Pró-Reitoria de Graduação
Curso de Farmácia
Trabalho de Conclusão de Curso
ESTUDO DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DE FÁRMACOS
NO CONTEXTO DOS ENSAIOS DE ESTABILIDADE
Autor: Guilherme Gonçalves da Silva
Orientador: Prof. MSc. Emmanuel de Oliveira Carneiro
Brasília - DF
2011
GUILHERME GONÇALVES DA SILVA
ESTUDO DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DE FÁRMACOS NO CONTEXTO
DOS ENSAIOS DE ESTABILIDADE
Monografia apresentada ao curso de
graduação em Farmácia da Universidade
Católica como requisito para obtenção do
título de Farmacêutico.
Orientador: Prof. MSc. Emmanuel de
Oliveira Carneiro
Brasília
2011
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Monografia de autoria de Guilherme Gonçalves da Silva, intitulada “ESTUDO
DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DE FÁRMACOS NO CONTEXTO DOS
ENSAIOS DE ESTABILIDADE”, apresentada como requisito parcial para obtenção
do título de farmacêutico pela Universidade Católica de Brasília, em 07 de junho de
2011, defendida e aprovada pela banca examinadora abaixo assinada:
____________________________________________
Prof. MSc. Emmanuel de Oliveira Carneiro
Orientador
Curso de Farmácia
_____________________________________________
Prof. MSc. Wilsione José Carneiro
Curso de Farmácia
______________________________________________
Profa. Dra. Silvia Keli de Barros Alcanfor
Curso de Química
Brasília
2011
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RESUMO
Referência: Silva, Guilherme G. Estudo dos produtos de degradação de
fármacos no contexto dos ensaios de estabilidade. 2011. 22p. Monografia (Curso
de Farmácia) – UCB, Brasília, 2011.
O prazo de validade e o período de utilização de qualquer especialidade
farmacêutica são determinados por estudos de estabilidade. Esses estudos são
subdivididos em quatro ramos: estudos de degradação forçada, estudos de
estabilidade acelerada, estudo de estabilidade de longa duração e o estudo de
estabilidade de acompanhamento. Os objetivos desses estudos são prever,
determinar ou acompanhar o prazo de validade e o período de utilização do produto
estudado. A primeira etapa dos estudos diz respeito ao desenvolvimento e validação
de um método analítico confiável. Sendo assim, é indispensável conhecermos os
produtos de degradação do produto e, para isso, é recomendada a utilização de
métodos cromatográficos e espectrométricos. O presente trabalho revisa a literatura
em busca de estudos de produtos de degradação e dos processos de validação dos
métodos analíticos aplicados a diversos fármacos disponíveis no mercado brasileiro
e internacional, além do referencial legal para elaboração e execução dos referidos
testes de estresse e degradação forçada.
Palavras chave: Estabilidade. Produto de degradação. Testes de estresse.
Validação.
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ABSTRACT
Reference: Silva, Guilherme G. Study of degradation products of
pharmaceuticals in the context of stability testing. 2011. 22p. Monograph
(Pharmacy Course) - UCB, Brasília, 2011.
The validity date and time of use of any medicinal product are determined by stability
studies. These studies are divided into four branches: degradation studies,
accelerated stability studies, long-term stability study and monitoring stability studies.
The aims of these studies are to predict, monitor or determine the validity and period
of use of the pharmaceutical product. The first stage of these studies concerns the
development and validation of a reliable analytical method. Therefore, it is essential
to know the degradation products of the drug and, for this, chromatographic and
spectrometric methods are used. This work reviews degradation products studies
and analytical methods validation processes for various drugs on brazilian and
international markets, besides the legal reference for the elaboration and
implementation of these stress tests and forced degradation.
Keywords: Stability. Degradation product. Stress test. Validation.
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LISTA DE FIGURAS
Figura 01. Estrutura química da venlafaxina (1) e de seus produtos de degradação
O-desmetilvenlafaxina (2) e dehidrovenlafaxina (3).
Figura 02. Estrutura da avizafona e de seus principais produtos de degradação.
Figura 03. Proposta de degradação da furosemida.
Figura 04. Estrutura química da oxcarbazepina, imp. A, imp. B e imp. C
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SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 7
2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 9
2.1 OBJETIVO GERAL ..................................................................................... 9
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS ...................................................................... 9
3. METODOLOGIA ............................................................................................ 10
4. ESTUDOS DE ESTABILIDADE ..................................................................... 11
5. ESTUDO DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DE FÁRMACOS .............. 14
5.1 METODOLOGIA GERAL EMPREGADA PARA O ESTUDO DOS
PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO ................................................................... 22
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS ........................................................................... 24
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................................... 25
7
1. INTRODUÇÃO
Toda especialidade farmacêutica possui um perfil específico de estabilidade,
tanto do seu princípio ativo, quanto da formulação de maneira geral. Os fatores que
definem esse perfil são de natureza ambiental, como a umidade, a temperatura, a
exposição à luz; de natureza intrínseca, como as propriedades físico-químicas do
produto e da formulação; e finalmente os decorrentes dos processos de manufatura
(BRASIL, 2005).
Um dos objetivos dos estudos de estabilidade de produtos farmacêuticos é a
fixação do prazo de validade, que pode ser definido como o período no qual o
medicamento apresenta sua potência alterada a mais ou menos 10%, associado à
quantificação dos produtos de degradação e sua investigação quanto ao potencial
tóxico (BRASIL, 2005; NETO et al., 2009).
A Resolução - RE nº 01, em vigor desde 29 de junho de 2005, instituiu o Guia
Para a Realização de Estudos de Estabilidade. Estabelecida pela ANVISA, essa
resolução normatiza três estudos de estabilidade: o estudo de estabilidade
acelerada, no qual é avaliada degradação química e/ou mudanças físicas em
amostras do mesmo produto no período de seis meses (amostras em 0, 3 e 6
meses); o estudo de estabilidade de longa duração, que avalia a estabilidade das
características físicas, químicas, biológicas e microbiológicas de amostras do
mesmo produto em um período de 24 meses (amostras em 0, 3, 6, 9, 12, 18 e 24
meses); e o estudo de estabilidade de acompanhamento, realizado para verificar
que o produto farmacêutico mantém suas características físicas, químicas,
biológicas e microbiológicas conforme os resultados obtidos nos estudos de
estabilidade de longa duração (BRASIL, 2005; NETO et al., 2009).
Os estudos de degradação forçada, que empregam condições de degradação
que excedem aquelas encontradas nos estudos de estabilidade acelerada, ainda
não foram regulamentados no Brasil. Porém, nações européias, o Japão e os
Estados Unidos já definiram legislações específicas nesse âmbito, sendo que
estudos dos produtos de degradação de fármacos são preconizados pela
International Conference on Harmonisation (ICH, 2003) Desta forma, pode-se prever
que tais testes serão preconizados pela Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) em um curto período de tempo.
8
Atualmente, encontram-se na literatura diversas pesquisas concluídas ou em
andamento sobre os estudos de degradação forçada, utilizando principalmente
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE), Cromatografia Gasosa (CG),
potenciometria entre outras metodologias instrumentais para a quantificação e
Detector de arranjo de diôdos (PDA) ou ultravioleta (UV) para a detecção dos
produtos de degradação. Como exemplo, podemos citar estudos de produtos de
degradação do aciclovir (SINHA et al., 2007), alizaprida (GROSA et al., 2010),
avizafona (BRENTON et al.,2006), fanciclovir (RAMAN et al., 2009) e venlafaxina
(CARNEIRO et al., 2010).
Neste sentido, o estudo dos produtos de degradação tem se tornado muito
importante no contexto dos ensaios de estabilidade. Tanto que a determinação
destes produtos por meio do teste de estresse, definido como o teste de estabilidade
do fármaco ou produto farmacêutico em que as condições excedem as usadas no
teste de estabilidade acelerada, tem merecido destaque e encontra-se padronizada
internacionalmente.
9
2. OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
Fazer uma revisão da literatura científica e regulatória sobre a determinação
dos produtos de degradação de fármacos pela aplicação dos testes de estresse na
avaliação da estabilidade de produtos farmacêuticos.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Apresentar os tipos de estudo de estabilidade preconizados pela Legislação
Brasileira, por meio da Resolução RE nº. 1, de 29 de julho de 2005, da Agência
Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA);
Revisar testes de estresse e estudos de produtos de degradação de fármacos
descritos na literatura;
Propor a metodologia geral empregada em um estudo de produtos de
degradação de fármacos.
10
3. METODOLOGIA
A revisão de literatura foi realizada por meio do operador booleano E/AND e
de palavras–chave, tanto em português como em inglês, como: stability-indicating
method, HPLC, degradation products, stress study, tablets pelas bases de dados
CAPES e SciELO, as quais foram acessadas na Universidade Católica de Brasília
no período de setembro a outubro de 2010 e maio de 2011. Foram selecionados
artigos em língua inglesa e portuguesa, com prioridade para os publicados nos
últimos 10 anos. Foi realizada busca sobre os assuntos regulatórios pertinentes ao
tema na legislação sanitária brasileira (ANVISA) e internacional (ICH).
11
4. ESTUDOS DE ESTABILIDADE
Os estudos de estabilidade de fármacos são uma etapa obrigatória do registro
de novos produtos farmacêuticos. A ANVISA elaborou a Resolução - RE nº 1 de 29
de junho de 2005, baseada na extinta Resolução - RE nº 398/2004. A RE 1/2005
define os parâmetros e limites obrigatórios para realização de estudos de
estabilidade acelerado, estudos de estabilidade de longa duração e estudos de
estabilidade de acompanhamento para qualquer forma farmacêutica.
Os objetivos desses estudos são, respectivamente, prever, determinar ou
acompanhar o prazo de validade e o período de utilização do medicamento
estudado. Em suma, prazo de validade e período de utilização dizem respeito à
estabilidade do produto antes e depois de sua abertura, respectivamente (BRASIL,
2005).
No âmbito legal, o produto farmacêutico pode ser submetido ao registro após
realização do estudo de estabilidade de longa duração por doze meses. De forma
alternativa, podem ser utilizados os resultados dos seis meses do estudo de
estabilidade acelerado associado aos seis meses iniciais do estudo de estabilidade
de longa duração. Por exemplo, no intuito de obter o registro da insulina “CHO” o
controle de qualidade de uma indústria hipotética deve realizar o estudo de
estabilidade de longo prazo, pretendendo-se armazenar o produto na faixa de 2 ºC a
8 ºC em embalagem impermeável. De acordo com a Tabela 01 a faixa de
temperatura na qual o produto estaria submetido em um estudo de estabilidade de
longo prazo é de 5 ºC mais ou menos 3 ºC e o período seria de 24 meses. Nessa
situação, o registro do produto seria obtido de forma provisória decorrido doze
meses do início desse estudo. Alternativa mais ágil seria desenvolver paralelamente
ao estudo anterior o estudo de estabilidade acelerado. A Tabela 01 orienta para
execução desse estudo na faixa de temperatura de 25 ºC mais ou menos 2 ºC por
um período de seis meses. Nessa situação, o registro do produto seria obtido
passado seis meses desde o início dos estudos. Além do teor e dos produtos de
degradação, o produto deveria ser avaliado quanto à claridade em soluções e a
perda de peso quando em líquido de base aquosa (BRASIL, 2005).
Alterando-se temperatura e, quando aplicável, umidade (Tabela 01), são
avaliadas como no exemplo anterior as formas farmacêuticas sólidas e semi sólidas,
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onde ainda deve ser avaliado a dissolução e dureza de sólidos e, separação de fase
e perda de peso em suspensões de base aquosa.
Tabela 01. Critérios para realização de estudos de estabilidade. (Fonte: Resolução RE 1/2005)
Os relatórios de estabilidade elaborados pelo controle de qualidade devem
conter a descrição do produto, plano de estudo, data de início do estudo, método
analítico correspondente tanto para teor do princípio ativo quanto para quantificação
dos produtos de degradação, limites microbianos, relatório do fabricante da
embalagem primária além de identificação do fabricante do princípio ativo. A esses
dados somam-se as características físico-químicas do produto, a quantificação dos
produtos de degradação e o teor de princípio ativo, sendo o último limitado a faixa de
variação de 5%. Caso a variação seja maior que 5% e menor que 10% o prazo de
validade provisório é reduzido de 24 para 12 meses (BRASIL, 2005).
De Diego et al. (2011) pesquisaram o perfil de estabilidade do maleato de
enalapril sob condições de estudo acelerado e de estresse. Quanto ao estudo de
estabilidade acelerado, foi utilizada câmara climatizada em temperatura de 40 ± 2 ºC
e umidade relativa de 75 ± 5% para decomposição dos comprimidos de maleato de
enalapril 10 mg em sua embalagem primária. Amostras foram retiradas em 0, 30, 90
e 180 dias de exposição. Foram utilizados nesse estudo comprimidos de três
fabricantes de genéricos e quatro fabricantes de marca, sendo um produto do último
grupo denominado medicamento de referência. As condições cromatográficas
utilizadas em todas as análises foram coluna de fase reversa C18, fase móvel
metanol : tampão fosfato pH 2,2 0,01M (55:45 v/v), fluxo de 1,0 mL/min, detecção
UV em 215 nm. Como padrão interno, foi usado solução de ácido salicílico (60
13
μg/mL). Os resultados do estudo mostraram alta degradação da maioria dos
comprimidos de maleato de enalapril testados. Enquanto o medicamento referência
apresentou redução de 1,8% do seu teor, um dos medicamentos genéricos mostrou
redução de 59,4% do teor inicial ao fim dos 180 dias. Os cromatogramas mostram
degradação gradual do maleato de enalapril em enalaprilato e, principalmente, em
dicetopiperazina. Associado a esses resultados, encontrou-se alta degradação da
solução de maleato de enalapril nos testes de estresse, principalmente em hidrólise
alcalina.
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5. ESTUDO DOS PRODUTOS DE DEGRADAÇÃO DE FÁRMACOS
Existem na literatura diversos relatos sobre estudos de degradação de
fármacos, disponíveis desde a década de 1970 (KOVAR et al., 1974; ROWBOTHAM
et al., 1976) e de relevância até os dias atuais.
Bedse et al. (2009) analisaram a matéria prima pura em pó de lamivudina,
inibidor da transcriptase reversa do HIV-1, quanto às suas características de
degradação forçada. Seus produtos de degradação foram produzidos e elucidados
utilizando reagentes padrão analítico e por procedimentos recomendados pelo ICH.
As vias de degradação, assim como os mecanismos de decomposição, foram
investigadas de acordo com os dados coletados. Os estudos desenvolvidos foram
reações de hidrólise ácida, básica e neutra por refluxo em ácido clorídrico (HCl)
0,1N, hidróxido de sódio (NaOH) 0,1N e água a 80º C por 48h, 12h e 72h,
respectivamente; oxidação por 48h em solução de peróxido de hidrogênio (H2O2) 3%
e H2O2 30% numa concentração de lamivudina de 1 mg.mL−1 e 10 mg.mL−1,
respectivamente; fotólise em placa de petri, com iluminação UV-A 200 Wh/m² e
térmica por aquecimento a seco a 50 ºC por dois meses. As amostras resultantes
foram diluídas e filtradas antes de serem analisas por Cromatografia Líquida de Alta
Eficiência (CLAE ou HPLC, High Performance Liquid Chromatography). A hidrólise
neutra não resultou nenhum produto de degradação, enquanto os meios ácidos e
alcalinos geraram três destes. A oxidação em H2O2 3% não gerou produto de
degradação, contudo, em H2O2 30% a degradação foi de 35% em 48h e completa
em 72h. Os estudos de fotólise e degradação térmica não demonstraram formação
de quantidades detectáveis de produtos de degradação nas amostras sólidas. A LCMS/TOF (Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas com
detecção por tempo de vôo) permitiu a elucidação das rotas de degradação e de
seus respectivos produtos de degradação. Diante disso, observa-se êxito na
elucidação dos produtos de degradação e de suas respectivas vias de produção,
considerando o método desenvolvido como capaz de qualificar e quantificá-los em
diversas condições de degradação (BEDSE et al., 2009).
Carneiro et al. (2010) avaliaram cápsulas de liberação prolongada de
venlafaxina (VEN), um antidepressivo de terceira geração, que age inibindo a
recaptação de serotonina, noradrenalina e, em menor grau, de dopamina. VEN
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possui boa absorção oral e é extensivamente metabolizada em desvenlafaxina, seu
principal metabólito ativo. São relatados na literatura diversos métodos de análise da
VEN em fluidos biológicos, porém, apenas três métodos indicadores de estabilidade
foram encontrados para formas farmacêuticas. A solução estoque padrão de VEN foi
preparada na concentração de 0,75 mg/mL, enquanto a solução estoque de amostra
foi preparada na concentração final de 1,5 mg/mL. A validação do método para
análise de VEN e seus produtos de degradação foi realizada quanto aos parâmetros
especificidade, linearidade, precisão, exatidão, limites de detecção e quantificação e
robustez, seguindo as orientações do ICH. Os estudos de degradação forçada foram
realizados sob condições ácidas, básicas e oxidativas, utilizando alíquotas de 5,0 mL
na concentração inicial de 1,5 mg/mL de VEN em solução de metanol, alcançando a
concentração final de 0,75 mg/mL. Foi usado HCl 2M, NaOH 2M e H2O2 3%, sendo
os dois primeiros incubados a 60 ± 5 °C por 24 h e o último mantido a temperatura
ambiente por 3 h, protegido da luz. As condições cromatográficas empregadas foram
coluna cromatográfica C8, tampão hidrogenofosfato dissódico 40 mM contendo
trietilamina (pH 6.8) e acetonitrila (75:25, v/v) como fase móvel, volume de injeção de
10 µL e fluxo de 1,0 mL/min. Os analitos foram detectados e quantificados por
detector UV na faixa de 225 nm. A linearidade e os limites de detecção (LOD) e
quantificação (LOQ) foram elucidados através dos dados inferidos da curva de
calibração da VEN, mostrando linearidade entre 0,45-1,05 mg/mL. O LOD e o LOQ
foram gerados a partir de três curvas de calibração independentes, resultando em
valores de 0,00043 mg/mL para LOD e 0,00145 mg/mL para LOQ. A análise de
precisão mostrou bons resultados, tanto inter-dia quanto inter-analista, assim como a
análise de exatidão, realizada em três concentrações diferentes. A robustez do
método foi verificada quanto a pequenas variações na taxa de injeção, pH da fase
móvel, temperatura da coluna, concentração do tampão e diferentes lotes da coluna
cromatográfica. A adequação do sistema CLAE foi avaliada pelos parâmetros fator
de retenção, número de pratos teóricos e fator de cauda, que resultaram em 2.76,
3201.4 pratos/m e 1.6, respectivamente. Os resultados não mostraram mudanças
significativas na quantificação de VEN. Os cromatogramas de degradação forçada
sob condições alcalina e oxidativa não mostraram picos adicionais, somente aquele
correspondente à VEN, demostrando que não houve formação de produtos de
degradação sob essas condições. O cromatograma correspondente a degradação
forçada por ácido mostrou dois picos adicionais (tempo de retenção 3,12 min e 9,34
16
min), que posteriormente foram caracterizados, por ESI-MS/MS (Espectrometria de
Massas-Massas com ionização por elétron-spray), como dehidrovenlafaxina (3),
produto de desidratação da VEN (1) e como a desvenlafaxina (2), esquematizados
na figura 1.
O
OH
(1)
O
OH
N
OH
(2)
N
N
(3)
Figura 1: Estrutura química da venlafaxina (1) e de seus produtos de degradação Odesmetilvenlafaxina (2) e dehidrovenlafaxina (3). (Fonte: CARNEIRO et al., 2010).
Observando o exposto, é correto afirmar que o método desenvolvido e
validado para análise de VEN em cápsulas de liberação prolongada pode ser
considerado simples, sensível, específico, preciso, exato e reprodutível, além de
indicativo da estabilidade da VEN (CARNEIRO et al., 2010).
O aciclovir puro em pó foi degradado em condições de estresse por Sinha et
al. (2007). Este antiviral é usado em muitos tipos de infecção por herpes-vírus, e
pode ser determinado em formulações farmacêuticas por vários métodos
cromatográficos, destacando-se a cromatografia em camada delgada (CCD) e
CLAE. Outro método descrito na literatura é a determinação fluorimétrica. Os
estudos de degradação forçada empregados foram degradação por hidrólise,
oxidação, fotólise e térmica. Todos os testes seguiram as recomendações do ICH e
a metodologia foi validada quanto à precisão, exatidão, especificidade e robustez. A
solução padrão de estoque foi preparada com 100 mg de aciclovir, chegando a
concentração final de 1 mg/mL. O sistema CLAE utilizou uma coluna C18 em fase
reversa, operada a temperatura ambiente. A fase móvel era composta por água
tridestilada-metanol (90:10), em fluxo de injeção a 1 mL/min. O comprimento de
onda para detecção foi 251 nm. Para validar o método foram desenvolvidas técnicas
de determinação da linearidade, por diluição da solução padrão de estoque em um
intervalo de 10-200 μg/mL, cujas alíquotas foram analisadas em triplicata por CLAE;
precisão intra-dia por injeção de três diferentes níveis de concentração em
17
hexaplicata no mesmo dia, e em três dias diferentes para determinar a precisão
inter-dia; exatidão, pelo percentual de recuperação do fármaco em três diferentes
concentrações da amostra; especificidade, determinando a pureza do aciclovir na
presença dos produtos de degradação; robustez, alterando o fluxo de injeção e a
temperatura da coluna cromatográfica. Os estudos de estresse foram desenvolvidos
sob hidrólise neutra, com água em refluxo por 96 h; hidrólise ácida, empregando HCl
em concentrações de 0,1 N, 1 N e 2 N a 80 °C por 2 h; hidrólise básica, com NaOH
1 N a 80 °C por 2 h; oxidação, com H2O2 a 1% por 30 min e posteriormente por 3 h,
H2O2 3% por 8 e 24 h e H2O2 10% e 30% por 24 h; fotólise, em solução aquosa,
ácida (HCl 0,1 N) e em estado sólido por 14 dias em uma câmara de fotoestabilidade
climatizada a 40 ºC e 75 % UR composta por duas lâmpadas UV e quatro lâmpadas
na faixa visível conforme recomendado pela opção 2 da orientação Q1B do ICH;
térmico, amostra sólida submetida ao calor seco a 70 °C por 15 dias. Foram
formados produtos de degradação relevantes somente na hidrólise ácida, em todas
as concentrações de HCl; na degradação oxidativa, a partir de uma concentração de
10% de H2O2 foi observado aumento da degradação diretamente proporcional à
concentração do agente oxidante e do tempo de exposição. A análise dos produtos
obtidos confirma a guanina como o principal produto de degradação do aciclovir. Os
outros testes de estresse não apresentaram formação significante de produtos de
degradação (SINHA et al., 2007).
Outro estudo de degradação de fármacos foi conduzido por Brenton et al.
(2006). Eles determinaram a avizafona, um pró-fármaco do diazepam desenvolvido
visando contornar a baixa solubilidade deste em água. Assim, ela pode ser
desenvolvida em uma formulação estável para aplicação intramuscular. O
comportamento de degradação da avizafona foi investigado sob quatro condições de
estresse: hidrolítica, oxidativa, fotolítica e térmica. A metodologia desenvolvida foi
validada, determinando os parâmetros de linearidade, especificidade, precisão
(repetibilidade e precisão intermediária) e exatidão. A cromatografia foi realizada em
coluna CN, a qual apresenta grupos nitrila associados à sílica, à temperatura de 35
°C em um fluxo de 300 μL/min. A detecção UV foi realizada a 254 nm. Fase móvel
composta por água:metanol:acetonitrila (7:1:2). As condições de degradação forçada
foram hidrólise ácida, HCl pH 1 (0,1 N); hidrólise alcalina, NaOH pH 12 (0,1 N);
degradação oxidativa, H2O2 a 1 e 10%. Estes estudos foram realizados à
temperatura ambiente (22 °C) sem interferência de luz. O fármaco sob a forma de pó
18
e em solução foi exposto a temperaturas de 60, 80 e 100 °C por duas semanas. A
fotoestabilidade do fármaco em pó e em solução foi avaliada por irradiação contínua
por lâmpada de xenônio em 7,1 h e 21 h.
O perfil de degradação fotolítica da avizafona em pó foi de 10% após 21h de
exposição à luz, enquanto a solução apresentou degradação de aproximadamente
70% após 7,1 h. As análises por CLAE-UV (CLAE com detecção Ultravioleta) e LCMS (Cromatografia Líquida acoplada a Espectrometria de Massas) elucidaram dois
produtos de degradação sob essas condições, sendo eles MACB e ACB (figura 2).
Tanto a hidrólise ácida quanto a hidrólise básica não produziram produtos de
degradação. Sob condições oxidativas a 10%, houve pequena degradação e
formação de um único produto (MACB). O estudo da degradação por calor seco
mostrou que esta foi extensa, 80% a 100 °C, e resultou em diversos produtos de
degradação. O principal deles foi o MPQ (figura 2), além de dois produtos de
degradação desconhecidos (BRENTON et al., 2006).
O
H2N
Cl
O
H
N
N
NH2
O
AVIZAFONA
O
O
N
O
H2N
NH 2
HN
Cl
ACB
Cl
MACB
Cl
MPQ
Figura 2: Estrutura da avizafona e de seus principais produtos de degradação. (Fonte: BRENTON et
al., 2006).
Ramam et al. (2009) avaliaram a degradação do fanciclovir, um análogo da
guanina, fármaco antiviral utilizado para diversas infecções por herpes-vírus. É um
pró-fármaco do penciclovir, com biodisponibilidade oral melhorada. Um novo método
indicador de estabilidade por CLAE em fase reversa foi desenvolvido para
determinação da pureza do fanciclovir na presença de impurezas e produtos de
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degradação. O método foi desenvolvido usando coluna ODS (octadecilsilano, C18)
com um gradiente de mistura dos solventes nas bombas A e B como fase móvel.
Tampão fosfato potássico dihidrogênio 0,01M, pH ajustado para 6,0 com 1% de
hidróxido de potássio, foi usado como tampão. Tampão e metanol em uma
proporção 80:20 (v/v) foram usados na bomba A. Tampão e metanol em uma
proporção 20:80 (v/v) foram usados na bomba B. O tampão também foi utilizado
como diluente. A programação do gradiente de eluição (Tempo/%B) foi configurada
como 0/5, 15/30, 25/50, 45/60, 55/5 e 60/5. O fluxo foi de 0,8 mL/min e a
temperatura da coluna foi mantida em 27 ºC. O sistema foi monitorado a 215 nm. O
fanciclovir foi submetido a condições de estresse oxidativo, ácido, básico, hidrolítico,
térmico e fotolítico. Observou-se degradação significativa em condições de
degradação oxidativa, ácida e básica e leve sob degradação hidrolítica. Os produtos
de degradação foram identificados a partir dos picos principais, sendo assim, essas
impurezas demonstraram o poder indicativo de estabilidade do método. O método
desenvolvido foi validado como proposto nas orientações do ICH, com determinação
dos parâmetros especificidade, limite de detecção, limite de quantificação, precisão,
linearidade, exatidão, robustez e adequação do sistema (RAMAN et al., 2009).
Cavrini et al. (2003) estudaram o perfil de degradação de comprimidos de
triantereno, um diurético poupador de potássio, comumente formulado em
associação a outros diuréticos, como a furosemida ou a hidroclorotiazida. Todos
esses fármacos apresentam fotorreatividade característica, com o espectro de
absorção máxima acima de 280 nm. A fotoestabilidade dos fármacos diuréticos
triantereno e furosemida foi avaliada individualmente e em associação. Métodos
espectrofotométricos, espectrofluorimétricos e cromatográficos foram aplicados para
monitorar a fotodegradação dos fármacos. Foram empregadas três fontes diferentes
de radiação: neon, lâmpada de tungstênio e luz solar. Confirmou-se extensa fotólise
da furosemida em solução aquosa e metanólica com pH 7,4. Contudo, quando os
fármacos estão associados em uma solução de pH 7,4 e expostos a radiação de 365
nm, foi observado um significante efeito fotoprotetor do triantereno sobre a
furosemida. Esse efeito pode ser explicado pela absorção da radiação a 357 nm
pelo triantereno com posterior emissão em um alto comprimento de onda não
absorvido pela furosemida. Os comprimidos da associação de fármacos também se
mostram fotoestáveis após 65 h de exposição à luz (CAVRINI et al., 2003).
20
Dias et al. (2004) revisaram os produtos de degradação da furosemida. Sob
condições específicas, a furosemida (1) degrada, gerando cinco produtos de
degradação. A hidrólise ácida promove clivagem do grupo furfuril, formando a
saluamina (2) e ácido furfurílico (3). Este último, por sua vez, é decomposto
posteriormente a ácido levulínico (4). Agentes oxidantes decompõem o grupo
sulfamoil da furosemida em ácido 4-cloro-5-sulfoantranílico (5). Já a exposição à luz
provoca substituição do átomo de cloro em poucos minutos (6). Estes produtos de
degradação da furosemida estão esquematizados na figura 3.
Figura 3: Proposta de degradação da furosemida. (Fonte: Dias et al., 2004).
Diversos autores preconizam a utilização de métodos cromatográficos para
detecção e quantificação da furosemida dos produtos de degradação, por apresentar
vantagens como a capacidade de separar e analisar quantitativamente o fármaco
em vários tipos de matrizes, e apresentar boa resolução, eficiência e sensibilidade.
Uma alternativa seria a metodologia potenciométrica, na qual se empregam
eletrodos íon-seletivos. Não há necessidade de separação prévia da amostra,
apenas diluição ou dissolução em solvente apropriado e ajuste de pH e força iônica
(DIAS et al., 2004).
Shingare et al. (2007) desenvolveram um método indicador de estabilidade
para oxcarbazepina , um fármaco antiepiléptico disponível desde o início da década
de 1990. O método emprega CLAE, coluna C18, fase móvel contendo mistura de
tampão dihidrogenofosfato de potássio 0,02 M:acetonitrila:metanol (45:35:20 v/v/v),
21
fluxo de 1 mL/min e volume de injeção de 20 μL. Além disso, a temperatura da
coluna esteve em 25 ºC e a análise dos analitos na faixa de 256 nm. Para esta
análise, foram preparadas quatro soluções de oxcarbazenipa, sendo uma solução
estoque de 1 mg/mL, duas soluções de trabalho (100 e 500 μg/mL) e uma solução
estoque de impurezas a 0,5 mg/mL. A validação do método analítico foi realizada
quanto à especificidade, precisão, exatidão, LOD, LOQ, linearidade e robustez. A
linearidade do método foi validada após separação de oxcarbazepina na presença
de três impurezas (imp. A, imp. B e imp. C). Para formação dos produtos de
degradação da oxicarbazepina, uma alíquota de matéria-prima a granel foi
submetida à degradação forçada por radiação UV (254 nm), aquecimento a seco (60
ºC), hidrólise ácida (HCl 0,5 N) e básica (NaOH 0,5 N) e oxidação (H 2O2 3%). O
período de fotólise e termólise foi de 10 dias, enquanto o período de hidrólise e
oxidação foi de 48 horas. Seis soluções independentes de oxcarbazepina (0,5
mg/mL) e dos produtos de degradação (0,15%) foram injetadas no equipamento
para confirmação da precisão. Os estudos de degradação forçada resultaram na
formação de produtos apenas durante a hidrólise básica, com a produção da imp. C.
(figura 4). Os parâmetros de validação do método mostraram-se dentro dos limites
recomendados (SHINGARE et al., 2007).
Figura 4. Estrutura química da oxcarbazepina, imp. A, imp. B e imp. C. (Fonte: SHINGARE et al.,
2007).
22
5.1. METODOLOGIA GERAL EMPREGADA PARA O ESTUDO DOS PRODUTOS
DE DEGRADAÇÃO
De forma genérica, os testes de estresse ou estudos de degradação forçada
seguem a seguinte metodologia proposta, baseada em monografias da Farmacopéia
Norte Americana (USP, United States Pharmacopea) e em recomendações do ICH.
A degradação do fármaco é avaliada em condições de hidrólise ácida (0,1 N, 1,0 N e
2,0 N de HCl com e sem temperatura de 80°C por 2 horas), de hidrólise alcalina (1 N
de NaOH com e sem temperatura de 80°C por 2 horas) e oxidativa (1% H2O2 por 30
minutos e subsequentemente por 3 horas; 3% H2O2 e 30% H2O2 por 24 horas), e
ainda é realizada a fotoestabilidade em câmara adequada por 14 dias. Caso as
condições apresentadas não sejam favoráveis a produção suficiente dos produtos
de degradação, outras condições devem ser delineadas para degradação
satisfatória do fármaco (ICH, 2005).
Neto et al. (2009) revisaram a literatura sobre estabilidade de fármacos e
medicamentos, e demonstrou a grande importância para a indústria farmacêutica do
desenvolvimento de métodos analíticos para identificação e quantificação dos
produtos de degradação. Os testes de estresse são considerados ferramentas úteis
na geração dos produtos de degradação para posterior estudo analítico, uma vez
que fármacos e/ou medicamentos são submetidos a condições extremas. O objetivo
dos testes de estresse é produzir decomposição branda (10-30%) do fármaco ou
medicamento analisado, visando reduzir a interferência por produção de produtos
secundários. São avaliados nesses estudos as consequências da atividade
hidrolítica, oxidativa, fotolítica, térmica e opcionalmente de íons metálicos sobre os
fármacos. Devido às particularidades inerentes a cada fármaco, o delineamento do
estudo torna-se um ponto crítico a ser superado pelos profissionais de pesquisa e
desenvolvimento (NETO et al., 2009).
Um desafio a ser superado é o desenvolvimento e validação de métodos
indicadores de estabilidade específicos, uma vez que os produtos de degradação e
suas vias de produção são frequentemente desconhecidos. Neste sentido, as
técnicas cromatográficas recebem destaque. Dentre elas, a CLAE é, sem dúvida, a
mais empregada devido às vantagens inerentes a suas próprias características,
como versatilidade, reprodutibilidade, custo relativamente baixo, além de permitir a
23
separação de uma grande variedade dos produtos formados, independente da
volatilidade ou estabilidade térmica, podendo ser associada a vários tipos de
detectores.
Uma vez determinadas as condições nas quais mais produtos ou maior
quantidade destes são formados, os testes devem ser repetidos em escala semipreparativa com o objetivo de gerar produtos de degradação em maior quantidade a
fim de extraí-los e purificá-los. A purificação dos produtos presentes no extrato bruto
obtido com clorofórmio e/ ou diclorometano pode ser efetuada por flash
cromatografia em coluna de vidro com sílica gel e fase móvel adequada. Esta etapa
pode ser monitorada por CCD (Cromatografia em Camada Delgada) e os produtos
puros obtidos em quantidade suficiente podem ser caracterizados pelos métodos
espectroscópicos clássicos como Ressonância Magnética Nuclear de Hidrogênios e
Carbonos (RMN 1H e
Visível e Infravermelho.
13
C), Espectrometria de Massas e Espectrofotometria UV-
24
6. CONSIDERAÇÕES FINAIS
O estudo dos produtos de degradação é uma das áreas emergentes que tem
conquistado espaço na indústria farmacêutica. Além da diminuição da potência do
medicamento, que é o efeito mais óbvio da instabilidade farmacêutica, também é
importante investigar se os produtos de degradação formados são tóxicos. E para
avaliar a toxicidade, estes produtos de degradação precisam ser obtidos por alguma
metodologia, especialmente a aplicação dos testes de estresse. Estas reações de
degradação são de grande importância, visto que elas podem possibilitar a
elucidação estrutural dos produtos de degradação, além de representar um potencial
método de produzi-los como padrões ou substâncias químicas de referência (SQR).
Em futuro próximo, tais compostos serão requeridos pelas indústrias farmacêuticas
que deverão identificar os produtos de degradação antes do registro de seus
medicamentos. Ressalta-se ainda que a área mostra-se bastante promissora no
cenário em que estamos inseridos, com proximidade física a pólos industriais
farmacêuticos, que necessitarão de acesso a estes compostos para atender às
iminentes especificações de qualidade dos seus medicamentos.
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