Data are means ± SEM, n=6 for all groups. *Significantly different
from the Control and ACH09 groups (P < 0.05). +Significantly different from the corresponding
HF group (p< 0.05).
Figure 4 – Effect of ACH09 on vasodilator effect of acetylcholine (ACh) in the perfused
mesenteric arterial bed at 90 and 180 day old offspring of control or high fat-fed dams during
suckling. Data are means ± SEM, n=6 for all groups. *Significantly different from the Control
and ASE groups (P < 0.05). +Significantly different from the corresponding HF group (p< 0.05).
Figure 5 – Effect of ACH09 on malondialdehyde (MDA in nmol/mg protein) analyzed by
thiobarbituric acid reactive substances and nitrite levels in mesentery (A, C) and plasma (B, D) at
90 and 180 day old offspring of control or high fat-fed dams during suckling. Data are means ±
139
SEM, n=6 for all groups. *Significantly different from the Control and ASE groups (p< 0.05).
+
Significantly different from the corresponding HF group (P < 0.05).
Figure 6 - Effect of ACH09 on superoxide dismutase (A), catalase (B) and glutathione peroxidase
(C) activities in mesentery and plasma at 90 and 180 day old offspring of control or high fat-fed
dams during suckling. Data are means ± SEM, n=6 for all groups. *Significantly different from
the Control and ASE groups (p< 0.05). +Significantly different from the corresponding HF group
(P < 0.05).
140
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