PRECIPITAÇÃO DE PROTEÍNAS
INTRODUÇÃO
Constituição e estrutura das PROTEÍNAS

Constituição
 Aminoácidos (aa) com elevada massa molar
(> 6000Da); dos quase 200 aa conhecidos,
apenas 20 constituem as proteínas.
 Os 20 aa das proteínas se diferenciam pela
cadeia lateral R, que determina o caráter ácido ou
básico do aa em solução.

Estrutura (quatro níveis) :
 Estrutura primária: refere-se à sequência dos
aminoácidos na cadeia linear peptídica.
 Estrutura
secundária: refere-se ao grau de
ordenação espacial da cadeia polipeptídica. São
estruturas helicoidais ou folhas pregueadas.

Estrutura terciária: refere-se ao arranjo espacial
obtido pelas dobraduras e enrolamentos da
estrutura secundária. Envolve a otimização de
várias interações (hidrofóbicas, eletrostáticas e
de van der Waals) e pontes de hidrogênio entre
vários grupos na estrutura da proteína.
As estruturas secundária e terciária conferem
à proteína a sua estrutura tridimensional.

Estrutura quaternária: envolve a associação de
subunidades terciárias de proteínas. Para sua
estabilização concorrem ligações iônicas, pontes
de hidrogênio, forças de van der Waals, pontes
bissulfeto e interações hidrofóbicas.
Representação esquemática das estruturas
das proteínas
Estrutura
primária
Estrutura
secundária
Estrutura
terciária
Estrutura
quaternária
Princípios de Solubilidade




Solubilidade: resultado global das interações
atrativas e repulsivas entre moléculas do
solvente e do soluto;
É favorecida quando há interações repulsivas
entre moléculas de soluto e atrativas entre
moléculas do soluto e do solvente;
Interações entre soluto e solvente são não
covalentes => interações eletrostáticas e forças
de Van der Waals;
Interações eletrostáticas: base da solubilidade de
moléculas polares neutras e com cargas em
solventes polares;

Solubilidade de Proteínas
Determinam a solubilidade
Regiões
Hidrofóbicas
(Apolares)
Regiões Hidrofílicas
(Polares)
Além dos aa, íons ferro e cobre, oligossacarídeos e
lipídeos conferem diferentes solubilidades às
proteínas.

pH: grande influência => altera o grau de
dissociação dos grupamentos;
Carga total zero leva a um aumento da
agregação devido à menor repulsão.

perfis de solubilidade em diferentes valores de pH
O ponto de solubilidade mínima é igual ou próximo
ao ponto isoelétrico (pI), que corresponde ao valor
de pH no qual a proteína possui carga global
igual a zero.

pH e distribuição de cargas:
+ +
- -
pI
De modo geral, o solvente é aquoso, e, alterandose as propriedades do meio por mudanças na
força iônica e no pH, por adição de solventes
orgânicos miscíveis e polímeros orgânicos, alterase a solubilidade das proteínas.
Desnaturação X Precipitação

A desnaturação compreende a destruição da
estrutura terciária de uma molécula de proteína e a
formação de cadeias polipeptídicas ao acaso.
- as variáveis pH, temperatura e solventes
orgânicos, dependendo dos valores, causam
desnaturação das proteínas.

A precipitação compreende a modificação da
estrutura tridimensional da molécula de proteína.
- as mesmas variáveis, dependendo dos valores,
causam precipitação das proteínas.
PRECIPITAÇÃO






Uso: purificação de proteínas de diferentes fontes
Precipitados: agregados protéicos de moléculas de
diferentes tamanhos;
Precipitação: operação na qual uma perturbação,
química ou física, em uma solução, promove a
formação de partículas insolúveis;
Remoção do precipitado: separação sólido-líquido;
Tradicionalmente usado também como etapa de
concentração;
Etapa preliminar em diversos procedimentos de
purificação;
Pode se empregada como etapa única;

Vantagens:

Facilidade de operação

Equipamentos relativamente simples

Facilidade de ampliação de escala

Grande número de agentes precipitantes
(sendo muitos de baixo custo ou usados em
concentrações pequenas)

As técnicas de precipitação
basicamente em dois grupos:
se
dividem

Redução da solubilidade da molécula alvo
pela modificação da solução:
 Adição de sais (sulfato de amônio) em altas
concentrações, de solventes orgânicos
(etanol, éter e acetona) e de polímeros nãoiônicos (polietilenoglicol).

Redução da solubilidade por alterações da
molécula alvo:
 Mudança da carga das proteínas (adição de
ácidos e bases), uso de precipitantes
aniônicos ou catiônicos.
A precipitação deve permitir que a
conformação adequada da proteína seja
recuperada, para que esta possa
“exercer” sua função bioquímica após o
processo.
PRECIPITAÇÃO POR SAIS

Neutralização das cargas superficiais
redução da camada de hidratação
com
=> agregação dos resíduos hidrofóbicos
Salting-out: adição de sais que promovem o
aprisionamento de moléculas de água, que
tornam-se escassas, e o consequente consumo
das moléculas de água nas regiões hidrofóbicas.
Estas, expostas, se interagem e se agregam.

Região
Hidrofóbica
(Apolar)
Regiões Hidrofílicas
(Polares)
Sais mais adequados são aqueles que
apresentam elevada solubilidade.
Os mais usados são:
citrato de sódio
sulfato de sódio
sulfato de amônio

Salting-in: em baixa concentração de sais
ocorre a indução de interações iônicas e
agregação das moléculas de proteína.
Globulinas se precipitam sob força iônica baixa
Método mais comumente usado para
separação de proteínas é o da adição de sais
neutros (salting out)
Esquema explicativo da precipitação por salting-in.

Primeira descrição quantitativa do salting out foi
feita por Cohn, em 1925:
log S =  - KS ( I )
Onde:
S = solubilidade da proteína (mol/L)
I = força iônica do meio (mol/L)
 = constante que representa a solubilidade da
proteína quando I = 0 (mol/L)
KS = constante de salting out
Misturas de proteínas não obedecem à equação!
PRECIPITAÇÃO POR SOLVENTES

A solubilidade das proteínas varia com a
distribuição
dos
resíduos
hidrofílicos
e
hidrofóbicos na superfície da molécula;

Álcoois de cadeia inferior, acetona, éteres e
outros são usados como precipitantes desde
início do século XIX;

Aplicação clássica: fracionamento das proteínas
do plasma sanguíneo por etanol frio (Método de
Cohn)
MECANISMO

Principal efeito:  da constante dielétrica do meio
+
+
-
Região
Hidrofóbica
+
+
Solvente
Orgânico
--
+
+
+
+
-
-
-
-
+
+
-
+
+
- + -
Agregação de
proteínas por
interações
eletrostáticas entre
superfícies com
cargas de sinal
oposto em meio
aquoso contendo
solvente orgânico.
SOLVENTES



Devem ser miscíveis em água, não reagir
diretamente com as moléculas e ser bons
precipitantes;
Mais usados: metanol, etanol e acetona;
Outros: n-propanol, i-propanol, 2-metoxietanol, e
outros álcoois, éteres e cetonas;

VARIÁVEIS QUE AFETAM O PROCESSO

Temperatura:
20 – 30 ºC estimulam a
xxxxxxxxxxxxxxxxxdesnaturação
< 0º C pode garantir que
xxxxxxxxxxxnão haja desnaturação
Adição do solvente  temperatura
=> deve ser lenta e sob refrigeração


Concentração de sais:  concentrações
dificultam interações eletrostáticas =>
dificuldade de precipitação => % solvente
pH: próximo ao pI favorece a precipitação
PRECIPITAÇÃO FRACIONADA







Meios a serem purificados, em geral, constituem misturas
Precipitação fracionada corresponde à precipitação em
duas ou mais etapas
Na primeira removem-se proteínas indesejáveis menos
solúveis e, nas seguintes, precipitam-se uma ou mais
moléculas-alvo
Em um estágio: útil como técnica de concentração
Fracionada: aplicação industrial para purificação;
Na precipitação fracionada em geral varia-se a
concentração do agente precipitante, mas também podese variar outros fatores;
Os estágios são chamados de “cortes” (em geral, dois);
30% v/v
50% v/v
Representação teórica dos perfis de solubilidade de uma
molécula de interesse e outras presentes no meio, em
concentrações crescentes de precipitante.
pH 4,6
% Recuperação
100
80
xilanase
60
beta-xilosidase
proteínas totais
40
20
0
0
20
40
60
80
100
% etanol (v/v)
Recuperação (%) das enzimas: xilanase (),
-xilosidase () e proteínas totais ().
Parâmetros de Avaliação

Recuperação de proteínas totais:

Rp = teor de proteínas após precipitação x 100
teor de proteínas inicial

Recuperação de atividade:

Ra =
atividade após precipitação x 100
atividade inicial

Aumento de pureza:

AP =
atividade específica após precipitação
atividade específica inicial
Resultados obtidos após precipitação fracionada com etanol das
enzimas xilanase, -xilosidase e proteínas totais.
-xilosidase
Amostra
RP1
(%)
RA2
(%)
AP3
Inicial
-
-
1,0
20% etanol
71
8
0,1
60% etanol
12
74
5,9
80% etanol
18
6
0,4
Xilanase
Amostra
RP
(%)
RA
(%)
AP
(AEf/AEini)
Inicial
-
-
1,0
20% etanol
71
6
0,1
60% etanol
12
7
0,6
80% etanol
18
81
4,4
1Recuperação
de proteínas totais;
Atividade; 3Aumento de pureza.
2Recuperação
de
PRECIPITAÇÃO POR POLÍMEROS
PEG (polietilenoglicol), polímero de alta massa molar,
neutro e miscível em água, disponível em diversos graus
de polimerização;





Em geral,  proporções de polímero (15 a 30%);
4000 g/mol ou mais são os mais eficientes
Mecanismo: exclusão da proteína do meio aquoso;
Concentração depende do tamanho da molécula a
ser precipitada e da massa molar do polímero, sendo
inversamente proporcional à concentração da
proteína;
Remoção do polímero: ultrafiltração, diálise, adição
de etanol.
Polieletrólitos: polímeros iônicos solúveis em
água; usados devido ao baixo custo e pouca
concentração residual;
 Policátion polietilenoimina e poliânion ácido
poliacrílico
 Mecanismo: agregação à proteína (floculação)
ou eletrostático (neutralização de cargas);
PRECIPITAÇÃO PELA TEMPERATURA
 Mecanismo:1) diminuição: redução na solubilidade;
2) aumento: desnaturação => exposição de grupos
hidrofóbicos que interagem e formam complexos
insolúveis;
PRECIPITAÇÃO ISOELÉTRICA
 Resulta da atração eletrostática das proteínas
quando estas estão próximas a seu pI;
 Método bastante simples: ajuste do pH
 Próximo ao pI a repulsão eletrostática é mínima
=> precipitação isoelétrica, por interação entre
as zonas hidrofóbicas;
 Vantagem: baixo custo
 Desvantagem: possibilidade desnaturação

Obs: Método útil para precipitar proteínas
indesejáveis e otimizar outros tipos de
precipitação;
Outros tipos de precipitação

Por afinidade: uso de interações específicas e
seletivas da molécula-alvo com algum ligante;
 Ex.:Cibracon
blue em metilmetacrilato para
purificar lactato desidrogenase.

Por íons metálicos: íons metálicos polivalentes
podem ser usados eficientemente na precipitação:
manganês, ferro, cobalto, níquel, cobre, zinco e
cádmio.
Mecanismo: mudanças do pI e formação de
ligações cruzadas com outras proteínas.

Principais métodos de precipitação de proteínas
Precipitante
Princípio
Vantagens
Desvantagens
Sais neutros
(salting-out)
Interações
hidrofóbicas pela
redução da camada de
hidratação da proteína
- Uso universal
- Baixo custo
- Corrosivo
- Liberação de
amônia em pH
alcalino
Polímeros nãoiônicos
Exclusão da proteína
da fase aquosa
reduzindo a
quantidade de água
disponível para a
solvatação da proteína
- Uso de
pequenas
quantidades de
precipitante
- Aumento da
viscosidade
Calor
- Baixo custo
interações
hidrofóbicas e
- Simples
interferência das
moléculas de água nas
ligações de hidrogênio,
- Risco de
desnaturação
Polieletrólitos
Ligação com a molécula
de proteína atuando
como agente floculante
- Uso de
- Risco de
pequenas
desnaturação
quantidades de
precipitante
Precipitação
isoelétrica
Neutralização da carga
global da proteína pela
alteração do pH do meio
- Uso de
- Risco de
pequenas
desnaturação
quantidades de
precipitante
Sais
metálicos
Formação de complexos
- Uso de
- Risco de
pequenas
desnaturação
quantidades de
precipitante
Solventes
orgânicos
Redução da constante
dielétrica do meio
aumentando as
interações eletrostáticas
intermoleculares
- Facilidade de
reciclagem
- Facilidade na
remoção do
precipitado
- Risco de
desnaturação
de proteínas
- Inflamável e
explosivo