Produção de
Proteínas
Recombinantes

O que são proteínas recombinantes?
São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes clonados.
Isto é, advêm da técnica de DNA recombinante.

Para que servem?
A produção de proteínas recombinantes permite obter benefícios em
várias áreas:
- saúde;
- biologia;
- bioquímica;
- microbiologia;
- genética;
- biotecnologia;
- agricultura;
- etc.
Algumas aplicações

Terapia gênica
Possibilidade de introdução de um gene num organismo e
consequente correção de doenças genéticas.

Melhoramento animal e vegetal
Plantas resistentes a pragas e a
diferentes meios nutritivos.
Animais de maiores dimensões,
mais férteis e carne com maior qualidade.

Criação de modelos animais
www.dqb.fc.ul.pt
Ideais para o estudo da estrutura, função e regulação de um gene, além
de facilitar a compreensão da fisiopatologia da doença.
Técnica de produção de proteínas recombinantes
• Isolar e preparar o DNA;
• Escolher o vetor apropriado;
• O fragmento de DNA a clonar é
introduzido em vectores de
clonagem, formando-se o DNA
recombinante.
• O DNA recombinante é inserido na
célula hospedeira – transformação,
que possui mecanismos enzimáticos
para a replicação do DNA e para a
síntese protéica;
• Selecção e identificação de células
que incorporam o DNA
recombinante;
• Verificar se a proteína foi expressa;
• Remoção e purificação das
proteínas.
The Cell- A Molecular Approach;Cooper, Geoffrey M..
Algumas enzimas envolvidas no processo
Enzimas
Função
Tipo II (endonuclease de restrição)
Cortam os DNAs em sequências de
bases específicas.
DNA ligase
Juntam duas moléculas de DNA ou
fragmentos.
Taq DNA polimerase
Adiciona os nucleotídeos na
extremidade 3´ da cadeia de DNA.
Transcriptase reversa
Produz uma molécula de DNA
através de uma molécula de RNA.
● Enzimas de restrição- Endonucleases
Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas
recombinantes são normalmente gerados por digestão através de
endonucleases de restrição ou PCR
. Conhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6
pares de bases.
. São designadas por três letras: EcoRI, HindIII.
Vetores de clonagem





Capaz de transportar uma seqüência de DNA estranha dando
origem a um DNA híbrido ou recombinante.
Capacidade de se auto-replicar.
Conter pelo menos um gene que confira resistência a antibióticos.
Possuir locais de restrição únicos, polylinker.
Fácil de purificar.
Tipos de vectores de clonagem
•
Plasmídeos (pBR322)
•
Fasmídeos ou fagemídeos
•
Cosmídeos
•
Bacteriófagos λ
•
YACs, BACs e PACs
www.biologianaweb.com/ Livro2/C11/pbr322.html
Vetores de expressão



Promotor
Códon de iniciação seguido de polylinker
Local de ligação ao ribossoma
Promotor
Local de ligação ao
ribossoma
Sítio de clonagem e
sequência codificante de 6
histidinas
www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html
www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html
Vetores para
clonagem gênica
O que precisa um vetor para servir de
molécula carreadora?

A escolha de um vetor depende do design do
experimento e de como o gene/proteína clonados
serão pesquisados posteriormente

Alguns vetores contêm uma origem procariótica de
replicação o qual permite sua manutenção em
bactérias.


Alguns vetores contêm uma origem
eucariótica de replicação permitindo
replicação autônoma e epissomal em células
eucarióticas.
Sítios de clonagem múltiplos são geralmente
incluídos para versatilidade e construção de
bibliotecas genômicas.


Genes de resistência a antibióticos e/ou marcadores
selecionados permitem a identificação de células
que adquiriram o vetor.
Alguns vetores possuem promotores induíveis ou
tecido-específicos que permitem a expressão
controlada dos genes introduzidos em células
transfectadas ou animais transgênicos.

Vetores mais modernos possuem elementos
multi-funcionais que permitem uma
combinação de clonagem, seqüenciamento
de DNA transcrição e replicação epissomal.
Muitos tipos de vetores

Plasmídeos, bacteriófagos, cosmídeos,
cromossomo artificial bacteriano (BAC),
cromossomo artificial de fungos (YAC),
retrovírus, vetor de baculovírus...
Escolha do vetor


Depende da natureza e do protocolo de
experimento
Tipo de célula que vai receber o vetor


Procariótica
Eucariótica
Vetor de Plasmídeo



Fechado, circular, DNA dupla fita, ocorre naturalmente em
bactérias e replica extracromossomalmente
Muitos conferem resistência a drogas para cepas bacterianas
Origem de replicação presente (ORI)

Examplos

pBR322
 Um dos primeiros plasmídeos utilizados
 Dois marcadores (resistência a Amp and Tet)
 Vários sítios de restrição espalhados através do plasmídeo
 ColE1 ORI

pUC18


Derivado do pBR322
Vantagens sobre pBR322:



Pode acomodar fragmentos de DNA maiores durante a
clonagem (5-10kbp)
MAior número de cópias por célula (500 per cell = 5-10x
mais que pBR322)
Múltiplos sítios de clonagem = “polylinker”
Esquema geral de clonagem

O vetor e o gene a ser clonado são purificados
separadamente e depois ligados entre si

Produtos ligados são introduzidos em células
competentes por técnicas de transformação. As
colônias são analizadas individualmente.


Os vetores que vêm de bactérias que
sobreviveram à seleção por antibióticos são
amplificados em outras bactérias
O plasmídeo contendo DNA é purificado em
larga escala
F. Vetores cosmídeos

Moléculas híbridas contendo DNA de plasmídeos e
de bacteriófagos lambaLambda components: COS
sequences (required for in vitro packaging into
phage coats)


Componentes do plasmídeo: ORI + Gene de resistência
aos antibióticos
Os sítios de clonagem vêm do lambda
F. Vetores cosmídeos


Após a transformação da bactéria, o rDNA
replica como plasmídeo.
Insertos bem grandes podem ser
acomodados por cosmídeos (mais de 35-45
kbp)
Bacterial artificial
chromosomes (BACs)




Pode acomodar mais de 1 Mb de DNA (= 1000kbp)
Vários componentes de replicação e de controle de
número de cópias estão presentes
Marcadores e sítios de clonagem em diferentes
lugares
Outras características:

Prmotores SP6 and T7
 Síntese de RNA mais eficiente
 Sondas de RNA para hibridização
Bacterial artificial
chromosomes (BACs)
I. Yeast artificial
chromosomes (YACs)

Molécula híbrida contendo componentes de fungos, protozoários
e bactérias (plasmídeos)

ORI = ARS (autonomously replicating sequence)
 MArcadores (TRP1 and URA3)
 Centrômero de fungos
Protozoa= Tetrahymena
 Sequências de telômeros




Plasmídeos bacterianos

Polylinker
Pode acomodar >1Mb (1000kbp = 106 bp)
I. Yeast artificial
chromosomes (YACs)
I. Yeast artificial
chromosomes (YACs)
Human artificial chromosomes




Devenvolvidos em 1997 – sintéticos, autoreplicantes
1/10 do tamanho de um cromossomo normal
Microcromossomo que passa para as células
durante a mitose
Contém:





ORI
Centrômero
Telômero
Cap protetor de DNA repetitivo no fim do cromossomo
Histonas dadas pela célula hospedeira
J. Human artificial
chromosomes
Transformação

Ocorre quando uma célula
incorpora e exprime um fragmento
de material genético.

Para a introdução do DNA
recombinante podem ser utilizados
vários métodos:
•
•
•
•
•
Células competentes;
Eletroporação;
Bombardeamento de DNA
revestido de Tungsténio;
Microinjeção;
Transfecção.
Modern Genetic Analysis.
Extracção e purificação de proteínas
• Extração
lise celular
• Purificação
Cromatografia de afinidade
Lehningher Principles of Biochemistry
Tags moleculares de fusão
Fusion Tag
Immobilized
Ligand
Binding Conditions
Elution Conditions
Available Formats
Glutathione (Stransferase(GS
T)
Reduced glutathione
Neutral (physiologic) pH,
and non-denaturing;
glutathione must be
reduced and GST must be
active
Free reduced
glutathione at neutral
pH (competitor)
Prepacked column
kits, spin cup column
kits, SwellGel Discs,
coated microplates
Histidine-tagged
Chelated Nickel or
Cobalt
Neutral (physiologic) pH
without reducing or
oxidizing agents; small tag
must be accessible in
fusion protein structure;
high ionic strength and
denaturants (chaotropes
such as 8 M urea)
compatible.
>200 mM Imidazole,
low pH, or strong
chelators
Prepacked column
kits, spin cup column
kits, SwellGel Discs,
Swell- Gel Discs in
96-well filter plates,
coated microplates
Maltose
Binding
Protein (MBP)
Dextrin
Neutral (physiologic) pH
and non-denaturing; NaCl
added to reduce
nonspecific binding
Maltose at neutral pH
(competitor)
Gel slurry, coated
microplates
Green
Fluorescent
Protein (GFP)
Anti-GFP antibody
Neutral (physiologic) pH
and non-denaturing
Usual
antibody/antigen
elution buffers (e.g.,
low pH or chaotropic
salts)
Coated microplates
Exemplos de Proteínas Recombinantes

Hormônio de crescimento humano – a administração deste hormônio
durante a infância permite a correção dos casos de nanismo.

Anticoagulantes – ativadores de plasminogênio tecidual que por sua
vez ativam a plasmina, enzima que dissolve os trombos (evita ataques
cardíacos).

Dismatase do superóxido – previne danificação de tecidos
quando este é exposto à falta de oxigênio.

Anticorpos monoclonais – são usados em testes
diagnósticos; transporte direccionado
(drogas, toxinas, componentes radioactivos
utilizados na terapia cancerígena), assim
como outras aplicações.
ioh.medstudents.com.br/ humoral.htm
Insulina
Referência cronológica

1922 - Frederick Grant Banting descobre a insulina.

1978 - É produzida insulina humana recombinante.

1982 - Esta insulina é disponibilizada no mercado.
Insulina
-
-
Duas cadeias peptídicas- cadeia A e cadeia B.
Duas pontes dissulfeto entre as cadeias A e B e outra na própria cadeia A.
Insulina recombinante
Monômeros- Insulina é
ativa na forma de
monômeros.
Dímeros – pontes de
hidrogênio entre as
extremidades C da
cadeia B.
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm
Zn 2+
Produção de insulina

Insulina proveniente de suínos e bovinos

Insulina humana biossintética
Introduction to Genetic Analysis.
Purify β-gal- insulin
fusion proteins
Β-gal
SAG
Seqüência
Referência
SAG1
Forward: CGGAATTCATGTCGGTTTCGCTGCACCAC
Reverse: CCCAAGCTTCACTCACGCGACACAAGCTG
Burg et al, 1988
SAG2
Forward: GCGGATCCATGAGTTTCTCAAAGACCACG
Reverse: GGGAATTCTTACACAAACGTGATCAACAA
Parmley et al, 1992
SAG3
Forward: GAGGATCCATGCAGCTGTGGCGGCGCAG
Reverse: GGGAATTCTTAGGCAGCCACATGCACAA
Cebron-Delauw, 1994
Padrão
1500pb
900pb
500pb
400pb
300pb
200pb
100pb
SAG2
SAG1
SAG3
A- SAG1 – CEPA RH
5`ATGTCGGTTTCGCTGCACCACTTCATTATTTCTTCTGGTTTTTTGACGAGTATGTTTCCGAAGGCAGTGAGACGCGCCGTCACGGCAG
GGGTGTTTGCCGCGCCCACACTGATGTCGTTCTTGCGATGTGGCGTTATGGCATCGGATCCCCCTCTTGTTGCCAATCAAGTTGTCACC
TGCCCAGATAAAAAATCGACAGCCGCGGTCATTCTCACACCGACGGAGAACCACTTCACTCTCAAGTGCCCTAAAACAGCGCTCACA
GAGCCTCCCACTCTTGCGTACTCACCCAACAGGCAAATCTGCCCAGCGGGTACTACAAGTAGCTGTACATCAACGGCTGTAACATTGA
GCTCCTTGATTCCTGAAGCAGAAGATAGCTGGTGGACGGGGGATTCTGCTAGTCTCGACACGGCAGGCATCAAACTCACAGTTCCAA
TCGAGAAGTTCCCCGTGACAACGCAGACGTTTGTGGTCGGTTGCATCAAGGGAGACGACGCACAGAGTTGTATGGTCACGGTGACAG
TACAAGCCAGAGCCTCATCGGTCGTCAATAATGTCGCAAGGTGCTCCTACGGTGCAGACAGCACTCTTGGTCCTGTCAAGTTGTCTGC
GGAAGGACCCACTACAATGACCCTCGTGTGCGGGAAAGATGGAGTCAAAGTTCCTCAAGACAACAATCAGTACTGTTCCGGGACGAC
GCTGACTGGTTGCAACGAGAAATCGTTCAAAGATATTTTGCCAAAATTAACTGAGAACCCGTGGCAGGGTAACGCTTCGAGTGATAAG
GGTGCCACGCTAATGATCAAGAAGGAAGCATTTCCAGCCGAGTCAAAAAGCGTCATTATTGGATGCACAGGGGGATCGCCTGAGAAG
CATCACTGTACCGTGAAACTGGAGTTTGCCGGGGCTGCAGGGTCAGCAAAATCGGCTGCGGGAACAGCCAGTCACGTTTCCATTTTT
GCCATGGTGATCGGACTTATTGGCTCTATCGCAGCTTGTGTCGCGTGA 3`
B- SAG2 – CEPA RH
5´ATGAGTTTCTCAAAGACCACGAGCCTAGCGTCGCTAGCGCTCACGGGCTTGTTTGTTGTGTTCAAGTTCGCTCTTGCGTCCACCACC
GAGACGCCAGCACCCATTGAGTGCACTGCCGGCGCAACGAAGACTGTTGATGCACCCTCCAGTGGTTCCGTTGTCTTCCGATGTGGG
GATAAACTAACCATCAGTCCCAGTGGCGAAGGTGATGTCTTTTATGGCAAGGAATGCACAGACTCGAGGAAGTTGACGACTGTCCTTC
CAGGTGCGGTCTTGGCAGCTAAGGTCGAGCAGCCCCCGAAAGGTCCTGCTACCTACACACTGTCTTACGACGGTACTCCCGAGAAAC
CTCAGGTTCTCTGTTACAAGTGCGTTGCCGAAGCAGGTGCTCCCGCTGGTCGAAATAATGATGGTGGTTCTAGCGCTCCGACGCCTAA
AGACTGCAAACTCATTGTTCGCGTTCCGGGTGCCGATGGCCGTGTCACATCTGGGTTTGACCCTGTGTCTCTCACGGGCAAGGTTCTT
GCTCCCGGTCTCGCAGGTTTGTTGATCACGTTTGTGTAA 3`
C- SAG3 – cepa rh
5´ATGCAGCTGTGGCGGCGCAGAGCAGCAGGTCCCGCGAGCCTGGGGAGGCAGTCTTTGCCGCTCGGGTGTTTTTTCGCGGCTTTTGG
TTTGTGCGTGTTGTCTGCGATCTTGGGAACCGGAGAGCACGGACTGTTCGTCGCCGCAGGGAAATCGAGAAGTAAGATAACCTATTTT
GGCACGCTCCTCAAGAAGGCTCCGAACTGGTACCGCTGCTCTTCAACGAGGGCGAATGAAGAGGTCGTAGGACATGTGACGCTGAA
CAAAGAGCACCCTGATATGACAATTGAATGCGTCGACGACGGCTTGGGCGGAGAGTTTTTGCCGCTCGAAGGCGGCACGTCGTCGTA
CCCGCGAGTATGTCACATTGATGCCAAGGACAAGGGCGACTGCGAGCGCAACAAGGGCTTTCTGACCGACTACATACCGGGCGCGA
ACAGGTACTGGTACAAGATAGAAAAGGTGGAGAACAACGGCGAGCAATCCGTTCTGTACAAATTCACAGTTCCTTGGATATTCCTTCC
GCCCGCCAAGCAGCGATACAAGGTTGGATGCCGATACCCGAACCACGAGTATTGCTTTGTTGAGGTCACCGTCGAACCCACGCCGCC
AATGGTCGAAGGCAAGAGAGTGACCTGCGGGTATCCCGAGTCCGGCCCCGTGAATCTCGAGGTGGACTTGTCAAAGGACGCGAACT
TTATCGAGATTCGGTGCGGCGAACAGCACCACCCGCAGCCGTCGACCTACACGCTGCAGTACTGCTCAGGTGACTCGGTGGACCCGC
AGAAGTGTTCGCCGCAGTCCCTGACGAACATTTTTTATGACTACAGCTCTTCGTGGTGGAAGGGGAAACTGAACGGGCCTGACGGGG
CAACTCTCACCATTCCACCCGGCGGGTTCCCCGAAGAAGACAAATCTTTTCTTGTCGGGTGTTCACTCACTGTGGACGGGCCGCCCTT
CTGCAACGTCAAAGTGAGAGTTGCCGGGAACCCCAGAAAGTGGGGGAGAGGCGGAGGCGGCCATCCAGGAAGCGGAGGATTGCAG
CCGGGAACTGAAGGGGAAAGTCAAGCTGGAACAGAAAGTTCAGCCGGCGCGAGTTCGCGAATGGCTTCCGTTGCCCTGGCGTTCCTT
CTCGGTCTCCTTGTGCATGTGGCTGCCTAA 3´
A - SAG1
M S V S LH H F I I S S G F LT S M F PKAV R RAV TAG V FAAP T LM S F L
R C G V MAS D PP LVAN Q V V T C PD K K S TAAV I LT PT E N H F T LK C
PKTALTEPPTLAYSPNRQICPAGTTSSCTSKAVTLSSLIPEA
EDSWWTGDSASLDTAGIKLTVPIEKFPVTTQTFVVGCIKGD
DAQSCMVTVTVQARASSVVNNVARCSYGADSTLGPVKLSA
EGPTTMTLVCGKDGVKVPQDNNQYCSGTTLTGCNEKSFKD
ILPKLTENPWQGNASSDKGATLTIKKEAFPAESKSVIIGCTG
G S P E K H H C T V K LE FAGAAG SAK SAAG TAS H V S I FAM V I G LI
G S IAAC VA
B - SAG2
MS FS K TTS LAS LALTG LFV V FK FALAS TTE TPAPIE CTAGAT
KTVDAPSSGSVVFRCGDKLTISPSGEGDVFYGKECTDSRK
LT T V LPGAV LAAK V E Q PPK G PATYT LSYD G T PE K P Q V LCY K
CVAEAGAPAGRNNDGGSSAPTPKDCKLIVRVPGADGRVTS
GFDPVSLTGKVLAPGLAGLLITFV
C - SAG3
M Q LW R R RAAG PAS LG R Q S LP LG C F FAAF G LC V LSAI LG T G
E H G LF VAAG K S R S K I TYF G T LLK KAPN WY R C S S T RAN E E V V
GHVTLNKEHPDMTIECVDDGLGGEFLPLEGGTSSYPRVCHI
DAKDKGDCERNKGFLTDYIPGANRYWYKIEKVENNGEQSV
LYKFTVPWIFLPPAKQRYKVGCRYPNHEYCFVE VTV EPTPP
MVEGKRVTCGYPESGPVNLEVDLSKDANFIEIRCGEQHHP
QPSTYTLQYCSGDSVDPQKCSPQSLTNIFYDYSSSWWKGK
LNGPDGATLTIPPGGFPEEDKSFLVGCSLTVDGPPFCNVKV
RVAGNPRKWGRGGGGHPGSGGLQPGTEGESQAGTESSAG
AS S R MAS VALAF LLG LLV H VAA
SAG3
Plasm
SAG1
SAG2
Padrão
45 Kda
35 Kda
24Kda
Positivo
SAG1
SAG2
SAG3
Negativo
IgGTotal
Neg
25000
Pos
IgG1
Neg
86%
IgG3
Pos
Neg
76%
Pos
40%
SAG1
RLU
20000
15000
10000
5000
24%
14%
60%
0
25000
28%
68%
62%
SAG2
RLU
20000
15000
10000
5000
32%
72%
38%
0
25000
RLU
SAG3
27%
62%
71%
20000
15000
10000
5000
38%
29%
63%
0
25000
76%
RLU
32%
68%
20000
GIPLs
15000
10000
5000
0
32%
24%
68%