UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO ESTUDO DA RELAÇÃO DE GENES E AGENESIA DENTÁRIA EM UMA POPULAÇÃO BRASILEIRA Marcelo de Castro Costa CD
Rio de Janeiro 2005 UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO Faculdade de Odontologia Departamento de Odontopediatria e Ortodontia Marcelo de Castro Costa CD ESTUDO DA RELAÇÃO DE GENES E AGENESIA DENTÁRIA EM UMA POPULAÇÃO BRASILEIRA Tese apresentada ao programa de pós­ graduação da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro­ UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do grau de Doutor em Odontologia Orientadores: Profa. Dra. Adriana Modesto Gomes da Silva Vieira Dr. Alexandre Rezende Vieira
Rio de Janeiro 2005 ii F O L H A D E A P R O V A Ç Ã O MARCELO DE CASTRO COSTA ESTUDO DA RELAÇÃO DE GENES E AGENESIA DENTÁRIA EM UMA POPULAÇÃO BRASILEIRA Tese de Doutorado submetida ao Programa de Pós­Graduação em Odontologia (Odontopediatria), Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro – UFRJ, como parte dos requisitos necessários à obtenção do título de Doutor em Odontologia (Odontopediatria). Rio de Janeiro, 21 de dezembro de 2005. _________________________________________________________ Profa. Dra. Ivete Pomarico Ribeiro de Souza DO­Prof a . Titular da Disciplina de Odontopediatria – FO­UFRJ _________________________________________________________ Prof. Dr. Nélio Victor de Oliveira DO­Prof. Adjunto do Departamento de Prótese e Materiais Dentários – FO­UFRJ _________________________________________________________ Prof. Dr. Ednilson Porangaba Costa DO­Prof. Adjunto do Departamento de Clínica Integrada – Cirurgia – FO­UFRJ _________________________________________________________ Prof a . D ra . Sheyla Cunha Charlier DO – Prof a . da Faculdade de Odontologia da UGF _________________________________________________________ Prof. Dr. Paulo Ferreira Garcia Filho DO – Prof. da Faculdade de Odontologia da UGF
iii F I C H A C A T A L O G R Á F I C A Costa, Marcelo de Castro Estudo da relação de genes e agenesia dentária em uma população brasileira. Marcelo de Castro Costa – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Odontologia, 2005. xv, 112 f;: Orientadores: Adriana Modesto Gomes da Silva Alexandre Rezende Vieira Tese (Doutorado) – UFRJ / Faculdade de Odontologia / Odontopediatria, 2005. Referências Bibliográficas: f. 77­85. 1. Agenesia dentária. 2. Genes. 3. Fatores de transcrição. 4.Prevalência. 5. Odontopediatria. I. Título. II. Tese (Doutorado) Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de Odontologia.
iv D E D I C A T Ó R I A Aos
meus
queridos
pais,
Oswaldo
e
Amélia, pelo exemplo de vida em comum e
pelo apoio e incentivo, sem os quais não seri a
possível a realiza ção deste traba lho.
Com carinho à Lúcia Helena, esposa e
companheira, e aos meus filhos Marcelo e
Fernanda
que
souberam
entender
minha
ausência dura nte o desenvolvimento deste
estudo.
v A G R A D E C I M E N T O S À Professora Dra. Adriana Modesto Gomes da Silva Vieira e ao Dr. Alexandre Rezende Vieira, orientadores e amigos, pela confiança e atenção constante durante o presente trabalho. Ao Professor Dr. Joaquim Magalhães Santeiro (in memorian) pelos preciosos ensinamentos e conselhos para a minha formação profissional. À Professora Dra. Ivete Pomarico Ribeiro de Souza que muito me incentivou à realização do Curso de Doutorado. Ao Professor Dr. Roberto Braga de Carvalho Vianna que sempre esteve ao meu lado e muito colaborou em minha formação discente e docente. Ao Professor Dr. Rogério Gleiser pelo exemplo e amizade. Ao Professor João Alfredo Farinhas pela sua grande amizade e apoio por todos esses anos que trabalhamos juntos. À Professora Dra. Laura Salignac de S.G. Primo por todo o carinho e atenção durante o meu curso de Doutorado. À Professora Lucianne Cople Maia de Faria pelas suas palavras de incentivo e sua contribuição no decorrer do curso. Ao Professor Dr. Urubatan Vieira de Medeiros, Coordenador do Curso de Doutorado em Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, pela dedicação, empenho e orientação. Ao meu sobrinho Paulo S. de Castro Costa pela sua ajuda preciosa para que este objetivo fosse alcançado. Aos meus sogros José Esteves e Maria Eugênia (in memorian), por acreditarem e confiarem em mim e em minha capacidade profissional.
vi Aos funcionários da Pós­Graduação da Faculdade de Odontologia da UFRJ pelo auxílio e atenção permanentes. Aos funcionários da Disciplina de Odontopediatria, pela paciência e cooperação sempre que necessário. Aos pacientes e seus responsáveis pela compreensão, colaboração e participação na realização deste trabalho. Aos meus colegas e amigos da Disciplina de Odontopediatria, pelo auxílio e apoio durante o desenvolvimento deste estudo.
vii R E S U M O C O S T A , M a r c e l o d e C a st r o . E s t u d o d a R e l a ç ã o d e G e n e s e A g e n e s i a De n t á r i a e m u m a Po p u l a ç ã o B r a s i l e i r a . Ri o d e J a n e i r o , 2 0 0 5 . T e s e ( D o u t o r a d o e m O d o n t o l o g i a , á r e a d e c o n c e n t r a ç ã o e m O d o n t o p e d i a t r i a ) – F a cu l d a d e d e O d o n t o l o g i a , U n i v e r si d a d e F e d e r a l d o Ri o d e J a n e i r o , Ri o d e J a n e i r o , RJ 2 0 0 5 . O p r i n c i p a l f a t o r e t i o l ó g i c o d a a g e n e si a d e n t á r i a é a h e r e d i t a r i e d a d e . O s g e n e s M S X 1 e P A X 9 e s t ã o co mp r o v a d a me n t e a s s o c i a d o s c o m o l i g o d o n t i a . O o b je t i vo d e s t e t r a b a l h o f o i a v e r i g u a r a e x i s t ê n ci a d e a s s o ci a ç ã o d e s s e s g e n e s c o m h i p o d o n t i a e m u ma p o p u l a ç ã o b r a s i l e i r a . E s t a p e s q u i s a f o i d e s e n v o l vi d a n a F a c u l d a d e d e O d o n t o l o g i a d e u ma i n s t i t u i ç ã o p ú b l i c a d e e n s i n o s u p e r i o r , e m d u a s e t a p a s. N a p r i me i r a p a r t e , f o r a m a v a l i a d a s 1 0 3 4 r a d i o g r a f i a s p a n o r â mi c a s , d e c r i a n ç a s d e 6 a 1 2 a n o s d e a mb o s o s g ê n e r o s , co m a f i n a l i d a d e d e s e i d e n t i f i c a r a o co r r ê n ci a d e a n o d o n t i a s . D a s r a d i o g r a f i a s a n a l i s a d a s , 5 1 9 e r a m d e c r i a n ç a s d o g ê n e r o ma s c u l i n o e 5 1 5 c r i a n ç a s d o g ê n e r o f e mi n i n o , s e n d o e n c o n t r a d o s 3 9 ca s o s d e a g e n e s i a d e n t á r i a , p e r f a z e n d o u ma p r e va l ê n ci a d e 3 , 7 7 % . A e s s e s 3 9 c a so s d e a g e n e s i a d e n t á r i a , p a r a a s e g u n d a p a r t e d e s t e e s t u d o , f o r a m a c r e s c e n t a d o s ma i s 1 1 6 p r o b a n d o s p r o v e n i e n t e s d e c l í n i ca s o d o n t o l ó g i ca s p r i va d a s d a s ci d a d e s d o Ri o d e J a n e i r o t o t a l i z a n d o 1 5 5 p a ci e n t e s c o m a u s ê n c i a c o n g ê n i t a d e , p e l o me n o s , 1 d e n t e p e r ma n e n t e , a e x c e ç ã o d o s t e r c e i r o s mo l a r e s . A c o l e t a d o ma t e r i a l b i o l ó g i c o f o i r e a l i za d a d e a c o r d o co m p r o t o c o l o p a d r ã o e a mp l i f i ca d o p o r r e a ç õ e s e m c a d e i a d e p o l i me r a s e ( P C R ) . At r a v é s d e s e q ü e n ci a me n t o d i r e t o d a s r e g i õ e s c o d i f i ca n t e s , n ã o f o r a m e n c o n t r a d a s mu t a ç õ e s p o t e n c i a l me n t e p a t o g ê n i c a s n o s g e n e s M S X 1 e P A X9 . E s s e s r e s u l t a d o s s u g e r e m q u e o u t r o s g e n e s c a n d i d a t o s d e v e m d e s e mp e n h a r u m p a p e l n a h i p o d o n t i a e m s e r e s h u ma n o s . P a l a v r a s ­ c h a v e : Ag e n e s i a D e n t á r i a – P r e v a l ê n ci a – G e n é t i c a .
viii A B S TR A C T C O S T A , M a r c e l o d e C a st r o . E s t u d o d a R e l a ç ã o d e G e n e s e A g e n e s i a De n t á r i a e m u m a Po p u l a ç ã o B r a s i l e i r a . Ri o d e J a n e i r o , 2 0 0 5 . T e s e ( D o u t o r a d o e m O d o n t o l o g i a , á r e a d e c o n c e n t r a ç ã o e m O d o n t o p e d i a t r i a ) – F a cu l d a d e d e O d o n t o l o g i a , U n i v e r si d a d e F e d e r a l d o Ri o d e J a n e i r o , Ri o d e J a n e i r o , RJ 2 0 0 5 . T h e d e n t a l a g e n e si s ma i n e t i o l o g i c f a c t o r i s h e r e d i t a r y . G e n e s M S X 1 a n d P A X 9 a r e d e f i n i t e l y a s s o c i a t e d wi t h o l i g o d o n t i a . T h e a i m o f t h i s s t u d y wa s t o e va l u a t e t h e a s s o ci a t i o n b e t we e n t h e s e g e n e s wi t h h yp o d o n t i a i n a Br a zi l i a n p o p u l a t i o n . T h i s r e s e a r c h wa s d e v e l o p e d i n a D e n t a l S c h o o l f r o m a p u b l i c u n i v e r si t y i n t wo p a r t s . I n t h e f i r s t p a r t , 1 0 3 4 p a n o r a mi c r a d i o g r a p h s f r o m c h i l d r e n b e t we e n 6 a n d 1 2 ye a r s o l d , wi t h b o t h g e n d e r we r e e v a l u a t e d wi t h t h e o b je c t i v e o f r e co g n i zi n g a n o d o n t i a o c c u r r e n c e . 5 1 9 r a d i o g r a p h s we r e f r o m ma l e c h i l d r e n a n d 5 1 5 f r o m f e ma l e , a n d i t wa s f o u n d 3 9 c h i l d r e n wi t h d e n t a l a g e n e s i s , o r a 3 , 7 7 % p r e v a l e n c e i n t h e s t u d y p o p u l a t i o n . T o t h e s e c o n d p a r t o f t h i s st u d y, 1 1 6 p r o b a t i v e s f r o m p r i v a t e d e n t a l c l i n i c s i n Ri o d e J a n e i r o we r e a d d e d t o t h e 3 9 ca s e s o f d e n t a l a g e n e s i s, t o t a l i zi n g 1 5 5 p a t i e n t s wi t h co n g e n i t a l a b s e n c e o f a t l e a s t o n e p e r ma n e n t t o o t h , e xc e p t t h i r d mo l a r s . T h e b i o l o g i c ma t e r i a l c o l l e c t i o n wa s d o n e f o l l o wi n g t h e s t a n d a r d p r o t o c o l a n d a mp l i f i e d b y c h a i n p o l y me r a s e r e a c t i o n ( P C R) . N o p o t e n t i a l p a t h o g e n i c mu t a t i o n s o n g e n e s M S X 1 a n d P A X 9 we r e f o u n d t h r o u g h d i r e ct s e q u e n c e s o f t h e c o d i f i e d p l a c e s. T h e s e r e su l t s su g g e s t t h a t o t h e r c a n d i d a t e g e n e s s h o u l d p l a ce a r o l e i n h u ma n h y p o d o n t i a . K e y wo r d s : D e n t a l a g e n e si s – P r e va l e n c e – G e n e t i c s.
ix L I S T A D E S I G L A S E A B R E V I A T U R A S A Adenina BMP Bonè Morphogenetic Protein C Citosina °C Graus Celsius CONEP Comissão Nacional de Ética em Pesquisa DNA Deoxyribonucleic Acid F Feminino FGF Fibroblast Growth Factor G Guanina Gl Grau de liberdade HOX Homeobox HUCFF Hospital Universitário Clementino Fraga Filho M Masculino mM Milimolar MSX Muscle Segment Homeobox mRNA Ácido Ribonucléico Mensageiro PAX Paired Box PCR Polymerase Chain Reaction RNA Ácido Ribonucléico SNPS Single Nucleotide Polymorphsms T Timina TDT Transmission / Disequilibrium Test TGFA Transforming Growth Factor Alpha TGFB Transforming Growth Factor Beta U Uridina UFRJ Universidade Federal do Rio de Janeiro X2 Qui­quadrado
x L I S T A D E Q U A D R O S Quadro 1: Estudos de Prevalência e Dentes mais ausentes nas Dentições Permanente e Decídua ........................................................................................................ 24 Quadro 2: Alguns Genes Humanos envolvidos com Agenesia Dentária................... 46
xi L I S T A F I G U R A S Figura 1: Swab do tipo escova citológica – Cytosoft tm Brush .................................... 54 Figura 2: Equipamento utilizado para a realização e Reações em Cadeia de Polimerase (PCR)................................................................................................................ 55 Figura 3: Localização do marcador CA do gene MSX1 e das mutações previamente ............................................................................................................................................ 56 Figura 4: Localização do marcador 3’UTR do gene PAX9 e das mutações previamente......................................................................................................................... 57 Figura 5: Equipamento utilizado para a realização da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) (ABI Prism®.7900 HT.Applied Biosystems, EUA)................................... 58 Figura 6: Distribuição dos probandos portadores de agenesia dentária de acordo com o gênero....................................................................................................................... 59
xii L I S T A D E G R Á F I C O S Gráfico 1: Gráfico da distribuição das agenesias dentárias da maxila ..................... 65 Gráfico 2: Gráfico da distribuição das agenesias dentárias da mandíbula ............... 66
xiii L I S T A D E T A B E L A S Tabela 1: Distribuição de freqüência dos pacientes com agenesias dentárias, relacionando­a com o gênero .............................................................................................. 60 Tabela 2: Avaliação geral dos pacientes em relação a arcada e lado do rosto de acordo com a presença de agenesia dentária nos pacientes do Programa de Treinamento Teórico Prático em Odontopediatria..................................................................................... 60 Tabela 3: Prevalência de agenesias dentárias de acordo com os lados direito e ..... 61 Tabela 4: Distribuição das agenesias uni e bilaterais quanto ao arco maxilar e mandibular........................................................................................................................... 61 Tabela 5: Número de dentes ausentes por probando ............................................... 62 Tabela 6: Distribuição das agenesias dentárias de acordo com o grupo dentário..... 62 Tabela 7: Número e freqüência dos dentes ausentes de acordo com sua localização ............................................................................................................................................ 64 Tabela 8: Coeficientes da regressão ........................................................................ 67 Tabela 9: Resumo do modelo................................................................................... 67 Tabela 10: ANOVA do modelo.................................................................................. 67
xiv S U M Á R I O 1 INTRODUÇÃO ................................................................................................... 1 2 REVISTA DA LITERATURA ............................................................................... 4 2.1 Odontogênese ............................................................................................ 4 2.2 Conceituação sobre Agenesia Dentária ...................................................... 5 2.3 Diagnóstico ................................................................................................. 6 2.4 Teorias sobre Agenesia Dentária................................................................ 8 2.5 Etiologia Genética..................................................................................... 11 2.6 Prevalência da Agenesia Dentária na Dentição Permanente .................... 16 2.7 Prevalência de Agenesia Dentária na Dentição Decídua .......................... 21 2.8 Associações de Agenesia Dentária com Outras Anomalias de Desenvolvimento.............................................................................................................. 25 2.9 Associações de Agenesia Dentária com Fissuras Labiopalatinas ............. 27 2.10 Genes Candidatos .................................................................................... 28 2.10.1 Padrões Hereditários: .......................................................................... 28 2.10.2 Quebra­Cabeças de Exons:................................................................. 30 2.10.3 Ligando e Desligando Genes:.............................................................. 31 2.10.4 O Código Genético para Formação Dentária: ...................................... 35 2.10.5 Rede de Sinais no Desenvolvimento Dentário: .................................... 37 2.10.6 Mutações Gênicas ............................................................................... 37 2.10.7 MSX1 (Muscle Segment Homeobox 1) ................................................ 39 2.10.8 PAX9 (Paired Box 9)............................................................................ 43 2.11 Como Estudar Genes (Tipos de Estudo)................................................... 47 3 PROPOSIÇÃO ................................................................................................. 50 4 MATERIAIS E MÉTODOS ................................................................................ 51
xv 4.1 Amostra e Método..................................................................................... 51 4.2 Coleta de Dados das Agenesias Dentárias............................................... 52 4.3 Métodos Estatísticos................................................................................. 53 4.4 Coleta de Material Biológico ..................................................................... 53 4.5 Análise Laboratorial .................................................................................. 54 4.6 Seqüenciamento do DNA.......................................................................... 55 4.6.1 MSX1 (Muscle Segment Homeobox) .................................................... 56 4.6.2 PAX9 (Paired – Box) ............................................................................. 57 5 6 RESULTADOS ................................................................................................. 59 5.1 Caracterização da Amostra....................................................................... 59 5.2 Associação dos Genes MSX1 e PAX9 com Agenesia Dentária ................ 68 5.3 MSX1........................................................................................................ 68 5.4 PAX9 ........................................................................................................ 68 DISCUSSÃO .................................................................................................... 69 6.1 7 MSX1 e PAX9........................................................................................... 74 CONCLUSÕES ................................................................................................ 76 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ......................................................................... 77 ANEXOS .................................................................................................................. 86
1 INTRODUÇÃO Alterações de número dos dentes resultam de problemas durante o estágio de iniciação e proliferação do desenvolvimento dentário. Esses distúrbios podem ser decorrentes de falência no processo de indução da lâmina dentária e os brotos dentários (período de iniciação) ou de deficiência na multiplicação celular, que promove o desenvolvimento dos brotos dentários (período de proliferação) (SCHEINEDER, 1990). Vários termos têm sido usados para definir a ausência congênita de dentes na dentição decídua ou permanente: anodontia total ou parcial, agenesia ou ausência de dentes, hipodonia e oligodontia. A anodontia total consiste na ausência completa de dentes, sendo uma condição extremamente rara e comumente associada a outros sintomas da displasia ectodérmica. A anodontia parcial pode ser de dois tipos: a hipodontia e a oligodontia (MELAMED et al. 1994). Oligodontia é o termo empregado para a ausência de vários dentes e hipodontia é usado quando um ou poucos dentes estão ausentes. Qualquer um dos trinta e dois dentes permanentes pode estar faltando, todavia, segundo SYMONS et al. (1993), a ausência congênita mais comum na dentição permanente, exceto os terceiros molares, é dos segundos pré­molares inferiores seguido pelos incisivos laterais superiores e segundos pré­ molares superiores, sendo mais freqüente a ausência bilateral. De acordo com GRABER (1978), a prevalência de hipodontia na população em geral varia de 1,6 a 9,6%, excluindo­se a ausência de terceiros molares que ocorrem em 20% da população. Já na oligodontia, ocorre agenesia de numerosos dentes (seis ou mais), podendo haver redução no tamanho e na forma dos dentes presentes, além de uma tendência de atraso em sua formação e erupção. Quanto maior o número de dentes, mais evidente será a redução do tamanho da coroa dos elementos presentes. A oligodontia está comumente
2 associada a síndromes específicas ou anomalias sistêmicas severas. É uma anomalia rara, com uma prevalência de 0,3% em dentes permanentes. A ausência congênita de dentes decíduos é ainda mais rara, apresentando uma freqüência muito menor quando comparada à dentição permanente, variando de 0,5% a 0,9%. Estudos epidemiológicos mostram uma alta probabilidade de ausência congênita do sucessor permanente, quando ocorre ausência de dentes decíduos. A etiologia pode estar ligada a influências ambientais e à genética. Dentre os fatores ambientais comumente relacionados estão os distúrbios de nutrição ou endócrino na infância, rubéola, sífilis, febre escarlate e terapia radioativa. Porém, quando a ausência congênita de dentes envolve mais de uma geração, na mesma família, é mais provável que esta apresente uma causa hereditária. GRAHNEN (1956), afirmou que essa anomalia tem uma característica geneticamente determinada, que segue um modo de transmissão autossômico dominante com penetrância incompleta e expressividade variável. A ausência de dentes pode levar a sérios danos a saúde oral e afetar o indivíduo como um todo, principalmente, se houver um envolvimento estético severo. Os pacientes com agenesia dentária necessitam, na sua maioria, de tratamentos protéticos ou ortodônticos de custo elevado e de longa duração para restabelecer a função mastigatória e a estética. Assim, a identificação de fatores genéticos envolvidos na etiologia da agenesia dentária seria o primeiro passo para uma melhor compreensão da função dos genes envolvidos no desenvolvimento dentário. O gene é uma pequena parte de um imenso processo que envolve milhares de substâncias e ações orgânicas. A quantidade de genes que possuímos, não é o mais importante, mas sim, a capacidade do organismo humano de combiná­los e transformar­se numa usina bioquímica produtora de proteínas. A missão de identificá­los, determinar sua localização, função e como interagem é o principal alvo dos geneticistas. Os pesquisadores têm se preocupado em identificar quais os genes defeituosos causadores de anomalias. Identificar mutações genéticas em famílias com agenesia dentária permitirá, a longo prazo, propor formas de
3 corrigir problemas durante esse desenvolvimento através de terapias que tivessem como alvo os genes defeituosos, impedindo o fenótipo de agenesia dentária. Além disso, permitirá um melhor entendimento do modo de herança, o que possibilitaria um esclarecimento mais preciso para as famílias de afetados por essa anomalia, sobre a causa da falta de dentes específicos. A compreensão da genética dento­orofacial humana e seu impacto no diagnóstico, prevenção e, eventualmente, terapêutica é parte integral do cuidado em saúde (VASTARDIS, 2000). Desta forma, o presente trabalho tem como objetivo verificar a associação de agenesia dentária isolada não­sindrômica com os genes MSX1 e PAX9 em uma população brasileira.
2 REVISTA DA LITERATURA 2.1 Odontogênese O termo odontogênese é usado para descrever eventos relacionados com a origem e a iniciação da formação dentária, assim como a origem e a formação dos tecidos ao redor dos dentes, como ligamento periodontal, cementum, osso alveolar. O desenvolvimento embriogênico dos dentes decíduos e permanentes se processa em quatro estágios denominados de inicial, embrionário, capsular e campanular. Na terceira semana embriogênica, o limite epitelial da cavidade oral começa a se expressar nas zonas proximais. Em seis semanas há uma coalescência das zonas odontogênicas superiores formando uma lâmina dental contínua e as duas zonas odontogênicas inferiores se prendem na linha média. Formam­se assim, arcos epiteliais em forma de C. Os dentes iniciam com a invaginação da lâmina dentária dentro do mesênquima subjacente. As mudanças morfológicas na lâmina dental se iniciam na sexta semana do desenvolvimento fetal e continuam além do nascimento até o quarto ou quinto ano. Na sexta semana a lâmina dentária produz brotos dentais (fase de botão) que correspondem aos dez dentes decíduos em cada maxilar. Na 8ª semana, todos os brotos dentais decíduos inferiores e superiores estão presentes. No final da 8ª semana aparece uma concavidade no fundo da superfície do broto dental o que é chamado de estágio de capuz (estágio de proliferação). Com o aumento da atividade nas células contíguas no broto dental ectodérmico as partes essenciais do dente como órgão do esmalte, papila e folículos dentários são identificáveis e são chamadas como um todo de germe dentário. O alargamento e o aprofundamento da superfície inferior do germe dentário é chamado de estágio campanular. A inscrição dos dentes permanentes que serão os sucessores dos dentes decíduos ocorre devido ao crescimento nos tecidos conectivos adjacentes ao bordo distal livre da
5 lâmina dentária, dando origem à lâmina sucessora. A lâmina dental se alarga distalmente ao segundo molar decíduo dando origem ao germe dentário do molar permanente (Mc DONALD & AVERY, 2001). Muitos defeitos e anomalias dentárias ocorrem durante os vários estágios de desenvolvimento do ciclo de vida dental. A natureza do defeito depende do estágio de desenvolvimento do dente no momento em que ela ocorre. As anomalias de número se dão durante a formação inicial dos germes dentais, ou seja, falhas durante o processo que origina a lâmina dentária e os brotos dentais (período de iniciação), ou deficiência na multiplicação celular que promove o desenvolvimento dos brotos dentais (período de proliferação) (SCHNEIDER, 1990). As anomalias de forma acontecem durante a morfodiferenciação e as de posição durante a erupção do dente. Identificando mutações humanas que causam anomalias dentárias, seremos mais capazes de entender o que é normal e o anormal em odontogênese. 2.2 Conceituação sobre Agenesia Dentária Agenesia de um ou mais dentes é a anomalia de desenvolvimento dentário mais comum em seres humanos. Vários são os termos usados para descrever anomalias numéricas. A anodontia verdadeira ou ausência congênita de dentes pode ser de dois tipos, total e parcial. Anodontia total, uma condição rara, ocorre quando todos os dentes estão ausentes podendo envolver tanto a dentição decídua quanto a permanente. A anodontia parcial ou agenesia dentária, envolve um ou mais dentes e é uma condição mais freqüente, podendo envolver qualquer dente. Certos dentes, como terceiros molares, incisivos laterais superiores e segundos pré­ molares inferiores e superiores estão freqüentemente ausentes (VASTARDIS, 2000). O termo hipodontia refere­se a uma anomalia caracterizada pela ausência congênita no arco dentário de um ou poucos dentes decíduos ou permanentes. A hipodontia grave
6 também é chamada de oligodontia, e indica a falta de seis ou mais dentes. A pseudo­ hipodontia é caracterizada pela ausência de dentes no arco dentário devido à impactação, erupção retardada ou esfoliação precoce (SHAFER et al. 1983). MOYERS (1991) considera incorreto o termo anodontia parcial como sinônimo de oligodontia. Ele afirma que qualquer dente pode estar ausente congenitamente, porém o percentual é maior para os segundos pré­molares inferiores, incisivos laterais superiores e os segundos pré­molares superiores. Agenesia dentária é um termo mais informativo, pois já deixa claro qual o defeito de desenvolvimento. 2.3 Diagnóstico Segundo GRABER (1978), a incidência de agenesia dentária no homem de acordo com vários trabalhos varia de 1,6% a 9,6% excluindo os terceiros molares, os quais ocorrem em 20% da população. Essa grande variação se explica primeiro por erro na coleta dos dados. Sem a ajuda das radiografias fica difícil dizer se um dente é ausente ou está somente impactado. Pode também se confundir um dente decíduo em oclusão com o permanente correspondente. Também a anamnese deve ser considerada com cuidado. Um dente permanente, extraído na infância pode ser considerado como congenitamente ausente pelo paciente, caso ele não se lembre da extração. Outro fator importante é a idade da população estudada, pois, alguns dentes só apresentarão imagem radiográfica mais tardiamente. Ainda, dependendo da seleção dos grupos que serão estudados poderão ser encontradas variações percentuais significativas. Quando trabalhamos com uma clínica de referência como numa Faculdade, ou quando examinamos pacientes de uma clínica particular, os resultados encontrados poderão variar significativamente (GRABER, 1978, MAKLIN et al. 1979). Mesmo levando­se em consideração todos os possíveis erros de metodologia, pode­ se concluir que o percentual de agenesia dentária varia de acordo com o grupo da população estudada, e também variam quais os dentes mais freqüentemente ausentes.
7 Quando identificamos uma possível síndrome displásica sistêmica em um paciente, devemos examinar outros membros da família procurando características parecidas e devemos encaminhar esses pacientes para diagnóstico apropriado. Por outro lado, o dentista ao examinar um paciente com ausência congênita de dentes, deve estar consciente da possibilidade de síndromes displásicas sistêmicas associadas. Deve por isso avaliar se seu paciente apresenta outros problemas congênitos de natureza mais abrangente. Também KROGNAN (1967), sugere que a genética da agenesia dentároia está sempre ligada ao desenvolvimento sistêmico, isto é, a associação da ausência congênita de dentes com síndromes sistêmicas nos leva à conclusão que essa anomalia pode em alguns casos ser a forma de um distúrbio congênito mais generalizado, principalmente da síndrome da displasia ectodérmica. Provavelmente, existem vários locais no sistema poligênico dental que, quando afetados, irão produzir agenesias dentárias. Alguns destes locais podem apresentar efeitos mais específicos, enquanto outros são mais generalizados. É obrigação do dentista, reconhecer essa anomalia, investigar possíveis problemas sistêmicos associados com ausência congênita de dentes e avaliar outros membros da família para possíveis manifestações dessa condição hereditária. Um dos mais valiosos serviços que um Odontopediatra pode oferecer aos seus pacientes é a radiografia aos cinco anos de idade. Nesse ponto, todos os dentes permanentes, exceto os terceiros molares, podem ser visualizados na radiografia e nesse exame poderão ser observados detalhes como estágio de formação, e anomalias, tais como dentes supranumerários ou agenesias dentárias (DUNN, 1958). Segundo Mac RAE et al. (1968), existem poucas contra­indicações para se tirar radiografias em crianças. Mesmo assim, freqüentemente poucos filmes são tirados e várias anomalias dentais deixam de ser detectadas com complicação no tratamento do paciente. SPYROPOULOS et al. (1979), afirmaram que o uso de radiografia panorâmica possibilita uma maior detecção de casos de agenesias dentárias, e que com outras tomadas radiográficas poderiam passar despercebidas.
8 MENCZER (1955), demonstra a importância da anamnese em conjunto com as radiografias para evitar conclusões erradas quanto às agenesias dentárias. Ele descreve um caso de esfoliação precoce de um incisivo central decíduo inferior, que poderia levar a falsa interpretação de ausência congênita deste elemento. Em outro caso, MENCZER (1955), descreve um paciente de quatro anos e um mês que não apresenta o segundo molar decíduo superior erupcionado, levando à falsa interpretação da ausência congênita desse elemento, uma vez que, o mesmo erupciona entre 18 e 24 meses. Pela radiografia se visualizou o elemento submerso. SUAREZ e SPENCE (1974), afirmam que hipodontia é extremamente interessante para os geneticistas por ser um polimorfismo dos mais comuns do ser humano. Porém, é preciso cuidado ao se diagnosticar casos de hipodontia, pois dentes impactados, germe de dentes permanentes extraídos, juntamente com dentes decíduos, poderiam levar a diagnósticos errados. Por outro lado, dentes decíduos não esfoliados poderiam ser confundidos com dentes permanentes, subestimando casos de agenesias dentárias. SUAREZ e SPENCE (1974), recomenda atenção e uso de radiografias para não acontecerem erros de diagnóstico. 2.4 Teorias sobre Agenesia Dentária Anomalia de número aparece como um fator hereditário isolado ou uma característica familiar transmitida como uma condição autossômica dominante, recessiva ou ligada ao sexo ou representa apenas uma de um grupo de anomalias de uma doença complexa ou de uma síndrome, como displasia ectodérmica hereditária, por exemplo. Não se sabe ao certo se ausência congênita de dentes é uma expressão incompleta de displasia ectodérmica ou se é provocada por uma mutação gênica independente. No entanto, ausência congênita de dentes sem nenhuma ligação com doença hereditária é encontrada com freqüência (McDONALD & AVERY, 2001). Os membros afetados por agenesias dentárias em uma mesma família mostram várias diferenças em relação à localização, simetria e número de dentes envolvidos. E
9 ainda, os dentes remanescentes na cavidade oral podem variar em tamanho, forma e grau de desenvolvimento. As anomalias de número, forma e estrutura dentária resultam de vários fatores etiológicos, durante os estágios de iniciação e proliferação do desenvolvimento dentário. A natureza da anomalia depende do tempo em que se manifesta sua função no embrião e qual a camada do germe que está envolvido. A ausência congênita de dentes pode advir de várias causas incluindo espaço limitado, anomalias funcionais do epitélio dental ou falhas na iniciação do mesênqüima subjacente (ZHU et al. 1996). A anodontia verdadeira ou ausência congênita de dentes é uma desordem de desenvolvimento no número de dentes, causada por ausência de lâmina dentária (anodontia total) ou o não desenvolvimento dos órgãos de esmalte de certos dentes (anodontia parcial ou oligodontia) devido a fatores genéticos, fatores locais ou uma combinação de ambos (SPYROPOULOS et al. 1979; SCHNEIDER, 1990). Segundo SHAFER et al. (1983), muitas teorias haviam sido propostas para se explicar as causas das agenesias dentárias e salientaram que a evolução da espécie humana no sentido de eliminar alguns dentes, genética e fatores ambientais são algumas delas. Le BOT et al. (1980), sustentam a hipótese de que a agenesia dentária pode ser a expressão de uma tendência evolutiva de seleção moderada, para a simplificação da dentição humana através da redução no número de dentes. GRABER (1978), afirma que a redução no número de dentes é concomitante com a redução do tamanho dos maxilares na evolução humana. O perfil dentário do ser humano do futuro deverá ser de um incisivo, um canino, um pré­molar e dois molares por quadrante. Antropologistas têm concluído que o homem está desenvolvendo maxilares cada vez menores que acomodarão menos de 32 dentes. CLAYTON (1956), em uma amostra de 3.557 humanos observou que das três séries dentárias existentes (incisivos, pré­molares e molares), o dente terminal ou mais posterior
10 da série era o mais freqüentemente ausente. Sugeriu, então, a hipótese de que tais dentes comumente ausentes eram “órgãos vestigiais”, com pouco valor prático para os humanos na atualidade. E que, durante o processo evolutivo, estes dentes não proveram vantagens seletivas para a espécie e tendem a serem perdidos. ZACHRISSON e MJOR (1975), dizem que a ausência congênita de incisivos laterais permanentes é uma simples diminuição do número de dentes da arcada, resultado de uma expressão da redução filogenética da espécie humana, levando em conta o fato do incisivo lateral ser um dente considerado final de série. SVINHUFVUD et al. (1988), relataram que a seletividade de agenesia dentária variava mais devido a posição anatômica de elemento dentário, do que de um processo propriamente evolutivo. Estes autores sugeriram que algumas regiões durante o desenvolvimento dentário, por serem áreas de fusão embriológica, são mais susceptíveis a sofrerem influência epigenéticas e tendem a expressar com mais freqüência agenesia. Por exemplo, o dente localizado na maxila, que na maioria das circunstâncias, apresenta­se ausente ou com variação de tamanho é o incisivo lateral, que desenvolve­se numa área de fusão embrionária entre o processo maxilar lateral e o processo nasal medial. Na mandíbula, agenesia ocorre com mais freqüência na área de segundos pré­molares. Esta área corresponde ao término distal da lâmina dentária primária e por isso, seria mais susceptível a agenesia sendo chamada de “área frágil”. A região de linha média formada pela fusão dos dois processos mandibulares seria outra “área frágil”. Também fazem parte da etiologia da agenesia dentária, fatores ambientais como a infecção da gestação pelo vírus da rubéola; GULLIKSON (1975), excesso de radiação; WERTHER e ROTHEMBERG (1939), GRABER (1978); uso de talidomida durante a gravidez; GRAVELY e JOHNSON (1971), traumas na região dentária, quimioterapia, escorbuto; ROCHA et al. (1983), sífilis materna, bebês prematuros; KEENE (1966), sarampo durante a gravidez, raquitismo, distúrbios endócrinos; ARYA e SAVARA (1974), distúrbios nutricionais durante a gravidez ou a infância, infecção do germe dentário (GRABER, 1978).
11 2.5 Etiologia Genética Agenesia dentária está associada a problemas genéticos, principalmente aqueles caracterizados por envolvimento ectodérmico, tais como as displasias ectodérmicas, que incluem cabelos finos e esparsos, redução do número e função de várias glândulas, em particular as glândulas sudoríparas (LYNGSTADAAS et al., 1996). Mais de 50 síndromes já foram descritas associando agenesia dentária como parte de seus aspectos fenotípicos. Entre elas, síndrome de Rieger, Robinson, Seckel, orodigitofacial, hipoplasia dérmica focal, Hallerman­Streiif, oculodentodigital, Russel­Silver, displasia condroectodérmica, displasia frontometafisiária, displasia craniofacial e outras (VIEIRA, 2003). Também é um achado freqüente em pacientes com fenda de lábio e palato envolvendo o osso alveolar como etiologia da ausência de dentes na região, especialmente incisivos laterais superiores (JUNLONGRAS et al. 2001). Além da displasia ectodérmica e fenda labiopalatal, KEENE (1966) associa ausência de dentes com síndrome de Down, síndrome de Ellis­van­Creveld e outras patologias. SUAREZ e SPENCE (1974), relataram que as causas da agenesia dentária eram consideradas controversas. Entretanto, na maioria dos casos, hereditariedade tem sido considerada como o fator principal. Uma tendência hereditária pode ser proposta demonstrando que dentes ausentes ocorrem mais freqüentemente entre parentes do que na população em geral. CHOSACK et al. (1975), estudaram as famílias de 305 probandos, concluindo que os índices mais altos de hipodontia observados nos pais e parentes em comparação com a população em geral, estão de acordo com a hipótese que hipodontia é geneticamente condicionada em acordo com outros autores. Um estudo de GRAHNEN (1956), com crianças com ausência congênita de dentes revelou que metade dos irmãos ou pais também tinham alguns dentes ausentes congenitamente. Deve­se estar atento para o fato que outras anomalias podem estar presentes no mesmo indivíduo.
12 STIMSON et al. (1997), investigaram a ausência congênita de dentes em três gerações de uma família e concluiram que a oligodontia previsivelmente poderia afetar 50% dos indivíduos da quarta geração. ARTE et al. (2001), em seus estudos com onze famílias finlandesas, concluíram que a prevalência de hipodontia nos parentes de primeiro e segundo graus de pessoas com hipodontia é de 4,5 a 4,9 vezes maior que a prevalência da população em geral. Normalmente, a história genética dos indivíduos é resumida em forma de símbolos num heredograma, e a penetrância reduzida pode ser detectada tanto em heredogramas que demonstram hereditariedade autossômica recessiva, como as que demonstram hereditariedade autossômica dominante, embora com mais freqüência neste último. Como nenhuma teoria de transmissão pode explicar todos os heredogramas, as opiniões dos pesquisadores se dividem em relação ao modo de herança da agenesia dentária (BOROCHOV e GREEN, 1971). RIBBLE (1931), GRAHNEN (1956), GRABER (1978), BURZYNSKI e ESCOBAR (1983), LIDRAL e REISING (2002), afirmaram que a redução do número de dentes possui causa geneticamente determinada, seguindo um modo autossômico dominante de transmissão, com penetrância incompleta e expressividade variável. Entretanto, modo autossômico recessivo (AHMAD et al., 1988, ATASU e AKYUZ, 1994) e modelo hereditário ligado ao sexo (DAHLBERG, 1937, SUAREZ e SPENCE, 1974) também foi documentado. Acredita­se que na genética humana, a mesma anomalia pode ser dominante em uma família e recessiva em outras. Penetrância é a probabilidade de um gene ter qualquer expressão fenotípica. Quando alguns indivíduos que têm o genótipo apropriado e não o expressam de modo algum, significa que o gene exibe penetrância reduzida e que há falta de penetrância do gene nestes indivíduos, o que reduziria a freqüência da ocorrência de determinada característica, apesar de dominante. A dentinogênese imperfeita tem praticamente 100% de penetrância, pois todos os indivíduos portadores do gene apresentam seu fenótipo. Por outro lado, a osteogênese imperfeita pode apresentar penetrância incompleta, uma vez que,
13 estudos de heredogramas demonstram indivíduos que transmitem o genótipo, mas aparentemente não estão afetados. O conjunto de todos os genes é denominado genótipo (ou genoma); e sua manifestação, ou seja, sua expressão visível, é denominada fenótipo. Expressividade é o grau de expressão do fenótipo. Quando a manifestação de um fenótipo difere em pessoas que apresentam o mesmo genótipo diz­se que o fenótipo tem expressividade variável. Essa expressividade variável é notada em determinadas anomalias vistas na cavidade oral que apresentam graus de severidade variável (GARDNER, 1977). Expressividade variável é encontrada com ou sem agenesia dentária associada, sendo o incisivo lateral conóide, o principal exemplo. WOOLF (1971) e PECK et al. (1993), afirmaram que em famílias com herança dominante de agenesia de incisivos, o gene responsável tende a mostrar penetrância reduzida e expressividade variável. Incisivos conóides ou com grande diminuição do tamanho mésio­distal, ou terceiros molares rudimentares podem ser reflexos de um defeito de um gene que causa agenesia dentária, porém com expressividade incompleta. Também agenesia unilateral pode ser o resultado de penetrância reduzida. Nos casos em que os indivíduos transmitem um gene apesar de não expressarem a característica, diz­se que o caracter é não penetrante. A penetrância reduzida pode acontecer nas mais variadas doenças geneticamente hereditárias. Temos por exemplo, um caso de uma criança de 6 anos cuja queixa principal era a ausência de vários dentes, mas não apresentava nenhuma doença sistêmica relevante. Verificou­se que na sua história familiar estava a etiologia hereditária associada a oligodontia. Essa anomalia foi caracterizada como sendo genética, de transmissão autossômica dominante, mas com penetrância incompleta (Mc DONALD & AVERY, 1983). ARYA e SAVARA (1974), afirmam que há uma diversidade de opiniões sobre o papel da hereditariedade em causar anodontia parcial. E isso, provavelmente devido a existência de um modo de transmissão com expressividade variável ou penetrância incompleta. ARYA e SAVARA (1974), em seu estudo, relatam um caso de pais não afetados por ausências
14 dentárias e filhos e filhas severamente afetados. A penetrância ou expressividade pode variar de uma geração para outra. GRAHNEN (1956), desenvolveu um estudo clássico em pais e parentes de 1.761 pessoas com hipodontia, concluindo que esse grupo apresentava uma freqüência significantemente maior de outros casos de hipodontia, do que a população em geral. GRAHNEN (1956), afirmou que na maioria dos casos, oligodontia é determinada por um modelo genético autossômico dominante com características de penetrância incompleta e expressividade variável. No estudo de GRAHNEN (1956), a penetrância é maior quando o exemplo na família tem mais de seis dentes ausentes. O trabalho de LYNGSTADAAS et al. (1996), teve por objetivo descrever o caso de uma criança com oligodontia isolada nas dentições decídua e permanente, com caráter sugestivo de herança autossômica dominante, com penetrância incompleta e expressividade variável, bem como discutir suas características pouco comuns. A história familiar encontrada neste caso suporta a etiologia hereditária associada a oligodontia. Contudo, a ausência da condição em uma geração sugere que esta apresenta penetrância incompleta. A variação de intensidade dos membros afetados sugere que a herança seja autossômica dominante e tenha expressividade variável. Vale ressaltar que o acontecimento em ambos os sexos descarta a possibilidade de herança ligada ao sexo, como sugeriram SUAREZ e SPENCE (1974). Uma característica pode ser hereditária através de um simples par de genes ou através de múltiplos pares de genes. Quando ambos os genes de um mesmo par, um do pai e outro da mãe são similares, nós dizemos que o indivíduo é homozigoto para aquela característica. Quando um determinato par de genes do mesmo local apresenta diferentes alelos (por exemplo, A e a) o indivíduo é considerado heterozigoto para aquela característica. Quando uma característica é evidente, mesmo quando os genes são diferentes ou heterozigotos, o fator é dito dominante, ou quando ambos os genes são necessários para que uma determinada característica apareça, o fator é dito recessivo.
15 Enquanto alguns autores sugerem que a hipodontia é causada por um único gene (ALVESALO e PORTIN, 1969, GORLIN et al. 1980) outros optam por uma herança poligênica, SUAREZ e SPENCE (1974); GRABER (1978); CHOSACK, EIDELMAN e COHEN (1975); ALVESALO (1971) e VIEIRA (2003), ou problema multifatorial, como proposta por BROOK (1984). BROOK (1984), realizou um estudo sobre o número e tamanho de dentes de crianças em idade escolar britânicas, e propôs um modelo de etiologia multifatorial, no qual a combinação de fatores genéticos e ambientais, cada um com um pequeno efeito, determinaria a presença do defeito. Neste estudo, a proporção de parentes afetados variou de acordo com a severidade da condição do probando. Embora um gene autossômico dominante é provavelmente o responsável pela hipodontia dos incisivos laterais superiores, é possível que um gene recessivo ou um modo de herança poligênico exista em algumas famílias (WOOLF, 1971). ALVESALO e PORTIN (1969), concluem que incisivos laterais superiores ausentes congenitamente ou malformados (conóides), são resultados de um mesmo gene. Já a preponderância em mulheres, tendência familiar e associação com outras anomalias, como caninos superiores ectópicos, transposição de canino e primeiro pré­molar superior, e outros dentes ausentes, sugere uma etiologia poligênica. Para ZACHRISSON (1975), existe uma tendência familiar na ausência congênita de incisivos laterais permanentes, mas na verdade essa condição é passada de geração por um sistema poligênico autossômico dominante, com penetrância incompleta e expressão variável, ou seja, o indivíduo que possui tais genes pode ou não apresentar manifestações clínicas, variando desde uma simples diminuição no diâmetro mésio­distal do incisivo lateral até a ausência completa desse elemento.
16 2.6 Prevalência da Agenesia Dentária na Dentição Permanente Existe uma grande variação entre os pesquisadores em relação a prevalência da agenesia dentária na dentição permanente e também sobre qual o dente mais frequentemente ausente. (Quadro 1, pág. 24) A incidência de ausência congênita de dentes na dentição permanente na população em geral, excluindo­se os terceiros molares, é de 1,6% a 9,6% (GRAHNEN, 1956, PINDBORG, 1970, EIDELMAN et al. 1973, GRABER, 1978, MAKLIN et al. 1979). GLENN (1964), em um estudo com 1702 crianças observou um índice de 5% de prevalência de ausência congênita de dentes permanentes excluindo terceiros molares, e os resultados deste estudo sugeriram aumento de prevalência de agenesia dentária quando comparados com dados de 30 anos atrás. ROSE (1966), realizou uma pesquisa de 6000 pacientes que recorreram a tratamento ortodôntico, com média de idade de 7 a 14 anos, encontrando 4,3% com um ou mais dentes ausentes congenitamente. CHOSACK, EIDELMAN & COHEN (1975), encontraram uma prevalência de agenesia de 4,6%, sendo que um ou mais incisivos laterais superiores estavam ausentes em 2,1% e os incisivos inferiores em 0,7% da amostra. SYMONS, STRITZEL & STAMATION (1993), estudando uma amostra de 5127 pacientes, verificaram agenesia de incisivo lateral permanente e segundo pré­molar em 2,2% e em 3,4% dos casos, respectivamente. No Brasil, o estudo de GLAVAM e SILVA (1995) sobre a ocorrência de hipodontia em crianças de 3 a 12 anos, encontrou como dentes mais afetados os incisivos laterais e os segundos pré­molares e uma prevalência de 3,1%, enquanto que na América do Norte foi observada uma prevalência de 3,7% de agenesia dentária. Agenesia de 1º e 2º molar é muito rara. Oligodontia, ou hipodontia severa ocorre na população com uma prevalência estimada de 0,25%; ZHU et al. (1996), afirmaram que a ausência de um ou mais terceiros molares é vista em 20,8% a 22,7% da população. Diferentes grupos étnicos demonstram prevalência
17 significativamente diferente para diferentes tipos de agenesia dentária. Por exemplo, na dentição dos asiáticos, os incisivos inferiores são os dentes mais comumente ausentes. Já nos caucasianos, os segundos pré­molares e incisivos laterais superiores estão mais frequentemente ausentes. A agenesia de um ou dois segundos pré­molares é muito comum, mas a ausência de três ou quatro segundos pré­molares é uma ocorrência mais rara. EIDELMAN et al. (1973), examinaram 21.384 crianças em idade escolar de 12 aos 18 anos de idade de uma comunidade de Israel encontrando a prevalência de 4,6% de casos de hipodontia sem diferenças significativas entre os gêneros. O dente mais freqüentemente ausente foi c incisivo lateral superior, com uma prevalência de 2,1% e o segundo dente mais freqüentemente ausente foi o segundo pré­molar inferior, com uma prevalência de 1,8% da população. Hipodontia em incisivos inferiores foi diagnosticado em 0,6% das crianças. Os autores também observaram que quando a prevalência de hipodontia de diferentes grupos de dentes foram analisados, as variações que existiam em diferentes populações eram mais enfatizadas, ou seja, grupos de origens variadas mostram uma diferença na prevalência total da hipodontia. EIDELMAN et al. (1973), sugerem que populações distintas poderiam ter diferentes freqüências de genes, o que explicaria essas diferenças. DOLDER (1936), examinando 10.000 escolares suíços, na faixa etária de 6 a 15 anos, verificou que 3,4% apresentavam ausência congênita de um ou mais dentes num total de 709 dentes, com uma média de dois dentes por paciente. O autor observou também que, a ausência era mais freqüente na mandíbula do que na maxila, numa proporção de 7 para 6, não encontrando diferença entre os lados, e nem quanto ao gênero. No entanto, notou que a ausência do incisivo lateral superior foi mais comum nos indivíduos do gênero feminino, e do segundo pré­molar nos do gênero masculino. OLIVER et al. (1945), também encontraram uma maior predominância de agenesia dentária na mandíbula.
18 GLENN (1961), afirmou que anodontia parcial é mais comum na mandíbula do que na maxila, e a explicação para isso é a tendência de um osso mandibular menor em tamanho do que o osso maxilar. GRAZIOSI et al. (1985), em seus estudos sobre anomalias dentárias, encontraram uma maior prevalência de ausência congênita de dentes no gênero feminino, bem como, uma maior predominância na maxila do que na mandíbula e maior número de ausências dos segundos pré­molares superiores, dos segundos pré­molares inferiores, dos incisivos laterais superiores, dos primeiros pré­molares superiores e dos primeiros pré­molares inferiores. BROGLIA e BARLOTTA (1965), estudaram 152 pacientes portadores de agenesias dentárias, sendo 64 do gênero masculino e 88 do gênero feminino. Encontraram 258 dentes ausentes, dando uma média de 1,7 dentes para cada indivíduo. Os autores observaram que as agenesias dentárias mais freqüentes eram do grupo dos incisivos laterais superiores, seguidas pelos segundos pré­molares inferiores. Verificaram também que agenesia dentária era mais comum na maxila (53,28%) do que na mandíbula (37,49%). As agenesias bilaterais eram porcentualmente iguais às unilaterais, não havendo predominância quanto ao lado. VEDOVELLO (1990) encontrou em seu trabalho com dois mil escolares, uma prevalência de 3,1% de agenesias dentárias. Observou também um maior número de agenesias dentárias na maxila do que na mandíbula, porém, sem diferença significativa quanto ao lado direito ou esquerdo. Encontrou um maior número de agenesias dentárias unilaterais na mandíbula, e o dente mais freqüentemente ausente era o incisivo lateral superior. Já STOCKTON et al. (2000), afirmavam que em caucasianos aproximadamente 80% das agenesias dentárias envolvem apenas um ou dois dentes. Os segundos pré­molares inferiores são os mais ausentes congenitamente, seguido pelos segundos pré­molares superiores, primeiros pré­molares superiores e incisivos laterais superiores. Os dentes mais distais de cada grupo de dentes são mais freqüentemente afetados, e se a severidade dos
19 casos piora, parece existir uma tendência a uma progressão anterior da agenesia de cada grupo de dentes. MULLER et al. (1970), em seus estudos de 14.940 adolescentes observaram que o incisivo lateral superior era o mais ausente quando o paciente apresentava ausência de um ou dois dentes e o segundo pré­molar era o mais ausente quando mais de dois dentes estavam ausentes congenitamente. BAILIT (1975), afirma que quando o terceiro molar está ausente, a possibilidade de ocorrência de hipodontia em outra área da dentição permanente é treze vezes maior. A agenesia dental normalmente é bilateral e simétrica com exceção dos incisivos laterais superiores, quando o lado esquerdo é mais freqüentemente ausente que o lado direito. Já LÜNDSTROM (1960), observou que metade dos casos de agenesia dentária é unilateral. Para MOYERS (1991), a freqüência de ausência congênita de dentes é normalmente bilateral simétrica, exceto no caso do incisivo lateral superior onde o dente da esquerda está ausente mais freqüentemente que o da direita, o que pode estar relacionado com o fato de que a fenda palatal unilateral ser mais observada do lado esquerdo. GARN e LEWIS (1962) estudaram 100 pessoas com ausência congênita de um ou mais terceiros molares e notaram que 53 outros dentes também estavam ausentes. Em 398 controles com todos os terceiros molares presentes, somente dezessete dentes estavam ausentes. Segundo FINN (1973), a ausência congênica de dentes ocorre normalmente bilateralmente, porém pode ocorrer unilateralmente. MESKIN e GORLIN (1963) realizaram estudo em uma amostra de 8.289 estudantes da Universidade de Minnesota, a fim de verificar agenesias dos incisivos laterais superiores e verificou que 0,95% eram portadores da agenesia. VOLK (1963) realizou um estudo em 15.294 estudantes, sendo 7779 do gênero masculino e 7515 do gênero feminino. Verificando que 5,85% indivíduos do gênero masculino e 7,27% do gênero feminino apresentavam um ou mais dentes ausentes, e
20 observou também que os incisivos laterais superiores, segundo pré­molar inferior e segundo pré­molar superior constituíam 87% dos dentes ausentes. CLAYTON (1956) avaliou radiograficamente 3557 pacientes num período de 12 anos. Os dados coletados revelaram 433 dentes ausentes, ou seja, 12,14% do grupo sem maior prevalência para nenhum gênero. O dente permanente mais freqüentemente ausente foi o segundo pré­molar inferior seguido pelo incisivo lateral superior e pelos incisivos centrais. O dente decíduo mais freqüentemente ausente foi o incisivo lateral superior, seguido pelo incisivo central superior e pelo primeiro molar. CLAYTON (1956) observou também que quando mais de um dente estava ausente, isso ocorria bilateralmente. Agenesia de quatro ou mais dentes sem considerar os terceiros molares, tem uma prevalência de 0,25% na população. A incidência de agenesia do terceiro molar na população é de 20% e é o dente mais comumente ausente. Em segundo lugar, vem a agenesia de segundo pré­molar com uma freqüência de 3,4%. Quanto aos segundos pré­ molares, agenesia de somente um segundo pré­molar é a forma mais comum. Agenesia dentária ocorre mais freqüentemente em grupos de dentes específicos como terceiros molares, segundos pré­molares e incisivos laterais. Os dentes permanentes mais freqüentemente ausentes são segundos pré­molares, incisivos laterais superiores, e terceiros molares, e os menos frequentemente ausentes são incisivos centrais, caninos inferiores e primeiros molares (SCHULTZE, 1970). Os segundos pré­molares inferiores foram os dentes mais comumente ausentes no estudo de MEIRA (2002), seguidos dos incisivos laterais superiores. Segundo SYMONS et al. (1993), os dentes mais freqüentemente ausentes, excluindo­se os terceiros molares, são os segundos pré­molares superiores e inferiores, os incisivos laterais superiores e inferiores, os caninos superiores e os incisivos centrais inferiores. BYRD (1943) examinou e radiografou 2.835 escolares, sendo 1.473 do gênero masculino e 1.398 do gênero feminino e encontrou 0,27% de dentes ausentes.
21 Dos indivíduos examinados, 45 do gênero masculino e 34 do gênero feminino apresentavam ausência congênita de um ou mais dentes. Em 47 crianças, a ausência era bilateral. O número total de dentes ausentes era 145, dos quais 77 pertenciam ao gênero masculino e 68 ao gênero feminino. Segundo ZHU et al. (1996), assim como dentes supranumerários a ausência congênita dentária é mais comum na dentição permanente e tem uma prevalência de 3.5 a 8% da população (excluindo terceiros molares), com uma predileção pelo gênero feminino na proporção de 3:2 em relação ao gênero masculino. MULLER et al. (1970), verificaram uma maior incidência de agenesia dental em mulheres. Em crianças brasileiras, essa predileção pelo gênero feminino foi observada por GLAVAM e SILVA (1995) e MEIRA (2002). EGERMARK­ERIKSSON e LIND (1971), concordam que a hipodontia é mais comum no gênero feminino, numa escala de 3:2. Já na dentição decídua, a freqüência de variações numéricas não são altas o suficiente para demonstrar nenhuma diferença estatística significante. KEENE (1966), estudou a relação entre idade materna e hipodontia em 296 pacientes. Ele concluiu que mães com menos de 20 anos ou com mais de 35 anos apresentaram uma tendência de terem o primeiro filho com maior incidência de hipodontia, em comparação com mães com a idade entre 20 e 35 anos. 2.7 Prevalência de Agenesia Dentária na Dentição Decídua As anomalias de desenvolvimento são menos freqüentes na dentição decídua do que na permanente. A incidência de ausência congênita de dentes decíduos varia de 0,5 a 1%. As ausências mais freqüentes são na ordem, incisivos laterais superiores, incisivos centrais superiores e primeiro molar (RAVN, 1971, JARVINEN & LEHTINEN, 1981).
22 Segundo PINDBORG (1970) agenesias dentárias são pouco comuns e são extremamente raras em outras áreas que não sejam a região dos incisivos decíduos. São mais freqüentes na maxila do que na mandíbula. MENCZER (1955) afirma que alterações na dentição decídua são menos freqüentes que anomalias similares na dentição permanente. Anomalias na dentição decídua não são indicações de problemas similares na dentição permanente. GRAHNEN e GRANATH (1961), realizaram uma investigação com o objetivo de associar hipodontia na dentição decídua com anomalia similar na dentição permanente. Foram observadas 1173 crianças entre 3 e 5 anos de idade durante um longo período de tempo. As crianças eram examinadas clínica e radiograficamente no Departamento de Odontopediatria da Royal Dental School Malmö. O resultado deste estudo mostrou que a prevalência de hipodontia na dentição decídua é de 0,5 a 0,9% e ocorre com mais freqüência na região dos incisivos, estando associada com a ausência congênita dos dentes permanentes sucessores. Mais detalhadamente, dos oito indivíduos com hipodontia na dentição decídua, seis apresentaram hipodontia na região correspondente na dentição permanente. Além disto, dois também tinham hipodontia em outra região, portanto o resultado desta investigação sugere uma correlação entre as duas dentições. Concluíram também que na dentição decídua, ausência congênita não é muito comum, mas quando ocorre, normalmente envolve incisivos laterais superiores, incisivos laterais inferiores e caninos inferiores. ZHU et al. (1996), também lembraram que a hipodontia na dentição decídua é uma condição rara. Quando ocorre, normalmente é na região de incisivos e freqüentemente está associada à ausência dos dentes permanentes sucessores. Segundo JARVINEN e LEHTINEM (1981), a ausência congênita de dentes decíduos afeta 0,5 a 1% da população, sem diferença estatisticamente significante entre meninos e meninas. A probabilidade de ocorrer anomalias na dentição permanente quando as crianças
23 apresentam anomalias de número na dentição decídua é cinco vezes maior do que em crianças com dentição decídua completa. Segundo observações de BOLK (1913), é comum o segundo molar decíduo inferior não esfoliar devido à ausência do segundo pré­molar correspondente. Já na maxila é mais comum que o segundo molar decíduo venha a esfoliar, mesmo que não exista o germe do segundo pré­molar correspondente. BOLK (1913), afirmava que esse fato não deve ser explicado como um fenômeno natural e que, com a evolução humana, além da permanência do segundo molar decíduo inferior e a ausência do segundo pré­molar, observaríamos também a não formação do incisivo lateral superior e do terceiro molar. BYRD (1943), acreditava ser imperativo um diagnóstico precoce e revisões periódicas para que se mantivesse os dentes decíduos, sem os permanentes sucessores, o maior tempo possível na arcada. Acreditava também que profilaxias e restaurações podem ser feitas nos dentes decíduos sem que isso acelere sua reabsorção no caso da ausência do sucessor.
24 Quadro 1: Estudos de Prevalência e Dentes mais ausentes nas Dentições Permanente e Decídua AUTORES ANO AMOSTRA PREVALÊNCIA DENTE + AUSENTE DENTIÇÃO Menczer 1955 2209 0,09 IL Decíduo Grahnen 1956 1006 6,1 2º PMI Permanente Clayton 1956 3557 6,0 2º PMI Permanente Grahnen e Granath 1961 1173 0,5 a 0,9% ILS Decíduo Glenn 1964 1702 5,0 2º PMI Permanente Keene 1966 296 3,3 2º PM Permanente Rose 1966 6000 4,3 2º PMI Permanente Muller et al. 1970 14.940 3,4 ILS Permanente Ravn 1971 ­­­ 0,5 a 0,9% ILS Decíduo Eidelman et al. 1973 21.384 4,6 ILS Permanente Chosack, Eidelman, Cohen 1975 1125 4,6 ILS Permanente Jarvinen e Lehtinen 1981 ­­­ 0,5 a 1,0% ILS Decíduo Symons, Stritzel e Stamation 1993 5127 3,4 2º PMI Permanente Glavam e Silva 1995 1625 3,12 ILS Permanente Vieira et al. 2004 116 ­­ 2°PMI Permanente
25 2.8 Associações de Agenesia Dentária com Outras Anomalias de Desenvolvimento Há indicações de que diferentes tipos de hipodontia podem ser causadas por diferentes fatores genéticos. GARN et al. (1963) e GRABER (1978), afirmaram que ocasionalmente, hipodontia é observada em pessoas sem nenhum outro sinal de doença hereditária. Tais agenesias dentárias não sindrômicas raramente são um fenômeno isolado, parece ser ligado a outras anomalias dentais tais como, microdontia e taurodontismo (SEOW e LAI, 1989, LYNGSTADAAS et al. 1996). BROOK (1984) observou ao avaliar a associação existente entre microdontia e hipodontia em uma amostra composta por 1115 crianças de 11 a 14 anos de idade, que 43% da amostra que apresentavam hipodontia também mostravam microdontia, o que sugere uma forte associação entre estas duas anomalias dentárias, e também constatou que o gênero feminino apresentava maior incidência de microdontia em relação ao gênero masculino. Membros afetados em uma família freqüentemente mostram diferenças significativas quanto à localização, simetria e número de dentes envolvidos. Além disso, os outros dentes presentes podem variar em tamanho, forma e sofrer um atraso na formação e erupção (BURZYNSKI e ESCOBAR, 1983). Vários estudos como (GARN et al. 1963; BAUM e COHEN, 1971; GRAVELY e JOHNSON, 1971), relacionaram mudanças na morfologia e no tamanho dos dentes em pessoas com hipodontia. O achado mais comum parece ser a diminuição na dimensão mésio­distal dos dentes contra­laterais, mais precisamente, segundo GARN e LEWIS (1968), na região dos incisivos. OLIVEIRA, CONSOLARO e HENRIQUES (1991), observaram que a hipodontia dos incisivos laterais superiores exercem uma pequena influência na redução simétrica do tamanho mésio­distal da coroa dos incisivos inferiores.
26 ALVESALO e PORTIN (1969) relacionaram agenesia de um incisivo lateral superior com incisivo lateral contra­lateral de menor tamanho. E também, com incisivo lateral superior conóide. Os autores verificaram que 42,9% das pessoas que tinham incisivo lateral superior conóide, tinham ausência congênita do dente homólogo, e que 11% dos parentes das pessoas que apresentavam os dois incisivos laterais superiores conóides, tinham agenesia dentária. Para ALVESALO e PORTIN (1969), incisivos laterais conóides são uma expressão mais fraca do gene que causa agenesia destes dentes, ou seja, são expressões diferentes do mesmo gene. Segundo ZHU et al. (1996), a mais comum anomalia dental que ocorre associada à ausência congênita de incisivos laterais permanentes ou segundos pré­molares é a ausência de outro dente qualquer. Outras seqüelas associadas a ausência congênita dentária incluem distúrbios de espaço, mal posicionamento dos caninos, erupção ectópica dos primeiros molares permanentes, ou infraoclusão de molares decíduos. GARN e LEWIS (1962) observaram que em 100 pessoas com ausência congênita de terceiros molares, 53 outros dentes também estavam ausentes. Em 398 controles com todos os terceiros molares presentes, somente 17 outros dentes estavam ausentes. SUAREZ e SPENCE (1974) relacionaram hipodontia dos terceiros molares com ausência, hipoplasia e tamanho reduzido dos dentes remanescentes. KEENE (1964) também relacionou a ausência congênita de um ou mais terceiros molares com um espaçamento maior entre os dentes e menos apinhamento. E isso ficava mais evidente quando existia ausência dos quatro terceiros molares. Também a associação entre dentes decíduos submersos e a ausência congênita de seu sucessor têm sido bem documentada. Isso leva à conclusão que quando uma anomalia está presente, há uma probabilidade maior que outras anomalias venham a ocorrer.
27 ROBERTS (1973) notou que em famílias com história de ausência congênita de segundos pré­molares, membros da família que não apresentavam casos de agenesia freqüentemente tinham raízes menores dos segundos pré­molares. WOOLF (1971) estudou 103 indivíduos com ausência congênita bilateral de incisivos superiores, ausência unilateral de incisivos superiores e incisivo conóide. A freqüência de indivíduos com incisivo lateral superior ausente era significantemente aumentada nos pais e irmãos dos indivíduos do estudo comparados com pais e irmãos de famílias controle. A freqüência de indivíduos com incisivos laterais superiores conóides também era aumentada nos parentes de primeiro grau dos indivíduos da pesquisa, indicando que existe uma relação genética entre incisivos ausentes e incisivos conóides. Em setenta e uma (69%) das 103 famílias dos indivíduos afetados por agenesias dentárias, pelo menos um parente de primeiro, segundo ou terceiro grau tem um incisivo superior conóide. Isso reforça a hipótese de que pelo menos parte do componente genético consiste em um gene ou genes autossômicos dominantes com penetrância incompleta e expressividade variável. É também plausível que essa característica tenha um modo de herança poligênica recessiva em algumas famílias. Existe um alto grau de concordância entre indivíduos afetados por agenesia dentária e membros da família também afetados com a mesma anomalia de incisivos, especialmente se o indivíduo afetado tiver ausência congênita bilateral de incisivos laterais superiores. Pode­se concluir que o desenvolvimento das dentições podem ser alterados por muitos genes mutantes diferentes e genótipos, alguns com uma ação específica envolvendo incisivos laterais superiores e outros com uma ação mais geral. No estudo de MEIRA (2002), 38% dos probandos apresentavam história positiva de agenesia dentária na família. 2.9 Associações de Agenesia Dentária com Fissuras Labiopalatinas As fissuras labiopalatinas são malformações congênitas que causam em seus portadores além do comprometimento estético severo, distúrbios funcionais, que vão desde
28 a alimentação até a fonação. Observou­se que anomalias dentárias se evidenciam mais freqüentemente em pacientes portadores de fissuras labiopalatinas do que na população em geral e ocorrem com maior incidência na dentição permanente, na região da fissura, onde é observada mais freqüentemente do que na região contralateral. O incisivo lateral superior é o elemento dentário mais susceptível a injúrias e mostra maior incidência de agenesia (PIRINEN et al., 2001). O diagnóstico precoce das anomalias dentárias é de fundamental importância para que sejam minimizados seus efeitos deletérios no desenvolvimento harmonioso da oclusão dentária e da estética, através de conduta clínica e ortodôntica adequada. Anomalias dentárias de número, tamanho, forma, desenvolvimento e erupção, são bastante freqüentes em fissurados labiopalatinos e a sua intensidade parece depender da severidade da fissura. Embora apareçam na dentição decídua, prevalecem na dentição permanente, e na maxila, sua incidência é maior do que na mandíbula. A incidência de agenesias dentárias e dentes supranumerários nas dentições decíduas e permanentes nos portadores de fissuras labiopalatinas são sete vezes mais freqüentes nesses pacientes do que na população em geral, sendo agenesia dentária duas vezes mais freqüentes que dentes supranumerários. LARSON et al. (1998), afirmam existirem evidências que crianças com fenda palatina têm risco maior de nascerem com ausência congênita de dentes fora da área da fenda. Também, quanto mais grave for a fenda, maior será o numero de dentes ausentes. 2.10 Genes Candidatos 2.10.1 Padrões Hereditários: SANDOR et al. (2001), acreditam estarmos próximos do término do Projeto Genoma Humano, ou seja, o mapa completo do material genético humano. Também a Companhia Particular “Celers Genomics” estima já ter decodificado 99% dos genes humanos. Cinco mil e setecentos dos cinqüenta mil a cento e quarenta mil genes que se acredita fazer parte do genoma humano foram identificados como a causa de doenças
29 genéticas (MCKUSICK, 1992). Atualmente, acredita­se que o número total de genes humanos não passa de trinta mil. Segundo FINN (1973), doenças genéticas podem ser classificadas em três grupos:
·
aberrações cromossomiais nas quais há uma anormalidade estrutural ou numérica dos cromossomos;
·
anormalidades em um gene o qual é transmitido como autossômico dominante, autossômico recessivo ou ligado ao sexo;
·
anomalia poligênica. Estima­se que 0,5% dos recém­nascidos terão uma aberração cromossômica, 1% terão uma anormalidade em um gene e 10% terão uma desordem poligênica. Os milhares de genes humanos são alinhados em seqüência e divididos em 23 pares de cromossomos. Uma cópia de cada cromossomo é herdada de cada progenitor, de forma que o total de número de cromossomos em cada corpo celular seja 46. Dentro dos cromossomos estão unidades menores chamadas de genes. Os genes são massas de protoplasma que ocupam uma posição específica. Os genes são segmentos de ácido desoxirribonucléico (DNA), material genético humano que determinam a produção de proteínas que por sua vez governam todos os processos da vida. O DNA é uma longa cadeia molecular de fosfato e açúcar com a forma de uma escada em espiral, cujos degraus são compostos pela combinação das chamadas bases nitrogenadas, as letras que traduzem o código genético – (A)denina, (C)itosina, (G)uanina e (T)imina. Em vez de tinta e papel, a receita de um ser humano é escrita com um elemento chamado DNA. Enquanto o nosso alfabeto tem 24 letras, o alfabeto do DNA possui somente quatro “letras (A,C,G, e T)”. Como o ser humano é extremamente complexo, esta receita é longa: está escrita com três bilhões de combinações destas quatro letras e divididas em “fascículos” chamadas cromossomos. Todas as instruções – os genes – estão espalhados ao longo dos cromossomos e vão determinar a estrutura e o funcionamento dos órgãos, dos membros, a cor da pele, dos olhos, a formação dos dentes, a distribuição da gordura no corpo, enfim, todas as nossas características (PEREIRA, 2000).
30 Cada gene é formado por uma determinada seqüência dessas bases (A,C,G e T) (GARDNER, 1977). Em uma regra quase geral, essas seqüências (ou seja, os genes) incluem alguns segmentos chamados “exons”, com informação que as células usarão na produção de proteínas, e segmentos intercalados, os “introns”, cuja informação será descartada, não sendo usada nesse processo celular. Para que a informação contida no DNA seja transferida para as diversas funções celulares, essa molécula precisa primeiro ser copiada, em um processo denominado transcrição, que gera uma molécula­irmã, o ácido ribonucleico (RNA). O RNA contém a mesma informação genética presente no DNA, mas difere deste por ter uma só cadeia e por apresentar, no lugar da base timina (T), a uridina (U). No entanto, o RNA só se torna funcional depois que os introns são retirados, em um processo conhecido como “splicing” (traduzido em português, por “cortar e ligar”). Em uma explicação simplificada, pode­se dividir o splicing em duas etapas: a retirada dos introns e a ligação dos exons. Retirados os segmentos “extras”, os exons são ligados uns aos outros e o RNA, agora chamado de RNA mensageiro (mRNA), torna­se funcional, ou seja, pode ser traduzido por organelas celulares denominadas ribossomos. No processo de tradução, a ordem dos exons no mRNA serve como modelo para a montagem, nos ribossomos, das moléculas essenciais para nossa existência: as proteínas (Mc DONALD & AVERY, 1983). Vital para a sobrevivência da maior parte dos organismos existentes na Terra o processo de splicing apresenta muitas variações (mecanismos alternativos), tanto nas formas de reconhecimento dos sítios de corte, para a retirada dos introns, quanto na escolha dos exons que serão ligados (PENALVA e ZORIO, 2001). 2.10.2 Quebra­Cabeças de Exons: Por muitos anos o processamento do RNA foi visto apenas como um mecanismo inventado pela célula para se livrar dos introns, unir os exons e produzir assim um RNA
31 mensageiro funcional, capaz de ser traduzido em uma proteína. À medida que mais e mais genes foram seqüenciados e analisados, percebeu­se que um número substancial deles originava mais de um tipo de mRNA. Mesmo produzidos a partir do mesmo gene, esses mRNAs podem conter diferenças na seqüência de bases, que será traduzida pelos ribossomos, possibilitando a montagem de proteínas distintas, com funções também distintas e algumas vezes até antagônicas (PENALVA e ZORIO, 2001).. 2.10.3 Ligando e Desligando Genes: Cada célula reflete o padrão de expressão de seus genes. Assim, esse padrão é diferente, por exemplo, em uma célula do fígado e em uma célula muscular. Certos genes ativos (ou seja, produzindo proteínas) em uma célula hepática podem estar “desligados” em uma célula muscular e vice­versa. Entre os vários processos celulares existentes que permitem “ligar e desligar” genes está o splicing alternativo. Durante o splicing do RNA, um exon que contém a informação para a montagem de uma região importante de uma proteína pode ser excluído, ou um exon que contém um sinal de parada de tradução pode ser introduzido. Nos dois casos, é gerada uma proteína não­funcional ou um produto truncado. Em outras palavras, o gene é “desligado”. Como o splicing é um processo complexo, com regulação fina, a mutação de um simples nucleotídeo (uma das letras do DNA) situado em um sítio de reconhecimento da junção exon­intron ou em um elemento regulador, pode causar um erro no processo e gerar um produto aberrante. Muitas vezes, isso significa a inativação do gene. As mutações espontâneas podem ocorrer porque:
·
as reações químicas nas células ocasionalmente se comportam de maneira atípica e produzem novas configurações do DNA;
·
uma irradiação casual pode alterar o DNA;
·
vários produtos químicos do meio ambiente podem modificar o DNA.
32 Não existe, por ora, qualquer explicação satisfatória para as mutações espontâneas, mas não é impossível que fatores ambientais causem a maioria dessas mutações (PENALVA e ZORIO, 2001). Um indivíduo que seja afetado por doença hereditária carrega uma alteração tal em seu DNA que as células afetadas produzirão uma proteína anormal, quantidades anormais de proteína ou ambos. Essas mutações continuam então nas próximas duplicações, fazendo com que a condição persista nas novas gerações (Mc DONALD & AVERY, 1983) E, a partir desses conhecimentos, a aplicação mais imediata será na identificação dos genes envolvidos com doenças genéticas. Vários desses genes já foram identificados deste o início do Projeto Genoma. A identificação do gene defeituoso, em uma doença, inicialmente permite diagnósticos mais precisos e precoces. Por outro lado, a partir do conhecimento da função original daquele gene defeituoso, podem­se desenvolver drogas específicas para suprir a falta desse gene. E, no futuro, cópias normais dos genes defeituosos, feitas sob medida em um laboratório, poderão ser inseridas nos pacientes corrigindo seu genoma. A essa técnica se dá o nome de terapia gênica (DIEGUEZ, 1997). Em 1906, ao fazer a autópsia de uma mulher de 55 anos, o médico alemão Alois Alzheimer (1864­1915) descobriu no cérebro da paciente seis lesões que ninguém nunca tinha visto antes. O problema estava dentro dos neurônios – as células cerebrais –, que em vários lugares apareciam atrofiados, cheios de placas estranhas e de fibras retorcidas, enroscadas umas nas outras. Desde então, esse tipo de degeneração nos neurônios ficou conhecido como o mal de Alzheimer. Até hoje, Alzheimer continua sendo uma síndrome de causa desconhecida. É incurável. Mas no ano de 1997 o entusiasmo tomou conta dos médicos, porque eles aprenderam a detectar os sinais da síndrome décadas antes de ela surgir. Está claro agora que se um cidadão possui alguns genes defeituosos, (o mais importante está situado no cromossomo 19 e os outros dois nos cromossomos 14 e 21), ele pode ter Alzheimer mais tarde. No futuro será possível testar drogas que podem não trazer a cura definitiva, mas que pelo menos aliviem os pacientes (SILVA, 1997).
33 Estudos convencionais em genética têm demonstrado que uma mutação em um ponto particular de um gene poderia causar alterações estruturais nas proteínas codificadas por esse gene (STEWART e PRESCOTT, 1976). Pesquisadores da Universidade de Wuerzburg, na Alemanha, isolaram o gene WKL1 que, quando defeituoso, produz uma proteína relacionada à esquizofrenia. A mutação no WKL1 foi detectada enquanto o grupo investigava o cromossomo 22 de 35 pessoas de três gerações de uma mesma família, oito delas esquizofrênicas. O cromossomo 22 é a região do genoma que a maior parte dos estudos já indicava ser produtora de proteínas relacionadas à doença. Uma vez identificada, a mutação poderá trazer duas contribuições essenciais ao tratamento e diagnóstico da doença. Hoje, os medicamentos que tratam a esquizofrenia atuam na produção do neurotransmissor dopamina. No futuro, remédios que neutralizem a ação da proteína, produzida pelo gene modificado, poderiam representar uma nova frente de combate, assim como seriam as terapias genéticas para corrigir os genes defeituosos (COSTA, 2001). A medida que progride o mapeamento genético descobrem­se genes ligados a várias doenças. Assim, se o paciente tiver um determinado gene defeituoso, pode­se prever a chance de ele desenvolver a doença. Por exemplo, os cânceres de mama e de ovário são disparados pelos genes BRCA1 e BRCA2 respectivamente. Se um deles apresentar anomalias, a chance de se ter câncer é de 80%. Já o gene APC alterado significa certeza de câncer de cólon. Uma má formação no gene retinoblastoma causa tumores nos olhos com 100% de certeza. Seqüenciar os genes é simples. O maior desafio será estudar a função das proteínas produzidas pelos genes. Aposta­se muito em uma nova forma de prática, terapêutica, a da medicina personalizada. O tratamento e a prevenção serão definidos sob medida para cada paciente, baseados em sua análise genômica (COSTA, 2001). No futuro, a terapia gênica promete corrigir as mutações causadoras das doenças, com remédios que seriam uma versão correta do gene. Mudará a conduta clínica, o diagnóstico. Teremos uma medicina personalizada. Não precisamos de novos tratamentos, mas de usar melhor o que temos. Não existirão terapias
34 gênicas milagrosas. Mas, com o diagnóstico mais preciso, usaremos melhor as drogas. Poderemos desenvolver mais remédios por conceitos tradicionais, porém criados para as reais necessidades do paciente (JANSEN, 2003). As bulas dos remédios costumam indicar as doses a serem administradas aos doentes para alcançar os efeitos desejados, mas nem sempre as coisas acontecem da forma prevista. Nas últimas décadas, estudos científicos têm revelado que os indivíduos respondem de modos diferentes aos medicamentos: em alguns casos, a mesma droga que cura uma pessoa pode ser tóxica para outra. Isso se deve, em boa parte, às variações genéticas existentes dentro da população humana. Ou seja, hoje usamos a dose máxima para todo tratamento, mesmo quando o paciente poderia receber uma dose diferenciada. Porém, a medicina do futuro não irá mais trabalhar com doses máximas toleradas e sim com doses mínimas eficazes, para as quais não há o risco de efeitos colaterais. O problema é que não é tão simples assim. Substituir DNA danificado em crianças nascidas com doenças hereditárias, está à vista há dez anos e continua mais ou menos no mesmo lugar. Alcançável, mas não alcançada. Naquela época, parecia fácil substituir genes defeituosos por uma cópia em boas condições, infelizmente, a terapia gênica revelou­se muito, mas muito mais complexa do que se imaginava (JANSEN, 2003). VENTER (2001), que liderou a pesquisa na Celera Genomics, em sua avaliação, antecipa o fracasso de muitas das técnicas de tratamento que começaram a ser testadas nos principais centros de pesquisa do mundo nos últimos anos. Trata­se das promissoras terapias gênicas, que prometem curar pessoas corrigindo defeitos em genes que não funcionam como deveriam. Para os cientistas, o ser humano é muito complexo para ser controlado apenas pela alteração de um ou outro gene. Friedman da Universidade da Califórnia, um dos mais respeitados especialistas em genética, acredita, porém, que os progressos estão acontecendo com rapidez cada vez maior. Praticamente todos os dias se encontram genes que, de uma maneira ou de outra, podem ajudar a tratar alguma doença. Ao mesmo tempo, os cientistas aprendem novas técnicas sobre a melhor maneira de implantá­lo nas células. Ou seja, estão acumulando
35 uma quantidade impressionante de descobertas que, não demora muito, vão construir um ramo inteiramente novo da medicina. Friedman prevê que num futuro próximo, talvez já se possa começar a pensar em mudar não apenas os genes das células comuns, mas também os das células sexuais que são o espermatozóide e o óvulo. Com isso, as alterações genéticas serão transmitidas dos pais para os filhos, ou seja, uma vez corrigido um mal hereditário num cidadão, não haverá mais a possibilidade da doença passar as gerações seguidas. Friedman acredita que as mudanças na medicina com a terapia gênica vão ser fenomenais. Comparáveis as das grandes revoluções do passado, como a das vacinas e a dos antibióticos (DIEGUEZ, 1997). 2.10.4 O Código Genético para Formação Dentária: Há indícios de que mecanismos genéticos diferentes controlam o desenvolvimento de dentes (WITKOP, 1987). Dentes são exemplos típicos de órgãos que se desenvolvem dos tecidos epitelial e mesenquimal. Assim, alterações em um ou mais genes que regulam as interações epitélio­mesênquima, durante o desenvolvimento dentário, poderiam causar agenesia dentária (LYNGSTADAAS et al., 1996). Mais de duzentos genes com essas características já foram identificados (THESLEFF, 2000). Genes e produtos desses genes (proteínas) são os sinais químicos para a comunicação entre as células necessárias para a formação dos dentes. Se esses sinais químicos determinam, o tempo, posição e forma de cada dente em cada quadrante dos maxilares, o mau funcionamento de um ou mais desses genes morforeguladores resultará na ausência congênita de um ou mais dentes, ou na modificação na forma e tamanho dos dentes. Então, um gene candidato para algum tipo de ausência dentária deve estar envolvido com o desenvolvimento dentário. Segundo THESLEFF (2000) vários genes têm sido identificados como reguladores do desenvolvimento embrionário, e nós estamos agora começando a entender como esses diferentes genes funcionam. Não sabemos em detalhe como vários genes afetam o comportamento celular, tais como a proliferação e a diferenciação celular, como eles
36 influenciam a morfogênese e como eles interagem entre si em complexos caminhos e redes. Mutações nesses genes causam defeitos congênitos. Estudos em Drosophila e em camundongos indicaram que os mesmos genes regulam o desenvolvimento de todos os animais há mais de 500 milhões de anos de evolução, isso leva a conclusão que estudos do desenvolvimento em qualquer animal é altamente relevante para outros animais. Também é verdade que os mesmos genes regulam numerosos processos de desenvolvimento no mesmo animal. Eles são usados sequencialmente durante o desenvolvimento em todas as partes do embrião, e seus efeitos dependem do momento e do tecido onde eles funcionam. Por exemplo, conjunto similares de genes governam o desenvolvimento de todos os órgãos em todos os animais, incluindo os dentes nos vertebrados. Embora moscas, obviamente não possuam dentes, informações obtidas em estudos em Drosophilas se aplicam em dentes devido às interações entre diferentes genes. Entretanto, a maioria das informações sobre o controle genético do desenvolvimento têm sido obtidas de estudo em camundongos (THESLEFF, 2000). Todas as células têm os mesmos genes, porém informações de fora das células determinam a decisão da célula de sinalizar ou não para um determinado gene. Existem várias famílias de moléculas que secretam sinais que transmitem informações entre as células. Elas atuam conectando receptores a lugares específicos da superfície celular, e através de cascatas moleculares no citoplasma, a sinalização resulta na ativação de fatores de transcrição, os quais entram no núcleo e regulam a expressão dos genes. Isso resulta na produção de novas proteínas, incluindo novos sinais receptores e fatores de transcrição e a continuação da comunicação entre as células. Cada modelo de sinalização inclui várias moléculas diferentes que interagem entre si e, então, o desenvolvimento é regulado por uma complexa rede de sinais. Os numerosos genes nessa rede de sinais são os reguladores centrais da morfogênese do embrião, determinando o tamanho e a forma dos órgãos incluindo os dentes (THESLEFF, 2000).
37 2.10.5 Rede de Sinais no Desenvolvimento Dentário: O evento mais importante durante a regulagem do desenvolvimento dentário é a interação entre o tecido epitelial e o tecido mesenquimal e requer o envolvimento de vários genes e suas proteínas. Moléculas sinalizadoras de diferentes famílias são usadas em seqüência durante o desenvolvimento dentário e reciprocamente do epitélio para o mesênquima. Além disso, vários fatores de transcrição têm sido identificados como os alvos da sinalização. Essas interações de sinais que determina localização, tamanho e forma dos dentes, começam nos primeiros estágios do desenvolvimento dentário. Os sinais mais estudados pertencem às famílias dos FGF (Fibroblast Growth Factors), TGFB (Transforming Growth & Factors) que inclui BMPS (Bone Morphogenetic Protein). Cada família consiste de vários sinais codificados por diferentes genes que são usados reinteradamente. Os primeiros sinais são secretados pelo ectoderma oral iniciando assim a odontogênese. Os sinais do mesênquima controlam o crescimento e a dobra do epitélio e também induzem a formação de centros de sinalização no epitélio, nos quais são ativados muitos genes que codificam sinais das moléculas. Um exemplo é o estágio de Casquete nos dentes, que expressam mais de dez sinais diferentes. Como resultado dessa sinalização, numerosos fatores de transcrição têm sido identificados como os alvos dos tecidos. Um exemplo é o DNP no início da morfogênese dentária fazendo com que o fator de transcrição Msx1 (Muscle Segment Homeobox 1) se expressasse no mesênquima. FGF (Fibroblast Growth Factors) também induz Msx1. Os numerosos fatores de transcrição têm sido descobertos, os quais são ativados no mesênquima como resultado do BMP (Bone Morphogenetic Protein) e do FGF (Fibroblast Growth Factors), assim como de outros sinais do epitélio (JERNVALL, J., THESLEFF, I. 1981). 2.10.6 Mutações Gênicas É evidente que todos os genes envolvidos com a rede de sinais são importantes para o desenvolvimento normal dos dentes. Camundongos geneticamente manipulados têm sido usados para experiências com diversos genes. Nesses camundongos, um determinado
38 gene é inibido e sua importância para o desenvolvimento pode ser analisada. O primeiro gene que se demonstrou essencial para o desenvolvimento dentário em camundongos foi o Msx1. Mais tarde mutações no MSX1 humano foram relacionados com oligodontia autossômica dominante. Nessas pessoas o desenvolvimento dentário é interrompido no estágio de botão. Msx1 é manifestado no mesênquima dentário e sua falta de expressão resulta na não manifestação do Bmp4 (Bone Morphogenetic Protein 4) e Fgf3 (Fibroblast Growth Factor 3), os quais agem como sinais recíprocos no epitélio. Foi demonstrado por BEI et al. (2000) que Bmp4 quando adicionado à culturas de Msx1 mutantes nos germes dentários, podem restituir o desenvolvimento dentário. Conclui­se que mutação de um componente (MSX1) interrompe o desenvolvimento, mas isso pode ser compensado pela introdução de seu alvo posterior (BMP4). Seguindo os mesmos passos da experiência com o Msx1, outros genes como Pax9, Left1 também foram demonstrados essenciais no desenvolvimento dentário. Deve­se observar que genes que regulam o desenvolvimento são usados com vários objetivos, no embrião, ou seja, uma mutação em um gene deve causar defeitos em diferentes tecidos e órgãos. Não existem exemplos de genes regulatórios que atuem somente no desenvolvimento dentário. Experiências com camundongos provam que quando a função gênica é bloqueada em ambas as cópias de um gene, agenesias dentárias vêem sempre acompanhadas de malformações em outros tecidos levando o camundongo à morte, por problemas em algum órgão vital. Em humanos, o mesmo acontece, porém, se apenas uma cópia do gene foi bloqueada, como num exemplo com mutações com o MSX1 ou PAX9, somente ocorreriam defeitos dentários. Entretanto, assim como ocorre com os camundongos, um exame mais minucioso poderia mostrar defeitos em outros órgãos. Para a escolha de genes candidatos, o conhecimento do papel biológico desses potenciais genes se faz necessário. Padrões de expressão em modelos animais e humanos são alguns dos fatores que devem ser considerados (VIEIRA, 2001).
39 Dentre os vários genes expressos, durante o desenvolvimento dentário, dois se destacam: mutações nos genes MSX1 e PAX9, estão associados com uma forma familiar, esporádica e não sindrômica de agenesia dentária. As proteínas produzidas por esses genes, servem como fatores de transcrição que são responsáveis pela troca de informações entre os tecidos dentais e são essenciais, para o estabelecimento do potencial odontogênico do mesênquima em resposta a sinais do epitélio (PETERS e BALLING, 1999). 2.10.7 MSX1 (Muscle Segment Homeobox 1) A família MSX de genes HOX de vertebrados foi originalmente isolada por homologia com a família de genes Msh (muscle segment homeobox) da Drosophila. Uma classe de MSX de genes Homeobox, o MSX1, localizado em 4p16 foi identificado em humanos (HILL et al. 1989). SATOKATA e MASS (1994) prepararam camundongos geneticamente modificados, os quais apresentavam ausência da função do gene Msx1, para determinar as conseqüências da deficiência desse gene na embriogênese dos vertebrados. Todos esses camundongos manifestaram uma deficiência do osso alveolar, mandibular e maxilar, fenda palatina e falha no desenvolvimento dos incisivos e paralisação do desenvolvimento dos molares no estágio de botão. Msx1 então tem um papel crítico na mediação das interações epiteliais e mesênqüimais durante o desenvolvimento ósseo e dentário. Camundongos com deficiência do gene Msx1 serve como modelo para fenda palatina e outras desordens no desenvolvimento crânio facial em humanos com deficiência no gene MSX1. Fica claro que em camundongos o fator de transcrição, Msx1 tem interação direta com o mesênqüima – epitélio iniciando a formação dentária JOWET et al. (1993). Em humanos, o MSX1 é expresso no mesoderma, ectoderma, nas válvulas cardíacas, mandíbula, arco hióide, olhos, germes dentários, glândulas salivares e membros (THESLEFF, 1998). A primeira mutação no MSX1 associada com agenesia dentária em humanos foi descrita por VASTARDS et. al (1996). Através de análises de ligação genética em uma
40 família com uma forma de oligodontia severa autossômica dominante não sindrômica, onde os indivíduos afetados apresentavam ausência congênita de segundos pré­molares e terceiros molares, os autores encontraram substituição do aminoácido Arginina por uma Prolina, no cromossomo 4p16.1, onde MSX1 está localizado. Os autores propuseram que a agenesia de grupos de dentes descritos por eles podem indicar que a função do gene MSX1 é crítica para o desenvolvimento normal de dentes específicos. O gene defeituoso produzia uma proteína mutante com uma estrutura anormal quando comparada com uma proteína normal. Análises funcionais mostraram que a capacidade de interações dessa proteína defeituosa com outros fatores de transcrição estava comprometida. Essa foi a primeira evidência de que a estrutura dentária é controlada por fatores de transcrição específicos (HU et al. 1998). VASTARDIS (1996) estudando outras quatro famílias não identificou mutação no gene MSX1 como a causa das ausências congênitas de incisivos laterais e segundos pré­ molares e incisivos laterais e caninos. Segundo JERNVALL e THESLEFF (2000) o desenvolvimento individual dos dentes envolve interações epiteliais – mesênqüimais que são mediadas por sinais compartilhados com outros órgãos. Parte dos detalhes moleculares dessa rede de sinais já foi estabelecida, particularmente os sinais das famílias BMP, FgF, Hh e Wnt, a maioria tendo sido identificada por análise da expressão dos genes e suas respostas em camundongos com desenvolvimento dentário suspenso. Evidências recentes sugerem que a mesma cascata de sinais é usada reiteradamente durante o desenvolvimento dentário. A determinação sucessiva da região do dente, o tipo de dente, coroa dentária e cúspides, envolve sinais que regulam o crescimento do tecido e sua diferenciação. O tipo de dente parece ser determinado por sinais epiteliais e envolve ativações diferenciadas dos genes no mesênquima. Esses sinais diferenciados podem ter permitido a divergência de forma dos quatro tipos de dentes. van den BOOGARD et al. (2000), estudaram uma família alemã com agenesia dentária e fendas palatina e labial, identificando uma substituição no gene MSX1, de uma
41 citosina (C) por uma adenina (A). Onze indivíduos afetados nessa família tinham ausência congênita dos quatro segundos pré­molares e dos terceiros molares, ou seja, um padrão semelhante de agenesia dentária encontrado no estudo de VASTARDIS et al. (1996) e no modelo animal de SATOKATA e MAAS (1994). Isso indica que MSX1 é um gene candidato, cujas mutações são responsáveis, não somente por agenesias dentárias, mas também por fenda palatina e labial não sindrômica. Síndrome de Witkop é uma desordem rara autossômica dominante, que provoca ausência severa de dentes. Para identificar o gene responsável pela síndrome, JUNLONGRAS et al. (2001), fizeram uma análise com genes candidatos em uma família com três gerações afetadas pela doença. Como mutações no MSX1 já haviam sido associadas com agenesias dentárias em duas famílias diferentes (VASTARDIS et al. 1996, van den BOOGARD et al. 2000), os autores o consideraram como um gene fortemente candidato para a síndrome de Witkop. Em um estudo de ligação, foram encontrados resultados positivos para marcadores próximos de MSX1 nos pacientes afetados dessa família, o que associa mutação no MSX1 com a síndrome de Witkop. Em um trabalho anterior, NIEMINEN et al. (1995), usando micro satélites dentro do gene MSX1 em 4p16 não encontraram correlação com a hipodontia de incisivos laterais, segundos pré­molares após estudarem cinco famílias finlandesas com vinte indivíduos afetados. Um grupo de São Paulo, Brasil, não encontrou nenhuma mutação na região do homeodomínio do MSX1 em vinte indivíduos com diferentes tipos de hipodontia, concluindo que esse gene deve ter um efeito altamente seletivo na dentição, tendo sido identificado somente em agenesias autossômicas dominantes de segundos pré­ molares e terceiros molares (SCAREL et al. 2000). Isso sugere que a mutação encontrada por VASTARDIS et al. (1996), deve explicar apenas uma pequena percentagem de casos de agenesias dentárias. LIDRAL e REISSING (2002) estudaram 92 indivíduos com agenesias dentárias, com o objetivo de verificar se mutações no gene MSX1 seriam causas comuns dessas anomalias. Os resultados demonstraram que apenas dois casos tinham um modelo de
42 agenesia similar aquelas descritas em estudos anteriores (ausência de 3os molares e 2os pré­molares), sugerindo que mutações em MSX1 são responsáveis por um modelo específico de agenesia dentária. Uma característica de agenesia provocada por mutações no gene MSX1, é o grande número de dentes ausentes nos indivíduos afetados. Nos casos de mutações do gene MSX1 percebe­se também uma diminuição dos dentes mais posteriores de cada série. Estas observações sugerem que o gene MSX1 tem também um papel na morfogênese dentária. LIDRAL e REISSING (2002), concluem que mutações no gene MSX1 resultam em um modelo específico de agenesia dentária hereditária, e a causa para casos de agenesia dentária mais comuns, quando somente um ou mais dentes estão ausentes, não são explicadas por mutações do gene MSX1. Não foram encontradas mutações do gene MSX1 em casos mais comuns de agenesia como de incisivos e pré­ molares indicando que estas têm uma etiologia diferente. Nesse estudo, oito indivíduos tinham fenda labial ou fenda palatina associada a agenesia dentária. Entretanto, nenhuma mutação no gene MSX1 foi encontrada nesses indivíduos, sugerindo que as fendas eram causadas por outros fatores. Para explicar porque somente certos dentes (pré­molares e terceiros molares) estão ausentes em famílias com mutações no gene MSX1, SHARPE (1995), sugere que MSX1 seja parte de uma combinação homobox­gene code que pode definir modelo de diferentes grupos de dentes nas arcadas. Embora isso seja possível, THESLEFF (1996) sugere que uma hipótese alternativa também é plausível, ou seja, essa forma de agenesia de grupos específicos de dentes pode talvez estar relacionada com o tempo do desenvolvimento. Esses dentes, juntamente com os incisivos laterais são os mais comumente ausentes e são os últimos a se desenvolver a partir do tecido dentro de cada família de dentes (incisivos, caninos, pré­molares e molares). É possível que defeitos na função do MSX1 pode progressivamente atrapalhar o processo da morfogênese dental e ter um efeito maior nos dentes que se desenvolvem mais tarde. Em brasileiros, VIEIRA et al. (2004), encontraram evidência de associação entre agenesias dentárias com história positiva na família e MSX1, o que sugere um papel desse gene nos casos não­esporádicos.
43 2.10.8 PAX9 (Paired Box 9) PAX9 é um membro de uma família de nove diferentes fatores de transcrição localizado em humanos em 14q12q13, e é expresso no mesênquima derivado da crista neural dos arcos maxilar e mandibular, o que contribui pra a formação do palato e dos dentes (DEUTSCH et al. 1988) PETERS et al. (1998), estudando camundongos geneticamente modificados com deficiência em Pax9, demonstraram que o PAX9 é essencial para o desenvolvimento de vários órgãos e elementos esqueléticos. Enquanto camundongos heterozigotos, não apresentaram nenhum problema evidente, camundongos homozigotos para o mutante de Pax9 morrem rapidamente após o nascimento, devido a problemas respiratórios, provavelmente conseqüência da fenda palatina. Esses animais não apresentam timo, glândulas paratireóides e órgãos derivados das porções faríngeas. Todos os membros apresentam polidactilia pré­axial, além de distúrbios na formação crânio­facial e do esqueleto, e ausência de todos os dentes, cujo desenvolvimento é interrompido na fase de botão. A primeira mutação PAX9 foi descrita por STOCKTON et al. (2000). Os autores relataram que o gene MSX1 foi associado à agenesia de segundos pré­molares e terceiros molares em estudos prévios. Entretanto, foi excluído o envolvimento do MSX1 em outras formas de agenesias dentárias como a de segundos pré­molares e incisivos laterais ou incisivos laterais e caninos. STOCKTON et al. (2000), estudaram uma família de indivíduos caracterizada por possuir uma forma única de oligodontia de forma autossômica dominante. Os indivíduos afetados possuíam uma dentição decídua normal e a ausência da maioria dos molares permanentes. Alguns indivíduos também apresentavam ausência de segundos pré­molares superiores e/ou inferiores assim como incisivos centrais inferiores. Os resultados indicaram que uma mutação estrutural no PAX, estava associada com agenesia dentária. Tendo em mente os achados no modelo animal de PETERS et al. (1998),
44 os afetados da família estudada por STOCKTON et al. (2000), não apresentavam anomalias em membros e nenhuma evidência de alteração no metabolismo do cálcio ou comprometimento do sistema imune. No estudo de NIEMINEN et al. (2001), é feita uma associação em uma família finlandesa, entre mutação no gene PAX9 e agenesia de segundos e terceiros molares e a maioria dos primeiros molares, ausência parcial de segundos pré­molares, além de redução do tamanho de outros dentes. Também GOLDEMBERG et al. (2000), descreveram uma família com uma forma não sindrômica de oligodontia principalmente envolvendo dentes permanentes posteriores, não encontrando envolvimento com defeitos na região do MSX1, o que estreitou ainda mais os fenótipos que poderiam ser associados com o MSX1. Resultados de estudos de ligação associaram uma mutação no fator de transcrição PAX9 com essa forma de oligodontia. Mais recentemente, num estudo de FRAZIER­BOWERS et al. (2002), com uma grande família associou­se uma mutação no PAX9 com oligodontia envolvendo agenesia da maioria dos molares. Os autores observaram a inserção de uma citosina no nucleotídeo 793 no exon 4 do PAX9 o que levou a remoção de 25 aminoácidos e adição de 51 outros não presentes na proteína original. Esse trabalho de FRAZIER­BOWERS et al. (2002), sugere que a mutação encontrada no PAX9 nesta família foi completamente penetrante, uma vez que todos os membros da família com a mutação tinham oligodontia de molar. Uma família em que o pai e a filha são afetados com hipodontia severa envolvendo agenesia de todos os molares decíduos e permanentes, foi associada com a anulação do gene PAX9, por PARIMAL et al. (2002). MOSTOWSKA et al. (2003), identificaram uma pessoa sem história familiar de agenesia dentária com mutação no PAX9. Esse indivíduo com ausência de terceiros molares, segundos pré­molares e vários incisivos, lembrava fenótipos associados com mutações do MSX1.
45 Ao se identificar diferentes tipos de mutações no PAX9 com casos de anodontia de molares permanentes em diversas famílias, conclui­se que esse gene é extremamente importante para o desenvolvimento desses dentes. E também, modelos similares de agenesia dentária podem acontecer à partir de diferentes mutações no mesmo gene (FRAZIER­BOWERS et al., 2002). Vários estudos enfatizam a importância do MSX1 e PAX9 no desenvolvimento dentário e sugere que mutações nesses genes são responsáveis por um modelo específico de agenesia dentária hereditária. Haploinsuficiência da proteína produzida pelo MSX1 afeta o desenvolvimento de todos os dentes, preferencialmente terceiros molares e pré­molares (VASTARDIS et al. 1996, JUMLONGRAS et al. 2001, LIDRAL e REISSING, 2002), enquanto reduzidas quantidades da proteína produzida pelo PAX9 afeta o desenvolvimento de molares (STOCKTON et al. 2000, NIEMINEN et al. 2001, DAS et al. 2003). As variações observadas no modelo da agenesia dentária sugerem que outros produtos de genes mutantes atuem do mesmo modo que o MSX1 e o PAX9, podendo influenciar no modelo de dentição. Outro trabalho de FRAZIER­BOWERS et al. (2002), em um estudo com duas famílias não confirmaram mutações no PAX9 como o agente causador, ficando claro que outros genes são responsáveis por outros casos de oligodontia de molar. Modelos em animais sugerem que fatores genéticos específicos devem estar envolvidos com grupos específicos de dentes durante os seus desenvolvimentos. Por exemplo, em camundongos com deficiência dos genes Dlx1 e Dlx2, os molares superiores não se desenvolvem embora os incisivos e os molares inferiores sejam normais. VIEIRA et al. (2004), encontraram evidência de que o PAX9 interage com o MSX1 em casos de agenesia dentária, o que suporta a hipótese de influência poligênica para esse defeito. Recentemente uma forma distinta de agenesia dentária envolvendo de poucos até todos os dentes permanentes em uma família chinesa, foi associada ao cromossomo 10g 11.2 (LIU et al. 2001).
46 Além desses locais, já conhecidos, NIEMINEM et al. (1995), e ARTE et al. (1996), sugerem um local distinto e desconhecido associado com hipodontia em várias famílias com incisivos e pré­molares ausentes, e excluíram várias regiões de genes candidatos já conhecidos, incluindo MSX1, MSX2, EGF, EGFR e FGF3. Outros genes certamente são potenciais candidatos à agenesia em humanos, como por exemplo, BMP2, BMP4, BMP7, DLX2, DLX5, FGF1, FGF2, FGF4, FGF8, FGF9, LEF1, GLI2 e GLI3, entre outros que fazem parte do estágio inicial da formação dentária (NEUBÜSER et al. 1997). Existem ainda outros genes humanos comprovadamente envolvidos com agenesia dentária (Quadro 2). Quadro 2: Alguns Genes Humanos envolvidos com Agenesia Dentária GENE Hereditariedade Localização do Cromossomo EDA­1 Ligada ao sexo Xq12.2­q13.1 EDA­2 Autossômico recessivo 2q11­q13 EDA­3 Autossômico dominante 2911­q13 MSX­1 Autossômico dominante 4p16.1 PAX­9 Autossômico dominante 14q12­q13 Baseado em evidências existentes, parece possível que ambas hipodontia e oligodontia tenham características heterogêneas, causadas por vários defeitos genéticos independentes, os quais atuam sozinhos ou combinados com outros genes e levam para fenótipos específicos (VIEIRA, 2003). Defeitos em MSX1 e PAX9 causam agenesia dentária severa (oligodontia), mas nenhum relato existe sobre esses genes estarem associados com agenesia dentária menos severa (hipodontia).
47 2.11 Como Estudar Genes (Tipos de Estudo) Pesquisadores têm dado preferência ao estudo de formas isoladas de agenesia dentária, sem ligação com síndromes, na esperança de encontrar mais facilmente quais os genes envolvidos na formação dentária e suas funções. Para descobrirmos a causa de uma anomalia, precisamos localizar o gene defeituoso no genoma humano. A determinação de genes candidatos para agenesia dentária resulta de estudos em organismos modelos, de estudos de ligação, de evidências citogenéticas ou de estudos demonstrando a expressão do gene durante o desenvolvimento dentário (MURRAY, 1995). Uma distribuição desigual de variantes genéticas destes genes candidatos nas populações caso e controle, podem indicar o papel de um gene candidato numa determinada anomalia (LANDER & SCHORK, 1994). Portanto, estudos de genes candidatos parece ser a melhor estratégia para a identificação de genes envolvidos na etiologia de algumas doenças, nos quais estudos de ligação baseados em um padrão familiar são comprometidos pela falta de acesso aos membros afetados, penetrância reduzida e heterogeneidade genética (LIDRAL et al. 1997). Fica claro que estudar genes candidatos para agenesia dentária é o mais adequado, levando­se em consideração o custo reduzido em comparação com uma busca por todo o genoma. Antes de 1980, não haviam métodos estabelecidos para ligar condições hereditárias com a genética molecular responsável por essas condições. A descoberta de marcadores genéticos através do genoma humano e o desenvolvimento de sofisticados métodos estatísticos para relacionar os marcadores com a doença, tornou possível ligar um trecho do DNA com uma característica herdada. Avanços no Projeto Genoma Humano nos últimos anos tem tornado possível mapear condições hereditárias como agenesia dentária familiar. Mesmo nos casos de agenesia dentária familiar que são transmitidas com características autossômicas dominantes, achados clínicos variam significantemente. Isso sugere que há vários genes defeituosos que podem causar agenesia dentária familiar.
48 As técnicas de bandeamento permitem a identificação de cada par individual de cromossomos (PINKHAN, 1996). Através do microscópio pode­se observar se existem deleções ou duplicações cromossômicas. Já os genes são muito pequenos para serem visualizados através do microscópio e por isso são estudados por meios celulares e bioquímicos. Atualmente, mapeamento de doença foi facilitado pela identificação de micro satélites marcadores altamente polimórficos, que podem ser facilmente analisados por uma reação em cadeia de polimerase (PCR). Através de estudos de ligação genética é possível identificar o local de um gene defeituoso no cromossomo. Por meio de estudos de ligação, verifica­se se dois traços co­segregam dentro das famílias, o que sugere que estejam próximos fisicamente (VASTARDIS, 2000). VASTARDIS (1996) teve como objetivo, determinar se duas características genéticas (um marcador genético, no caso o DNA polimorfismo de localização conhecido no cromossomo) e a agenesia dentária são segregados separadamente ou se co­segregam, o que sugere que estão localizados próximos fisicamente. Genes com proximidade física, isto é, localizados próximos uns aos outros, são passados juntos dos pais para os filhos. Por isso, co­segregação de um fenótico como agenesia dentária e um marcador conhecido, sugere que essas características genéticas estão próximas umas das outras, na mesma região do cromossomo, proporcionando ao mesmo tempo, o local do gene defeituoso. Quando esse local é identificado em uma família o passo seguinte é determinar se a mesma localização no cromossomo de outras famílias também causará agenesia dentária. E ainda, se mutações diferentes no mesmo gene ou mais de um gene defeituoso (em diferentes cromossomos) causam a mesma anomalia. Também se vários genes atuam juntos causando o mesmo problema, subseqüentemente, retomando ainda mais, será possível identificar, através da localização no cromossomo, qual o gene e qual a mutação que produz determinada anomalia. VASTARDIS (1996) usou essa estratégia em uma família que apresentava agenesia autossômica dominante de segundos pré­molares e terceiros molares descobrindo em qual cromossomo o gene defeituoso estava localizado, qual gene era esse, e o que nesse gene
49 causava a anomalia. Ou seja, VASTARDIS (1996) identificou um local no cromossomo 4 p onde residia o gene responsável pela agenesia dental. Subseqüentemente ele detectou uma mutação no ponto do gene MSX1 de todos os membros afetados da família estudada. Testando cinco outras famílias que apresentavam outros dentes ausentes, ficou claro que defeitos em vários genes contribuem para a anomalia. Os estudos de ligação são ideais para a identificação de loci relacionados a um traço genético, porém é necessária a coleta de famílias com vários membros afetados, o que é altamente dispendioso (VIEIRA, 2001). Além disso, este é o método ideal para estudo de traços mendelianos simples. Para casos de heterogeneidade genética, os estudos de ligação não são eficazes, devido à dificuldade de encontrar um modelo preciso que explique adequadamente o padrão de herança (MURRAY, 1995). Com os estudos de associação pode­se verificar se um determinado alelo e a anomalia estudada mostram uma correlação. Em caso positivo, pode­se afirmar que esse alelo é a causa da doença (LANDER & SCHORK, 1994). Os estudos de associação podem ser feitos em populações de indivíduos não aparentados, o que facilita as pesquisas. Os testes de desequilíbrio de transmissão (TDT) foram originalmente propostos como um acompanhamento de marcadores associados com uma doença, detectados previamente em estudos de caso­controle, porém são igualmente válidos, ainda que evidência prévia para uma associação não esteja presente (SPIELMAN et al. 1993). Os testes de desequilíbrio de transmissão (TDT) são muito mais eficazes para serem aplicados em situações de alta heterogeneidade genética, penetrância diminuída e expressividade variável (LIDRAL et al. 1997). Dentre os vários genes expressos durante o desenvolvimento dentário, o MSX1 (Muscle Segment Homeobox Factor 1) e o PAX9 (Paired Box Factor 9) foram escolhidos para a realização deste trabalho.
3 PROPOSIÇÃO
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Avaliar a prevalência de hipodontia em uma amostra dos pacientes atendidos no Programa de Treinamento Teórico­Prático em Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de uma instituição pública de ensino superior.
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Verificar o gênero mais afetado pela anomalia e o número de dentes mais ausentes.
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Verificar qual arcada e o lado da arcada, assim como o lado do rosto mais afetado por agenesia dentária não­sindrômica.
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Verificar se são encontradas mais agenesias dentárias unilaterais ou bilaterais.
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Verificar qual o grupo de dentes e quais os elementos dentários mais freqüentemente ausentes.
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Verificar a existência de mutações no gene MSX1 em casos de agenesia dentária isolada leve (hipodontia).
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Verificar a existência de mutações no gene PAX9 em casos de agenesia dentária isolada leve (hipodontia). Hipóteses:
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Mutações no gene MSX1 causam agenesia dentária isolada menos severa (hipodontia) em humanos.
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Mutações no gene PAX9 causam agenesia dentária menos severa (hipodontia) em humanos.
4 MATERIAIS E MÉTODOS 4.1 Amostra e Método Entre agosto de 1997 e dezembro de 2004, o Programa de Treinamento Teórico Prático em Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de uma instituição pública de ensino superior, acumulou uma documentação correspondente a 2400 pacientes entre 6 e 12 anos, a faixa etária atendida pelo Programa (sem restrição de gênero ou etnia). O critério para seleção da amostra baseou­se na condição de que as fichas contivessem uma radiografia panorâmica com boa qualidade técnica, possibilitando a visualização de todos os elementos dentários e estruturas circunvizinhas. Três examinadores, supervisionados pelo pesquisar, procederam à avaliação das radiografias, com o auxílio de negatoscópio medindo 13cm x 37cm coberto com moldura de cartolina preta em condições de eliminação ideal, isto é, em uma sala cuja única luz era a do negatoscópio e lupa. Dessas, foram excluídos os pacientes que apresentassem qualquer tipo de síndrome e também aqueles nos quais não foi possível um diagnóstico confiável de agenesia dentária, devido à idade dentária atrasada ou falta de informação segura dos pais e/ou probando em relação à extração ou não do dente em questão. Através desse processo reduziu­se para 1034 as fichas em condições ideais. Dentre essas foram selecionados 39 pacientes com ausência congênita de pelo menos 1 dente permanente com exceção dos 3os molares. Estes dentes não foram considerados devido à dificuldade de diagnosticar sua ausência em indivíduos jovens. Para a primeira parte desse trabalho, ou seja, para efeito do estudo epidemiológico, foram considerados esses 39 pacientes. Para a segunda parte desse trabalho, ou seja, estudar genes candidatos para agenesia isolada, foram selecionados mais 116 pacientes provenientes de Clínicas Odontológicas privadas da cidade do Rio de Janeiro (Rio de Janeiro, Brasil), com a idade
52 variando de 6 a 50 anos, que somados aos 39 indivíduos previamente selecionados do Programa de Treinamento Teórico Prático em Odontopediatria da Faculdade de Odontologia, totalizou 155 probandos (indivíduos). Esse estudo foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa do Hospital Universitário Clementino Fraga Filho (HUCFF) (Anexo 3) e pela Comissão Nacional de Ética em Pesquisa do Ministério da Saúde do Brasil (CONEP) (Anexos 4 e 5). Após isso, todos os pacientes selecionados, bem como seus pais, que apresentavam ou não agenesias dentárias, foram convidados para que se pudesse fazer a coleta do DNA. Todos os envolvidos no projeto só eram considerados aptos a participar após ler, discutir, entender e assinar o “Termo de Consentimento Livre e Esclarecido” (Anexo 1). Crianças entre 6 e 14 anos deveriam também ser apresentadas ao estudo e assinar o documento “Consentimento de Menores” (final do Anexo 1), além da necessidade de seus pais também assinarem o consentimento. Para cada família, foi preenchida uma ficha clínica apropriada (Anexo 2) nas quais constavam informações sobre o tipo de agenesia dentária de cada membro da família e o seu respectivo heredograma. Por questões éticas, na ficha clínica e para a identificação da amostra biológica era utilizado um código para indicação do probando, da mãe e do pai. Além disso, cada família foi identificada através de um número entre 1 e 155. 4.2 Coleta de Dados das Agenesias Dentárias Das radiografias obtidas, as agenesias dentárias foram separadas: Quanto ao gênero. Por quadrantes. Quanto à maxila e mandíbula. Quanto ao lado direito e esquerdo. Quanto ao grupamento dentário afetado (incisivos, caninos, pré­molares ou molares). Se unilaterais ou bilaterais.
53 4.3 Métodos Estatísticos Os dados coletados foram submetidos ao teste X2 (qui­quadrado) a nível de 5% de significância. A análise de regressão (ANOVA) explicou a associação das variáveis para o desfecho da agenesia dentária, a nível de 5% de significância. 4.4 Coleta de Material Biológico A coleta de material biológico foi realizada através da extração de células da mucosa da bochecha com uma escova citológica (CYTO – PAK Cytosoft tm Brush Medical Packaging Corporation, Camarillo, CA, EUA) (Figura 1) apropriada que, segundo RICHARDS et al. (1993), é o meio mais adequado de coleta de DNA de uma grande população com uma melhor relação custo­benefício. Além disso, uma correlação de 100% entre os resultados de DNA de células da bochecha e do sangue e um padrão de sucesso na amplificação por Reação de Cadeia de Polimerase (PCR) de 99% foram observados. Outra vantagem deste método de coleta de DNA é evitar a necessidade de uma punção venosa, o que o torna mais aceito pelos pacientes e evita a exposição dos profissionais de saúde e dos técnicos de laboratório a patógenos nocivos. Os procedimentos para a coleta de células da mucosa da bochecha seguiram o protocolo padrão, ou seja, a coleta foi feita com o paciente sentado e com a cabeça apoiada em um local iluminado por luz natural, respeitando­se todas as normas de biosegurança. A escova foi girada firmemente contra a mucosa jugal direita, por 30 segundos Após a coleta, a escova foi inserida na embalagem protetora, na qual foram escritos a data e os códigos da família e membro desta. Os mesmos procedimentos foram realizados com o uso de uma segunda escova na mucosa jugal esquerda (RICHARDS et al., 1993). De acordo com SCAREL et al. (2002), células do epitélio bucal são uma fonte segura de DNA para o seqüenciamento direto de produtos de Reação de Cadeia de Polimerase
54 (PCR) Além de ser um procedimento de fácil execução, pode ser usado em larga escala na população. Seqüenciamento é a identificação das letras (bases) químicas que compõem cada gene humano. Os swabs foram então armazenados a 20ºC negativos até o envio pelo correio (Federal Express Corporation), para o Centro de Pesquisa de Anomalias Crânio­Faciais do Departamento de Pediatria de Iowa (EUA), onde o material foi armazenado em um freezer no laboratório localizado na sala 2182 do edifício Medical Laboratories no campus da Universidade de Iowa. A sala 2182 possui acesso limitado a funcionários que se utilizam de cartão magnético individualizado. O freezer também possui acesso restrito, e é mantido fechado a chave. Todas as amostras armazenadas apresentavam unicamente o código de identificação. Figura 1: Swab do Tipo Escova Citológica – Cytosoft tm Brush 4.5 Análise Laboratorial Em até dois dias após o recebimento dos swabs, foi realizada a extração do DNA. A extração foi feita em uma das escovas de cada indivíduo (Anexo 6) e a outra era congelada a ­70ºC. Após isso, uma porção de DNA extraído era identificada e estocada também a ­70ºC para eventual necessidade futura (conforme previsto no estudo de MEIRA, 2002) para
55 uso por outros pesquisadores. O restante do material era colocado em uma placa acrílica com 96 orifícios para uso imediato no laboratório. 4.6 Seqüenciamento do DNA As amostras de DNA foram inicialmente amplificadas por reação em cadeia de polimerase (PCR) (SAIKI et al. 1985), usando­se dois marcadores microsatélites altamente polimórficos para assegurar que não existia nenhum erro de identificação e que o material era passível de ser amplificado por Reação de Cadeia de Polimerase (PCR). Nos momentos em que a amplificação por PCR não obtinha sucesso, novas extrações eram realizadas usando­se a escova estocada. Todos os reagentes utilizados são os comumente encontrados no mercado nos Estados Unidos e os “primers” foram sintetizados no Centro de DNA, o qual serve os laboratórios da Universidade de Iowa (EUA). Reações de Cadeia de Polimerase (PCR) foram feitas usando­se o equipamento Gene Amp’PCR System 9700, Perkin Elmer., EUA. (Figura 2) Figura 2: Equipamento Utilizado para a Realização e Reações em Cadeia de Polimerase (PCR) (Gene Amp’PCR System 9700, Perkin Elmer, EUA).
56 No presente estudo foram amplificadas as regiões codificantes dos genes MSX1 e PAX9 utilizando­se “primers” previamente publicados (FRAZIER­BOWERS et al. 2002, LIDRAL & REISSING, 2002). 4.6.1 MSX1 (Muscle Segment Homeobox) O marcador polimórfico CA, um dinucleotídeo citosina­adenina com cinco alelos, localizado num único intron do gene MSX1 (Figura 3), foi amplificado com “primers” e Reações de Cadeia de Polimerase (PCR). Figura 3: Diagrama do Gene MSX­1 – Exons e Localização do Marcador CA do gene MSX1 e das Mutações Previamente Descritas na Literatura Relacionadas com Agenesia Dentária. G2125C – VASTARDIS et al. (1996). C752A – van den BOOGARD et al. (2001). C605A – JUNLONGRAS et al. (2001). T620A – LIDRAL e REISSING (2002).
57 4.6.2 PAX9 (Paired – Box) O marcador PAX 9 3’UTR (Figura 4), descrito originalmente por NISHIMURA et al. (1996), foi amplificado através de Reação de Cadeia de Polimerase (PCR). Figura 4: Diagrama do Gene PAX9 – Exons e Localização do Marcador 3’UTR do Gene PAX9 e das Mutações Previamente Descritas na Literatura relacionadas com Agenesia Dentária. InsG219 – STOCKTON et al. (2000). A340T – NIEMINEM et al. (2001). InsC793 – FRAZIER­BOWERS et al. (2002). Após a amplificação do DNA, os produtos foram purificados e reações de seqüenciamento foram realizadas de acordo com protocolo padrão (JEZEWSKI et al., 2003), isto é, foi realizado um seqüenciamento direto de ambos os genes, MSX1 e PAX9 usando o Prism® 3700 DNA Analyzer (Perkin­Elmer Applied Biosystems) procurando­se pela presença de mutações e SNPS (Single Nucleotide Polymorphsms ou polimorfismos de um único nucleotídeo) que poderiam ser apontados como uma das causas genéticas da ausência de dentes. O programa ABI sequence (versão 2.1.2.) foi utilizado para a análise das seqüências (Figura 5).
58 Figura 5: Equipamento utilizado para a realização da Reação em Cadeia de Polimerase (PCR) (ABI Prism®.7900 HT.Applied Biosystems, EUA). Esses dados foram armazenados em duas bases de dados, uma para os pesquisadores na Universidade Federal do Rio de Janeiro e outra para os pesquisadores no Centro de Anomalias Craniofaciais da Universidade de Iowa. Essas bases de dados foram protegidas por senha e seu acesso é restrito aos pesquisadores diretamente envolvidos com esse projeto. Esse estudo tem o potencial de gerar resultados que permitam fazer a previsão individual de risco genético para agenesia dentária.
59 5 RESULTADOS 5.1 Caracterização da Amostra Das 1034 radiografias examinadas, constatou­se agenesia dentária em 39 pacientes (3,77%), sendo 22 (56,41%) do gênero feminino e 17 (43,58%) do gênero masculino. A faixa etária variou entre 06 e 12 anos. 43,58% Feminino Masculino 56,41% Figura 6: Distribuição dos probandos portadores de agenesia dentária de acordo com o gênero. Na Tabela 1 observa­se que a amostra foi constituída de 515 crianças do gênero feminino e 519 crianças do gênero masculino num universo de 1034 pacientes. 22 (4,27%) probandos do gênero feminino e 17 (3,27%) do gênero masculino tinham agenesia dentária, totalizando 39 probandos. Aplicando o teste qui­quadrado (gl=1) podemos concluir que o gênero não tem influência significativa (p=0,13) na presença de agenesia dentária.
60 Tabela 1: Distribuição de freqüência dos pacientes com agenesias dentárias, relacionando­a com o gênero Gênero Número de Pacientes Pacientes com Agenesias Dentárias Freqüência Feminino 515 22 4,27% Masculino 519 17 3,27% Total 1034 39 3,77% Teste qui­quadrado: p>0,05 Em relação a freqüência absoluta e relativa na Tabela 2 observamos que 43 (45,26%) casos de agenesia dentária ocorreram na maxila e 52 (54,73%) na mandíbula. Em relação ao lado, observamos no lado direito a presença de 51 (53,68%) ocorrências de agenesias dentárias enquanto no lado esquerdo tivemos 44 (46,31%). Tabela 2: Avaliação geral dos pacientes em relação a arcada e lado do rosto de acordo com a presença de agenesia dentária nos pacientes do Programa de Treinamento Teórico Prático em Odontopediatria Variáveis Com anodontia Maxila 43 (45,26%) Mandíbula 52 (54,73%) Direito 51 (53,68%) Esquerdo 44 (46,31%) Arcada Lado Para o lado direito da maxila encontrou­se em relação à freqüência absoluta e relativa, conforme a Tabela 3, 23 casos de agenesia dentária perfazendo um total de 53,48% e para o lado esquerdo, foram constatados 20 casos de agenesia dentária (46,51%).
61 Do total geral de casos de agenesia dentária observados na mandíbula, os números totalizavam para o lado direito 28 casos (53,84%) e para o esquerdo 24 casos (46,15%). (Tabela 3)
Tabela 3: Prevalência de agenesias dentárias de acordo com os lados direito e esquerdo das arcadas Direito % Esquerdo % Maxila 23 53,48 20 46,51 Mandíbula 28 53,84 24 46,15 A presença de agenesias unilaterais e bilaterais sugere uma associação ao arco sendo maior o número de agenesias unilaterais no arco mandibular e maior o número de agenesias bilaterais no arco maxilar. Foram encontrados um maior número de agenesias bilaterais do que unilaterais no presente estudo. (Tabela 4) Tabela 4: Distribuição das agenesias uni e bilaterais quanto ao arco maxilar e mandibular Arco Maxilar Mandibular Total Unilateral 6 21 27 Bilateral 18 16 34 Total 24 37 61 Tipo
A freqüência absoluta e relativa de números de dentes ausentes por probando pode ser verificada na Tabela 5. Observamos que esse número variou de 1 a 12; 19 crianças (48.71%) apresentavam um dente ausente; 9 crianças (23%) apresentavam dois dentes ausentes com um total de 18 dentes ausentes. Apenas 11 probandos (28,30%) apresentavam ausência de três ou mais dentes. Um ou dois dentes correspondem ao maior percentual de agenesias dentárias (71,78%). 62 Tabela 5: Número de dentes ausentes por probando Número de Dentes Ausentes Número de Pacientes % de Pacientes Total de Dentes 1 19 48,71 19 2 9 23,07 18 3 4 10,25 12 4 3 7,69 12 7 2 5,12 14 8 1 2,56 8 12 1 2,56 12 Total 39 100,00 95 Na Tabela 6, relacionando as agenesias dentárias de acordo com o grupo dentário, observa­se que 62,1% (n=59) correspondiam aos segundos pré­molares enquanto 12,6 (n=12) das ausências correspondiam ao grupo dos incisivos laterais e logo depois 11,5% (n=11) pelos primeiros pré­molares. Tabela 6: Distribuição das agenesias dentárias de acordo com o grupo dentário e sua localização no arco maxilar e no arco mandibular Incisivo Central Dente Lado Incisivo Lateral Canino Primeiro Pré­Molar Segundo Pré­Molar Primeiro Molar Segundo Molar TOTAL Arco D E D E D E D E D E D E D E Maxilar 0 0 5 3 1 2 3 3 13 11 0 0 1 1 43 Mandibular 1 2 2 2 1 2 2 3 21 14 0 0 1 1 52 TOTAL 1 2 7 5 2 4 5 6 34 25 0 0 2 2 95
63 Na Tabela 7 pode­se constatar que em toda a população de probandos estudada foi verificado um total de 95 dentes ausentes. O segundo pré­molar inferior direito (45) foi o dente mais vezes ausente, 21 vezes (22,10%) seguido pelo segundo pré­molar inferior esquerdo (35) 14 vezes (14,73%). No anexo 7 (pág.96) , pode ser verificado o(s) dente(s) congenitamente ausente(s) em cada probando do presente estudo.
64 Tabela 7: Número e freqüência dos dentes ausentes de acordo com sua localização DENTE N o DE DENTES AUSENTES PERCENTUAL (%) 17 1 1,05 16 0 0,00 15 13 13,68 14 3 3,15 13 1 1,05 12 5 5,26 11 0 0,00 21 0 0,00 22 3 3,15 23 2 2,10 24 3 3,15 25 11 11,57 26 0 0,00 27 1 1,05 37 1 1,05 36 0 0,00 35 14 14,73 34 3 3,15 33 2 2,10 32 2 2,10 31 2 2,10 41 1 1,05 42 2 2,10 43 1 1,05 44 2 2,10 45 21 22,10 46 0 0,00 47 1 1,05 TOTAL 95 100,00
65 Observa­se no Gráfico 1 que os segundos pré­molares foram os dentes mais ausentes na maxila, seguidos pelos incisivos laterais e depois pelos primeiros pré­molares. Gráfico 1: Gráfico da distribuição das agenesias dentárias da maxila DIREITO
ESQUERDO 40 35 30 25 20 13 15 11 10 5 5 3 0 0 1 2 3 3 0 0 1 1 0 Incisivo central Incisivo lateral Canino Primeiro pré­molar Segundo pré­ molar Primeiro molar Segundo molar Para a mandíbula, observa­se no Gráfico 2 que os dentes mais ausentes foram os segundos pré­molares, seguidos pelos primeiros pré­molares e depois pelos incisivos laterais.
66 Gráfico 2: Gráfico da distribuição das agenesias dentárias da mandíbula DIREITO ESQUERDO 40 35 30 25 21 20 14 15 10 5 1 2 2 2 1 2 Incisivo central Incisivo lateral Canino 2 3 1 1 0 0 0 Primeiro pré­molar Segundo pré­molar Primeiro molar Segundo molar De acordo com o modelo (modelo 1) e as Tabelas 8, 9 e 10 a agenesia dentária (variável desfecho) pode ser explicada pela associação aditiva das variáveis explicativas: gênero, total de agenesias dentárias na maxila, total de agenesias dentárias na mandíbula e se unilaterais ou bilaterais, sendo que o gênero e a condição unilateral ou bilateral mostraram menor influência sobre a agenesia dentária. Modelo 1: Total de ausência congênita = 4,969E­02 +­4,332E­02*gênero + 0,961*Mand_E+ 0,964*Mand_D + 1,004*Max_E + 1,001*Max_D + 8,442E­02*BILA
67 Tabela 8: Coeficientes da regressão Coeficiente não­ padronizado Modelo 1 Coeficiente padronizado Erro padronizado ,050 (Constante) 4,969E­02 B t Beta Sig. ,999 ,325 GÊNERO ­4,33E­02 ,055 ­,009 ­,784 ,439 MAND_E ,961 ,047 ,274 20,399 ,000 MAND_D ,964 ,040 ,319 23,875 ,000 MAX_E 1,004 ,071 ,362 14,136 ,000 MAX_D 1,001 ,074 ,333 13,557 ,000 8,442E­02 ,066 ,018 1,279 ,210 BILA a. Variável dependente: Total de ausências congênitas Tabela 9: Resumo do modelo R Modelo 1 R quadrado ajustado R quadrado ,998ª ,996 Erro estimado ,995 ,163 a. Variáveis explicativas: (Constante) BILA, MAND_D, MAX_D, MAND_E, MAX_E b. Variável dependente: Total de ausência congênita. Tabela 10: ANOVA do modelo Soma das quadrados Modelo 1 Regressão Resíduo Total Média dos quadrados df 212,713 5 ,877 33 213,590 38 F 42,543 1600,645 ,027 a. Variáveis explicativas: (Constante) BILA, MAND_D, MAX_D, MAND_E, MAX_E b. Variável dependente: Total de ausência congênita.
Sig. ,000 a 68 5.2 Associação dos Genes MSX1 e PAX9 com Agenesia Dentária Para a segunda parte deste trabalho, a amostra final constou de 155 probandos. Sendo 96 (61,9%) do sexo feminino e 59 (38,1%) do sexo masculino. A idade dos probandos variou de 06 a 50 anos. 5.3 MSX1 Não foi encontrada nenhuma mutação potencialmente patogênica em MSX1. 5.4 PAX9 Não foi encontrada nenhuma mutação potencialmente patogênica em PAX9.
6 DISCUSSÃO O complexo desenvolvimento das estruturas intra­orais sofre influências de uma longa lista de tendências naturais. Todo esse mecanismo pode ser anulado ou alterado por condições adversas, como as anomalias dentais congênitas, que são do conhecimento do Odontopediatra. O reconhecimento desses fatores anormais, durante as fases das dentições decídua e mista, pode permitir um planejamento do tratamento com prognóstico mais favorável. Em certos casos pode até minimizar a necessidade de intervenções extensas. Entretanto, o profissional só poderá desenvolver sua capacidade diagnóstica corretamente, frente às anomalias dentais de número, se estiver munido de exames complementares. Especificamente no caso das agenesias dentárias, torna­se essencial para diagnóstico, a utilização de radiografias abrangendo todos os dentes e estruturas circunvizinhas (DUNN, 1958, MAC RAE et al. 1968, SPYROPOULOS et al. 1979). Dessa forma, foi imprescindível selecionar os casos com radiografias panorâmicas, para a realização do estudo epidemiológico de agenesia dentária em pacientes atendidos no Programa de Treinamento Teórico­Prático em Odontopediatria da Faculdade de Odontologia de uma instituição de ensino superior num período de 7 anos. Sabendo­se que pacientes portadores de distúrbios genéticos e sistêmicos, tais como: displasia craniofacial, fissurados ou síndrome de Ellis­van­Creveld, são mais propensos à presença de agenesias dentárias (KEENE, 1966), esses casos foram retirados do estudo, uma vez que poderiam mascarar a verdadeira freqüência nos pacientes da amostra. Muita controvérsia existe em torno da etiologia das agenesias dentárias (SUAREZ e SPENCE, 1974), mostraram que a teoria mais largamente aceita consiste na hereditariedade.
70 Foi verificado, através da literatura, que as freqüências relativas a agenesias dentárias variam consideravelmente, e, que tal ocorrência depende de alguns fatores como: diferentes materiais e métodos de investigação. Assim, qualquer tipo de comparação entre resultados em estudos de freqüência só pode se realizado entre pesquisas efetuadas com material e método semelhantes. No Quadro 1 pág. 24 estão agrupados estudos de freqüência realizados por diversos pesquisadores. Em nossa pesquisa examinamos 1034 pacientes com radiografias panorâmicas de boa qualidade e encontramos uma percentagem de 3,77% de portadores de agenesias dentárias do total examinado conforme caracterização da amostra (pág. 59). A real freqüência dessa anomalia no arquivo da disciplina não pôde ser alcançada visto que de 2400 fichas clínicas, apenas 1034 (43,08%) apresentaram radiografias em condições que permitissem sua inclusão na amostra a ser estudada. Nossos resultados se aproximam bastante dos de ROSE (1966), como também dos de MULLER et al. (1970), o mesmo acontecendo com o de GLAVAN e SILVA (1995). Já GRAHNEN (1956), encontrou em 1006 escolares, uma prevalência de 6,1% de portadores de agenesias dentárias. GLENN (1964) em seu estudo com 1702 crianças observou um índice de 5% de prevalência de agenesias dentárias e sugeriu um aumento de prevalência de ausência congênita de dentes quando comparou seus dados com outros de trinta anos atrás. Nossos resultados atuais não estão de acordo com essa sugestão do autor. De uma maneira geral, nossos resultados são compatíveis com os obtidos por diversos autores que se preocupam com a prevalência de agenesias dentárias. A freqüência obtida neste trabalho encontra­se abaixo da média dos estudos na literatura pesquisada. Tal fato pode parecer estranho devido ao local onde a análise foi realizada. Sendo a disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia da UFRJ, um ponto de referência no atendimento odontológico infantil, alguns dos pacientes da amostra podem ter sido encaminhados à instituição com suspeita de presença da anomalia. Tal fato
71 não constitui uma tendenciosidade como sugeriram ISSÁO e KAHTALIAN (1968), pois os casos referendados para tratamento diluíram­se frente ao número total da amostra, ou seja, crianças que buscaram tratamento ao acaso. Alguns autores, como (ZHU et al. 1996, EGERMARK­ERIKSON e LIND, 1971, GRAZIOSI et al. 1985, MEIRA, 2002) afirmaram através de seus estudos de freqüência que existe uma predileção das agenesias dentárias pelo gênero feminino na proporção de 3:2 em relação ao gênero masculino. Nossos resultados apresentados na Tabela 1 pág.60, não confirmam essa tendência. Aplicando­se o teste do X2 , qui­quadrado, não houve diferença significativa quanto ao gênero. Também CLAYTON (1956), WOOLF (1971), EIDELMAN et al. (1973) e CHOSACK et al. (1975), em suas pesquisas, não encontraram diferença significante quanto ao gênero, confirmando os achados de DOLDER (1936). Encontramos em nosso trabalho 39 pacientes portadores de agenesias dentárias com um total de 95 dentes ausentes. Como ficou evidenciado pela Tabela 2 pág. 60, 43 dentes ausentes, ou seja, 45,26% da amostra foram encontrados no arco superior. E 52 dentes, ou seja, 54,73% da amostra foram encontrados no arco inferior. Estes nossos resultados estão em concordância com o de DOLDER (1936) que, em sua pesquisa, observou que a ausência era mais freqüente na mandíbula que na maxila, numa proporção de 7 para 6. Também em seus resultados, OLIVER et al. (1945) demonstraram uma maior predominância de agenesias na mandíbula. Em sua primeira pesquisa, GLENN (1961), afirma que as agenesias da mandíbula predominavam sobre as da maxila, numa razão de 34:31 e em seu segundo trabalho, em 1964, confirmou que as agenesias da mandíbula predominavam sobre as da maxila numa proporção de 62:60.
72 Já os resultados de BROGLIA e BARLOTTA (1965), GRAZIOSI et al. (1985), VEDOVELLO (1990) encontraram maior predominância de agenesia dentária na maxila do que na mandíbula. De acordo com a Tabela 2 pág. 60 encontramos em nosso trabalho, 51 dentes ausentes (53,68%) no lado direito e 44 dentes ausentes (46,31%) no lado esquerdo, e essa predominância do lado direito se observou em ambos os arcos, conforme Tabela 3 pág. 61 . Nossos resultados diferem dos de (DOLDER, 1936, BROGLIA e BARLOTTA, 1965 e VEDOVELLO, 1990), que não encontraram diferença quanto ao lado. Já OLIVER et al. (1945), em seu trabalho encontraram uma predominância das agenesias do lado esquerdo, GLENN (1961), encontrou em sua primeira pesquisa, uma maior freqüência de agenesias do lado esquerdo para o lado direito na proporção de 35:30, enquanto na segunda pesquisa em 1964 não encontrou predominância maior para nenhum lado. Encontramos em nosso trabalho, um maior número de agenesias dentárias bilaterais (34) do que unilaterais (27) Tabela 4, pág. 61. A presença de agenesias dentárias bilaterais e unilaterais está associada ao arco, sendo maior o número de agenesias unilaterais no arco mandibular e maior o número de agenesias bilaterais no arco maxilar. BYRD (1943), BAILIT (1975) e MOYERS (1991), também encontraram uma predominância maior de agenesias dentárias bilaterais, porém GLENN (1961) observou um maior número de agenesias unilaterais coincidindo com o trabalho de VEDOVELLO (1990). Já BROGLIA e BARLOTTA (1965), observando os seus resultados, concluíram que não havia diferença significativa entre a predominância de agenesias dentárias bilaterais e unilaterais. A ocorrência das agenesias dentárias podem ser simples ou múltiplas. Porém, existe um predomínio da ausência congênita de um dente isolado ou de dois dentes, como foi demonstrado nos estudos de (VOLK, 1963, EIDELMAN et al. 1973, FINN 1973, ZHU et al. 1996 e STOCKTON et al. 2000). Tal predileção ficou clara neste trabalho, onde 48,71% dos
73 pacientes tinham apenas um elemento ausente e 23,07% tinham dois dentes ausentes totalizando 71,78% dos probandos Tabela 5, pág. 62. Procuramos também verificar se existe maior proporção de agenesias dentárias num dos arcos quando associadas ao grupamento de dentes. Observamos na Tabela 6, pág. 62, e Tabela 7, pág. 64 que a proporção de agenesias no arco maxilar e arco mandibular está associada ao grupamento de dentes, sendo maior a proporção de 2os pré­molares inferiores. Fica evidente em nosso trabalho que, pela ordem, entre os casos de agenesia dentária, excluindo­se os terceiros molares, há um maior número de ausência dos segundos pré­molares inferiores, seguidos pelos segundos pré­molares superiores, incisivos laterais superiores, primeiros pré­molares superiores, primeiros pré­molares inferiores e incisivos laterais inferiores. STOCKTON et al. (2000), baseados nos resultados obtidos, em sua amostragem, concluíram que, pela ordem, entre os casos de agenesia dentária, excluindo­se os terceiros molares, há um maior número de ausências dos segundos pré­molares inferiores, segundos pré­molares superiores, incisivos laterais superiores, primeiros pré­molares inferiores, primeiros pré­molares superiores e incisivos laterais inferiores. Só dois grupos de dentes diferem dos nossos resultados. GRAZIOSI et al. (1985), excluindo­se os terceiros molares, encontraram pela ordem um maior número de ausências congênitas no grupo dos segundos pré­molares superiores, segundos pré­molares inferiores, dos incisivos laterais superiores, primeiros pré­molares superiores, primeiros pré­molares inferiores e dos incisivos laterais inferiores. Só os dois primeiros grupos de dentes diferem dos nossos resultados. GLENN (1964), VOLK (1963), MULLER et al. (1970), EIDELMAN et al. (1973) e VEDOVELLO (1990), observaram uma maior prevalência de ausência congênita de incisivos laterais superiores. Agenesia dentária familiar é uma condição heterogênica caracterizada pela ausência congênita de dentes decíduos e/ou permanentes, variando de uma forma suave, envolvendo
74 ausência de um ou dois dentes, à severa onde a maioria dos dentes podem estar ausentes (THESLEFF, 2000). Agenesia dentária autossômica dominante tem sido localizada em pelo menos três loci cromossômicos, MSX1 (VASTARDIS et al 1996), PAX9 (STOCKTON et al. 2000), e um lócus desconhecido no cromossomo 10 (LIU et al.2001). 6.1 MSX1 e PAX9 VASTARDIS et al. (1996) e van den BOOGARD et al. (2000), associaram a mutação no gene MSX1 com famílias que apresentavam oligodontia de segundos pré­molares e terceiros molares. NIEMINEM et al. (1995), SCAREL et al. (2000), não encontraram correlação entre o gene MSX1 e hipodontia de incisivos laterais ou segundos pré­molares em seus estudos. Este fato indica que este gene é responsável por tipos específicos de agenesia dentária em humanos, as quais envolvem elevado número de dentes ausentes. No presente estudo, não foi verificada associação entre o marcador CA do gene MSX1 e agenesia dentária, nos casos de hipodontia. Futuras pesquisas devem ser realizadas separando­se as famílias em grupos de acordo com o número de ausências dentárias e as diferentes combinações de dentes ausentes no probando, tais como, ausência de incisivos, de pré­molares, de incisivos e pré­molares e de pré­molares e molares, para que resultados mais conclusivos em relação ao papel do MSX1 na etiologia da agenesia dentária possam ser obtidos. Já STOCKTON et al. (2000), NIEMINEM et al. (2001), DAS et al. (2003), afirmavam que reduzidas quantidades da proteína produzida pelo PAX9 afeta o desenvolvimento dos molares permanentes. Todos os indivíduos afetados nestes estudos apresentavam ausência de segundos e terceiros molares. No presente trabalho, não foi notada associação positiva entre esse gene e o defeito estudado (hipodontia). Uma vez que famílias com agenesias dentárias também podem apresentar fenótipos de fenda labial e/ou palatina, o que parece mais importante a médio prazo é tentar verificar se a agenesia dentária serviria de preditor para um risco aumentado de fenda labial e/ou palatina, defeito que requer uma longa reabilitação física e emocional.
75 Esse trabalho propôs seqüenciar, além de regiões codificantes dos genes MSX1 e PAX9, regiões conservadas no intron (região não codificante de proteínas), mas que podem ter importante função reguladora. Muitos genes são expressos durante o desenvolvimento dentário o que torna a lista de genes candidatos bastante longa. Futuros estudos devem explorar esses genes na tentativa de identificar aqueles responsáveis por hipodontias. Cabe à Disciplina de Odontopediatria da Universidade Federal do Rio de Janeiro aprimorar a documentação dos seus pacientes, inclusive com exames radiográficos, visando o enriquecimento dos seus arquivos, fonte inestimável para inúmeras pesquisas e estabelecimento dos padrões de nossa população.
7 CONCLUSÕES
·
Nos 1034 escolares estudados encontramos prevalência de agenesia dentária de 3,7%.
·
Foi maior a proporção de agenesias dentárias em escolares do gênero feminino. A agenesia de um ou dois dentes foi a mais freqüente.
·
A proporção de agenesias dentárias na mandíbula foi maior do que na maxila.
·
A proporção de agenesias dentárias no lado direito foi maior do que no lado esquerdo, tanto na maxila quanto na mandíbula.
·
A presença de agenesias dentárias unilaterais e bilaterais está associada ao arco, sendo maior o número de agenesias dentárias unilaterais no arco mandibular e maior o número de agenesias dentárias bilaterais no arco maxilar. Foram encontrados um maior número de agenesias dentárias bilaterais do que unilaterais no presente estudo.
·
O grupo de dentes mais freqüentemente ausentes foi o dos segundos pré­ molares e destes, os inferiores.
·
Quanto a elementos ausentes a maior freqüência foi do segundo pré­molar inferior direito, seguida pelo segundo pré­molar inferior esquerdo, segundo pré­molar superior direito e depois segundo pré­molar superior esquerdo.
·
Não foram encontradas mutações potencialmente patogênicas nos genes MSX1 e PAX9 através de seqüenciamento direto das regiões codificantes (exons).
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86 ANEXOS
87 ANEXO 1: TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO PROJ ETO: ESTUDO DA RELAÇÃO DE GENES E AGENESIA DENTÁRIA EM UMA POPULAÇÃO BRASILEIRA PESQUISADOR: MARCELO DE CASTRO COSTA ORIENTADORES: PROFª D RA . ADRIANA MODESTO DR. ALEXANDRE REZENDE VIEIRA Proposta: Estamos convidando pessoas para participar de uma pesquisa sobre diferentes tipos de ausências de dentes. A proposta desse estudo é descobrir se há diferenças genéticas entre indivíduos com e sem ausências dentárias. Esta informação poderá ser útil para identificar a causa principal de ausência de dentes. Esta pesquisa é um passo em busca de meios de predizer e/ou prevenir essa alteração no futuro. Este estudo envolverá um exame específico de DNA, seu material genético. Necessitamos fazer o teste em um grande grupo de indivíduos que tenham ausência de dentes. Você poderá solicitar a qualquer momento que seus dados sejam desconsiderados e/ou destruídos. Nesse caso, qualquer registro seu será apagado e qualquer amostra de DNA sua ainda existente será destruída. Pedimos também que você nos autorize a verificar seu prontuário odontológico e consultar suas radiografias. É possível que solicitemos uma nova radiografia para você, no caso de acharmos que precisamos olhar um exame mais atualizado, ou caso suspeitemos que você possa apresentar um problema que precise ser investigado. Essa nova radiografia será realizada por nós sem nenhum custo para você. Pedimos a sua autorização para contactá­lo novamente para podermos fornecer informações de seu interesse no futuro, sobre essa pesquisa. Procedimentos: Se você concordar em participar, realizaremos um procedimento no qual uma pequena escova (similar a uma escova de dente) será girada sobre a parte interna da bochecha, coletando células das quais o DNA será extraído para análise. Risco: O procedimento de coletar células da bochecha causa pouco ou nenhum desconforto e tem uma possibilidade mínima de infecção. Vale destacar que os procedimentos realizados não trarão prejuízos a saúde dos pacientes.
88 Benefícios: Não há benefício direto para você e seu filho em participar deste estudo. A sociedade deve se beneficiar da identificação de genéticas moleculares de ausências dentárias em pacientes. Isto é um projeto de pesquisa, e não uma forma de tratamento ou diagnóstico para você e seu filho de qualquer condição que vocês possam apresentar, todavia, durante a coleta do material, uma avaliação da cavidade bucal será feita, verificando­se a presença de lesões cariosas, periodontais e disfunções oclusais. Caso uma possível condição que necessite atenção especializada de um dentista ou médico seja constatada, você será comunicado e orientado a procurar atendimento. Com isso, acreditamos que além dos riscos serem insignificantes, seus benefícios indiretos serão relevantes. Custo e compensação: Nenhum pagamento será realizado para participação nesta pesquisa. Confidência: Sua amostra de DNA será armazenada pelo Centro de Pesquisa em Anomalias Craniofaciais da Universidade de Iowa (Estados Unidos) por um período de até no máximo 5 anos. Informações sobre os dados clínicos e da pesquisa serão armazenados em dois bancos de dados, um no Departamento de Odontopediatria e Ortodontia da Universidade Federal do Rio de Janeiro e outro no Centro de Pesquisas de Anomalias Craniofaciais da Universidade de Iowa. Estes bancos de dados conterão os nomes dos participantes, os endereços, as idades e os diagnósticos que continuarão arquivados para que possamos contactar os participantes no futuro com relação a esta pesquisa. Esta informação estará protegida por senha de acesso para identificadores pessoais limitados a certos indivíduos. Os participantes que desejarem poderão ter acesso aos dados da pesquisa em qualquer momento, ou mesmo ter suas informações pessoais removidas deste arquivo bastando para isso um contato com o pesquisador responsável por este projeto, Dr. Marcelo de Castro Costa, telefone (21) 2562­2101. Um registro de sua participação nesta pesquisa será mantido, mas de forma confidencial, através do uso de códigos numéricos e arquivos fechados. Os resultados, em sua totalidade, serão publicados em literatura científica especializada, estando também disponíveis para consulta na Biblioteca Setorial da Disciplina de Odontopediatria da Faculdade de Odontologia da UFRJ, localizada no Departamento de Odontopediatria e Ortodontia ou na Biblioteca Central do Centro de Ciências da Saúde (CCS/UFRJ).
89 Injúria decor rente da participação na pesquisa: Se houver qualquer tipo de injúria resultante diretamente da participação nesta pesquisa, tratamento médico estará disponível na Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro. Nenhuma compensação será obtida do Departamento de Odontopediatria e Ortodontia da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal do Rio de Janeiro, a menos que esta injúria seja comprovada ser o resultado direto de negligência dos empregados da Universidade. Participação voluntária: A sua participação e de seu filho são voluntários. Nenhuma punição, discriminação, estigmatização ou perda de benefícios aos quais você e seu filho têm direito na Faculdade de Odontologia da UFRJ ocorrerá se vocês decidirem não participar. Vocês podem desistir da participação em qualquer momento sem punição ou perda de benefícios aos quais vocês têm direito. Se vocês cancelarem a participação, seus dados não serão mais incluídos em nenhuma análise e serão completamente apagados do banco de dados. Nenhuma análise posterior será realizada e suas amostras serão destruídas. Perguntas: As perguntas são bem­vindas. Você receberá uma cópia do documento de consentimento e resumo de informações. Se existirem dúvidas sobre este projeto de pesquisa ou se você precisar ser atendido por nós por causa de algo que aconteceu depois que coletamos a sua amostra, por favor, entrar em contato com o pesquisador responsável por este projeto Marcelo de Castro Costa, Rua Visconde de Pirajá, 303 Sala 803 – Ipanema – Rio de Janeiro – RJ – CEP: 22410­001, telefone (21) 2247­3592 ou 2562­2101. Se você tiver alguma consideração ou dúvida sobre a ética da pesquisa, entre em contato com o Comitê de Ética em Pesquisa (CEP)– Sala 01D­46­ 1° andar, telefone: (21) 2562­2480 – e­mail:[email protected] Estou certo do que foi exposto acima e autorizo minha participação nesta pesquisa. ________________________________ _____/_____/_____ Nome do paciente Data ________________________________ _____/_____/_____ Assinatura do paciente Data ________________________________ _____/_____/_____ Assinatura do Representante Legal Data
90 Eu discuti os pontos acima com o participante ou representante legal. É minha opinião que o participante entendeu os riscos, benefícios e obrigações envolvidas na participação neste projeto. ________________________________ Marcelo de Castro Costa Pesquisador Responsável por este Projeto Professor Auxiliar da Disciplina de Odontopediatria da FO/UFRJ _____/_____/_____ Data ________________________________ Adriana Modesto Gomes da Silva Vieira Professora Orientadora da Pesquisa Professor Adjunto da Disciplina de Odontopediatria da FO/UFRJ _____/_____/_____ Data ________________________________ Alexandre Rezende Vieira Pesquisador do “Craniofacial Research Center” Universidade de Iowa
_____/_____/_____ Data 91 ANEXO 2: FICHA CLÍNICA ESTUDO DA RELAÇÃO DE GENES E AGENESIA DENTÁRIA EM UMA POPULAÇÃO BRASILEIRA Família
Código / Diagnóstico: Pr– _____________________________________________________________ M– _____________________________________________________________ P– ______________________________________________________________ Heredograma: 92 ANEXO 3: PARECER DE APROVAÇÃO DO CEP HUCFF/UFRJ
93 ANEXO 4: PARECER DE APROVAÇÃO DA COMISSÃO NACIONAL DE ÉTICA EM PESQUISA DO MINISTÉRIO DA SAÚDE DO BRASIL ­ CONEP
94 ANEXO 5: PARECER SOBRE CUMPRIMENTO DE RECOMENDAÇÃO DO COMITÊ DE ÉTICA EM PESQUISA
95 ANEXO 6: PROTOCOLO PADRÃO PARA EXTRAÇÃO DO DNA DAS CÉLULAS DA MUCOSA DA BOCHECHA OBTIDAS COM A UTILIZAÇÃO DE UMA ESCOVA APROPRIADA 1 Adicionar 600 microlitros de NaOH a 50 mM em um tubo de 1,5 mililitros e colocar a escova com as células coletadas dentro desse tubo. Fechar o tubo; 2 Misturar por 30 segundos usando um vortex; 3 Aquecer o tubo a uma temperatura de 95°C por 5 minutos; 4 Centrifugar brevemente para condensar; 5 Remover a escova e adicionar 60 microlitros 1M Tris pH 8.0 ao tubo; Misturar por 30 segundos usando um vortex; 6 Centrifugar por 10 minutos a 13.000 rotações por minuto e remover o sobrenadante para estocagem.
96 ANEXO 7: IDENTIFICAÇÃO DOS DENTES AUSENTES EM CADA PACIENTE DO ESTUDO EPIDEMIOLÓGICO PROBANDO 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 GÊNERO M M M F M M M F M F F F M F M F M F M IDADE 12 10 12 12 12 11 11 12 11 7 8 8 10 9 9 9 10 9 7 20 F 10 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 F F F M F M M F F M F F F M F F M M F 11 8 9 6 7 6 8 10 7 6 8 9 11 12 6 7 9 12 11 DENTE AUSENTE 35,45 35 15,25 14, 15, 23, 24, 25, 35,45 15 35,45 15, 25, 45 32 45 32, 35, 42, 45 45 45 35, 45 33, 43 35, 45 45 12, 13, 22, 23, 31, 35, 41, 45 15, 25, 45 45 14, 15, 17, 24, 25, 27, 34, 35, 37, 44, 45, 47 14, 15, 24, 25, 34, 35, 45 15, 33, 45 15, 25, 45 31 25 12 45 12, 15, 22, 25 35 35 42 15, 25 15 35, 45 12, 22 45 12 15, 25, 34, 44 35