Atresia das vias biliares extra-hepáticas:
Expressão gênica em um modelo experimental
Autora:
Elisa de Carvalho
Brasília - 2005
Orientador:
Luiz Alberto Simeoni
Co-orientador:
Jorge A. Bezerra
Universidade de Brasília
Cincinnati Children's
Hospital Medical Center
I - Introdução
AVBEH: principal indicação de transplante hepático
AVBEH: principal indicação de transplante hepático
AVBEH: 50% dos transplantes hepáticos pediátricos
BALISTRERI, W. F. et al. Biliary atresia: current concepts and research directions.
Summary of a symposium. Hepatology 23, 1682-1692 (1996).
Nenhuma outra patologia, nem na idade adulta, é responsável por essa
monta de indicação para o transplante.
AVBEH
Complicações da
portoentorostomia
Complicações da
doença
Colangite
Colestase
?
Progressão da
hepatopatia
Hipertensão portal
Cirrose biliar
Varizes esofagogástricas
Hiperesplenismo
Ascite
Insuficiência hepática
Síndrome hepatopulmonar
Síndrome heparorrenal
Terapêutica: portoenterostomia
Evolução
pósDiagnóstico tardio
portoenterostomia
Etiopatogênese
?
Etiopatogênese
Predisposição genética
Desenvolvimento do
fígado e vias biliares
Injúria durante o
desenvolvimento
dos ductos biliares
(primeiro trimestre)
Defeitos na morfogênese:
Genes da lateralidade
INV
CFC1
ZIC3
Má-formação da placa ductal
JAG 1
HNF-6
HNF-1β
Fatores ambientais
(infecção viral)
Reovírus
Rotavírus
Citomegalovírus
HLA
Fatores anatômicos
Toxicidade
Ácidos biliares tóxicos
AVBEH
(embrionária)
Artéria hepática
Canal pancreatobiliar
AVBEH
(perinatal)
Embrionária
20 %
Disfunção imune no
neonato
Resposta TH1
Células T CD8+
Células NK
Macrófagos
Auto-imunidade
Perinatal
80 %
Histologia das vias biliares
Obstrução progressiva
das VBEH
Modelo animal: AVBEH
Rotavírus rhesus do grupo A
PHILLIPS, P. A. et al. Chronic
obstructive jaundice induced by
Reovirus type 3 in weanling
mice. Pathology 1, 193-203
(1969).
SCHMELING, D. J. et al.
Experimental obliterative
cholangitis. A model for the
study of biliary atresia. Ann.
Surg. 213, 350-355 (1991).
RIEPENHOFF-TALTY, M. et al.
Group A rotaviruses produce
extrahepatic biliary obstruction
in orally inoculated newborn
mice. Pediatr. Res. 33, 394399 (1993).
PETERSEN, C. et al.
New aspects in a murine model
for extrahepatic biliary atresia.
J. Pediatr. Surg. 32, 1190-1195
(1997).
Camundongos Balb/c
Modelo animal: AVBEH
Rotavírus rhesus do grupo A
Indução: AVBEH
Idade do animal
< 12 horas
Camundongos Balb/c
Carga viral
106 PFU/mL
Via de inoculação
Intraperitoneal
Modelo animal: bem
estabelecido, como
adequado para pesquisas
experimentais relacionadas
à atresia.
Modelo animal: AVBEH
Rotavírus rhesus do grupo A
RRV
Fator inicial:
Infecção
Expressão gênica
Camundongos Balb/c
Inflamação e fibrose
obliterante
As modificações da expressão gênica comandam os processos
biológicos que influenciam a evolução da doença após o a lesão inicial.
Hipótese do estudo
Genoma
Inoculação de RRV
Ativação ou desativação reacional de genes
Reprogramação da função celular
(Estimulação ou inibição de processos biológicos)
Fibrose progressiva com obliteração das VBEH
II - Objetivos
Objetivo geral
Analisar o transcriptoma (expressão gênica) das vias biliares extrahepáticas, em modelo experimental de AVBEH, nas diferentes fases da
evolução dessa doença.
Objetivos específicos
Identificar os genes ativados e os desativados, nos camundongos
infectados pelo RRV, em relação ao grupo controle, nos diferentes
estágios da obstrução biliar.
Avaliar os processos biológicos que se correlacionam ao
desenvolvimento da atresia das vias biliares extra-hepáticas.
Identificar e analisar as vias moleculares que regulam o dano celular e a
obliteração das vias biliares extra-hepáticas.
III - Métodos
Desenho do estudo
Estudo experimental, randomizado e controlado.
114 camundongos Balb/c: menores que 24 horas de vida
filhos de mães negativas para o RRV
Grupo A (modelo animal de AVBEH): 63 camundongos
injeção intraperitoneal: 1,5 x 106 UFF de Rotavírus rhesus do grupo A (20 μL)
primeiras 24 horas de vida
Excluídos: animais do grupo A que não desenvolveram AVBEH.
Grupo B (grupo controle): 51 camundongos
Injeção intraperitoneal: 20 μL de soro fisiológico 0,9%,
primeiras 24 horas de vida.
102 Camundongos Balb/c (< 24 horas de vida)
Inoculação intraperitoneal
com RRV
Inoculação intraperitoneal
com SF 0,9%
Grupo A: 51 camundongos
(modelo animal de AVBEH)
Grupo B: 51 camundongos
(grupo controle)
Clínica: peso, icterícia, colúria e acolia fecal
Laboratorial: bilirrubinúria
Anestesia:
Microdissecção e ressecção das vias biliares
Retirada de dois fragmentos hepáticos
Animais sacrificados com:
03 dias de vida: subgrupos A1 e B1
07 dias de vida subgrupos: A2 e B2
14 dias de vida subgrupos: A3 e B3
03 amostras
RNA: Microarranjos
03 amostras
RNA: RT PCR
03 amostras
Histologia: VB
Dia 3
Dias 7 e 14
Amostra 01
Amostra 01
Avaliação da expressão gênica
Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip®
Reação em cadeia da polimerase em tempo real
Novas tecnologias
GeneChip: permite a avaliação do transcriptoma (perfil de
“funcionamento” de todos os genes em um momento específico níveis de mRNAs dos genes expressos) em um único ensaio.
RT PCR: teste de maior acurácia para determinação da expressão
gênica.
Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip®
Várias seqüências de nucleotídeos (representando todo o
genoma) são depositadas em uma superfície de vidro (o chip) e
cada oligonucleotídeo configura uma sonda para um gene
específico.
Extração:
RNA das vias biliares
Homogeneização e
lise celular (TRIzol)
Fase da separação
(fenol/clorofórmio)
RNA
Lipídeos
Carboidratos
Proteínas
Precipitação
(isopropanol)
RNA
RNA
TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA
Qualidade do RNA
Microarranjos de oligonucleotídeos: sistema GeneChip®
Local de origem do sinal de
fluorescência e a intensidade deste
identifica o gene em questão e seu
nível de expressão.
Quantificação do sinal de fluorescência: sistema GeneChip®
Unidade de expressão: pixel
Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring
Análise dos resultados do GeneChip®: GeneSpring
Avaliação conjunta dos resultados de todas as amostras.
Comparação entre os grupos experimental e controle.
Avaliação estatística.
Classificação dos genes em funções biológicas (Gene Ontology).
GeneSpring
Seleção estatística dos genes e
dos processos biológicos
O valor da expressão dos genes no GeneSpring é um valor relativo (ou
normalizado) em relação ao controle.
Segunda etapa:
As amostras do grupo controle foram usadas como valor basal.
A intensidade do sinal de cada gene no grupo experimental foi dividida
pelo valor do mesmo gene no grupo controle, o que foi realizado
separadamente para os dias 3, 7 e 14.
Primeira etapa:
Média de todos os sinais da expressão gênica.
Este valor é dividido por cada um dos sinais individualmente.
Objetivo: evitar valores extremos.
Normalização
Grupo experimental X Grupo controle
(Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)
GeneSpring
Seleção estatística dos genes e
dos processos biológicos
Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle
Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle
Seleção dos genes
(Anova p < 0,01)
Normalização
Grupo experimental X Grupo controle
(Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)
GeneSpring
Seleção estatística dos genes e
dos processos biológicos
Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels
em pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo
(Diagrama de Venn)
Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle
Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle
Seleção dos genes
(Anova p < 0,01)
Normalização
Grupo experimental X Grupo controle
(Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)
GeneSpring
Seleção estatística dos genes e
dos processos biológicos
Reclassificação dos genes
(PubMed, GeneCard, UniGene, Gene, GeneBank)
Seleção dos processos biológicos
(Anova p < 0,05)
Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels
em pelo menos duas das três amostras de cada subgrupo
(Diagrama de Venn)
Genes ativados ou desativados > 2x em relação ao controle
Genesativados ou desativados < 2x em relação ao controle
Seleção dos genes
(Anova p < 0,01)
Normalização
Grupo experimental X Grupo controle
(Feito separadamente: dias 3, 7 e 14)
Validação dos resultados do
GeneChip
Reação em cadeia da polimerase
em tempo real
RT PCR: Quantificação do número de cópias
Sinal de fluorescência: SYBR Green
Curva de amplificação da RT PCR com várias amostras
Curva de amplificação da RT PCR e definição do CT
Fluorescência emitida
Platô
Linha que delimita o
nível de detecção do
sinal de fluorescência
Amostra
Threshold
Amostra: sem DNA
Região da linha de base
CT
Quantidade de cópias
inicial da amostra
Número de ciclos
Cálculo da expressão gênica
Expressão de um gene
Quantidade de cópias do gene-alvo
Quantidade de cópias do gene padrão
Variação da expressão
Expressão do gene no grupo experimental
Expressão do gene no grupo controle
Gene padrão: 18S.
Animais do grupo experimental e do controle.
Especificidade dos microarrranjos:
árvore biliar extra-hepática
Expressão da citoqueratina-7 (Krt2-7):
Fígado e árvore biliar extra-hepática
Validação: RT PCR
IV - Resultados
Incidência de AVBEH: animais infectados por RRV
63 camundongos
AVBEH: 51 camundongos (81%)
Outros estudos: 67% a 86%
Petersen C et al., 1997; Czech-schmidt G et al., 2001;
Shivakumar P et al., 2004
Evolução da infecção pelo RRV
Icterícia
AVBEH: quadro
clínico
Colúria
Acolia fecal
Ausência:
Quadro diarréico
X
Humanos: diarréia importante (O'ryan M. et al., 2005)
Animais mais velhos: ausência de icterícia (Feng N. et al., 1994)
Camundongos
RRV: tropismo pelos colangiócitos
Brevidade cronológica
Não persiste com o crescimento e o amadurecimento do animal
RRV: tropismo único pelas células do epitélio biliar neonatal
(Shivakumar et al., 2004)
De modo similar em humanos:
Atresia é observada apenas em lactentes nos primeiros três meses de
vida, não se desenvolvendo em crianças maiores ou em adultos.
BALISTRERI, W. F. Neonatal cholestasis. J.
Pediatr. 106, 171-184
(1985).
BEZERRA, J. A. & BALISTRERI, W. F. Cholestatic
syndromes of infancy and childhood. Semin.
Gastrointest. Dis. 12, 54-65 (2001).
Imaturidade temporária: relacionada à idade precoce
Pode desempenhar um papel importante na história natural dessa
doença.
Aspecto macroscópico das vias biliares extra-hepáticas
Vesícula biliar distendida .
Vesícula biliar pequena e contraída.
Vias biliares de aspecto normal.
Vias biliares estreitas e fibrosadas.
Avaliação histológica das vias biliares
Grupo controle
Dia 3
Dia 3
Dia 7
Dia 14
Grupo experimental
Dia 7
Dia 14
Barra preta: 100 μm
Peso médio dos camundongos
SF 0,9%
RRV
Peso médio dos camundongos relacionado aos dias seguidos à
inoculação com SF0,9% ou RRV, com p < 0,01 dos dias 7 a 14.
Modelo animal:
Idade
Sinais clínicos
ss
Aspectos macroscópicos
Histologia
Evolução
Hipodesenvolvimento:
Fenótipo da AVBEH em crianças
Redução da ingesta alimentar
Esteatorréia
Avaliação histológica do fígado
Grupo controle
Dia 3
Dia 7
Dia 14
Grupo experimental
Dia 3
Dia 7
Dia 14
Papel do vírus
RRV (vias biliares e tecido hepático):
identificado nos animais sacrificados com 7 dias
RRV (vias biliares e tecido hepático):
Não foi isolado naqueles sacrificados com 14 dias.
SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts
by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental
biliary atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004).
MACK, C. L. et al. Armed CD4+ Th1 effector cells and
activated macrophages participate in bile duct injury in murine
biliary atresia. Clin. Immunol. 115, 200-209 (2005).
Efeito citopático direto do vírus
Potencial papel dos processos imunes na evolução da doença.
Infiltrado linfocitário periductular
Predomínio: linfócitos TH1 e CTLs.
SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of extrahepatic bile ducts by lymphocytes is regulated by IFN-gamma in experimental biliary
atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329 (2004).
Transcriptoma das vias biliares
Transcriptoma das vias biliares
(45.101 genes transcritos)
Anova p < 0.01
Genes ativados ou desativados < 2x ou > 2x
Sinal gerado pelo Affymetrix > 100 pixels
849 genes
Seleção dos processos biológicos
Anova p < 0,05
3SF
3RRV
7SF
7RRV 14SF 14RRV
Alto
Árvore genética:
GeneSpring
E
Baixo
359 genes
Reclassificação funcional dos genes
(PubMed, UniGene, Gene, GeneCard, GeneBank)
Dia 3:
Imunidade
Enzimas
Proteínas estruturais
Transporte
Transcrição e tradução
Dia 7:
Imunidade
Enzimas
Proteínas estruturais
Apoptose
Transdução de sinais
498 genes
Dia 3
Dia 7
Dia 14:
Imunidade
Enzimas
Proteínas estruturais
Transcrição e tradução
Transdução de sinais
Ativados:
310 genes
(62%)
Dia 14
Classificação funcional dos genes ativados nos dias 3, 7 e 14.
Transdução de sinal
Apoptose
Transcrição e tradução
Transporte
Proteína estrutural
Enzima
Imunidade
Dia 3
ll
Dia 7
Genes ativados
Imunidade: três etapas da pesquisa.
Maior número de genes ativados: processos imunes no dia 7.
Dia 14
Imunidade
Dia 3
Fase precoce da lesão biliar (dia 3)
Imunidade inata
Imunidade adquirida
Imunidade inata
Células fagocitárias
(neutrófilos e macrófagos)
Frações do
complemento
Tyki
C1R
Ativação
macrofágica
Ativação da cascata
de complemento
Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+
PSMB8
TAP2, TAPBP
Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+
PSMB8
TAP2, TAPBP
H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10
Via do MHC da classe I para apresentação de antígenos: linfócito T CD8+
PSMB8
TAP2, TAPBP
H2-D1, H2-Q7, H2-K1, H2-T1, H2-T10
Imunidade
celular
Etapas da imunidade adquirida
Ativação dos linfócitos
LY6E
LY6A
Dias após a exposição ao antígeno
Receptores dos interferons e ativação da via clássica JAK-STAT
IRF9
IFIT1
Imunidade adquirida: dia 3
i)
Processamento e apresentação do antígeno
ii) Aumento da expressão do MHC da classe I
iii) Fatores reguladores dos interferons
iv) Estimulação dos linfócitos T
Imunidade humoral
Imunidade celular
BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction of proinflammatory immunity in
children with biliary atresia. Lancet 360, 1653-1659 (2002).
Imunidade
Dia 7
Imunidade inata: complemento
C1R – Dia 3
C1Qα, C1Qβ
C3αR1
Citotoxicidade mediada por anticorpos
FcγRIIIA (CD16)
FcγRIII
(CD16)
Célula NK
Célula
NK
ativada
Ac liga-se ao antígeno na
superfície do patógeno
Receptores Fc (NK)
reconhecem os Ac
Sinalização para célula NK
matar a célula-alvo
A célula alvo morre por
apoptose
Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos: linfócito T CD4+
Catepsinas
Biossíntese
do MHC da
classe II
IFNG
H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1
BROOME, U. et al. Different expression of HLA-DR and ICAM-1 in livers from patients with biliary atresia and Byler's disease. J. Hepatol. 26, 857862 (1997).
FENG, J. et al. The aberrant expression of HLA-DR in intrahepatic bile ducts in patients with biliary atresia: an immunohistochemistry and immune
electron microscopy study. J. Pediatr. Surg. 39, 1658-1662 (2004).
Expressão anômala do MHC da classe II nos ductos biliares: lesão progressiva
KOBAYASHI, H. et al. Hepatic overexpression of MHC class II antigens and macrophage-associated antigens (CD68) in patients with biliary atresia
of poor prognosis. J. Pediatr. Surg. 32, 590-593 (1997).
Receptores das células
T e seus ligantes
Reconhecimento
do antígeno
Redistribuição dos
receptores
e seus ligantes
Sinapse imunológica
H2-AΑ, H2-AΒ1,
H2-EΑ, H2-EΒ1
TCRB-V13
Receptores das células
T e seus ligantes
Reconhecimento
do antígeno
H2-AΑ, H2-AΒ1,
H2-EΑ, H2-EΒ1
TCRB-V13
LFA1
Redistribuição dos
receptores
e seus ligantes
Moléculas de adesão
intercelular
Sinapse imunológica
Moléculas
deal. adesão:
DILLON, P. W. et
Differential
expression
of the major na
papel
significativo
histocompatibility antigens and
reação
inflamatória
ICAM-1 on
bile duct epithelialna
cells in biliary atresia. Tohoku J.
atresia biliar, por
Exp. Med. 181, 33-40 (1997).
ocasionarem atração,
DAVENPORT, M. et al.
retenção
e ativação
Immunohistochemistry of the liver
anddos
biliary leucócitos
tree in extrahepatic
biliary atresia. J. Pediatr. Surg.
circulantes.
36,
1017-1025 (2001).
Receptores das células
T e seus ligantes
H2-AΑ, H2-AΒ1,
H2-EΑ, H2-EΒ1
TCRB-V13
LFA1
Reconhecimento
do antígeno
Redistribuição dos
receptores
e seus ligantes
Outro evento de sinalização
intracelular é a fosforilação
das tirosinas, por tirosinas
cinases da família Src.
CD45R
Determina a atividade de sinalização
das cinases da família Src.
HCK
Sinapse imunológica
Receptores das células
T e seus ligantes
H2-AΑ, H2-AΒ1,
H2-EΑ, H2-EΒ1
TCRB-V13
Reconhecimento
do antígeno
Redistribuição dos
receptores
e seus ligantes
LFA1
CD45R
Dia 7
Sinapse imunológica
Fundamental:
ativação dos
mecanismos de
sinalização intracelular
na ativação da célula T
Componentes
essenciais:
sinapse
imunológica
Regulam a
produção de
citocinas.
Desenvolvimento das subpopulações das células T
IL2RG
Ativação das
células T
Principal citocina:
célula T naive.
Estágio inicial:
diferenciação da
célula T
Proliferação e a
expansão clonal
das células T
naive
Crescimento e
diferenciação
das células T.
Polarização:
citocina
Subpopulações:
TH1 e TH2
Etapas do
desenvolvimento
dos linfócitos.
Pergunta: predomínio TH1 ou TH2?
A proporção relativa dessas subpopulações é o principal determinante das funções
protetoras e das conseqüências patológicas da resposta imune.
TH1 e TH2: citocinas e funções efetoras diferentes
IFNG
Ações biológicas do interferon gama
(A) Ativação de macrófagos, que passam a apresentar maior atividade microbicida.
(B) Nas células B, promove a troca do isótopo para anticorpos opsonizantes e fixadores
de complemento.
(C) Promove a diferenciação das células T CD4+ naive para a subpopulação TH1
e inibe a proliferação das células TH2.
(D) Aumenta da expressão das moléculas do MHC das classes I e II.
TH1 e TH2: citocinas e funções efetoras diferentes
IFNG
Citocina: estabelece a presença de atividade das células TH1.
Receptores dos interferons e ativação da via clássica JAK-STAT
IFNG
STAT1
CXCL10,
TGTP, CXCL9,
LY6C, IGTP,
IFI1, IIGP1,
SAMHD1,
AIF1 e genes
do MHC das
classes I e II
Aciona a transcrição dos genes induzidos pelos interferons.
Dia 7
Dia 3
Fatores reguladores do interferon
Interferon gama
(IRF7 e IRF9)
Genes induzidos pelo Ifnγ
Via molecular com genes correlacionados
Ativação temporal dos indutores do interferon em fases precoces da lesão biliar,
seguida da expressão de uma rede molecular dirigida pelo interferon gama, que
conhecidamente polariza os linfócitos em um perfil pró-inflamatório TH1.
Papel do interferon gama na obstrução das vias biliares
Modelo animal
Crianças
SHIVAKUMAR, P. et al. Obstruction of
extrahepatic bile ducts by lymphocytes is
regulated by IFN-gamma in experimental
biliary atresia. J. Clin. Invest 114, 322-329
(2004).
MACK, C. L. et al. Armed CD4+ TH1
effector cells and activated macrophages
participate in bile duct injury in murine
biliary atresia. Clin. Immunol. 115, 200209 (2005).
Camundongos knock out para essa
citocina importância do interferon gama
no desenvolvimento da obstrução biliar.
Aumento da produção do interferon
gama pelos linfócitos TH1 e elevação do
TNF-α produzido pelos macrófagos.
MACK, C. L. et al. Biliary atresia is
associated with CD4+ TH1 cell-mediated
portal tract inflammation. Pediatr. Res. 56,
79-87 (2004).
BEZERRA, J. A. et al. Genetic induction
of proinflammatory immunity in children
with biliary atresia. Lancet 360, 16531659 (2002).
Perfil de citocinas característico da
presença de linfócitos TH1, a saber: IL-2,
interferon gama, TNFα e IL-12.
Aumento do interferon gama e do
osteopontin, sinalizando a resposta TH1,
bem como a desativação dos genes
relacionados às imunoglobulinas.
Transcriptoma: dia 7
IFNG
TNFRSF1β, TNFαIP2
Mediador da resposta inflamatória
Fagócitos mononucleares ativados,
células T estimuladas por antígenos,
células NK e mastócitos.
Enzima
Dia 7
Via do MHC da classe II para apresentação de antígenos: linfócito T CD4+
Catepsinas
Biossíntese
do MHC da
classe II
CTSC, CTSS
Processamento do
antígeno
H2-AΑ, H2-AΒ1, H2-EΑ, H2-EΒ1
Expressão coordenada de genes co-relacionados
Apoptose
Dia 7
Mediadores da apoptose: exocitose de grânulos
GZMA
GZMB
Papel: CTLs
Lise das células-alvo
Mediadores da apoptose: mediada por FasL-Fas
CASP8
Expressão do FasL no epitélio dos ductos biliares pode participar da lesão progressiva dos ductos biliares
intra-hepáticos após a portoenterostomia.
LIU, C. et al. Expression of fas ligand on bile ductule epithelium in biliary atresia--a poor prognostic factor. J.
Pediatr. Surg. 35, 1591-1596 (2000).
Histologia das VBEH X transcriptoma biliar
Imunidade
Dia 14
Ativação: Metabolismo do ferro
HAMP1
Maior ativação gênica
LCN2
Diminuem a disponibilidade de ferro e, por isso, além de agirem
como fatores de defesa, também podem ser responsáveis pela
anemia da inflamação ou doença.
Desativação: Recrutamento de linfócitos
CCL21A
VAP1
Silenciamento: diminuição dos processos imunes no dia 14
Transdução de sinais
Dia 14
Silenciamento de genes
Transdução de sinais relacionados à imunidade
Fatores de transcrição das células T
Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T
MAP2K5
RHOB
JUN
Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T
FKBP5
Sinalização intra-celular: ativação dos fatores de transcrição das células T
expressão
muito genes
relacionados
à resposta
InibiçãoNF-κB
químicaregula
desse a
fator:
preveniu de
a obstrução
biliar secundária
ao RRV.
inflamatória/imune.
FENG, J. et al. Rotavirus-induced murine biliary atresia is mediated by nuclear factor-kappaB. J. Pediatr.
Surg. 40,Sinergismo
630-636 (2005).com o STAT1: sinalização da resposta aos interferons.
Via molecular coordenada por genes co-relacionados:
Desativação das vias responsáveis:
Produção do AP-1
Ativação do NFAT
Proteínas estruturais
Desativados
Matriz extracelular
Dia 7: FBN2, ADAMTS5, COL4A5, COL14A1, PCOLCE, SPARCL1, FGFR1, GSN, MFAP2, OGN
Dia 14: COL4A5, COL16A1, FBLN1, FMOD, FLRT3
Alta expressão: “morfogênese, fibrinogênese e remodelamento da matriz extracelular”.
CHEN, L. et al. Altered expression of genes involved in hepatic morphogenesis and fibrogenesis are
identified by cDNA microarray analysis in biliary atresia. Hepatology 38, 567-576 (2003).
CHOE, B. H. et al. The pattern of differentially expressed genes in biliary atresia. J. Korean Med. Sci.
18, 392-396 (2003).
Pequena quantidade de células viáveis nas fases tardias da obstrução biliar.
Exclusão de segmentos atrésicos durante a ressecção da árvore biliar extra-hepática.
Microscópio de captura a laser de alta resolução.
Validação dos resultados dos microarranjos pela RT PCR
Curva standard: expressão gênica
Curva standard do gene Irf9
RT PCR: curva de dissociação
Curva de amplificação do gene Stat1, das 18 amostras
Resultados do RT PCR
Genes escolhidos para validação dos resultados dos microarranjos:
IRF7, IRF9, IFNG, IGTP, STAT1, CXCL9 e CXCL10
Etapa
Gene
Descrição
Variação*
Dia 3
IRF7
Interferon regulatory factor 7
45,2
Dia 3
IRF9
Interferon dependent positive acting
transcription factor 3 gamma
7,0
Dia 7
IGTP
Interferon gamma induced GTPase
35,3
Dia 7
STAT1
Signal transducer and activator of transcription 1
12,7
Dia 7
CXCL10
Chemokine (C-X-C motif) ligand 10
63,5
Dia 7
CXCL9
Chemokine (C-X-C motif) ligand 9
57,4
Dia 7
IFNG
Interferon gamma
69,1
Quantificação da expressão gênica nos microrarranjos e na RT PCR
Variação
IRF7
(Dia 3)
IRF9
(Dia 3)
IFNG
(Dia 7)
IGTP
(Dia 7)
STAT1
(Dia 7)
CXCL9
(Dia 7)
CXCL10
(Dia 7)
GeneChip
13
4.1
3.9
12.2
12.5
24.7
36.8
RT PCR
45.2
7.0
69.1
35.3
12.7
57.4
63.5
Diferença no grau de ativação:
A RT PCR apresenta maior acurácia e sensibilidade em relação aos microarranjos de
oligonucleotídeos, tendo também maior reprodutibilidade.
DING, C. & CANTOR, C. R. Quantitative analysis of nucleic acids--the last few years of progress. J. Biochem.
Mol. Biol. 37, 1-10 (2004).
Resultados da RT PCR
Validam os obtidos nos microarranjos (GeneChip®)
Confirmam a existência do circuito inflamatório associado ao interferon gama.
Polarização para a resposta imune adquirida TH1.
Especificidade dos microarrranjos
33,1
1,2
Fígado
Vias biliares
*Citoqueratina-7 (KRT2-7): filamento presente nos colangiócitos
Em resumo...
Histologia das VBEH X transcriptoma biliar
Papel do sistema imune
Interferon gama, TH1
Lesão e na obstrução das vias biliares
Alvos de intervenção terapêutica?
Fase precoce
Aumento da expressão do MHC da classe I
Moléculas: processamento de antígeno para MHC da classe I
Fase tardia
Aumento da expressão do MHC da classe II
Moléculas: processamento de antígeno para MHC da classe II
Moléculas: sinapse imunológica
Novos achados
Apoptose
Ativação da cascata do complemento
Citotoxicidade mediada por anticorpos
VI - Conclusões
O transcriptoma da árvore biliar demonstrou a presença predominante de
um processo pró-inflamatório, neste modelo experimental da atresia de
vias biliares extra-hepáticas, com ativação reacional de genes em
períodos específicos da progressão do processo obliterativo.
Notavelmente, os animais portadores de AVBEH apresentaram ativação
do interferon gama e a expressão seqüêncial de uma rede hierárquica de
genes relacionados à essa citocina, o que reflete um predomínio da
resposta TH1.
A ativação de outros processos biológicos relacionados à apoptose, à
cascata de complemento, à ADCC e aos fatores epigenéticos demonstra a
presença dessas vias metabólicas durante o desenvolvimento da doença.
Coletivamente, esses genes formam uma seleção transcricional altamente
importante para a direção de estudos futuros, que possam explorar como
genes individuais ou grupo de genes relacionados entre si podem regular o
início da lesão biliar, bem como a progressão para obliteração das vias
biliares.
A definição dos papéis de cada componente desse circuito inflamatório
deve contribuir para a elucidação dos mecanismos etiopatogênicos da
AVBEH e para o advento de novas opções terapêuticas que influenciem na
evolução da doença, no prognóstico do paciente e na necessidade do
transplante hepático.
Autores
Elisa de Carvalho
Cong Liu
Pranavkumar Shivakumar
Gregg Sabla
Bruce Aronow
Jorge A. Bezerra
Se consegui enxergar mais longe
é porque estava apoiado sobre os ombros de gigantes.
Obrigada!
Isaac Newton, Matemático Inglês.
Processos imunes – Enzimas – Dia 7
 USP18: imunidade inata.
 SLFN4: crescimento e desenvolvimento das células T.
 OASL2, OAS1G e OAS2: atividade antiviral, induzida pelos interferons.
 GBP1, GBP2 e GBP3: proteína ligadora de GTP com atividade GTPase, induzida pelo
interferon gama durante ativação macrofágica.
 GZMA: apoptose.
 PSMB8, PSMB9 e PSMB10: processamento de antígeno para o MHC da classe I.
 SAMHD1: induzida pelo interferon, proteína de ligação ao GTP.
 CTSS e CTSC: proteólise, processamento do antígeno e geração de peptídeo para o
MHC da classe II.
 CYBB, CYP1B1, CYBA, NCF1 e NCF2: complexo NADPH oxidase (fagocitose).
 PLA2G7: ativa os neutrófilos polimorfonucleares e aumenta a permeabilidade vascular.
Atua na inflamação e na anafilaxia. Produzido por plaquetas, leucócitos e células
endoteliais.
 HCK: membro da família Src da tirosina cinase, exerce papel na resposta imune inata e
na sinalização para ativação do STAT 5.
 PTPRC (CD45R): pertence à família dos receptores da tirosina fosfatase, que
desempenha papel na sinalização dos receptores dos linfócitos B e T.
 LYZS: tem função bacteriolítica, em tecidos e fluidos corporais.
 PTPN18: fosforilação de aminoácidos. Desfosforila a autofosforilada tirosina cinase.
Papel da colestase: lesão histológica hepática
Ácidos biliares hidrofóbicos
Apoptose primária de hepatócitos
PALMEIRA, C. M. & ROLO, A. P. Mitochondrially-mediated toxicity of bile acids.
Toxicology 203, 1-15 (2004).
Avaliação do comitê de ética médica
Institutional Animal Care and Use Committee of
Cincinnati Children’s Hospital Research Foundation.
Transporte
Dia 3
Ativados
Transportadores de membrana (ATP8A1 e LAPTM4A)
Transportadores nucleares (XPO7 e NUTF2)
Metabolismo (STARD4)
Imunidade (TAP2)
Transporte de ânions (SLC4A2)
Transporte de cátions (ATP6V1B2)
Desativados
Transporte de colesterol (APOB)
Transporte de aminoácidos (SLC1A4)
Controle da transcrição e da tradução
Dia 14
Desativados
Fatores de transcrição: TCF21, MEIS1, PBX1, ZF, CEBPG, ZBTB20, JUN
 Splicing do RNA: SFRS7
 Tradução e síntese protéica: EIF4A2, SERPINH1
Extração:
RNA das vias biliares
Homogeneização e
lise celular (TRIzol)
Fase da separação
(fenol/clorofórmio)
RNA
Lipídeos
Carboidratos
Proteínas
Precipitação
(isopropanol)
RNA
RNA
TRIzol Reagent® – Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA
Obtenção do cDNA de fita dupla
2,5 μg de RNA
Tampão
DNase I
Água
Destruição do DNA
Temperatura ambiente (15 min)
EDTA 25mM – 65°C (10 min)
Desativa a DNase
Primers
Nucleotídeos
Mistura: anelamento
RNase OUTTM
70°C (10 min) - 4°C (1 min)
Anelamento
Desfaz estruturas
secundárias: RNA
SuperScriptTM
(transcriptase reversa)
Tampão
Agentes redutores
42°C (50 min) - 17°C (15 min) - 4°C (1 min)
Formação do cDNA
Destruição do RNA
SupserScriptTM Reverse Transcriptase
(Invitrogen Corporation – Life Technologies, NY, USA)
RT PCR: Curva padrão
 Amostra padrão (conhecida)
Coeficiente de correlação: 1.000
 Amostra em estudo
(concentração desconhecida)
RT PCR: Curva de dissociação
Controle da quantidade e da qualidade do RNA
Beckman – DU® – 64 – Spectophotometer:
Concentração do RNA (A260 x 4): > 2,5 μg
Beckman – DU® – 64 – Spectophotometer:
Pureza (260/280 nm): razão > 1,6
Agilent 2100 Bioanalyzer
Qualidade do RNA
Enzima
Dia 3
Processos imunes
OAS1G e OASL2
Enzima 2’-5’ oligoadenilato sintetase: marcador da atividade dos interferons
Degradação do RNA viral
Expressão gênica
Transcrição: ATF5
HRMT1L2 (transcrição do STAT1)
Chaperona: PDIA3
Ciclo da ubiquitina: USP1 e USP7
Metabolismo
Carboidratos (glicogênio): PYGB
Lipídios: LIP1
Enzima
Dia 7
Receptores do interferon I e ativação da via GAS
HCK
Membro da família Src
Ativação do STAT5
Enzima
Dia 14
Ativado: GSTA2
Demonstrado previamente em análise de expressão de genes em fígado de
camundongos adultos submetidos à obstrução crônica dos ductos biliares
extra-hepáticos.
CAMPBELL, K. M. et al. Transcriptional reprogramming in murine liver defines the physiologic
consequences of biliary obstruction. J. Hepatol. 40, 14-23 (2004).
Resposta da colestase crônica ou do estresse oxidativo persistente em
estágios avançados da obstrução ao fluxo biliar.
Proteínas estruturais
Desativados
VIL2 (dia 3)
SVIL (dia 14)
Proteína do citoesqueleto, necessária para a manutenção e a integridade das
microvilosidades do bordo estriado das células epiteliais canaliculares, nas
quais os transportadores de membrana da secreção biliar estão localizados.
Expressão diminuída ou ausente do gene VIL nas crianças portadoras de doenças
hepáticas colestáticas progressivas.
PHILLIPS, M. J. et al. Abnormalities in villin gene expression and canalicular
microvillus structure in progressive cholestatic liver disease of childhood. Lancet
362, 1112-1119 (2003).
Transdução de sinais
Dia 14
Receptores do interferon I e ativação da via GAS
STAT5
Transdução de sinais
Dia 7
STAT1: sinalização do interferons
ARHGDIB: sinalização mediada pela proteína Rho, crucial para a ativação da LFA1
CSF2Rβ1: estimula a produção de leucócitos
CEBPβ: ativa a transcrição de genes da fase aguda e participa nos mecanismos que
controlam a transcrição dos genes induzidos pelo interferon
Vias moleculares relacionadas à imunidade
Controle da transcrição e da tradução
Dia 3
Ativados
Replicação e no reparo do DNA: RBBP4, MCM3, RAD23B, TDG
Controle do ciclo celular: NDN
Expressão gênica:
 Controle transcricional: FUS, ATF4, ATF5, MEF2A, DHX9, TBX2, MTA2, NDN, TCERG1, PFTF1,
SMARCE1.
 Controle pós-transcricional
- splicing do RNA: RNPC2;
- tradução: PUM2, NOL5, EIF4EBP2, EIF4A1;
- ubiquinização de proteínas: TRIM30, MKRN1.
Processos imunes:
 HRMT1L2: controla a transcrição do STAT1
 IRF7e IRF-9: fator regulador de interferons
 BACH2: controla a transcrição da AP-1 em células neurais e linfócitos
Desativados: fenômenos epigenéticos
Desativação das histonas (HIST1H1E, HIST2H2BE, HIST1H3A)
Metilação do DNA (DNMT3A, CTCF).
O papel dos fatores epigenéticos na patogênese da atresia: pacientes portadores da forma
embrionária. Estrutura da cromatina: SMARCA-1, HDAC3 e RYBP
ZHANG, D. Y. et al. Coordinate expression of regulatory genes differentiates embryonic and
perinatal forms of biliary atresia. Hepatology 39, 954-962 (2004).