Expressão heteróloga e avaliação da atividade de uma fosfolipase recombinante de lagarta Lonomia obliqua. Bolsista: Brenda Marin Iniciação Científica (PIBIQ/CNPq) Orientador: Olga Meiri Chaim / Colaboradores: Adriano Marcelo Morgon, Gabriel Otto Meissner, Marta de Mauro Oliverio Introdução: A lagarta Lonomia obliqua, conhecida popularmente por taturana, é responsável por um número elevado de envenenamentos na Região Sul do Brasil. Seu veneno é uma mistura proteica, sendo a fosfolipaseA2 reconhecida como causadora de muitos dos sintomas do quadro clínico do envenenamento, o Erucismo Lonômico. Objetivo: Clonagem e expressão desta toxina sob forma recombinante para testes de atividade bioquímica e biológica. Métodos: - A sequência de DNA foi obtida através de PCR com oligonucleotídeos específicos e posterior clonagem em vetor de clonagem pGEM-T; - Após transformação em cepa DH5α, os clones positivos para a construção foram selecionados para subclonagem em vetor de expressão pSMT3; - A expressão se deu em cepa BL21 STAR (DE3) One Shot, a 30ºC, por 4 horas, com o indutor IPTG 0,5mM; - A expressão foi analisada por SDS-PAGE 12,5% e Western-Blotting anti his-tag (adicionada pelo vetor) Referências: CHAVES-MOREIRA, D. Caracterização biquímica e biológica de fosfolipases presentes em veneno de Loxosceles intermedia e Lonomia obliqua. 349 f. Tese (Doutorado em Biologia Celular e Molecular) – UFPR, 2011. Resultados/Discussão: Figura 1 – PCR de colônia. 13 dos 14 clones positivos na altura de 900pb. Figura 2 – Análise da expressão por Western Blotting da proteína PLA2 em cepa de expressão BL21 STAR (DE3) One Shot. As setas na Fig. 2 apontam em 32kDa, a PLA2 expressa com 0,5mM de IPTG, nos tempos 0h, 4h, na fração solúvel (S) e no precipitado (P). Nesse teste, observa-se o baixo rendimento da proteína solúvel, sendo a maioria sob formas truncadas e de corpos de inclusão, mesmo com a tag de solubilidade adicionada pelo vetor. Como alternativa para obtenção de maior concentração solúvel, testa-se a subclonagem em vetores da família pET. Conclusões: - O desenho dos primers para a clonagem em vetor de clonagem (pGEM-T) e de expressão (pSMT3) foi eficiente para a obtenção da sequência madura da toxina; - Essa toxina foi, pela primeira vez, obtida através de clonagem e expressão em cepa BL21 Star (DE3) One Shot; - O pSMT3 não possibilitou alto rendimento da toxina solúvel, mesmo que fusionada a uma tag de solubilidade.