Cristiane Saraiva da Silva Ferreira
ESTUDO DAS TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA
CONVENCIONAL, FISH E
RT-PCR NO DIAGNÓSTICO DA LEUCEMIA
PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA)
Belo Horizonte
2006
Cristiane Saraiva da Silva Ferreira
ESTUDO DAS TÉCNICAS DE CITOGENÉTICA
CONVENCIONAL, FISH E
RT-PCR NO DIAGNÓSTICO DA LEUCEMIA
PROMIELOCÍTICA AGUDA (LPA)
Orientador: Wilham Jorge
Dissertação apresentada ao Curso
de Mestrado do Departamento de
Biologia Geral do Instituto de
Ciências
Biológicas
da
Universidade Federal de Minas
Gerais, como requisito parcial à
obtenção do título de Mestre em
Genética.
Belo Horizonte
Departamento de Biologia Geral
Instituto de Ciências Biológicas
2006
Dedico esta conquista aos pacientes
que, com presteza, permitiram a
utilização de suas amostras para
realização deste estudo.
AGRADECIMENTOS
À Universidade Federal de Minas Gerais, ao Instituto de Ciências Biológicas, ao
Departamento de Biologia Geral, em especial ao curso de Pós-Graduação em Genética
na pessoa da Prof. Andréa Maria Amaral Nascimento, pela possibilidade de cumprir
mais uma etapa da minha formação profissional.
Ao Prof. Wilham Jorge que confiou em mim e abriu as portas do seu laboratório
para uma nova linha de pesquisa e que, com paciência e bom humor, acompanhou,
orientou, corrigiu e aconselhou no decorrer deste estudo.
Ao Instituto Hermes Pardini nas pessoas do Dr. Victor Pardini e do Dr. Hermes
Pardini, que confiaram, permitiram e deram suporte para o desenvolvimento das
atividades previstas como objetivo deste trabalho.
Ao Alessandro, que além da companhia em todos os momentos, foi
imprescindível nos ensinamentos teóricos e técnicos, foi paciente e, sobretudo um
grande incentivador. Essa conquista também é sua!
À Dulce, por todos os ensinamentos, pelo exemplo de profissionalismo e
competência, pelo incentivo e também pelas boas idéias que nortearam este estudo.
Aos amigos do Laboratório de Citogenética, especialmente à Érica que foi
companheira, ouvinte e contribuiu com boas dicas na finalização deste estudo.
Aos companheiros de trabalho do setor de Citogenética do IHP, Karina,
Marlene, Siliana, Viviani, Patrícia, Fabiana, Liege, Keila, Adilson, Cristiane, Júnior,
Soraia e Lúcio que torceram, participaram e seguraram a onda durante esses dois anos
de correria.
Aos amigos Karina e Gustavo, Mônica e Adriano que dividiram comigo os
momentos de tensão, vibraram com as conquistas, entenderam minha ausência em
momentos importantes, enfim, porque foram e são meus amigos.
Aos meus pais, Osvaldo e Valdete, sempre incentivando e colaborando com
meus estudos, à minha irmã Rosiane, meu eterno exemplo (valeu pelos artigos e pelas
dicas!), aos Celso e Gui por mostrarem o “outro lado”.
À Dona Côte e ao Sr. Raul, que com suas orações foram imprescindíveis.
Aos amigos da pós-graduação, em especial à Ju e ao Bruno, por terem sido mais
que colegas. À Marina pela presteza nas informações!
A todos, meus sinceros agradecimentos.
RESUMO
A Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) ou Leucemia Mielóide Aguda (LMA)
subtipo M3 é responsável por 10% de todas as LMAs. A grande maioria dos pacientes é
caracterizada por uma coagulopatia severa e pela presença da translocação entre os
braços longos (q) dos cromossomos 15 e 17: t(15;17)(q22;q21). Essa translocação
reflete o rearranjo do gene da leucemia promielocítica (PML) localizado no
cromossomo 15q22 com o gene do Receptor Alfa do Ácido Retinóico (RARα)
localizado no cromossomo 17q21. A presença da fusão PML-RARα predispõe uma
diferenciação favorável em resposta ao tratamento com ácido all-trans retinóico
(ATRA). A detecção desse marcador genético confirma o diagnóstico e permite o
monitoramento do clone leucêmico durante o tratamento.
Trinta amostras de medula óssea foram submetidas à análise cariotípica por
bandamento G. A análise cromossômica foi possível em 28 das 30 amostras, 12 casos
apresentaram a translocação t(15;17), 15 apresentaram cariótipo normal e 1 caso
apresentou a translocação t(9;22). As mesmas amostras foram submetidas a
Hibridização In Situ Florescente (FISH) revelando como positivo 15 dos 30 casos e a
positividade variou de 15 a 100%. Dezenove dos 30 pacientes apresentaram-se
positivos para a translocação t(15;17) no teste da Reação em Cadeia mediada pela
Polimerase-Transcriptase Reversa (RT-PCR).
Os testes foram realizados com o objetivo de comparar os resultados obtidos
considerando, além da sensibilidade, outros fatores como: as dificuldades na execução,
a agilidade do resultado, a especificidade do teste e o custo envolvido.
Quando os resultados dos testes foram comparados, eles mostraram que o RTPCR foi o mais sensível. A análise cromossômica mostrou ser útil ao diagnóstico da
doença e o FISH foi aparentemente o mais fácil de executar.
ABSTRACT
Acute promyelocytic leukemia (APL) or acute myeloid leukemia (LMA)
subtype M3 is responsible for 10% of all AMLs. The vast majority of patients is
characterized by a severe coagulopathy and by the presence of the translocation of long
arms (q) of 15 and 17 chromosomes t(15;17)(q22;q21). This translocation reflects the
rearrangements of promyelocitic leukemia (PML) gene located at 15q22 with the
Retinoic Acid Receptor alpha (RARα) located at 17q21. The presence of the PMLRARα fusion predicts a favorable differentiation response to treatment with all-trans
retinoic acid (ATRA). The detection of this genetic marker confirms the diagnosis and
permits the monitoring of the leukemic clone during the treatment.
Thirty bone marrow samples were submitted to karyotype analysis after Gbanding. Karyotyping was successful in 28 of 30 samples, 12 cases presented t(15;17),
15 normal karyotype and one with t(9;22). The same samples were submitted to
Fluorescent In Situ Hybridization (FISH) analysis resulting positive 15 in the 30 cases
and positivity of cells varied from 15 to 100%. Nineteen of the 30 patients presented
positive at Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) to the
translocation t(15;17).
The objective of the tests performed was to compare the results obtained
considering, beside the sensibility, other factors like: the difficulties with the
performance, the agility of the result, the specificity to test and the cost involved.
By comparing the three tests, they showed that RT-PCR was the most sensitive.
Karyotype showed to be useful for accurate diagnosis of the disease and FISH
apparently is easier to perform.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Diagrama mostrando as linhagens celulares originadas da célulatronco multipotente da medula óssea. ................................................ 2
Figura 2: Ideograma mostrando os cromossomos 15 e 17 normais contendo
os genes PML e RARα, respectivamente e após a translocação.......... 7
Figura 3: Organização genômica dos genes PML e RARα normais e após
translocação. ....................................................................................... 9
Figura 4: Posição e seqüência dos oligonucleotídeos usados para PCR. ........... 21
Figura 5: Metáfase analisada por bandamento G para definição do cariótipo
do paciente 29 apresentando a translocação t(15;17)(q22;q21).......... 23
Figura 6: Metáfase obtida por FISH para o paciente 29, positiva para a
translocação t(15;17). ......................................................................... 24
Figura 7: Intérfase obtida por FISH para a paciente 8, positiva para a
translocação t(15;17). ......................................................................... 24
Figura 8: Resultado da amplificação do cDNA do gene RARα normal e das
fusões gênicas PML-RARα e RARα-PML. ........................................ 26
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Dados biológicos, cariotípico, de FISH e de RT-PCR dos pacientes
não tratados estudados........................................................
27
Tabela 2: Dados biológicos, cariotípico, de FISH e de RT-PCR dos pacientes
tratados estudados...............................................................
28
Tabela 3: Grau de indicação do teste de acordo com as variáveis avaliadas. .... 37
LISTA DE ABREVIATURAS
ACT – Association of Cytogenetic Technologist
ATRA – Ácido All-Trans Retinóico
bcr – breakpoint cluster region
cDNA - Ácido DesoxirriboNucléico complementar
CIVD – Coagulação IntraVascular Disseminada
COEP/UFMG – Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas
Gerais
DNA –Ácido DesoxirriboNucléico
FAB - French-American-British
FISH - Hibridização In Situ Fluorescente
INCA – Instituto Nacional do Câncer
ISCN – Sistema Internacional de Nomenclatura em Citogenética Humana
LLA – Leucemia Linfóide Aguda
LMA – Leucemia Mielóide Aguda
LMA-M3 – Leucemia Mielóide Aguda subtipo M3
LMC – Leucemia Mielóide Crônica
MLL – Leucemia Linfóide Mielóide
MRD – Doença Residual Mínima
Ph – cromossomo Philadelfia
PML – gene da Leucemia ProMielocítica
RARα - gene do Receptor α do Ácido Retinóico
RNA – Ácido RiboNucléico
RT-PCR – Reação em Cadeia mediada pela Polimerase-Transcriptase Reversa
SSC – Solução Salina Concentrada
SMD – Síndrome MieloDisplásica
SUMÁRIO
I-
INTRODUÇÃO................................................................................ 1
I.1- Hematopoese ............................................................................. 1
I.2- Doenças hematológicas malignas ............................................. 2
I.3- Classificação das leucemias ...................................................... 3
I.4- Leucemia Mielóide Aguda ....................................................... 4
I.5- Leucemia Promielocítica Aguda .............................................. 5
I.6- Alteração Citogenética ............................................................. 6
I.7- Tratamento da Leucemia Promielocítica Aguda ................... 10
I.8- Importância do diagnóstico para o tratamento ..................... 11
I.9- Testes mais utilizados na identificação da translocação
t(15;17)............................................................................................... 11
I.10- Importância do estudo ............................................................ 13
II-
OBJETIVOS .................................................................................... 14
III-
MATERIAIS .................................................................................... 15
IV-
MÉTODOS ....................................................................................... 16
IV.1- Citogenética Convencional ou Cariótipo com Banda G na
Medula Óssea ................................................................................... 16
IV.2- Hibridização In Situ Fluorescente (FISH) ........................... 17
IV.3- Reação em Cadeia mediada pela PolimeraseTranscriptase Reversa (RT-PCR) .................................................. 19
V-
RESULTADOS ................................................................................ 22
V.1- Citogenética Convencional ou Cariótipo com Banda G na
Medula Óssea ................................................................................... 22
V.2- Hibridização In Situ Fluorescente (FISH)
.............................
V.3- Reação em Cadeia mediada pela Polimerase-Transcriptase
23
Reversa (RT-PCR) ........................................................................... 25
V.4- Comparação dos resultados .................................................... 29
VI-
DISCUSSÃO .................................................................................... 30
VII-
CONCLUSÕES ................................................................................ 38
I-INTRODUÇÃO
I.1- Hematopoese
A hematopoese é um sistema altamente organizado responsável pela produção
das células sanguíneas. Durante a gestação, a formação do sangue se dá a partir de
células mesenquimais embrionárias do saco vitelino, passando pelo fígado, baço, timo e
gânglios linfáticos atingindo seu pico visceral ao redor do terceiro e quarto mês de
gestação. Finalmente, da trigésima semana até a vida adulta, todas as linhagens
celulares hematopoéticas se encontram representadas na medula óssea (ZANICHELLI
et al., 1995).
Na medula óssea, a formação das células sanguíneas inicia-se com as células
progenitoras precoces, ou células-tronco multipotentes, que se diferenciarão em células
precursoras “comprometidas”, isto é, com desenvolvimento restrito a apenas uma
linhagem. Os linfoblastos e os mieloblastos são as células precursoras comprometidas
com a linhagem linfóide e mielóide, respectivamente. As células precursoras, por sua
vez, passarão por diversos estágios de diferenciação e maturação, determinados pelos
fatores reguladores do crescimento, e formarão linfócitos derivados de linfoblastos e
granulócitos,
eritrócitos,
monócitos
e
plaquetas
derivados
de
mieloblastos
(HOFFBRAND et al., 2004) (Figura 1).
Em termos quantitativos, a hematopoese apresenta uma produção celular alta,
em torno de 1012 células sanguíneas/dia/Kg, em adultos (ANJOS et al., 2000).
O sangue é constituído por eritrócitos, plaquetas e leucócitos. A principal função
dos eritrócitos ou hemácias é o transporte de oxigênio. As plaquetas são responsáveis
pela formação do tampão mecânico durante a resposta hemostática à lesão vascular; os
leucócitos, juntamente com as imunoglobulinas e com o sistema do complemento,
agem na proteção do organismo contra infecções. Os leucócitos ou células brancas, por
sua vez, podem ser divididos em dois grandes grupos: dos fagócitos e dos imunócitos.
Os fagócitos são formados pelos monócitos e granulócitos que, de acordo com
afinidade tintorial de grânulos específicos, se distinguem em neutrófilos, eosinófilos e
basófilos. Os imunócitos são formados pelos linfócitos, pelas suas células precursoras e
pelos plasmócitos (HOFFBRAND et al., 2004).
O controle da proliferação, diferenciação e maturação destas células é feito
através de uma complexa interação molecular das células com o microambiente da
medula óssea (SACHS, 1995 citado por ANJOS et al., 2000).
Figura 1: Diagrama mostrando as linhagens celulares originadas da célula-tronco
multipotente da medula óssea.
I.2- Doenças hematológicas malignas
Alterações em qualquer estágio da hematopoese poderão causar uma
proliferação descontrolada de células sanguíneas que darão origem a doenças
hematológicas malignas. Quando a proliferação descontrolada resulta em acúmulo de
precursores de leucócitos na medula óssea e no sangue, fica caracterizada a doença
conhecida por LEUCEMIA. Quando este acúmulo de precursores ocorre nos
linfonodos, fica caracterizada a doença conhecida por LINFOMA (HOFFBRAND et
al., 2004).
As alterações que desencadeiam tais processos de malignidade, também
denominados de câncer, são mutações genéticas acumuladas que ocorrem em dois
grandes grupos de genes: os oncogenes e os genes supressores tumorais. Nos oncogenes
as mutações genéticas geram ganho de função, enquanto nos genes supressores
tumorais há perda de função (HOFFBRAND et al., 2004).
Aparentemente as células malignas surgem em um processo de múltiplos passos
onde uma célula inicial sofre uma mutação e, por divisões celulares sucessivas, serão
produzidas subpopulações, ou clones de células filhas, com alterações genéticas
adicionais que podem fornecer vantagens seletivas e culminar em um processo
malígno. Algumas destas alterações podem dar às células uma vantagem de
crescimento, por exemplo, criando tumores que contenham variantes clonais (FETTCONTE et al., 2000).
Na maioria dos casos, a causa do acúmulo das mutações genéticas causadoras de
doenças hematológicas malignas é desconhecida. Entretanto, sabe-se que existe uma
combinação de suscetibilidade genética e de fatores ambientais que determinam as
mutações genéticas. Em se tratando de fatores hereditários, há incidência muito alta de
leucemia em algumas doenças genéticas, particularmente na Síndrome de Down, na
anemia de Fanconi, na síndrome de Klinefelter, dentre outras. Quanto aos fatores
ambientais, alguns produtos químicos, como o benzeno, algumas drogas, a radiação e
alguns agentes infecciosos, como vírus e bactérias, podem também desencadear
leucemias (HOFFBRAND et al., 2004).
I.3- Classificação das leucemias
As leucemias são classificadas em quatro tipos: leucemias agudas e crônicas,
que, por sua vez, se subdividem em linfóides e mielóides.
As leucemias agudas progridem rapidamente e são doenças agressivas nas quais
a transformação maligna, que causa acúmulo de blastos na medula óssea, acompanhada
do bloqueio maturativo variável, gera insuficiência de leucócitos diferenciados na
medula e no sangue. As mesmas se subdividem em Leucemia Mielóide Aguda (LMA)
e em Leucemia Linfoblástica Aguda (LLA) conforme os blastos sejam mieloblastos ou
linfoblastos, respectivamente.
As leucemias crônicas distinguem-se das leucemias agudas pela sua progressão
mais lenta. Paradoxalmente, também são mais difíceis de curar. Nestas, a proliferação
clonal não está associada inicialmente a um bloqueio maturativo, uma vez que a
população celular se diferencia e amadurece embora haja graus variáveis de displasia. É
possível subdividir as leucemias crônicas nos grupos mielóide, Leucemia Mielóide
Crônica (LMC) e linfóide, Leucemia Linfóide Crônica (LLC), conforme estejam
associadas ao acúmulo de granulócitos ou de linfócitos, respectivamente (ANJOS et al.,
2000; HOFFBRAND et al., 2004).
I.4- Leucemia Mielóide Aguda
A Leucemia Mielóide Aguda (LMA) ocorre em todas as faixas etárias e tem sua
incidência aumentada com a idade. É responsável por 12% dos casos de leucemia em
menores de 10 anos, por 28% em jovens de 10 a 15 anos e por 80 a 90% dos casos de
leucemia aguda em adultos (GREER and KINNEY, 1990).
Quanto ao desenvolvimento, a LMA pode ser primária, com surgimento de novo,
ou secundária, que se desenvolve a partir de mielodisplasia, neoplasia relacionada com
anomalias quantitativas das três linhagens mielóides, de outras doenças hematológicas
ou após tratamento prévio com quimioterápicos. Os tipos primários e secundários têm
marcadores genéticos e prognósticos diferentes (HOFFBRAND et al., 2004).
Na apresentação clínica a LMA é definida pela presença de mais de 30% de
mieloblastos na medula óssea. A anemia e a trombocitopenia (sangramento anormal)
quase sempre são profundas (HOFFBRAND et al., 2004).
Na década de 70, a Leucemia Mielóide Aguda foi classificada nos subtipos M1,
M2, M3, M4, M5 e M6 por uma associação formada por franceses, americanos e
britânicos (FAB) baseados nos critérios de morfologia das células acometidas e também
nos padrões de reações enzimáticas. Os subtipos M0 e M7 foram acrescentados
subseqüentemente, após a incorporação da imunofenotipagem como critério de
classificação das LMA.
Na década de 90, a Organização Mundial de Saúde (OMS) reclassificou as
Leucemias Mielóides Agudas passando a considerar alterações citogenéticas como um
critério de classificação, confirmando portanto, a importância destas na definição do
comportamento clínico e no resultado evolutivo da doença. Foram identificados
diferentes tipos de alterações cromossômicas estruturais ou numéricas como
translocações recíprocas, inversões, inserções, deleções, translocações não balanceadas,
isocromossomos, cromossomos isodicêntricos, trissomias e monossomias isoladas, com
recorrência em LMA (MRÓZEK et al., 2004). Além das alterações citogenéticas, a
OMS também considerou aspectos clínicos e de tratamento para a reclassificação.
Com a classificação feita pela OMS, passaram a existir os seguintes subtipos de
LMA:
-
LMA com t(8;21)(q22;q22) ou rearranjo gênico ETO/AML1;
-
Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) ou LMA com t(15;17)(q22;q11-12)
e variantes ou rearranjo gênico PML/RARA;
-
LMA com eosinofilia ou LMA com inv(16)(p13q22) ou t(16;16)(p13;q22),
rearranjo gênico CBFalfa/MYH11;
-
LMA com alterações no 11q23;
-
LMA com displasia de múltiplas linhagens;
-
LMA/SMD associada a tratamento;
-
LMA não categorizada nos ítens anteriores;
A existência de vários subtipos de LMA evidencia a natureza heterogênea desta
neoplasia hematológica, constituindo um enorme desafio diagnóstico e terapêutico.
Cada vez mais, os subtipos de LMA estão sendo considerados como uma doença
específica e não mais uma doença única, justificando o baixo sucesso dos tratamentos
padronizados para uma única doença e servindo de impulso para a diversificação de
condutas clínicas (BITTENCOURT et al., 2003).
I.5- Leucemia Promielocítica Aguda
Como visto, a LMA-M3, segundo a classificação da FAB, ou Leucemia
Promielocítica Aguda (LPA), segundo a classificação da OMS, consiste em um subtipo
único de Leucemia Mielóide Aguda que foi reconhecido como entidade clínica distinta,
pela primeira vez, em 1957 (HILLESTAD, 1957 citado por O´CONNOR et al., 1999).
Atualmente sabe-se que a LPA é responsável por 5 a 10% dos casos de Leucemia
Mielóide Aguda (O`CONNOR et al., 1999).
A
doença
representa
uma
expansão
clonal
de
células
precursoras
hematopoéticas associada com o bloqueio da diferenciação da linhagem mielóide que
tem, como conseqüência, um acúmulo de promielócitos anormais derivados de
mieloblastos. Nos tipos mais comuns de LPA, 80% dos casos, os promielócitos
possuem múltiplos bastonetes de Auer que se apresentam como grânulos azulados na
coloração pela técnica de Romanowsky, sendo esta chamada forma clássica
(BENNETT et al., 1976). Nos outros 20% dos casos, não são visualizados grânulos
azulados na coloração pela técnica de Romanowsky caracterizando uma variante
hipogranular, chamada de forma variante (GOLOMB et al., 1980; GRIGNANI et al.,
1993; O’CONNOR et al., 1999).
As características clínicas dos pacientes afetados pela LPA são pancitopenia, ou
seja, diminuição de todas as principais linhagens de células (eritrócitos, leucócitos e
plaquetas) no hemograma e hemorragia. Muitos pacientes apresentam coagulopatia
severa que combina coagulação intravascular disseminada (CIVD) e fibrinólise, ambas
associadas com alta morbidade e mortalidade (TALLMAN and KWAAN, 1992;
LINCH et al., 1994; RODEGHIERO and CASTAMAN, 1994; PINHEIRO et al.,
2003). A LPA afeta pessoas com média entre 30 e 35 anos de idade (GREER and
KINNEY, 1990).
Os exames laboratoriais para diagnóstico da LPA baseiam-se na contagem e
identificação das células do sangue (hemograma) e da medula óssea (mielograma), nas
alterações bioquímicas e imunológicas e, principalmente, na presença de uma alteração
citogenética característica deste subtipo de leucemia.
I.6 – Alteração Citogenética
A exemplo da associação do cromossomo Philadelphia (Ph) resultante da
translocação entre os cromossomos 9 e 22 [t(9;22)(q34;q11)] (ROWLEY, 1973), com a
Leucemia Mielóide Crônica, uma translocação recíproca entre os cromossomos 15 e 17
está presente em mais de 99% dos pacientes afetados pela Leucemia Promielocítica
Aguda. Ambos os cromossomos sofrem uma quebra em determinada região e a seguir
as partes quebradas são religadas de maneira errada (O’CONNOR et al., 1999). Com as
quebras, fragmentos de tamanhos diferentes são trocados ficando a parte terminal do
cromossomo 15 ligada ao cromossomo 17 quebrado, também denominado 17q-,
enquanto a parte terminal do cromossomo 17 fica ligada ao cromossomo 15 quebrado,
denominado 15q+ (Figura 2).
Essa translocação foi descrita pela primeira vez em 1977 por Rowley et al. que
localizaram o ponto de quebra no cromossomo 15, no braço q, banda 2, subbanda 2 e o
ponto de quebra no cromossomo 17, também no braço q, banda 2, subbanda 1,
determinando a translocação t(15;17)(q22;q21).
Analisando os pontos de quebra nos cromossomos através das técnicas de
clonagem posicional e pesquisa do gene candidato, foi possível identificar os genes
envolvidos na translocação. No cromossomo 15, o gene envolvido é chamado PML
(gene da Leucemia ProMielocítica) que normalmente codifica um fator transcricional e
no cromossomo 17, o gene envolvido é chamado RARα, codificador do receptor alfa do
ácido retinóico (BORROW et al., 1990; de THÉ et al., 1990; LEMONS et al., 1990
citado por GRINWADE and SOLOMON, 1997; ALCALAY et al, 1991) (Figura 2).
Figura 2: Ideograma mostrando os cromossomos 15 e 17 normais contendo os genes PML
e RARα, respectivamente e após a translocação (LEGUES S. et al., 2002).
O gene PML, localizado no cromossomo 15, consiste de sete exons estendidos
numa região mínima de 30Kb (O`CONNOR et al., 1999)(Figura 3).
A proteína PML normal é expressa numa ampla variedade de tecidos, inclusive
nas células da linhagem hematopoética, ficando localizada no núcleo da célula,
principalmente dentro de estruturas chamadas de corpos nucleares (O`CONNOR et al.,
1999). Baseado no fato de ser essencial para a proliferação celular normal, o papel do
gene PML seria de regulador negativo do crescimento e supressor tumoral atuando
como regulador específico da diferenciação hematopoética. Porém, seu modo de ação
ainda não está completamente elucidado (WANG et al.,1998; RUGGERO et al., 2000;
BORDEN, 2002). Duas proteínas principais são produtos do gene PML, uma de 48kDa
e uma de 98kDa. Entretanto, existem isoformas destas originadas por splicing
alternativo no processamento dos exons centrais 4, 5 e 6 (GODDARD et al., 1991;
BORROW and SOLOMON, 1992 citado por GRINWADE and SOLOMON, 1997;
FAGIOLI et al., 1992; FLENGHI et al., 1995; TERRIS et al., 1995) e por variação nas
regiões C-terminais (GRINWADE and SOLOMON, 1997).
A quebra no gene PML envolvida na translocação associada a LPA pode se dar
em três pontos diferentes: no intron 6, na extremidade 3`, chamado de bcr1 (breakpoint
cluster region 1) determinante em 55% dos casos, no exon 6, também na extremidade
3`, chamado bcr2, determinante em cerca de 5% dos casos, ou no exon 3, na
extremidade 5` do gene, chamado bcr3, determinante em 40% dos casos (REITER et
al., 2003) (Figura 3).
O gene RARα normal codifica o receptor ALFA nuclear do ácido retinóico,
membro da família dos receptores de hormônio esteróide, essencial para a
embriogênese normal e diferenciação mielóide pós-natal (GRINWADE et al., 1996;
GARICOCHEA, 1999). A proteína RARα normal tem 48kDa e seu único ponto de
quebra envolvido na translocação associada a LPA está localizado dentro do íntron 2
chamado bcr (O`CONNOR et al., 1999) (Figura 3).
A translocação t(15;17) gera dois produtos híbridos: um resultante da fusão
gênica PML-RARα e outro resultante da fusão gênica recíproca RARα-PML. Enquanto
a fusão PML-RARα é expressa em 100% dos pacientes afetados pela LPA, apenas 70 a
80% destes apresentam o produto de RARα-PML, levando a crer que a presença do
primeiro produto seja determinante para a patogênese da doença (ALCALAY et al.,
1992; GRINWADE et al., 1996).
O produto PML-RARα desintegra os genes envolvidos interrompendo suas
funções normais e recruta co-repressores nucleares que reprimem a transcrição de genes
essenciais levando a parada na maturação das células da linhagem mielóide, seguida de
proliferação descontrolada destas células (de THÉ et al., 1991; GODDARD et al.,
1991; KAKIZUKA et al., 1991; KASTNER et al., 1992). O produto recíproco RARαPML, apesar de não ter seu papel bem definido, possui alguns motivos funcionais que,
pela sua constituição, interagem com a proteína p53 e desse modo poderia contribuir na
oncogênese da doença (MISTRY et al., 2003).
Figura 3: Organização genômica dos genes PML e RARα normais e após translocação.
a)Organização genômica dos genes PML e RARα nos cromossomos 15 e 17,
respectivamente, salientando os pontos de quebra associados a translocação t(15;17): bcr1,
bcr2 e bcr3 no gene PML e bcr no gene RARα. b)Produtos gênicos resultantes da quebra em
bcr1. c)Produtos gênicos resultantes da quebra em bcr2. d)Produtos gênicos resultantes da
quebra em bcr3.
Em adição aos rearranjos gênicos PML-RARα e RARα-PML, quatro fusões
variantes com o gene RARα são responsáveis pelo restante dos casos de LPA: a PLZFRARα, a NPM-RARα, a NuMA-RARα e a STAT5b-RARα resultantes de translocações
cromossômicas (ARNOULD et al., 1999; GRINWADE, 1999).
Um grupo de pacientes com LPA apresenta alterações cromossômicas adicionais
a translocação t(15;17) com uma incidência de 20 a 43%, dentre elas a trissomia do 8, o
iso(17q) e a del(9q) (SLACK et al., 1997 citado por KOCKI et al., 2003). A maioria
dos estudos sugere que as alterações adicionais não têm impacto no prognóstico da
doença (GRINWADE, 2001).
I.7- Tratamento da LPA
Até recentemente, a combinação quimioterápica de antraciclina com citarabina
(Ara C) era o único tratamento para a LPA alcançando uma remissão completa, ou seja
a regressão da doença, em 65% a 80% dos casos recém diagnosticados. Os pacientes
remanescentes morriam precocemente, principalmente por sangramento devido a piora
da coagulopatia ou por quimiorresistência. Cinqüenta a 65% dos pacientes com
remissão completa, mais tarde tiveram recaída e 30 a 40% sobreviveram por 2 anos
(GOLDBERG et al., 1987; HEAD et al., 1994).
Na década de 90, o esclarecimento sobre o envolvimento do gene RARα na
translocação t(15;17) associada a LPA permitiu compreender, em parte, os resultados
promissores descritos por um consórcio franco-chinês que usou doses elevadas de ácido
all-trans retinóico (ATRA) nesta doença (GARICOCHEA, 1999), alguns anos antes da
descrição molecular da translocação. Desta forma, provendo uma ligação direta da
terapia com a anormalidade genética (BORROW et al., 1992).
Os benefícios potenciais do ATRA são: remissão completa ativada em taxa
comparável a quimioterapia convencional, mas sem induzir hipoplasia da medula,
remissão alcançada nos casos de quimiorresistentes e, além disso, o ATRA leva a uma
rápida melhora da tendência hemorrágica que é a causa freqüente da mortalidade nessa
doença (FENAUX et al., 1997 citado por GRINWADE et al., 1998).
O ATRA exerce um efeito negativo no complexo PML/RARα, induzindo uma
mudança conformacional na proteína híbrida e promovendo o bloqueio transcricional
da mesma com consequente deslocamento dos co-repressores nucleares, em favor da
ativação transcricional dos genes essenciais para a maturação das células da linhagem
mielóide revertendo e alcançando a diferenciação dos promielócitos acumulados em
granulócitos, resultando em um rápido aumento na contagem de células do sangue
periférico (WILLMAN, 1999 citado por GRINWADE, 2001). Entretanto, o ATRA
quando utilizado isoladamente pode desencadear reações tais como febre, insuficiência
respiratória e infiltrado pulmonar que caracterizam a chamada “Síndrome do ATRA”
(PINHEIRO et al., 2003). Para isso e também com o objetivo de eliminar as células
portadoras da translocação t(15;17), protocolos de tratamento combinando o ATRA e a
quimioterapia de efeito citotóxico, foram desenvolvidos visando reverter o número de
células diferenciadas e os pacientes passaram a apresentar remissão completa da doença
em 80% a 90% dos casos, com redução significativa de complicações trombohemorrágicas (HUANG et al., 1988; CASTAIGNE et al., 1990; CHEN et al., 1991;
ALLFORD et al., 1999; FENAUX et al., 1999; JANSEN et al., 1999).
Devido a existência deste tratamento específico para pacientes afetados pela
LPA com translocação t(15;17), a doença é considerada de bom prognóstico,
influenciando positivamente na taxa de remissão e também no risco de recaída
(GRINWADE, 2001).
Os casos de LPA com translocações variantes respondem mal ao tratamento
com o ATRA (O`CONNOR et al., 1999).
I.8- Importância do diagnóstico para o tratamento
Como citado anteriormente, o tratamento com o ATRA é específico para
pacientes com LPA e, por conseguinte, não traz resultados positivos para outros tipos
de leucemia, já que estes não estão associados à formação do produto PML-RARα,
fonte de ação do agente diferenciador (ATRA). Portanto, é necessário que o diagnóstico
utilizado confirme o subtipo de leucemia em questão para que o tratamento com o
ATRA seja eficiente.
Além de definir o subtipo corretamente, é necessário que o diagnóstico seja
rápido já que esta é uma doença de progressão rápida que muitas vezes leva a morte
precoce.
Considerando que as características clínicas e os dados de contagem e análise
morfológica de células podem ser confundidos com outros tipos de leucemia
(O`CONNOR et al., 1999), as formas de diagnóstico mais utilizadas atualmente visam
identificar a alteração citogenética característica da LPA que é a translocação
t(15;17)(q22;q21).
I.9- Testes mais utilizados na identificação da translocação t(15;17)
Basicamente, existem quatro métodos diferentes para a identificação da
translocação t(15;17)(q22;q21) utilizados como diagnóstico para LPA: o Cariótipo com
bandamento G; a Hibridização In Situ Fluorescente (FISH), a Reação em Cadeia da
Polimerase-Transcriptase Reversa (RT-PCR) e a transferência de Southern (Southern
blotting).
O Cariótipo com banda G consiste na técnica de extender em lâmina o conjunto
cromossômico em metáfase de um indivíduo, permitindo a identificação, a contagem e
a análise estrutural dos cromossomos, possibilitando a identificação de alterações
numéricas e estruturais tais como trissomias, monossomias, deleções, inversões e
translocações, dentre outras, de natureza constitucional ou adquirida.
Por ser um método dependente de cultura de células, a qualidade da amostra
biológica analisada, baseada na viabilidade e no número de células semeado em cultura,
é imprescindível a obtenção de extensões cromossômicas em metáfase de boa qualidade
e em bom número para a análise. Caso contrário, não será possível identificar as
alterações cromossômicas ou haverá a chance de resultados falso-negativos. Por estes
motivos, o cariótipo é considerado um teste de triagem de média sensibilidade cuja taxa
de detecção da translocação t(15;17) varia de 80 a 85% (O`CONNOR et al., 1999).
O teste da FISH consiste na utilização de sondas de DNA marcadas com
fluorocromos que se complementam com o DNA de cromossomos extendidos em
lâmina tratadas para este procedimento, permitindo a identificação de alterações
citogenéticas específicas definidas pela sonda utilizada. No caso do FISH, a análise dos
cromossomos pode ser feita tanto em metáfases como em intérfases. Por este motivo o
método de FISH é considerado de boa sensibilidade (MANCINI et al., 1995).
A Reação em Cadeia da Polimerase-Transcriptase Reversa (RT-PCR) é um
método molecular a partir do qual é feita uma análise, por transcrição reversa do RNA e
amplificação do cDNA obtido, para detecção do produto gênico resultante da expressão
da fusão gênica formada pela alteração citogenética. A reação é feita utilizando-se
iniciadores e enzimas que transcrevem e amplificam regiões específicas. Por detectar 1
célula com a fusão PML-RARα em 104 até 106 células, podendo este número ser
aumentado em 10 vezes no caso de detectar também a fusão RARα-PML, este é
considerado um teste de grande sensibilidade no diagnóstico da LPA (TOBAL et al.,
1995; O`CONNOR et al., 1999; MISTRY et al., 2003).
A transferência de Southern consiste em identificar fragmentos específicos de
DNA obtidos por digestão de DNA genômico. Após a separação destes fragmentos por
eletroforese, os mesmos são transferidos para uma membrana que é banhada com sonda
marcada. Um auto-radiograma é usado para revelar a presença de quaisquer bandas no
gel que sejam homólogas a sonda. Este método exige grande quantidade de amostra
para obtenção de resultado.
Os testes mais utilizados na identificação da translocação t(15;17) além de
serem empregados no diagnóstico da doença, são úteis no controle da doença após o
tratamento, na tentativa de se detectar células cancerosas que permaneceram no corpo
que caracterizaria a Doença Residual Mínima (DRM).
Assim, métodos que possam detectar células tumorais residuais ou recaídas
precoces, sem manifestação clínica, têm sido empregados amplamente na tentativa de
se instituir a terapêutica adequada o mais precocemente possível (SIMPÓSIO:
TRANSPLANTE DE MEDULA ÓSSEA, 2000).
I.10- Importância do estudo
A última estatística do Instituto Nacional do Câncer (INCA, 2005) prevê
472.050 novos casos de câncer no Brasil em 2006. Desses, 9550 serão casos de
leucemia afetando pessoas de qualquer idade e sexo. Os números por si revelam a
importância dos estudos e descobertas nesta área.
Considerando que aqueles pacientes acometidos pela LPA, dentre os 9550 casos
de leucemia previstos, possuem prognóstico positivo e poderão atingir a remissão
completa se diagnosticados de forma rápida e correta, e também, tendo em vista a
existência de diferentes métodos de diagnóstico para este tipo de doença hematológica,
torna-se importante estudar e definir a conduta diagnóstica para que seja empregado o
tratamento adequado e para que pacientes com outros subtipos leucêmicos não sejam
tratados indevidamente com o ATRA.
II- OBJETIVOS
Tendo em vista o exposto, o presente trabalho tem por objetivos:
II.1: Selecionar pacientes caracterizados clinicamente e morfologicamente como
portadores de LPA para serem submetidos às técnicas de diagnósticos definidas para
este trabalho.
II.2: Realizar o cariótipo com bandamento G nas amostras dos pacientes
selecionados e determinar a sensibilidade desta técnica no diagnóstico da LPA.
II.3: Realizar o teste de FISH (“fluorescent in situ hibridization”) nas amostras
dos pacientes selecionados e determinar a sensibilidade desta técnica no diagnóstico da
LPA.
II.4: Realizar o teste molecular de RT-PCR para detectar tanto o produto da
fusão gênica PML/RARα quanto da fusão RARα/PML nas amostras dos pacientes
selecionados e determinar a sensibilidade desta técnica no diagnóstico da LPA.
II.5: Comparar os resultados obtidos em cada teste considerando, além da
sensibilidade, outros fatores como: as dificuldades na execução, a agilidade do
resultado, a especificidade do teste e o custo envolvido.
III- MATERIAIS
Para este estudo foram utilizadas amostras de medula óssea de 30 pacientes que
realizaram exames para diagnóstico de Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) no
Instituto Hermes Pardini, no período de março de 2004 a fevereiro de 2006. Todos
apresentavam diagnóstico clínico e morfológico de LPA.
Aos pacientes foi requisitada a leitura e assinatura do TERMO DE
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (ANEXO I). Em caso de pacientes
menores de 18 anos foi solicitado ao responsável a leitura e assinatura do TERMO DE
CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO (ANEXO II) e em seguida foram
realizados os três testes previstos como objetivos deste trabalho para cada amostra.
Além disso, foi feito contato com os médicos hematologistas responsáveis pelos
pacientes com o intuito de esclarecer o estudo em questão e de obter dados clínicos dos
mesmos.
Este estudo foi submetido e aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
Universidade Federal de Minas Gerais (COEP/UFMG).
IV- MÉTODOS
IV.1- Citogenética Convencional ou Cariótipo com Banda G na Medula Óssea
As amostras de medula óssea colhidas com anticoagulante heparina sódica, na
proporção de 0,1mL para cada 3,0mL de amostra, foram analisadas quanto ao número
de blastos através da contagem em câmara de “Neubauer”. A seguir, foram semeadas
em 2 tubos Falcon (tubo 1 e tubo 2) contendo meio de cultura RPMI-1640 (GIBCO),
respeitando a proporção de 106 blastos por mililitro de meio totalizando 5,0mL de
meio/tubo. Um volume de 100mL de meio de cultura RPMI-1640 utilizado foi
previamente suplementado com 25mL de soro fetal bovino, 1,0mL de antibiótico
(penicilina a 10.000U/ml), 0,025mL de fungicida (5,0mg/ml) e 1,25mL de L-glutamina
(29,2mg/ml), sendo o pH da mistura acertado em 7.0 usando HCl 1N ou NaOH 1N.
Todo esse procedimento foi feito em condições de assepsia em capela de fluxo laminar.
Após semeadas, as culturas foram colocadas em estufa a 37oC. Doze a 22 horas
depois, dependendo do horário de entrada da amostra, foram adicionados 20,0µL de
colcemid (CALBIOCHEM) (10,0µg/mL) ao tubo 1 que foi incubado por mais 6 horas
em estufa a 37oC para interrupção das células em divisão celular em fase de metáfase,
através do rompimento do fuso mitótico por ação do colcemid. Após este tempo, o tubo
1 foi centrifugado a 1200rpm por 8 minutos. O sobrenadante foi desprezado e ao
sedimento formado no fundo do tubo, foram acrescentados 5,0mL de solução
hipotônica, KCl 75,0mM, preaquecida a 37oC. Durante 9 minutos foram feitas
delicadas homogeneizações da mistura. Após adicionar 1,0mL de solução fixadora
(metanol:ácido acético, 3:1), foi feita nova centrifugação, retirada do sobrenadante e
adição de 5,0mL de solução fixadora, repetindo esse procedimento por 4 vezes ou até a
obtenção de uma amostra transparente. Finalizado o processo o tubo 1 foi armazenado
em freezer a –20oC.
Quarenta e oito horas após semeadura da medula óssea em meio de cultura,
foram acrescentados 20,0µL de colcemid (10,0µg/mL) ao tubo 2 que foi incubado por
mais 1 hora em estufa a 37oC. Passado o tempo de incubação, foi feito o procedimento
de hipotonização, fixação e lavagem da amostra idêntico ao tubo 1.
Após, no mínimo, 2 horas de armazenamento em freezer a –20oC, o material
fixado, tanto no tubo 1 quanto no tubo 2, foi concentrado por centrifugação e retirada
do sobrenadante, e pelo menos 4 lâminas de cada tubo foram preparadas pingando 3
gotas da amostra concentrada em lâmina de vidro molhada e resfriada. Em seguida, as
lâminas foram colocadas em chapa aquecida a 40oC. Após secas, as lâminas foram
envelhecidas por 48 horas em estufa de secagem a 55oC e posteriormente foram tratadas
com tripsina, onde cada lâmina foi mergulhada por, aproximadamente, 5 segundos em
tripsina 1:250 (0.005g/ml) diluída em tampão Dulbecco (GIBCO) (1:10), em seguida
foi mergulhada em tampão Dulbecco acrescido de soro fetal bovino. Imediatamente as
lâminas foram coradas com corante GIEMSA-WRIGHT diluído em tampão fosfato, pH
6.8 a 6.9, para obtenção do padrão de bandamento GTG utilizado para identificação,
contagem e análise estrutural dos cromossomos com conseqüente avaliação da presença
ou ausência da translocação t(15;17).
Os parâmetros utilizados como base para análise do cariótipo estão
fundamentados
no
SISTEMA
INTERNACIONAL
DE
NOMENCLATURA
CITOGENÉTICA HUMANA (ISCN, 1995). Todas as metáfases foram analisadas
quanto ao número e a estrutura dos cromossomos sendo considerada uma resolução
mínima de 250 bandas para a escolha daquelas que foram analisadas. No caso de
resultados negativos, no mínimo 20 metáfases foram analisadas e no caso de resultados
positivos, 15 foi o número mínimo de metáfases analisadas, conforme recomendação
técnica da Association of Cytogenetic Technologist – ACT (KNUSTEN et al., 1990;
1991).
IV.2- Hibridização In Situ Fluorescente (FISH):
As mesmas amostras fixadas e armazenadas em freezer utilizadas para preparar
lâminas para o cariótipo com banda G, foram utilizadas para a técnica de FISH. Uma
lâmina de vidro foi lavada em água destilada corrente e em seguida foi limpa com lenço
de papel embebido em etanol absoluto com o cuidado de não deixar fiapos na mesma.
Em seguida, 3 gotas da amostra concentrada foram pingadas na lâmina limpa. A mesma
foi avaliada quanto a região com maior concentração de intérfases e metáfases bem
distribuídas que fora delimitada com lápis marcador. A lâmina marcada foi deixada em
temperatura ambiente por 24 horas protegida de poeira e umidade. No dia seguinte, a
lâmina foi lavada em solução salina concentrada (SSC 2X) por 2 minutos a temperatura
ambiente. Depois de escorrer, a lâmina foi mergulhada nas séries de etanol, 70%, 85%
e 100% por 2 minutos cada, em temperatura ambiente. Após secagem, 10,0µL da sonda
de DNA PML/RARα (AQUARIUS), homogeneizada e pré aquecida a 37oC, foi
aplicada a região marcada. A sonda foi coberta com lamínula, tomando-se o cuidado de
não formar bolhas. No próximo passo, a lâmina com lamínula foi colocada em chapa
aquecida a 75oC por 2 minutos. A seguir a lâmina com lamínula foi armazenada em
câmara úmida e escura por 20 horas, em estufa a 37oC. Decorridas 20 horas, a lâmina
foi retirada da câmara escura e em seguida a lamínula foi retirada cuidadosamente. A
lâmina foi mergulhada em solução SSC 0,4X, preaquecida a 72oC, por 2 minutos. Após
escorrer, foi lavada em solução SSC 2X 0,05% tween-20 por 30 segundos a
temperatura ambiente. Após escorrer, foram aplicados 10,0µL de solução
contracorante, DAPI (0,06 µg/ml) (AQUARIUS), que foi coberta com lamínula. A
lâmina com lamínula foi colocada no escuro por 10 minutos em geladeira (2 a 8oC) e
em seguida levada ao microscópio de fluorescência (NIKON E-800) para a análise da
translocação, conforme instruções do fabricante da sonda. Foram utilizados os filtros
simples (DAPI) e triplo (DAPI/FITC/TEXAS-RED) para visualização dos sinais
fluorescentes.
Os parâmetros utilizados como base para análise do FISH estão fundamentados
no SISTEMA INTERNACIONAL DE NOMENCLATURA CITOGENÉTICA
HUMANA (ISCN, 1995).
A sonda de FISH escolhida para este estudo apresenta uma marcação
fluorescente vermelha (específica para o espectro TEXAS RED) para uma região
específica, de aproximadamente 40Kb, dentro do gene PML no cromossomo 15 e uma
marcação fluorescente verde (específica para o espectro FITC) para uma região
específica, também de aproximadamente 40Kb, dentro do gene RARα, no cromossomo
17. Uma célula é considerada negativa quando apresenta dois sinais vermelhos e dois
sinais verdes que se referem aos dois cromossomos 15 íntegros e aos dois cromossomos
17 íntegros, respectivamente. Uma célula é considerada positiva quando apresenta um
sinal vermelho isolado referente a um cromossomo 15 íntegro, um sinal verde isolado
referente ao cromossomo 17 íntegro e um sinal amarelo referente a sobreposição dos
sinais verde e vermelho referente a fusão dos cromossomos 15 e 17. Algumas vezes não
há sobreposição dos sinais verde e vermelho, mas a proximidade dos dois garante a
positividade do resultado. Um sinal verde mais fraco pode estar presente numa célula
positiva e se refere a uma parte do gene RARα marcado de verde, remanescente no
cromossomo 17.
Foram analisadas células em metáfase ou em intérfase que apresentaram no
mínimo um sinal vermelho, um sinal verde e um sinal amarelo sendo os sinais verde e
vermelho os sinais de integridade considerados como controle da marcação da sonda,
conforme descrição do fabricante. Foram considerados positivos para a translocação
t(15;17)(q22;q21) pacientes que apresentaram no mínimo 10% das células analisadas
positivas, sendo este o valor de referência apresentado por GRINWADE e LO COCO
(2002) que leva em conta a porcentagem de marcação inespecífica da sonda que sugere
como resultado positivo, uma célula com sinal verde e vermelho próximos devido
apenas a estrutura dos cromossomos em intérfase e não por representar uma
translocação efetivamente. Os esforços foram no sentido de se analisar 100 células
dentre metáfases e intérfases. Entretanto, um mínimo de 50 células foi estabelecido
para serem consideradas para a análise.
IV.3- Reação em Cadeia mediada pela Polimerase-Transcriptase Reversa (RTPCR):
Uma alíquota das mesmas amostras fixadas e armazenadas em freezer utilizadas
para preparar lâminas para citogenética convencional foram utilizadas para extração de
RNA usando o kit comercial QIA Amp Viral RNA MiniKit (QIAGEN).
A transcrição reversa, combinada com a etapa externa da reação de
amplificação foram realizadas em um mesmo passo usando 2,0µl de RNA total
extraído, 1,0µl da enzima rTth DNA Polymerase (2,5U/µl)(APPLIED BIOSYSTEMS)
, 5,0µl de tampão para RT-PCR 5X, 2,5µl de solução de manganês (25mM), 0,75µl de
dNTPs (10mM), 1,0µl de cada iniciador externo (10µM), 9,75µl de água para PCR, em
um volume final de 25µl por tubo. Os iniciadores utilizados foram descritos por Borrow
e colaboradores (1992) e estão ilustrados na Figura 4.
O programa utilizado inicia-se com uma etapa de 30 minutos a 60oC para a
transcrição reversa e a seguir a etapa de amplificação externa inicia com 5 minutos a
95oC para desnaturação inicial e 38 ciclos de 30 segundos a 94oC, 1 minuto a 55oC e 1
minuto a 72oC. A seguir uma extensão final é dada por 10 minutos a 72oC que ao se
encerrar reverte a temperatura para 4oC.
Para a etapa de amplificação interna, 1,0µl do produto de cada reação de
iniciadores externos combinados foi acrescido de 5,0µl de tampão para PCR 10X, 0,3µl
da enzima Taq DNA Polymerase (INVITROGEN)(5,0U/µl), 0,5µl de cada iniciador
interno e 42,71µl de água destilada, em um volume final de 50µl. As condições de
amplificação foram as mesmas. Os produtos obtidos por transcrição reversa do RNA e
amplificação do cDNA foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,5%
(BORROW et al., 1992).
Inicialmente quatro reações de RT-PCR foram feitas para cada amostra: o
controle de amplificação do cDNA do RARα normal (iniciadores externos 5 e 7 e
iniciadores internos 6 e 8), o controle de amplificação do cDNA do PML normal
(iniciadores externos 1 e 3 e iniciadores internos 2 e 4), a amplificação do cDNA
resultante da fusão PML-RARα (iniciadores externos 1 e 7 e iniciadores internos 2 e 8)
e a amplificação do cDNA resultante da fusão RARα-PML (iniciadores externos 5 e 3 e
iniciadores internos 6 e 4).
NÚMERO
1
2
3
4
5
6
7
8
GENE
PML
PML
PML
PML
RARA
RARA
RARA
RARA
POSIÇÃO
5´EXTERNO
5´INTERNO
3`EXTERNO
3`INTERNO
5´EXTERNO
5´INTERNO
3`EXTERNO
3`INTERNO
SEQUÊNCIA 5`-3`
AGCTGCTGGAGGCTGTGGAC
TGTGCTGCAGCGCATCCGCA
CGGCATCTGAGTCTTCCGAG
CTGCTGATCACCACAACGCG
GGCCAGCAACAGCAGCTCCT
GGTGCCTCCCTACGCCTTCT
TCTTCTGGATGCTGCGGCGG
GGCGCTGACCCCATAGTGGT
Figura 4: Posição e sequência dos oligonucleotídeos usados para PCR. (Modificado de
BORROW et al., 1992)
V-RESULTADOS
Os dados biológicos e os resultados dos testes para identificação da translocação
t(15;17) estão resumidos nas Tabelas 1 e 2.
Dos 30 pacientes com diagnóstico clínico e morfológico de LPA estudados, 19
eram mulheres com idade média de 33,68 anos ± 14,58, numa faixa de 9 a 65 anos e 11
eram homens com idade média de 34,09 anos ± 16,45, numa faixa de 12 a 63 anos. Para
dezesseis deles (pacientes 2, 5, 6, 8, 11, 13, 14, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27 e 29), os
testes foram realizados na fase de diagnóstico da doença e foram designados pacientes
não tratados (Tabela 1) enquanto para 14 deles (pacientes 1, 3, 4, 7, 9, 10, 12, 15, 16,
17, 18, 19, 28 e 30) os testes foram realizados na fase de controle da doença e foram
designados pacientes tratados (Tabela 2).
V.1- Citogenética Clássica ou Cariótipo com Banda G na Medula Óssea
Dos 30 pacientes estudados, 12 apresentaram a translocação t(15;17)(q22;q21)
no cariótipo, sendo que em 4 deles (2, 8,13 e 29) todas as metáfases apresentaram a
alteração, em 6 deles (5, 6, 11, 14, 25 e 27) algumas metáfases eram alteradas e outras
não, configurando um mosaicismo da translocação, e em 2 deles (20 e 23) além da
translocação t(15;17), também apresentaram alterações secundárias. Um paciente (21)
apresentou a translocação t(9;22)(q34;q11). Todos os pacientes com cariótipo alterado
estudados encontram-se na fase de diagnóstico da doença (Tabela 1). Quinze pacientes
apresentaram cariótipo normal, ou seja, sem alteração no número e na estrutura dos
cromossomos e para outros 2 pacientes (22 e 24) não foram obtidas metáfases
adequadas para a análise cromossômica. A Figura 5 mostra uma metáfase analisada por
bandamento G para definição do cariótipo do paciente 29.
Foram gastos, em média, oito dias para finalização do cariótipo para cada
paciente.
Figura 5: Metáfase analisada por bandamento G para definição do cariótipo do paciente 29
apresentando a translocação t(15;17)(q22;q21).
V.2- Hibridização In Situ Fluorescente (FISH):
Os resultados do FISH foram apresentados nas Tabelas 1 e 2 como porcentagem
de células positivas.
Quinze dos 30 pacientes (2, 5, 6, 8, 11, 13, 14, 18, 20, 22, 23, 25, 26, 27 e 29)
apresentaram a translocação t(15;17)(q22;q21) associada a LPA enquanto os outros 15
(pacientes 1, 3, 4, 7, 9, 10, 12, 15, 16, 17, 19, 21, 24, 28 e 30) não apresentaram essa
alteração.
As Figuras 6 e 7 ilustram uma metáfase e uma intérfase submetidas a FISH,
analisadas para o paciente 29 e 8 respectivamente revelando em ambos os casos a
presença da translocação t(15;17).
Foram gastos em média cinco dias para finalização do teste de FISH para cada
paciente.
Figura 6: Metáfase obtida por FISH para o paciente 29, positiva para a
translocação t(15;17).
Figura 7: Intérfase obtida por FISH para a paciente 8, positiva para a
translocação t(15;17).
V.3- Reação em Cadeia mediada pela Polimerase-Transcriptase Reversa (RTPCR):
Durante a fase de padronização dos testes, foi eliminada a reação do controle de
transcrição reversa e amplificação do cDNA do gene PML normal com o objetivo de
simplificar a execução do teste, uma vez que o controle para o gene RARα normal
apresentou resultados satisfatórios.
Todos os 30 pacientes estudados apresentaram o fragmento referente ao produto
do gene RARα normal (253bp) (Figura 8a) usado como controle do RNA extraído para
cada paciente. Na figura 8a foi mostrado o resultado de 6 dos 30 pacientes apenas como
ilustração dos resultados obtidos. Além do produto do gene RARα normal, 4 pacientes
(5, 6, 13 e 23) apresentaram amplificação dos fragmentos PML-RARα (355bp)
representado na Figura 8b somente para os pacientes 5 e 6, e também dos fragmentos
RARα-PML (144bp, 215bp, 403bp). Os fragmentos apresentaram tamanhos diferentes
por causa da existência de splicing alternativo do gene PML. Cinco pacientes
apresentaram amplificação apenas do fragmento PML-RARα (14, 15, 22, 26 e 28) e
outros 10 apresentaram amplificação apenas do fragmento RARα-PML (2, 7, 8, 11, 18,
20, 25, 27, 29 e 30), representados na Figura 8c somente para os pacientes 7, 8 e 11,
totalizando 19 pacientes com a translocação t(15;17)(q22;q21). Onze pacientes
apresentaram amplificação do cDNA do gene RARα normal, mas não amplificaram os
fragmentos referentes aos produtos das fusões gênicas PML-RARα e RARα-PML
resultantes da translocação e por esse motivo foram considerados negativos para a
translocação t(15;17)(q22;q21).
Duas amostras de pacientes com LMA com translocação t(8;21)(q22;q22) e
duas amostras de pacientes com LMC com translocação t(9;22)(q34;q11) foram
utilizadas como controle de especificidade da reação e não amplificaram os produtos
das fusões PML-RARα e RARα-PML como esperado (resultado não mostrado). Além
disso, para cada reação foi utilizada uma amostra sem cDNA, chamada o branco da
reação, como controle de contaminação cruzada de cDNA.
Foram gastos em média três dias para finalização da RT-PCR.
a)
253bp
b)
355bp
c)
403bp
215bp
144bp
Figura 8: Resultado da amplificação do cDNA do gene RARα normal e das fusões
gênicas PML-RARα e RARα-PML. a) Resultado da amplificação do cDNA do RARα
normal para os pacientes 7, 8, 9, 10, 11 e 12. b) Resultado da amplificação do cDNA da
fusão PML-RARα para os pacientes 1, 2, 3, 4, 5 e 6. c) Resultado da amplificação do
cDNA da fusão RARα-PML para os pacientes 7, 8, 9, 10, 11 e 12. E: escada padrão de
peso molecular (100bp); B: branco da reação.
Tabela 1: Dados biológicos, cariotípico, de FISH e de RT-PCR dos pacientes não tratados estudados.
Paciente
Sexo
Idade
2
5
6
8
11
13
14
20
21
22
23
24
25
26
27
29
F
M
F
F
F
F
F
M
F
M
M
M
F
F
F
M
33
12
32
23
52
45
23
22
9
32
38
55
52
27
49
46
*positivo > 10%
Cariótipo
46,XX,t(15;17)(q22;q21)[20]
46,XY,t(15;17)(q22;q21)[18]/46,XY[2]
46,XX,t(15;17)(q22;q21)[10]/46,XX[10]
46,XX,t(15;17)(q22;q21)[15]
46,XX,t(15;17)(q22;q21)[14]/46,XX[6]
46,XX,t(15;17)(q22;q21)[20]
46,XX,t(15;17)(q22;q21)[18]/46,XX[2]
46,X,Yqh+,+8,t(15;17)(q22;q21)[20]
46,XX,t(9;22)(q34;q11)[25]
sem resultado
46,XY,del(11)(q13),t(15;17)(q22;q21)[19]/46,XY[1]
sem resultado
46,XX,t(15;17)(q22;q21)[19]/46,XX[1]
46,XX[30]
46,XX,t(15;17)(q22;q21)[19]/46,XX[1]
46,XY,t(15;17)(q22;q21)[20]
FISH*
100%
82%
42%
98%
60%
78%
60%
97%
6%
73%
97%
3%
58%
49%
94%
94%
RT-PCR
PML-RARα
RARα-PML
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Resultado
Final
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
Tabela 2: Dados biológicos, cariotípico, de FISH e de RT-PCR dos pacientes tratados estudados.
Paciente
1
3
4
7
9
10
12
15
16
17
18
19
28
30
Sexo
F
M
F
M
F
F
M
M
F
F
F
F
M
F
*positivo > 10%
Idade
26
17
19
63
19
45
16
36
27
23
27
44
38
65
Cariótipo
46,XX[29]
46,XY[30]
46,XX[23]
46,XY[30]
46,XX,9qh+[20]
46,XX[30]
46,XY[30]
46,XY[30]
46,XX,16qh+[30]
46,XX[30]
46,XX[30]
46,XX[20]
46,XY[30]
46,XX[30]
FISH*
3%
2,2%
3,1%
8%
5%
4%
5%
2,5%
1%
5%
15%
1,9%
7%
3%
RT-PCR
PML-RARα
+
+
-
RARα-PML
+
+
+
Resultado
Final
+
+
+
+
+
V.4- Comparação dos resultados
Na análise geral, considerando o resultado final dos três testes, 19 pacientes
foram considerados positivos para a translocação t(15;17)(q22;q21) em pelo menos 1
teste e 11 foram considerados negativos.
Dos 19 pacientes com resultado positivo para o RT-PCR, 6 foram negativos
para o Cariótipo e 4 foram negativos para o FISH. Por conseguinte, 6 pacientes tiveram
resultado falso-negativo no cariótipo e 4 pacientes tiveram resultado falso-negativo no
FISH.
VI- DISCUSSÃO
A existência de um tratamento específico para o subtipo LPA de Leucemia
Mielóide Aguda, caracterizado por coagulopatia fatal, com alcance da remissão da
doença, faz necessário um diagnóstico rápido e preciso da patologia.
Apesar de existir características clínicas e morfológicas bastante específicas
para este subtipo de leucemia, em muitos casos elas são confusas e podem
comprometer o diagnóstico. A descrição da translocação t(15;17)(q22;q21) por Rowley,
em 1977, como marcador diagnóstico da LPA, facilitou a classificação da doença e
assim os testes diagnósticos com potencial para identificar essa translocação tornaramse amplamente utilizados. Entretanto, existem diferenças significativas na sensibilidade,
na execução, na agilidade e no custo dependendo do teste utilizado. Na prática, muitos
destes fatores são desconhecidos pelos profissionais que solicitam estes testes
diagnósticos, gerando erros na identificação de pacientes potencialmente tratáveis e
comprometendo a conduta do tratamento.
Neste estudo foram realizados os três testes diagnósticos mais comumente
utilizados para identificação da translocação t(15;17)(q22;q21): análise do cariótipo, a
FISH e o RT-PCR.
Os resultados do RT-PCR foram utilizados como referência para os outros dois
testes realizados, já que este apresentou maior índice de positividade na identificação da
translocação t(15;17). Devido a sua alta sensibilidade, o teste de RT-PCR é considerado
o PADRÃO-OURO no controle da doença remanescente após o tratamento, doença
residual mínima (MRD), que tem por objetivo inferir sobre o risco de relapso da LPA
em pacientes tratados (BIONDI et al., 1992; CHEN et al., 1992; MILLER et al., 1992;
HUANG et al., 1993; MILLER et al., 1993; FUKUTANI et al., 1995b; TOBAL et al.,
1995).
Comparando-se as tabelas 1 e 2 onde os pacientes foram divididos em não
tratados e tratados, respectivamente, é possível notar a efetividade do tratamento da
LPA já que pacientes tratados apresentaram, na sua maioria, resultados negativos para
a detecção da translocação t(15;17).
No presente estudo, os 12 pacientes com resultado positivo para o teste de
análise do cariótipo, a chamada técnica de Citogenética Convencional, tiveram o
diagnóstico confirmado pelo RT-PCR. Isso significa que não foram encontrados
resultados falso-positivos no emprego do cariótipo como teste diagnóstico. Dentre os 16
pacientes com resultado negativo para a translocação t(15;17) utilizando o Cariótipo, 10
foram confirmados pelo RT-PCR, enquanto 6 deles tiveram resultado positivo para o
RT-PCR (pacientes 7, 15, 18, 26, 28 e 30). Isso significa que para esses 6 casos, ou seja,
37,5% dos resultados negativos para a análise do cariótipo, os resultados eram falsonegativos revelando uma fragilidade do teste.
Essa fragilidade se deve principalmente a baixa probabilidade de se encontrar
metáfases com alteração cromossômica nos casos em que há mosaicismo e o número de
metáfases alteradas é pequeno em relação ao número de metáfases normais, haja visto
que apenas 30 metáfases foram analisadas nestes casos. Outro fato que contribui para
uma probabilidade pequena de se encontrar células alteradas em casos de mosaicismo é
o fato de metáfases alteradas, por motivo desconhecido, terem pior qualidade e serem
desprezadas para a análise. De fato, nos 6 resultados falso-negativos o número de
células alteradas encontradas no resultado de FISH foi menor que 50% das células
analisadas, configurando um mosaicismo baixo, difícil de ser detectado pela análise do
cariótipo.
O número de metáfases analisadas neste estudo está de acordo com o número
definido pela comunidade citogenética (KNUSTEN et al., 1990; KNUSTEN et al.,
1991). Conhecidamente, o número de metáfases consideradas de boa qualidade para
serem analisadas para o Cariótipo é limitado pelo número de metáfases obtidas em
cultura, dependente do número de células com viabilidade no momento da semeadura
da amostra biológica, influenciada pela condição clínica do paciente, pelo procedimento
de coleta, conservação e transporte da amostra.
Alguns fatores comprometem a obtenção de células viáveis para a cultura e,
portanto, diminuem o sucesso na obtenção de metáfases para a análise do cariótipo.
Dentre estes fatores estão, uma coleta de medula óssea feita fora dos padrões
recomendados, por exemplo, com “contaminação” por sangue periférico ou com
volume insuficiente e uma conservação inadequada, diferente da temperatura ambiente
(mais ou menos 250C), por um período maior que 6 horas quando conservada no
anticoagulante heparina sódica, ou maior que 24 horas quando conservada no meio de
cultura. Além disso, é conhecido o fato de metáfases obtidas a partir do cultivo de
células da medula óssea apresentarem, na prática, uma baixa resolução de bandas
característica da amostra, o que dificulta a análise dos cromossomos. Possivelmente, um
dentre esses motivos foi responsável pelos resultados falso-negativos encontrados neste
estudo.
O exposto acima explicaria o fato de 2 dos 30 pacientes estudados não terem
apresentado um número de células suficiente para a análise e conseqüentemente para a
conclusão do cariótipo (pacientes 22 e 24).
Por outro lado, foi encontrado, dentre os resultados negativos para a translocação
t(15;17)(q22;q21), um paciente com a translocação t(9;22)(q34;q11) característica de
outros tipos de leucemia, mais especificamente a Leucemia Mielóide Crônica, dentre
outras. Neste paciente, a presença de características morfológicas atípicas gerou uma
confusão no diagnóstico clínico, esclarecida pelo cariótipo. Caso o tratamento com o
ATRA tivesse sido empregado ao diagnóstico clínico, este teria sido sem sucesso e,
além disso, teria deixado de ser empregado o tratamento correto aplicado para este outro
tipo de leucemia. Por outro lado esse fato mostra uma importante vantagem no emprego
da análise do cariótipo que foi capaz de detectar outras alterações cromossômicas, assim
como de detectar alterações secundárias como aquelas encontradas nos pacientes 20 e
23, cujo significado biológico e clínico ainda é incerto.
O paciente com translocação t(9;22), além daqueles com alterações secundárias
detectadas pelo cariótipo, tiveram resultado negativo nos testes de FISH e RT-PCR para
a translocação t(15;17).
Em resumo, a sensibilidade, definida como a probabilidade do teste em
identificar um evento quando este estiver presente, bem como de não identificá-lo na
sua ausência, calculada pela razão entre o número de testes verdadeiramente positivos e
a somatória deste número com o número de falsos negativos, foi de 76% para o
cariótipo, considerando como verdadeiramente positivos os resultados do teste de RTPCR. Este valor está abaixo dos 80% calculado para a maioria dos estudos realizados
(O`CONNOR et al., 1999).
Quanto ao teste de FISH, todos os 15 pacientes com resultado positivo foram
confirmados pelo RT-PCR eliminando falso-positivos no emprego do FISH como teste
diagnóstico. Para os 15 pacientes com resultado negativo no teste de FISH, 4 não foram
confirmados pelo RT-PCR (pacientes 7, 15, 28 e 30). Logo, para o FISH, 26,7% dos
resultados foram falso-negativos. Um deles, o paciente 15, realizou o teste após o
tratamento com o ATRA, mas apresentou resistência ao tratamento, persistindo as
alterações clínicas, segundo relato do médico responsável pelo mesmo, apesar do
diagnóstico morfológico de LPA. Isso sugere que o paciente apresente uma alteração
molecular variante, não identificada pelo FISH nem pelo cariótipo, com formação do
produto gênico PML-RARα detectado pelo RT-PCR. Fica evidente a especificidade do
teste de FISH para a translocação t(15;17)(q22;q21) e não para alterações variantes,
enquanto o RT-PCR garante a detecção do produto gênico associado a doença,
independente da alteração que o gerou.
Alguns estudos, entretanto, mostraram resultados positivos para detecção de
alterações variantes envolvendo os cromossomos 15 e 17 através do teste de FISH
(CHEN et al., 1994) sugerindo que o tipo e o tamanho da sonda empregada, além do
tipo de alteração citogenética, tem relevância no potencial de detecção de alterações
variantes por esse teste.
Os outros três pacientes (7, 28 e 30), com resultado falso-negativo para o FISH,
foram tratados com o ATRA e provavelmente tinham alcançado a remissão da doença,
não relatada pelo médico responsável, restando na fase do teste um pequeno número de
células alteradas em relação ao número de células normais, já que numa contagem de
100 células pelo FISH o resultado foi negativo e no RT-PCR com uma sensibilidade de
até 106 células foi detectada positividade. Essa positividade é característica de doença
residual mínima (MRD), importante para controle do tratamento da doença.
Em relação ao cariótipo, o teste de FISH detectou positividade em dois pacientes
com resultado negativo naquele teste. Em ambos os casos o número de células positivas,
mesmo no teste de FISH, foi menor que 50, dentre as 100 células analisadas. Logo, a
possibilidade de analisar um número maior de células, tanto em metáfases quanto
intérfases, aumenta a probabilidade de serem detectadas células alteradas nos casos de
mosaicismo. Além disso, para os dois casos sem resultado para o Cariótipo, devido a
ausência de metáfases para serem analisadas, foram analisadas para o teste de FISH,
devido a possibilidade de analisar intérfases por este teste. Logo, a possibilidade de se
analisar intérfases confere grande vantagem a essa técnica para o diagnóstico da LPA.
Em resumo, em uma amostra de 30 pacientes, a sensibilidade do teste de FISH
calculada como descrito anteriormente, foi de 82%, menor que a sensibilidade do RTPCR e maior que a sensibilidade do Cariótipo.
Os resultados obtidos por RT-PCR corroboram os dados obtidos na literatura ao
se mostrar mais sensível na detecção do produto da translocação t(15;17). Dentre os
testes empregados neste estudo, este foi o que detectou maior positividade, inclusive em
pacientes tratados, confirmando sua maior sensibilidade na detecção de doença residual
mínima. Além disso, este teste se mostrou específico ao indicar como negativo os
pacientes afetados por outros tipos de translocações cromossômicas.
Entretanto, houve uma variação discordante da maioria dos estudos quanto a
presença dos fragmentos correspondentes aos produtos gênicos das fusões PML-RARα
e RARα-PML. Na maioria dos estudos, a presença do produto PML-RARα foi
visualizada em 100% dos pacientes com a translocação t(15;17), determinando a
positividade da doença. No entanto, neste estudo o produto PML-RARα foi visualizado
em apenas 9 dos 19 pacientes positivos. Nos outros 10 pacientes com a translocação
t(15;17), foi visualizado apenas o produto RARα-PML.
Grinwade e colaboradores (1996), ao encontrar pacientes com o produto da
fusão gênica RARα-PML isoladamente, afirmaram que a presença de qualquer dos
produtos seria igualmente determinante da positividade de LPA, portanto abrange os
resultados obtidos no presente estudo. No mesmo trabalho, os autores sugeriram que a
má qualidade da amostra e a utilização de amostras coletadas após a indução do
tratamento poderiam explicar a ausência do produto da fusão PML-RARα. Além disso,
a possibilidade de existir sítios de splicing alternativo do gene PML, já que estes foram
descritos amplamente, no sítio de anelamento dos iniciadores utilizados também poderia
explicar a ausência do produto da fusão PML-RARα.
Ao contrário dos outros estudos, para os quais a extração de RNA foi feita a
partir da amostra de medula óssea fresca, neste estudo a extração de RNA foi feita a
partir de células fixadas em metanol:ácido acético (3:1), cujo rendimento, qualidade e
influência na amplificação do material são desconhecidas e, portanto, também pode ser
responsável pela ausência do produto RARα-PML.
A presença do produto da fusão gênica RARα-PML em 14 dos 19 pacientes
positivos para a translocação t(15;17), somando a presença isolada e acompanhada do
produto PML-RARα, está de acordo com outros estudos que o identificaram em 70 a
80% dos pacientes positivos (ALCALAY et al., 1992; GRINWADE et al., 1996).
No decorrer da análise dos resultados obtidos neste estudo, alguns
questionamentos quanto a metodologia utilizada para o teste de RT-PCR para
diagnóstico da translocação t(15;17)(q22;q21) foram levantados, apesar de ser uma
metodologia referenciada em trabalhos científicos de grande importância e também da
utilização dos controles.
Inicialmente, a dúvida estava relacionada à possibilidade de contaminação de
uma amostra pelo RNA de outra durante a extração do RNA e também no conjunto de
reações de transcrição reversa e amplificação realizadas, resultando em diagnósticos
falso-positivos, já que as extrações e as reações de transcrição reversa e amplificação
foram realizadas para grupos de pacientes ao mesmo tempo. Essa contaminação é
discutida em vários estudos que utilizam o teste de RT-PCR e gira em torno de 5%
(MELO et al., 1998). Para evitar essa possibilidade de contaminação, além das medidas
de controle utilizadas, tanto a extração quanto as reações de transcrição reversa e
amplificação deveriam ser feitas individualmente, além de utilizar sempre uma amostra
de um paciente sabidamente livre de LPA como controle negativo sendo estas as
modificações a serem feitas no teste para uso futuro.
Outra questão levantada neste estudo, refere-se à possibilidade de resultados
falso-negativos concluídos a partir da ausência de amplificação dos produtos resultantes
das fusões gênicas PML-RARα e RARα-PML.
Erros na transcrição reversa e
amplificação podem ocorrer, já que o controle de amplificação do gene RARα se deu
em reações separadas, de acordo com a metodologia referenciada para este estudo. É
importante lembrar que, para cada paciente, três reações de RT-PCR foram feitas
separadamente: o controle da amplificação do cDNA do RARα normal, amplificação do
cDNA resultante da fusão gênica PML-RARα e amplificação do cDNA resultante da
fusão gênica RARα-PML. O ideal seria que o controle positivo de transcrição reversa e
amplificação do cDNA do RARα normal fosse feito na mesma reação, ou seja, no
mesmo tubo das reações para transcrição reversa e amplificação dos produtos
resultantes da fusão gênica. Isso diminuiria as chances de resultados falso-negativos.
Dessa maneira, considerando a possibilidade de resultado falso-positivo
originado por contaminação e a possibilidade de falso-negativo por erro de
amplificação, os cálculos de sensibilidades dos testes aqui definidos podem representar
valores sub ou superestimados dependendo dos resultados verdadeiramente positivos e
negativos.
Apesar disso, considerações foram feitas para os resultados obtidos neste estudo
por se tratar de testes utilizados na maioria dos serviços de diagnóstico disponíveis.
Dentre os três testes realizados, o mais simples, considerando o menor número
de possíveis falhas na execução da metodologia, e o mais fácil de analisar é o FISH.
Basta que as ferramentas de análise adequadas estejam disponíveis e que as instruções
do fabricante da sonda sejam seguidas. O Cariótipo exige estrutura adequada e
manipulação especializada, além do controle de fatores externos algumas vezes difíceis
de serem controlados, tais como temperatura e umidade do ambiente, além de exigir
amplo treinamento para análise do resultado. Quanto ao RT-PCR, as dificuldades estão
na execução da metodologia, pois exige atenção durante a manipulação das amostras
além do uso de reagentes e ambiente livres de RNAse. A análise de resultados do RTPCR faz parte da rotina de um laboratório de biologia molecular.
A agilidade na liberação do resultado, que consiste na rapidez na liberação do
mesmo, também é um ponto relevante na definição do teste diagnóstico a ser utilizado
visto que, em caso de evolução rápida, é necessário o diagnóstico rápido da doença para
início imediato do tratamento. Neste estudo o prazo médio para liberação do teste de
RT-PCR foi de três dias, podendo ser reduzido para dois e até mesmo 1 dia se todos os
procedimentos forem feitos seguidos um do outro. O prazo de liberação médio para o
resultado do teste de FISH foi de 5 dias podendo ser reduzido para três dias ao realizar a
hibridização das células contidas na amostra colhida, ou seja, sem cultivo celular,
enquanto o Cariótipo levou oito dias para ter o resultado liberado.
Quanto à especificidade, na fase de diagnóstico é mais vantajoso que o teste não
seja específico para a LPA para que outras alterações associadas a outras doenças
possam ser detectadas. Na fase de controle do tratamento, é necessário que o teste seja
específico para a LPA para que seja percebida a eficiência do tratamento utilizado.
Quanto ao custo, o teste de FISH dispende maiores gastos, já que as sondas
fluorescentes disponíveis no mercado são importadas, além do uso de equipamentos de
tecnologia de alto custo. O RT-PCR tem custo intermediário, enquanto o Cariótipo
utiliza reagentes e insumos de valor mais baixo do que o FISH e o RT-PCR.
Todas as variáveis consideradas relevantes na definição do teste laboratorial de
diagnóstico da LPA estão organizadas na Tabela 3. Para cada teste foi definido o grau
de indicação da sua utilização de acordo com as variáveis avaliadas neste estudo.
Tabela 3: Grau de indicação do teste de acordo com as variáveis avaliadas.
VARIÁVEIS
CARIÓTIPO
FISH
RT-PCR
Sensibilidade
+
++
+++
Execução
+
+++
++
Agilidade
+
++
+++
Especificidade ao diagnóstico
+++
+
++
Especificidade ao tratamento
+
++
+++
Custo
+++
+
++
+:menos indicado; ++: mediamente indicado; +++: mais indicado;
VII- CONCLUSÕES
A partir deste estudo foi possível constatar a necessidade de se conhecer a
aplicação de cada teste diagnóstico na identificação da translocação t(15;17), com o
objetivo de adequar o teste à condição clínica e financeira do paciente, visando obter
resultados confiáveis que garantam o sucesso do tratamento a ser empregado. Além
disso, é preciso levar em consideração as variações dentro de cada técnica para
interpretação dos resultados obtidos.
Tendo em vista os resultados expostos e considerando a sensibilidade, a
execução, a agilidade, a especificidade versus aplicabilidade e o custo, na escolha do
teste utilizado para diagnóstico da LPA, é recomendável a aplicação do Cariótipo como
teste inicial quando as características clínicas da doença são confusas e existe a
possibilidade de uma outra doença envolvida. O Cariótipo foi o único dos três testes
capaz de detectar alterações cromossômicas variantes e alterações secundárias
associadas a LPA, além de alterações associadas com outras doenças que possuem
características clínicas em comum e que confundem o diagnóstico.
Em caso de resultado negativo para o Cariótipo e persistência das características
clínicas de LPA, o FISH seria recomendável por ser um teste mais confiável do que o
RT-PCR.
Caso ainda persistam as características clínicas da LPA e o resultado para o
FISH seja negativo, o teste de RT-PCR aumentaria a possibilidade de detectar poucas
células alteradas por ter se mostrado mais sensível.
O FISH é o teste mais recomendado quando um dos testes para identificação da
translocação t(15;17) for utilizado na fase de controle da doença após o tratamento, ou
seja, quando é esperado um número pequeno ou nulo de células alteradas. O teste de
RT-PCR, apesar de ser considerado o padrão-ouro para detecção de Doença Residual
Mínima (MRD), se utilizado da maneira que foi realizado neste estudo, apresenta
possibilidade de gerar resultados falso-positivos e também falso-negativos.
Portanto, será necessário realizar modificações no teste de RT-PCR sugeridas
neste trabalho, para que a confiabilidade no teste somada a sua sensibilidade superem o
teste de FISH na fase de controle do tratamento da doença.
VII- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS*
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ANEXO I
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para maiores de 18 anos
Projeto: Estudo da translocação t(15;17) por citogenética convencional, FISH e
RT-PCR em pacientes com Leucemia Promielocítica Aguda (LPA)
A leucemia é uma doença que afeta a formação das células sanguíneas e tem
como conseqüência o aumento exagerado de um ou mais tipos de células no sangue. O
tipo de célula acumulado definirá qual tipo de leucemia se desenvolverá. Basicamente,
se as células acumuladas forem da linhagem mielóide, a leucemia desenvolvida será a
Leucemia Mielóide. Por outro lado se as células acumuladas forem da linhagem
linfóide, a leucemia desenvolvida será a Leucemia Linfóide. Dependendo da progressão
da doença esses dois tipos de leucemia, mielóide e linfóide, se subdividem em dois
grupos: o grupo das Leucemias Agudas com progressão rápida e agressiva e o grupo das
Leucemias Crônicas com progressão mais lenta.
A Leucemia Mielóide Aguda (LMA) ocorre em todas as faixas etárias sendo a
forma mais comum de leucemia aguda em adultos. Sua incidência aumenta com a idade.
De acordo com a morfologia das células afetadas, com a coloração citoquímica, com os
aspectos imunológicos e genéticos a LMA se divide em oito subtipos denominados M0,
M1, M2, M3, M4, M5, M6 e M7. As características clínicas variam de acordo com
cada subtipo e os tratamentos em desenvolvimento também. Portanto, para garantir que
o tratamento empregado tenha sucesso e alcance resultados positivos com recuperação
do paciente, é preciso diagnosticar com rapidez e com precisão o subtipo em questão.
Neste trabalho, temos como objetivo comparar três técnicas de diagnóstico
diferentes utilizadas para detectar a translocação entre os cromossomos 15 e 17 presente
em 90% dos casos de LMA-M3. Esta translocação promove a troca de partes dos
cromossomos envolvidos permitindo o rearranjo de dois genes cujas funções normais
estão associadas ao processo de formação das células sanguíneas e que após
rearranjados perdem esta função e acontece uma desregulação na diferenciação celular
seguida de proliferação desordenada levando a leucemia.
O trabalho será desenvolvido visando estabelecer a conduta mais indicada para
o diagnóstico rápido e preciso deste subtipo de leucemia para o qual existe tratamento
específico e com resultados bastante promissores. O tratamento se baseia na utilização
do ácido transretinóico (ATRA) que exerce um efeito negativo no rearranjo gênico
promovido pela translocação, permitindo uma remissão completa das complicações
trombo-hemorrágicas.
Fica garantido aos participantes deste trabalho o sigilo sobre os dados clínicos e
laboratoriais, e a proteção de sua identidade em caso de publicação na imprensa
científica.
Como serão utilizadas amostras de medula óssea remanescentes de outros
exames, este estudo não oferecerá quaisquer riscos aos participantes em estudo.
O participante será beneficiado com um diagnóstico realizado por três
metodologias distintas e será informado dos resultados da pesquisa através do seu
médico.
Os resultados desta pesquisa serão divulgados em forma de resumo em eventos
científicos e envio para apreciação e publicação em periódicos nacionais e internacionais
podendo ser consultados para pesquisas relacionadas, com devido sigilo sobre a
identidade dos pacientes.
A coordenação do projeto é do Prof. WILHAM JORGE responsável pelo
Laboratório de Citogenética localizado no Bloco L3 do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Minas Gerais.
Ressarcimento ou indenização não se aplicam para o caso de não obtenção de
resultados sejam por que razão for.
Todo o material biológico, após cultura de células e extração de RNA, será
descartado segundo as normas da Vigilância Sanitária.
Eu,_____________________________________________________________,
( ) concordo em participar do trabalho: Estudo da translocação t(15;17) por
citogenética convencional, FISH e RT-PCR em pacientes com Leucemia
Promielocítica Aguda (LPA) e permito que seja utilizada minha amostra de medula
óssea remanescente de outros exames para o estudo acima citado.
( ) não concordo em participar do trabalho: Estudo da translocação t(15;17)
por citogenética convencional, FISH e RT-PCR em pacientes com Leucemia
Promielocítica Aguda (LPA) e não permito que seja utilizada minha amostra de
medula óssea remanescente de outros exames para o estudo acima citado.
Assinatura do paciente: ____________________________________________
Data: ___ / ___ / ___
Assinatura o pesquisador Responsável: _______________________________
Data: ___ / ___ / ___
Contatos:
- Pesquisador Responsável: Prof. Wilham Jorge
Endereço: Avenida Antônio Carlos, N06627, Pampulha – CEP 31270-901– Belo
Horizonte/MG Telefone: 031 3499 2612.
- Colaborador: Victor Cavalcanti Pardini
Endereço: Rua Aimorés, N033, Funcionários – CEP 30140-070 – Belo Horizonte/MG
Telefone: 031 3228 6200
- Orientada: Cristiane Saraiva da Silva Ferreira
Endereço: Paulo Diniz Carneiro, N0191/404, Buritis – CEP 30575-820 – Belo
Horizonte/MG
Telefone: 031 3378 3407
- Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais
(COEP/UFMG)
Endereço: Avenida Antônio Carlos N06627, Pampulha – CEP 31270-901– Belo
Horizonte/MG
Telefone: 031 3499 4592.
ANEXO II
Termo de Consentimento Livre e Esclarecido para menores de 18 anos
Projeto: Estudo da translocação t(15;17) por citogenética convencional, FISH e
RT-PCR em pacientes com Leucemia Promielocítica Aguda (LPA)
A leucemia é uma doença que afeta a formação das células sanguíneas e tem
como conseqüência o aumento exagerado de um ou mais tipos de células no sangue. O
tipo de célula acumulado definirá qual tipo de leucemia se desenvolverá. Basicamente,
se as células acumuladas forem da linhagem mielóide, a leucemia desenvolvida será a
Leucemia Mielóide. Por outro lado se as células acumuladas forem da linhagem
linfóide, a leucemia desenvolvida será a Leucemia Linfóide. Dependendo da progressão
da doença esses dois tipos de leucemia, mielóide e linfóide, se subdividem em dois
grupos: o grupo das Leucemias Agudas com progressão rápida e agressiva e o grupo das
Leucemias Crônicas com progressão mais lenta.
A Leucemia Mielóide Aguda (LMA) ocorre em todas as faixas etárias sendo a
forma mais comum de leucemia aguda em adultos. Sua incidência aumenta com a idade.
De acordo com a morfologia das células afetadas, com a coloração citoquímica, com os
aspectos imunológicos e genéticos a LMA se divide em oito subtipos denominados M0,
M1, M2, M3, M4, M5, M6 e M7. As características clínicas variam de acordo com
cada subtipo e os tratamentos em desenvolvimento também. Portanto, para garantir que
o tratamento empregado tenha sucesso e alcance resultados positivos com recuperação
do paciente, é preciso diagnosticar com rapidez e com precisão o subtipo em questão.
Neste trabalho, temos como objetivo comparar três técnicas de diagnóstico
diferentes utilizadas para detectar a translocação entre os cromossomos 15 e 17 presente
em 90% dos casos de LMA-M3. Esta translocação promove a troca de partes dos
cromossomos envolvidos permitindo o rearranjo de dois genes cujas funções normais
estão associadas ao processo de formação das células sanguíneas e que após
rearranjados perdem esta função e acontece uma desregulação na diferenciação celular
seguida de proliferação desordenada levando a leucemia.
O trabalho será desenvolvido visando estabelecer a conduta mais indicada para
o diagnóstico rápido e preciso deste subtipo de leucemia para o qual existe tratamento
específico e com resultados bastante promissores. O tratamento se baseia na utilização
do ácido transretinóico (ATRA) que exerce um efeito negativo no rearranjo gênico
promovido pela translocação, permitindo uma remissão completa das complicações
trombo-hemorrágicas.
Fica garantido aos participantes deste trabalho o sigilo sobre os dados clínicos e
laboratoriais, e a proteção de sua identidade em caso de publicação na imprensa
científica.
Como serão utilizadas amostras de medula óssea remanescentes de outros
exames, este estudo não oferecerá quaisquer riscos aos participantes em estudo.
O participante será beneficiado com um diagnóstico realizado por três
metodologias distintas e será informado dos resultados da pesquisa através do seu
médico.
Os resultados desta pesquisa serão divulgados em forma de resumo e pôsteres em
eventos científicos e envio para apreciação e publicação em periódicos nacionais e
internacionais podendo ser consultados para pesquisas relacionadas.
A coordenação do projeto é do Prof. WILHAM JORGE responsável pelo
Laboratório de Citogenética localizado no Bloco L3 do Instituto de Ciências Biológicas
da Universidade Federal de Minas Gerais.
Ressarcimento ou indenização não se aplicam para o caso de não obtenção de
resultados sejam por que razão for.
Todo o material biológico, após cultura de células e extração de RNA, será
descartado segundo as normas da Vigilância Sanitária.
Eu, ___________________________________________________________________
(
)
concordo
e
me
responsabilizo
pela
participação
de
____________________________________________________________ no trabalho:
Estudo da translocação t(15;17) por citogenética convencional, FISH e RT-PCR
em pacientes com Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) e permito que seja
utilizada sua amostra de medula óssea remanescente de outros exames para o estudo
acima citado.
( ) não concordo e não me responsabilizo pela participação de
______________________________________________________ no trabalho: Estudo
da translocação t(15;17) por citogenética convencional, FISH e RT-PCR em
pacientes com Leucemia Promielocítica Aguda (LPA) e não permito que seja
utilizada sua amostra de medula óssea remanescente de outros exames para o estudo
acima citado.
Assinatura do RESPONSÁVEL____________________________________________
Data: ___ / ___ / ___
Assinatura do pesquisador Responsável:______________________________________
Data: ___ / ___ / ___
Contatos:
- Pesquisador Responsável: Prof. Wilham Jorge
Endereço: Avenida Antônio Carlos N06627, Pampulha – CEP 31270-901– Belo
Horizonte/MG Telefone: 031 3499 2612.
- Colaborador: Victor Cavalcanti Pardini
Endereço: Rua Aimorés, N0 33, Funcionários – CEP 30140-070 – Belo Horizonte/MG
Telefone: 031 3228 6200
- Orientada: Cristiane Saraiva da Silva Ferreira
Endereço: Paulo Diniz Carneiro, N0 191/404, Buritis – CEP 30575-820 – Belo
Horizonte/MG - Telefone: 031 3378 3407
- Comitê de Ética em Pesquisa da Universidade Federal de Minas Gerais
(COEP/UFMG)
Endereço: Avenida Antônio Carlos N06627, Pampulha – CEP 31270-901– Belo
Horizonte/MG - Telefone: 031 3499 4592.