Documentos
Agrobiologia
213
ISSN 1517-8498
Junho/2006
http://www.sciencemag.org/cgi/content/full/291/5507/1221/F1
Credit: Joe Sutliff
República Federativa do Brasil
Luiz Inácio Lula da Silva
Presidente
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
Roberto Rodrigues
Ministro
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Conselho de Administração
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Presidente
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Vice-Presidente
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Cláudia Assunção dos Santos Viegas
Ernesto Paterniani
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Silvio Crestana
Diretor Presidente
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Kepler Euclides Filho
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Diretores Executivos
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Chefe Geral
Eduardo Francia Carneiro Campello
Chefe Adjunto de Pesquisa e Desenvolvimento
Rosângela Straliotto
Chefe Adjunto Administrativo
ISSN 1517-8498
Junho/2006
Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária
Centro Nacional de Pesquisa em Agrobiologia
Ministério da Agricultura, Pecuária e Abastecimento
Documentos 213
Genômica e Proteômica
Kátia Regina dos Santos Teixeira
Jean Luiz Simões Araújo
Seropédica – RJ
2006
Exemplares desta publicação podem ser adquiridas na:
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BR465 – km 7
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Dorimar dos Santos Felix (Bibliotecária)
Expediente:
Revisor e/ou ad hoc: Luc Felicianus Marie Rouws
Normalização Bibliográfica: Dorimar dos Santos Felix
Editoração eletrônica: Marta Maria Gonçalves Bahia
1ª impressão (2006): 50 exemplares
T266
Teixeira, Kátia Regina dos Santos
Genômica e proteômica / Jean Luiz Simões Araújo.
Seropédica: Embrapa Agrobiologia, 2006. 37 p. (Embrapa
Agrobiologia. Documentos, 213).
ISSN 1517-8498
1. Genôma. 2. Proteôma. 3. DNA. 4. Cromossoma. 5. Ácido
nucléico. I. Simões-Araújo, Jean Luiz, colab. II. Embrapa. Centro
Nacional de Pesquisa de Agrobiologia (Seropédica, RJ). III. Título.
IV. Série.
CDD 572.86
 Embrapa 2006
Autores
Kátia Regina dos Santos Teixeira
Bióloga, PhD em Biologia Celular e Molecular, Pesquisadora
da Embrapa Agrobiologia.
BR 465, km 7 – Caixa Postal 74505, Cep 23851-970,
Seropédica/RJ
e-mail: [email protected]
Jean Luiz Simões Araújo
Engenheiro Agrônomo, PhD em Genética de Plantas,
Pesquisador da Embrapa Agrobiologia
BR 465, km 7, Caixa Postal 74505, Cep 23851-970,
Seropédica/RJ
e-mail: [email protected]
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36
Apresentação
A preocupação crescente da sociedade com a preservação e a
conservação ambiental tem resultado na busca pelo setor produtivo
de tecnologias para a implantação de sistemas de produção agrícola
com enfoques ecológicos, rentáveis e socialmente justos. O enfoque
agroecológico do empreendimento agrícola se orienta para o uso
responsável dos recursos naturais (solo, água, fauna, flora, energia
e minerais).
Dentro desse cenário, a Embrapa Agrobiologia orienta sua
programação de P&D para o avanço de conhecimento e
desenvolvimento de soluções tecnológicas para uma agricultura
sustentável.
O documento 213/2006 aborda a questão da genômica e
Proteômica no contexto do avanço de conhecimento na área. O
documento foi escrito com a finalidade de fornecer conhecimentos
básicos das facilidades da genômica e proteômica hoje disponível
na literatura. O documento procura introduzir o leitor na área de
genômica e discute os diferentes métodos e estratégias de
sequencimento completo de genomas e apresenta os diferentes
programas de sequencimaneto no país. Da mesma forma, faz uma
introdução a área de proteômica e discute os métodos disponíveis
para o avanço de conhecimento da proteômica de expressão,
funcional e estrutural. O documento está apresentado numa forma
bastante amigável que permitirá ao leitor conhecer um pouco da
área sem maiores dificuldades.
José Ivo Baldani
Chefe Geral da Embrapa Agrobiologia
FEY, S. J.; LARSEN, P. M. 2D or not 2D. Current Opinion in
Chemical Biology, London, v. 5, p. 26-33, 2001.
SUMÁRIO
1. Introdução................................................................................
7
2. Introdução a Genômica .........................................................
2.1. O Sequenciamento de DNA ........................................
2.2. Sequenciamento automático de DNA .......................
2.3. Estratégias para sequenciamento completo de
genômas.........................................................................
2.3.1. Sequenciamento hierárquico ...........................
2.3.2. Seqüenciamento por fragmentos aleatórios
(Shotgun) ........................................................................
2.4. Pirosseqüenciamento: nova alternativa para o
seqüenciamento rápido de genômas.........................
7
8
9
3. Introdução a Proteômica .......................................................
3.1. Análise do perfil de proteínas expressas através
de eletroforese bidimensional (2D-GE).....................
3.2. Espectrometria de massa e sua aplicabilidade na
proteômica .....................................................................
3.2.1. Equipamentos de espectrometria de massa
e sua aplicação .............................................................
11
12
13
16
20
22
25
28
4. Considerações finais.............................................................. 33
5. Referências Bibliográficas .................................................... 34
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35
interesse, tem sido lançado no mercado não deve ser o parâmetro
de escolha da técnica a ser usada no planejamento de um projeto
na área de proteômica. Antes de tudo deve-se ter bom senso e
conhecimento do funcionamento básico de cada um dos tipos de
equipamentos disponíveis para que o objetivo do estudo seja
alcançado.
Foi com a finalidade de fornecer um conhecimento básico das
facilidades da genômica e proteômica disponível que este
documento foi escrito. Detalhes de variações das técnicas e outros
avanços devem ser uma busca constante nestas áreas devido ao
grande volume de informação disponível e que já foram temas de
diversas revisões e publicações técnico-científicas.
5. Referencias bibliográficas
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34
Genômica e Proteômica
Kátia Regina dos Santos Teixeira
Jean Luiz Simões-Araújo
1. Introdução
O sufixo OME tem sua origem no latim e significa massa ou grandes
quantidades. Neste contexto, a introdução no Brasil nos últimos 5
anos de equipamentos com capacidade para análise de um grande
número de amostras e aplicação de técnicas avançadas nos
estudos de caracterização de genes e proteínas resultou no avanço
das disciplinas denominadas genômica e proteômica, assim como
em outras áreas emergentes, que tem como base a produção de
informações e processamento de dados em larga escala.
A aplicação de técnicas de seqüenciamento de DNA e
caracterização do conteúdo de proteínas e sua identificação tem
sido fonte de geração de informação sobre diversos sistemas
biológicos. A genômica, inicialmente aplicada ao estudo de
genômas “completos” e parciais de diversos microrganismos,
plantas e animais (inclusive o genôma humano) tem sido uma
ferramenta cada vez mais utilizada para a prospecção de genes em
comunidades complexas, recebendo portanto a denominação de
metagenômica.
2. Introdução a Genômica
A partir das primeira evidências em 1944 de que o Ácido
Desoxirribonucléico (DNA) era responsável pelo armazenamento e
transferência da informação genética de geração para geração,
iniciou-se uma verdadeira corrida para determinação da estrutura do
DNA. Diversos estudos mostravam que o DNA era uma molécula
longa e fina, composto por açúcar, fósforo e quatro diferentes tipos
de bases nitrogenados. Em 1953, WATSON & CRICK determinaram
a estrutura do DNA, como uma dupla fita anti-paralela onde resíduos
de timina (T) se pareiam com adenina (A) e guanina (G) com
citosina (C) através de ligações do tipo pontes de hidrogênio.
07
Diversas outras descobertas importantes, ainda em meados do
século passado, como a descoberta do RNA mensageiro e a
identificação do código genético, possibilitaram a determinação do
fluxo da informação genética, o que se convencionou chamar-se o
Dogma Central da Biologia Molecular. No início dos anos 70, o
isolamento das primeiras enzimas de restrição, bem como o
seqüenciamento das primeiras moléculas de DNA, caracterizou o
início da Era Genômica. O aprimoramento dos métodos de
seqüenciamento, o surgimento de diferentes métodos de clonagem
e da reação em Cadeia da Polimerase (PCR), bem como o
desenvolvimento do seqüenciamento automático de DNA e a
crescente capacidade da análise de dados, através do uso cada vez
maior dos computadores, possibilitaram o seqüenciamento completo
dos primeiros genômas em meados da década de 80. Esta revisão
visa discutir de forma clara e objetiva os principais aspectos
relacionados ao desenvolvimento da Era Genômica com o objetivo
de preencher uma lacuna relacionada a deficiência de bibliográfica
em língua Portuguesa.
2.1. O Seqüenciamento de DNA
As primeiras seqüências de DNA foram obtidas no início da década
de 70, quando as extremidades coesivas do fago λ, com apenas 12
pares de bases (pb), foram seqüenciadas (WU & TAYLOR, 1977).
Apesar de diferentes métodos de seqüenciamento terem sido
desenvolvidos, o método mais utilizado até hoje é o método da
terminação de cadeia que utiliza didesoxirribonucleotídeos (ddNTP)
(Figura 1), processo aprimorado por SANGER et al. (1977). Este
método baseia-se na capacidade da DNA polimerase de utilizar
ddNTP 2’, 3’ como substrato. No entanto, a incorporação do ddNTP
na cadeia de DNA que está sendo sintetizada interrompe a reação
de polimerização porque a extremidade 3’ do ddNTP não possui um
grupo hidróxila necessário para a formação da ligação fosfodiéster
com o nucleotídeo subseqüente da síntese. Dessa forma, a reação
de amplificação e o fragmento anteriormente sintetizado fica com o
ddNTP no final da cadeia. GILBERT E SANGER, através de estudos
independentes (SANGER et al., 1977; MAXAM & GILBERT, 1980),
utilizaram este princípio para determinar a seqüência do DNA a
08
identificação de proteínas em banco de dados públicos ou derivados
de projetos de seqüenciamento em andamento.
4. Considerações finais
A facilidade de acesso a equipamentos e técnicas que permitem a
análise de ácidos nucléicos e proteínas em larga escala tem sido um
marco importante para o avanço da ciência com base no volume e
velocidade de geração de dados nos últimos anos.
A tecnologia de seqüenciamento automatizado de DNA
proporcionou alterações profundas na natureza das pesquisa
realizada em diversos ramos da ciência. A redução significativa do
custo, da complexidade e do tempo necessário para o
seqüenciamento de grandes quantidades de DNA, incluindo
melhorias na capacidade de seqüenciamento de genôma de
bactérias e eucariotos, proporcionou um grande acúmulo de
informações e um impacto significativo na econômica, ciência e
cultura. Atualmente, já estão complemente seqüênciados o genôma
humano, de diversas planta e insetos, 920 projetos de
seqüenciamento do genômas de bactérias estão em andamento e
mais de 350 genômas já foram concluídos. Além disso, o
surgimento de novas abordagens, que permitem o seqüenciamento
do genôma de uma bactéria em alguns dias, certamente, trará
substanciais alterações na maneira de estudar os microrganismo e
num futuro próximo, estaremos comparado genômas com a mesma
freqüência que hoje comparamos genes.
No campo da proteômica uma diversidade de técnicas tem sido
desenvolvidas nos últimos anos, algumas com base no uso de
espectrometria de massa e outras com base em técnicas de
imunologia, ensaios enzimáticos, bio-imagens e microarranjos
(RAMSTRÖM & BERGQUIST, 2004; ISSAQ et al., 2005;
PANICKER et al., 2006). São tantas as opções de equipamentos e
estratégias que os pesquisadores devem ser criteriosos no
momento de fazer a escolha adequada ao objetivo de seus estudos.
A freqüência com que novos equipamentos do tipo espectrometria
de massa, resultante de combinações de módulos básicos para préfracionamento, ionização e separação das moléculas de nosso
33
sua característica de separar os peptídeos por massa seguido pela
fragmentação dos peptídeos em uma câmara de dissociação
induzida por colisão (CID – Collision induced dissociation) e
separação de fragmentos parciais derivados após a quebra da
ligação peptídica (em geral). Neste caso, os cromatrogramas
obtidos correspondem a m/z do peptídeo menos uma carga
referente ao resíduo liberado após a fragmentação. Para melhor
entendimento ver a representação esquemática apresentada na
figura 19.
Fragmentação ao acaso dos peptídeos nas
ligações amidas por CID.
partir da marcação do ddNTP com radioatividade (32P, 33P, 35S).
Durante os ciclos de polimerização os ddNTP vão sendo
incorporados aleatoriamente e no final da reação se obtém um
conjunto de fragmentos com tamanhos diferentes sendo o final
marcado, nesse caso com radioatividade. A mistura de fragmentos é
submetida a eletroforese para separação por tamanho (Figura 2A) e
a análise visual do gel posteriormente possibilita a determinação da
seqüência de bases. Pela descoberta desse método, Gilbert e
Sanger receberam o prêmio Nobel de Química em 1980.
Apesar de ser um método considerado rápido para a época o custo
o seqüenciamento ainda era muito alto. Pelo método de Sanger o
seqüenciamento é realizado em quatro reações independentes,
sendo que em cada uma delas é adicionado um ddNTP diferente
(ddATP, ddCTP, ddGTP e ddTTP) marcado com 32P, 33P, ou 35S.
Após a reação os fragmentos são separados através de eletroforese
em gel de poliacrilamida, o gel é seco e exposto a um filme de raio
X. Após a revelação do filme de raio X é então realizada a leitura da
seqüência, sendo possível identificar apenas de 200 a 300 pb por
gel durante uma corrida longa.
Figura 19 – Representação da fragmentação de peptídeos e cromatograma gerado a partir
dos produtos derivados contendo menos um resíduo de aminoácidos.
A seqüência é deduzida com base no valor de m/z total subtraído do m/z dos peptídeos
fragmentados. As formas b e y produzidas correspondem a mesma seqüência porém os
fragmentos são caracterizados pela presença de íons produzidos a partir do N-terminal ou
C-terminal, respectivamente.
A análise de peptídeos em espectrômetros do tipo MS/MS garante,
além da obtenção de suas massas, a obtenção de informação sobre
a sua estrutura primária e, apesar de nem todo espectro ser
completo, a obtenção da seqüência de pelo menos um peptídeo
pode permitir a identificação de uma proteína. Os dados gerados a
partir de análise do tipo MS/MS confere uma alta especificidade na
32
Figura 1 - Didesoxirribonucleotídeo (ddNTP), análogo aos dNTP, utilizado para interromper
a síntese de DNA durante a reação de polimerização.
2.2. Seqüenciamento automático de DNA
Com o desenvolvimento do seqüenciamento automático de DNA
grande parte das limitações apresentadas pelo método de Sanger
09
foram reduzidas ou eliminadas, principalmente devido aos
aprimoramentos dos equipamentos, reagentes químicos e
inovações ópticas, o que permitiu a utilização de ddNTPs marcados
com fluorescência (Figura 2B). Cada ddNTP fluorescente constitui
aproximadamente 1% da mistura de dNTPs, logo a reação de
polimerização produz uma mistura de produtos fluorescentes de
vários tamanhos que pode ser separadas em gel de poliacrilamida.
Outra grande vantagem do seqüenciamento automático é a
utilização do laser e programas de computadores específicos. Além
disso, cada ddNTP é marcado com uma molecular fluorescente, que
quando excitada pelo laser, emite fluorescência em comprimentos
de onda diferentes para cada tipo de base associada. Dessa forma,
não há necessidade de fazer quatro reações independentes para
cada fragmento DNA a ser seqüenciado, como cada ddNTPs emite
fluorescência em um comprimento de onda específico, os quatro
ddNTPs podem ser misturados na mesma reação e o equipamento
(seqüenciador) detecta o sinal que é analisado por programas
específicos de bioinformática resultando na seqüência de DNA
(Figura 2B). Uma outra etapa do processo de seqüenciamento
bastante laboriosa é a preparação do gel de poliacrilamida e a
eletroforese. No entanto, nos seqüenciadores mais modernos a
eletroforese ocorre no interior de microcapilares preenchidos com
uma matriz linear de poliacrilamida (LPA) que pode ser facilmente
substituída, após cada eletroforese, utilizando gás sob alta pressão
deixando o equipamento pronto para nova eletroforese, facilitando
ainda mais o seqüenciamento e aumentando sua velocidade.
A medida que os seqüenciadores automáticos de DNA foram sendo
aperfeiçoados a capacidade de produção de seqüências de DNA foi
aumentando cada vez mais havendo necessidade do
desenvolvimento de uma plataforma computacional para
processamento e análise dessas informações o que proporcionou o
surgimento de uma área especifica da informática, a Bioinformática.
a capacidade de detectar modificações, além de outros parâmetros
variáveis (sítios de clivagem, modificações e inespecificidade
enzimática). Por esta técnica é possível inferir certas modificações
pós-traducionais tais como processamento de peptídeo sinal, cuja
informação presente no gene não é recuperada na forma de
proteína ativa e neste caso a massa deduzida in silico é diferente da
massa obtida experimentalmente. Os dados resultantes da análise
de fingerprint são simples e permitem a identificação de proteínas
mesmo com apenas 25% de cobertura, apesar de não permitir inferir
a seqüência do peptídeo, sem conhecimento prévio da seqüência de
aminoácidos deduzida a partir de um gene conhecido (Figura 18).
Figura 18 – Cromatograma derivado da análise de proteínas por Fingerprint em MALDI-MS.
As figuras A e B apresentam alguns peptídeos, representando a cobertura parcial de duas
proteínas diferentes. Observem que a massa dos peptídeos é correlacionada com as
massas de peptídeos disponíveis em banco de dados e seqüências candidatas.
Equipamentos de massa também permitem a obtenção das
seqüências de peptídeos com base no método de fragmentação dos
peptídeos. Para o seqüenciamento de peptídeos o equipamento de
massa seqüencial (MS/MS, TOF/TOF) é o mais adequado devido a
10
31
opostas aos definidos no analisador são adsorvidos enquanto os
outros atravessam o campo e alcançam o detector figura 17.
A)
B)
Fragmentos de DNA
com ddNTP fluorescente
cópias do molde de DNA
com seqüência
desconhecida
Molde de DNA
Migração
do DNA
Detector
Figura 17 – Esquema do funcionamento do espectrômetro de massas com analisadores do
tipo quadrupólo.
Espectrômetros de massa (MS) disponíveis atualmente para análise
de proteínas e peptídeos permitem a aplicação de técnicas para a
identificação de proteínas através de mapeamento (“fingerprint”) e
seqüenciamento de aminoácidos, caracterização de modificações
pós-traducionais e também como ferramenta para quantificação da
expressão de proteínas.
A análise de proteínas intactas em MS é pouco informativo e menos
sensível que a caracterização das massas dos peptídeos derivados
de sua proteólise. A obtenção de massa de uma proteína intacta
não permite a sua identificação por estarem sujeitas a modificações
pós-traducionais e ao grande número de proteínas que apresentam
massas semelhantes. Por outro lado, a fragmentação de proteínas
isoladas, derivadas de fracionamentos e até mesmo em solução
permite a obtenção de um perfil de massas dos peptídeos presentes
em sua composição. Este tipo de abordagem denominada
“fingerprint” é mais informativo devido a exatidão da medida de
massa obtida, a cobertura dos peptídeos em domínios estruturais
que permitem identificar o tipo e até mesmo a função da proteína e
30
Autoradiografia do gel após
eletroforese
Seqüência
de DNA
Fragmentos de DNA com
ddNTP fluorescente na
extremidade são aplicados nos
capilares e submetidos a
eletroforese
Feixe de
Laser
Fonte de
Laser
Resultado gerado pelo computador após os
fragmentos passarem pelo detector
Figura 2 - Seqüenciamento de DNA através do método de Sanger utilizando radioatividade
(A) e seqüenciamento automático de DNA (B). Fonte NELSON et al. (2000).
2.3. Estratégias para seqüenciamento completo de genômas
Apesar
do
desenvolvimento
dos
equipamentos
para
seqüenciamento ter possibilitado a diminuição do custo e
aumentando sobremaneira a velocidade do processo, o tamanho do
fragmento de DNA capaz de ser seqüenciado em cada reação, de
maneira geral, fica em torno de 400 a 600 bp, um fragmento bem
pequeno quando se comparado com o tamanho de um genôma
completo. No caso de bactéria, por exemplo, o genôma pode conter
entre 106 e 107 pares de bases (Figura 3). Logo o seqüenciamento
de todo o genôma requer muitos milhares de trechos curtos de
seqüências que precisam ser gerados. No momento existem duas
principais estratégias utilizadas para gerar essas seqüências: o
seqüenciamento hierárquico e o seqüenciamento completo por
fragmentos aleatórios (Whole Genome shotgun sequencing). Em
ambos os casos, para seqüenciar o genôma de um organismos,
inicialmente é necessário isolar o DNA do organismo de interesse e
11
elaborar bibliotecas de DNA genômico, no entanto, a estratégia
utilizada para clonagem e o tamanho dos fragmento clonados
variam bastante.
Plamídeos
vírus
bactéria
grade com polaridade semelhante aos íons promove desaceleração
das moléculas de mesmo tamanho que viajam em diferentes
velocidades após a ionização (Figura 16). Este tipo de equipamento
apresenta alta resolução (10000 a 20000) e o limite de massa varia
até a faixa de 8 -10 kDa, neste caso íons de moléculas menores
como os peptídeos derivados de tripsinização são mais facilmente
analisados.
fungos
plantas
algas
insetos
moluscos
Peixe
anfíbios
répteis
pássaros
mamíferos
10 4
10 5
10 6
10 7
10 8
10 9
10 10
10 11
Figura 3 - Tamanho de alguns genômas em pares de base.
2.3.1. Seqüenciamento Hierárquico
Essa estratégia geralmente é utilizada para o seqüenciamento de
grandes genômas. Nesse caso, uma das primeira etapas é a
construção de um mapa físico do genôma para que os fragmentos
seqüenciados possam ser facilmente montados. Em seguida,
grandes regiões do DNA genômico, como por exemplo um
cromossomo, são cortados em grandes fragmentos e clonados em
vetores específicos como BACs, PACs, and YACs. Esse DNA
clonado é novamente fragmentado em pequenos pedaços entre
1000 a 3000 pares de bases, clonado em vetores adequados e
posteriormente submetidos ao seqüenciamento. Essas seqüências
associadas com o seqüenciamento das extremidades dos BACs,
PACs, and YACs e o mapa físico são utilizadas para montagem do
genôma (Figura 4).
12
Figura 16 – Esquema do funcionamento de espectrômetros de massas com analisadores
do tipo TOF e tipo de informação obtida (resolução).
Analisadores do tipo quadrupólo (dois pólos carregados
positivamente e dois carregados negativamente) funcionam como
um filtro de íons de diferentes cargas, geralmente produzidos a
partir do tipo de ionização associada ao equipamento.
Equipamentos do tipo quadrupólo usam módulo de ionização tipo
ESI que gera dois tipos de íons (carregados positiva ou
negativamente). Durante a passagem dos íons ao longo do
quadrupólo em presença de uma corrente alternada, íons de cargas
29
Genoma
Biblioteca BAC com sobreposição
Biblioteca “shotgun” de cada BAC
Seqüência de DNA do genoma
Figura 4. Etapas para o seqüenciamento Hierárquico de Genôma
2.3.2. Seqüenciamento por fragmentos aleatórios (Shotgun)
Figura 15 – Representação da ionização por de pulverização de elétrons (ESI). Moléculas
em solução são ionizadas ao passar por um capilar metálico submetido a alta voltagem.
As gotículas contendo moléculas carregadas são evaporadas em
câmara durante fluxo de gás inerte sob pressão atmosférica.
3.2.1. Equipamentos de espectrometria de massa e sua
aplicação
Os equipamentos de espectrometria utilizados atualmente em
estudos de proteôma utilizam dois tipos de analisadores do tipo m/z
(massa/carga): TOF (Time-of-flight) e o Quadrupólo.
O analisador tipo TOF, pode ser traduzido como tempo de vôo, pode
ser caracterizado pelo tempo de vôo dos íons em uma câmara de
vácuo. O valor obtido no cromatograma não é quantitativo e reflete a
relação de massa e carga do íon (m/z). O modo Linear tem
capacidade de caracterizar proteínas de massa acima de 50 kDa
porém com baixíssima resolução. Duas estratégias para melhorar a
resolução da análise em TOF são a extração atrasada (DE –
delayed extraction) e o refletor. Na técnica de DE, o Laser incide
sobre a matriz contendo a amostra e após a adsorção é aplicada a
voltagem para promover a dissociação dos íons em direção ao
detector no modo Linear. O desenvolvimento de um espelho do tipo
refletor foi um avanço em relação ao modo Linear, e neste caso uma
28
Essa estratégia dispensa a etapa de mapeamento físico, uma das
tarefas mais difíceis e demoradas. O genôma do organismo é
fragmentado em pequenos pedaços, por quebra mecânica
(sonicação ou nebulização) e diversas bibliotecas são geradas
desses fragmentos aleatórios (Figura 5 e 6). O Tamanho dos
fragmentos clonados varia entre 1000 a 4000 pb, podendo chegar a
10.000 pb, as extremidades de um grande número de clones são
seqüenciadas e utilizadas para a montagem do genôma completo.
Apesar de ser estratégia mais rápida, demanda uma alta
capacidade computacional para processamento das seqüências e
montagem correta do genôma. Esta estratégia tem sido empregada
para o seqüenciamento de inúmeros genômas de procariontes como
de bactéria, por exemplo Xilela fastidiosa e Gluconacetobacter
diazotrophicus (consórcio RIOGENE) dentre outras, e também tem
sido utilizada para genômas de eucariontes, bem maiores, incluindo
o genôma humano. Um grande problema para os projetos de
seqüenciamento genômico é a grande quantidade de regiões do
genôma com seqüências repetidas o que, dentre outros problemas,
dificulta bastante o trabalho final de bioinformática para montagem
das seqüências. Para suplantar esse problema, mesmo quando se
utiliza a estratégia “shotgun” podem ser utilizadas bibliotecas com
grandes fragmentos de DNA para auxiliar a ordenação dos clones e
montagem do genôma. Além de diminuir a quantidade de
13
seqüenciamento das bibliotecas “shotgun”. No caso de genômas de
organismos eucariontes superiores, além da quantidade de DNA
repetitivo ser muito maior, esses problemas são agravados pelo fato
dos genes possuírem íntrons dificultando ainda mais a montagem e
localização das regiões codificantes do genôma. Uma alternativa
nesse caso é seqüenciar apenas o Genôma Funcional, ou seja, o
DNA complementar ao RNA mensageiros ou o cDNA. Nesse caso, o
RNA total do organismo é extraído, utilizado para síntese de cDNA
através da enzima transcriptase reversa, o cDNA é então clonado e
seqüenciado. Essa estratégia foi utilizada no Brasil para o
seqüenciamento do genôma de cana-de-açúcar, onde foram
seqüenciados um total de 340.000 ESTs (do Inglês Expressed
Sequencing Tags ou Etiquetas de seqüências Expressas).
O Brasil tem se destacado no seqüenciamento de genômas de
diverso organismos através de diversos projetos em redes, a nível
nacional e regional, envolvidos nos laboratórios de biologia
molecular em mais de 48 instituições de ensino e pesquisa, com a
mobilização de cerca de 240 cientistas de quase todas as regiões
do país. Os projetos serão divididos nos setores agrícolas e de
saúde. Conforme uma breve discussão a seguir.
Genoma
Bibliotecas “Shotgun”
Seqüência de DNA do Genoma
Figura 5 - Etapas para o seqüenciamento de genôma por fragmentos aleatórios (“Shotgun”).
Área de Saúde
Esquistossomose - Rede Genôma do Estado de Minas Gerais,
utilizando como modelo o genôma expresso do Schistosoma
mansoni, parasita responsável por infecção da esquistossomose,
doença que atinge cerca de 200 milhões de indivíduos em todo o
14
Figura 14 – Esquema do processo de ionização por MALDI.
Peptídeos ou fragmentos de proteínas co-cristalizada com uma
matriz (derivada de pequenos compostos orgânicos) liberam
molécula e partículas ionizadas após a ação do Laser. A protonação
induzida dos peptídeos depende da sua interação com a matriz.
Por sua vez o processo de ionização que utiliza a técnica de
pulverização de elétrons (ESI) permite que amostras de peptídeos
em solução (dissolvidos em solventes polares e voláteis) sejam
submetidos a ionização pela passagem através de um capilar sob
alta voltagem e pressão atmosférica (Figura 15). Neste caso, o uso
de um gás, geralmente N2, promove a volatilização do solvente e
com base no potencial electrostático ocorre a dissociação de íons
de diferentes cargas. A ionização através da técnica de pulverização
de elétrons (ESI) em microcapilares, sob pressão atmosférica e alta
voltagem, ganhou popularidade devido a facilidade com que ela
pode ser aplicada em conjunto com técnicas de cromatografia e
técnicas de separação eletroforéticas em fase líquida (AEBERSOLD
& GOODLETT, 2001). Além disso, a capacidade deste método de
ionização em produzir analitos com múltiplas cargas é adequada
para seu uso com instrumentos de espectrometria de massas do
tipo quadrupólo ou outros tipos de analisadores de massa com faixa
limitada de m/z (massa/carga).
27
spray ionization - ESI), são considerados métodos de ionização
suaves em comparação com outros métodos conhecidos e
associados ao processo de análise por espectrometria de massa. O
fator determinante que caracteriza como suave estas formas de
ionização depende das condições específicas utilizadas durante o
processo de geração de íons que não provoca uma significante
decomposição química e mesmo ligações fracas do tipo nãocovalentes são mantidas (MANN et al., 2001).
O método de ionização por MALDI se utiliza de pulsos de Laser
como fonte da energia de ionização e depende do uso de uma
matriz. A mistura de peptídeos derivados de fragmentação
enzimática é embebida em uma matriz orgânica (geralmente αcyano-4-hydroxycinaminic acid), composta por uma mistura de
peptídeos padrões (tipo “bradykinin” e ACTH) com moléculas
pequenas capazes de absorver energias do tipo UV (ultra-violeta) e
IR (infra-vermelho) que se co-cristralizam com os peptídeos da
amostra na presença de um doador de prótons (GARBIS et al.,
2005). Posteriormente os peptídeos ionizados são liberados a partir
dessa matriz após o bombardeamento com o feixe de laser emitido
em uma câmara (Figura 14). A ionização via MALDI é geralmente
utilizada com analisadores de massa do tipo tempo de vôo (Time-ofFlight - TOF) que são espectrômetros de massa mais simples e
robustos que apresentam sensibilidade para uma faixa ampla de
massas.
Como
este
método
de
ionização
produz
predominantemente íons carregados com uma única carga os
espectros gerados por MALDI-MS (ou MALDI-TOF) são simples de
interpretar.
mundo. Rede coordenada pela Fapemig (Fundação de Amparo à
Pesquisa de Minas).
Leishmaniose - ProGeNe (Programa Genôma do Nordeste), para o
seqüenciamento de Leishmania chagasi, uma das três espécies
responsáveis pela leishmaniose visceral, doença que afeta países
de clima quente e temperado no mundo todo. Projeto coordenado
pela UFPE (Universidade Federal de Pernambuco).
P. brasiliensis (Micose) - Projeto em Rede do Centro-Oeste, para o
estudo do genôma funcional e diferencial de Paracoccidioides
brasiliensis, fungo responsável por micose endêmica, denominada
paracoccidioidomicose, de alta prevalência na América Latina. Rede
coordenada pela UnB (Universidade de Brasília).
Doença de Chagas - Consórcio entre o Instituto de Biologia
Molecular do Paraná, Fiocruz (Fundação Oswaldo Cruz) e
Universidade de Mogi da Cruzes destinado a desenvolver a
genômica funcional do processo de diferenciação celular do
Trypanosoma cruzi: seleção e caracterização de novos genes e
análise de novos alvos quimioterápicos, sob coordenação do IBMP
(Instituto de Biologia Molecular do Paraná).
Setor Agrícola
Vassoura de Bruxa - Rede Genômica no Estado da Bahia, para
estudos do genôma do fungo Crinipellis perniciosa causador da
doença 'vassoura de bruxa' nas plantações de cacau, coordenado
pela Unicamp (Universidade Estadual de Campinas).
Fixador de Nitrogênio - Programa RioGene (Rede Genôma do
Estado do Rio de Janeiro) destinado ao seqüenciamento do genôma
da bactéria fixadora de nitrogênio Gluconacetobacter diazotrophicus,
coordenado pela UFRJ (Universidade Federal do Rio de Janeiro)
com participação da Embrapa Agrobiologia.
Fixador de Nitrogênio - Programa Genôma do Estado do Paraná,
para estudo do genôma estrutural e funcional da bactéria endofítica
fixadora de nitrogênio Herbaspirillum seropedicae, coordenado pela
UFPR (Universidade Federal do Paraná).
26
15
Fragmentos de DNA
Cultura de E. coli
no gel como alternativa para detecção de proteínas de baixa
expressão não é a solução, pois tem sido observado ocorrência de
saturação e fusão de spots em relação ao gel padrão, indicando
limitação da resolução do gel 2D (INAGAKI & KATSUTA, 2004).
Uma alternativa para estes problemas é o pré-fracionamento de
amostras de proteínas para aumentar a resolução de proteôma em
gel 2D através da redução da complexidade da amostra original.
Maiores detalhes sobre estratégias de pré-fracionamento podem ser
encontrados na revisão feita por WASINGER & CORTHALS (2002)
ou em trabalhos mais recentes.
æ Extração do DNA Plasmidial
Reação de Sequeciamento
(PCR)
Transformação de E.
coli e distribuição em
placas de 96 poços
Sequeciamento
(MegaBace 1000)
Read
}
“Contig”
Bioinformática
Ligação ao Vetor
3.2. Espectrometria
proteômica
Figura 6 - Estratégia utilizada pelo consorcio RIOGENE para o seqüenciamento completo
do genôma de Gluconacetobacter diazotrophicus
2.4. Pirosseqüenciamento:
nova
seqüenciamento rápido de genômas
alternativa
para
o
Apesar do aumento significativo da velocidade de seqüenciamento
com a utilização dos seqüenciadores automáticos, baseados no
método de SANGER et al. (1977), e o desenvolvimento de
diferentes estratégicas para o seqüenciamento completo do
genôma, ainda há uma grande quantidade de trabalho, tempo e
recursos financeiros para obtenção de hesito em um projeto de
seqüenciamento. Diversos grupos de pesquisa têm realizado
esforços para o desenvolvimento de métodos para a determinação
da seqüenciamento de DNA. Três métodos são bastante
promissores: seqüenciamento por hibridização (BAINS & SMITH
1988; DRMANAC et al., 1989; KHRAPKO et al., 1989; SOUTHERN,
1989), seqüenciamento por assinatura paralela, baseado na ligação
e clivagem do DNA (BRENNER et al., 2000) e o
pirosseqüenciamento (RONAGHI et al.; 1996, 1998). O
pirosseqüenciamento é uma técnica baseada na detecção do
pirofosfato (PPi) durante a síntese do DNA pela DNA polimerase.
Através de uma cascata de reações uma certa quantidade de luz
16
de
massa
e
sua
aplicabilidade
na
A análise de peptídeos e proteínas por espectrometria de massa
(MS – Mass spectrometry) se baseia na fragmentação de proteínas
em moléculas menores (peptídeos) antes de sua ionização e
separação por massa molecular (MW).
O desenvolvimento de métodos de ionização adequados para
proteínas e peptídeos e sua associação a instrumentos de análise
de massa fizeram com que a técnica de espectrometria de massa
(MS) se tornasse uma técnica complementar às técnicas de
ressonância nuclear magnética (NMR – nuclear magnetic
resonance), cristalografia de Raio X e outras técnicas clássicas de
química de proteínas aplicadas no estudo de diversos aspectos de
sua estrutura e função.
Métodos de ionização
Na década de 80, avanços no estudo de macromoléculas por
espectrometria de massa foram marcados pelo desenvolvimento de
dois processos de ionização capazes de gerar íons em moléculas
grandes e não-voláteis tais como as proteínas e peptídeos, sem
causar fragmentação significativa da molécula a ser analisada.
Estes processos conhecidos como ionização por desadsorção da
matriz mediada por Laser (MALDI - matrix-assisted laser
desorption ionization) e por pulverização de elétrons em
microcapilares sob pressão atmosférica e alta voltagem (electron
25
visível é gerada de acordo o número de nucleotídeos incorporados
(Figura 7). Essa cascata é iniciada com a reação de polimerização
do DNA e a liberação do PPi como resultado da incorporação no
nucleotídeos pela polimerase. O PPi é subseqüentemente
convertido a ATP através da ATP sulfurilase, o qual fornece energia
para a luciferase oxidar luciferina e gerar luz. Anteriormente esse
método não era utilizado para o seqüenciamento de genômas em
função da limitação no tamanho das leituras (reads) gerados em
torno de 80 a 120 pares de bases (RONAGHI et al., 1998). No
entanto, diversos aprimoramentos tecnológicos possibilitaram a
automação da reação e o desenvolvimento de uma equipamento
capaz de seqüenciar 25 milhões de bases, como uma precisão de
99% ou mais, em apenas 4 horas (AGAH et al., 2004; MARGULIES
et al., 2005).
IPG
strip
Figura 13 – Exemplo do uso de diferentes faixas de gradientes de pH para caracterização
preliminar do proteôma de uma cultivar de trigo (SKYLAS et al., 2005).
Tiras contendo faixas de pH imobilizados do tipo ampla (Broad - pH 3–10), média (mid - pH
4–7, 5–8, and 6–11) e estreita (narrow-range (pH 5.5–6.7). Proteínas foram detectadas com
corante fluorescente tipo SYPRO Ruby.
A detecção de proteínas básicas, de alto peso molecular,
hidrofóbicas ou pouco abundantes tem sido um dos desafios para a
análise de proteôma através de 2D-GE. Diversas estratégias para
superar estas limitações já foram descritas por vários autores para a
detecção de proteínas básicas e hidrofóbicas (RABILLOUD, 1998;
HOVING et al., 2002; TASTET et al., 2003). No caso de proteínas
que apresentam baixo nível de expressão celular, tais como
moléculas sinalizadoras e proteínas regulatórias (ex.: NifA –
regulador positivo da transcrição de genes nif), a detecção de
proteínas é de grande importância em estudos que visam
caracterizar a expressão diferencial de proteínas e seu mecanismo
de regulação. Aplicar maior quantidade de proteínas
24
Figura 7 - Princípio do Pirosseqüenciamento. A reação de polimerização do DNA libera o
PPi que é convertido a ATP pela ATP sulforilase. O ATP é utilizado como fonte de energia
para produção de luz pela luciferase (adaptado de RONAGHI, 2001).
O Pirosseqüenciamento é um método rápido para seqüenciamento
que não se baseia em eletroforese. No caso do equipamento
desenvolvido pela Roche Apllied Science denominado “Genome
Sequencer 20 System” (Figura 8), o seqüenciamento pode ser
dividido em quatro etapas principais (Figura 9): 1) DNA Genômico é
isolado e fragmentos com 300 a 800 pares de bases, gerados por
17
nebulização, são ligados a adaptadores e separados em fita
simples; 2) os fragmentos ligados são imobilizados em nanoesferas
de forma que apenas um fragmento seja ligado a cada esfera; 3) as
esferas são capturas por gotículas de uma emulsão água-óleo
contendo os reagentes para a reação de PCR (emPCR).
Figura 12 – Ilustração da técnica de 2D-GE para separação de proteínas de acordo com
seu pI e MW.
Figura 8 - Esquema do equipamento para o pirosseqüenciamento. O seqüenciador consiste
de quatro grandes subsistema: a) Câmara de distribuição de Fluídos, b) câmara de
circulação que inclui lâminas de fibra ótica contendo poços, c) câmara CCD para captura e
montagem das imagens e um computador que fornece ao usuário uma interface para
controlar o equipamento (adaptado de MARGULIES et al., 2005).
A reação de PCR ocorre em cada gota, resultando em esferas
contendo em torno de 10 milhões de copias de um único DNA
molde; 4) A emulsão e quebra, as fitas de DNA desnaturas, e as
esferas contendo clones de DNA fita simples são depositados em
poços de um lâmina de fibra ótica. Pequenas esferas contendo as
enzimas necessárias para a reação de pirosseqüenciamento
imobilizadas são depositadas em cada poço (Figura 9). Após a
preparação das esferas a reação de seqüenciamento é realizada
através da passagem de uma solução contendo o tampão de reação
e os nucleotídeos (A, T, G, e C) independentemente, com uma
18
Apesar do grande potencial de separação desta técnica, nem todas
as proteínas presentes em um extrato total podem ser resolvidas
devido a sua reduzida taxa de expressão e/ou diferenças extremas
em relação a solubilidade. Algumas estratégias podem ser adotadas
para resolver algumas limitações associadas a 2D-GE, uma delas é
o uso de múltiplos géis em diferentes faixas de pH ou peso
molecular para implementar a resolução da análise (Figura 13).
23
3.1. Análise do perfil de proteínas expressas através de
eletroforese bidimensional (2D-GE)
A eletroforese bidimensional (2D-GE) se tornou uma das técnicas
mais importantes para separação de proteínas com alta resolução
para análise proteômica através de espectrometria de massa (MS).
No entanto, apesar da grande demanda de substituição desta
técnica e inúmeros questionamentos sobre sua aplicabilidade em
relação a outras técnicas menos laboriosas para avaliação de
grandes volumes de amostras, seu nível de resolução e
sensibilidade ainda são bastante úteis para obter uma visão global
da atividade celular (revisado por FEY & LARSEN, 2001). A técnica
de eletroforese bidimensional tem como base a separação de
proteínas de acordo com seu ponto isoelétrico (pI) e sua massa
molecular (MW) em duas etapas de forma a ampliar o poder de
resolução de amostras complexas de proteínas (Figura 12). Na
primeira etapa a mistura de proteína solúvel do extrato bruto de uma
amostra é submetida a eletroforese na ausência de agentes
desnaturantes (SDS, uréia, DTT) de modo a favorecer a separação
dos polipeptídeos em determinado pH devido ao conteúdo de
cargas positivas e negativas de acordo com propriedade intrínseca
de cada molécula. De acordo com seu pI, cada proteína apresenta
carga líquida igual a zero e portanto tende a precipitar a partir de
uma solução, ou deixa de migrar ao longo de uma matriz de
poliacrilamida no caso da eletroforese, ao apresentar níveis de
protonação e redução capazes de neutralizar sua carga. A técnica
de 2D-GE, apesar dos seus mais de 25 anos de aplicação em
análise de proteínas, só recentemente recebeu atenção e inovações
que garantem a sua aplicação com altos índices de
reproducibilidade tais como a introdução de gradientes de pH
imobilizados em tiras de gel de poliacrilamida (GORG et al., 2000;
HANASH, 2000), as quais podem ser adquiridas comercialmente. As
condições de eletroforese utilizadas em diversos laboratórios não
são fruto de um consenso, e portanto devido a estas variações
dificilmente um gel pode ser comparado ao de outro laboratório em
detalhe.
22
lavagem do sistema após a passagem de cada base. A luz gerada é
capturada e utilizada para geração do pirograma (Figura 10).
Figura 9 - Preparação das amostras para a reação de pirosseqüenciamento, reação de
PCR em emulsão (emPCR), deposição das esferas contendo o DNA amplificado e
detecção da luz (Adaptado de MARGULIES et al., 2005). Ver detalhes no texto.
Figura 10 - Pirograma com os dados brutos obtidos na reação de pirosseqüenciamento
mostrando a proporção de sinal obtida para a incorporação de um, dois, três e quatro
nucleotídeos. Na parte inferior é indicado a ordem dos nucleotídeos e na parte superior a
seqüência obtida (Adaptado de RONAGHI, 2001).
19
Essa tecnologia tem vantagens na exatidão e facilidade de utilização
para diferentes aplicações. Dispensa a clonagem, construção de
biblioteca e seleção de clones, marcação de nucleotídeos, e a
eletroforese de DNA. Além disso, possui alta flexibilidade e suposta
alto nível de automação. Apesar de produzir seqüências com
tamanho entre 80 a 120 pares de bases, o que poderia ser um
problemas para a montagem do genôma, o desenvolvimento de
algoritmos matemáticos específicos e o grande número de
seqüências geradas, torna possível o seqüenciamento de um
genôma bacteriano em poucos dias (MARGULIES et al., 2005).
Certamente se para o organismos de interesse já houver algum
genôma seqüenciado será muito mais fácil a montagem do genôma
e dessa forma, dada a velocidade do seqüenciamento, essa
plataforma tecnológica poderá ser muito utilizada para o
seqüenciamento de genômas microbianos em larga escala e a
“tipagem” baseadas na seqüência do genôma.
3. Introdução a Proteômica
como ferramenta para a caracterização estrutural de proteínas
técnicas de cristalização e de análises por raio X e NMR. Além
disso, estudos in silico utilizando ferramentas de bioinformática são
essenciais para validar estruturas e identificar possíveis sítios de
interações dessas moléculas com seus potenciais ligantes.
Desde o final da década de 90, a análise proteômica tem sido feita
com base em duas etapas principais: separação de proteínas e
caracterização por espectrometria de massa (MS) da massa
molecular e/ou seqüência de aminoácidos dos peptídeos derivados
de digestão enzimática. A separação de proteínas pode ser
realizada através da eletroforese bidimensional (2D-gel
electrophoresis ou 2D-GE) ou diferentes tipos de cromatografia
(Figura 11). A técnica de cromatografia líquida (LC – liquid
chromatography ou CL) é uma das mais convencionais e pode ser
aplicada em conjunto com equipamentos de espectrometria de
massa sem necessidade de processamento entre a etapa de
separação e a análise de espectrometria de massa (LC-MS e LCMS/MS).
O termo proteôma pode ser traduzido no conteúdo de proteínas
presentes em uma amostra (ex.: tecido, órgão, plantas, animais,
cultura de células) em um determinado ponto ou ciclo de vida. A
abordagem em larga escala do estudo de proteínas, sua estrutura,
localização, modificação pós-traducional, função e interação com
outras proteínas e ligantes é denominada Proteômica. A Proteômica
pode ser separada em diversos campos de acordo com o objetivo
de estudo: Proteômica da expressão, Proteômica Funcional,
Proteômica Estrutural.
A Proteômica da expressão tem como objetivo caracterizar os níveis
de regulação da expressão de proteínas em respostas as condições
ambientais ou fisiológicas da célula ou organismo em estudo
(MONTI et al., 2005). Proteômica funcional visa monitorar e analisar
as propriedades espacial e temporal da rede molecular envolvidos
em células vivas ao longo de um processo ou ciclo celular. Neste
caso o foco está associado a atividade protéica, complexos multiproteínas e vias sinalizadoras (GODOVAC-ZIMMERMANN &
BROWN, 2001; MONTI et al., 2005). Proteômica estrutural utiliza
20
Figura 11 – Esquema da estratégia freqüentemente aplicada em estudos de Proteôma
(adaptado de GARBIS et al., 2005).
21