UNIVERSIDADE ESTADUAL DE FEIRA DE SANTANA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOTECNOLOGIA
GISELE PINTO ROCHA
BACTÉRIAS ASSOCIATIVAS E SIMBIONTES DOS
NÓDULOS DE ARACHIS PINTOI (LEGUMINOSAE)
Feira de Santana, BA
2007
ii
GISELE PINTO ROCHA
BACTÉRIAS ASSOCIATIVAS E SIMBIONTES DOS
NÓDULOS DE ARACHIS PINTOI (LEGUMINOSAE)
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-graduação em
Biotecnologia, da Universidade Estadual de Feira de Santana
como requisito parcial para obtenção do título de Mestre em
Biotecnologia.
Orientador: Dr. Eduardo Gross
Co-Orientador: Dr. Luciano Paganucci de Queiroz
Feira de Santana, BA
2007
iii
Aos
Meus pais, Tietre e Lúcia, que foram o
começo de tudo... e que sempre me apoiaram
em minhas decisões, estando sempre comigo.
Ao
Meu querido Alex, esposo, companheiro e
amigo, pelo carinho, amor, incentivo e
compreensão em todos os momentos.
Aos
Meus irmãos, Tietre e Marcel, sempre
presentes em minha vida.
DEDICO
iv
AGRADECIMENTOS
O meu primeiro agradecimento é ao Deus da minha vida e provedor de todas
as minhas vitórias. Pai, obrigada por tudo!
Ao orientador, Prof. Dr. Eduardo Gross, pela amizade, pelos ensinamentos
profissionais, éticos e humanos, além da paciente orientação e confiança.
Ao co-orientador, Luciano Paganucci de Queiroz, pelo incentivo.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq)
pelo apoio financeiro ao projeto.
À Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado da Bahia (FAPESB) pela bolsa
de Desenvolvimento Tecnológico e Regional (DTR-3) concedida.
À Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS) e ao Programa de Pósgraduação em Biotecnologia (PPGBiotec).
Ao Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) pelo apoio ao projeto.
À Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC) pela disponibilidade das suas
instalações.
À coordenadora da Estação de Zootecnia do Extremo Sul (CEPLAC), Bahia,
Cláudia de Paula Rezende, pela disposição e incansável ajuda na coleta dos
materiais de pesquisa.
Ao Prof. Dr. Euan K. James pela disponibilização das instalações no “Centre
for High Resolution Imaging and Processing”, Escócia.
À Valentina de Fátima, técnica da Escola Superior de Agricultura Luiz de
Queiróz (ESALQ/USP).
Ao coordenador do PPGBiotec, Prof. Dr. Aristóteles Góes-Neto, foi muito bom
poder contar com o teu incentivo e grande apoio neste projeto.
À Profa. Dra. Ana Paula Trovatti Uetanabaro, obrigada pelo apoio e
colaboração incansável, indispensáveis para uma melhor execução das atividades.
À Profa. Áurea Barreto (LAPEM) e ao Prof. Dr. Milton Roque (LAMASP) pela
atenção dispensada.
Ao Laboratório de Biologia Molecular (LAMOL) e ao Prof. Dr. Cássio Van den
Berg.
v
Aos amigos e colegas do LAMOL: Ricardo, Reyjane Patrícia, Patrícia, Andréa
Karla, Daiane e Sabrina.
Ao Laboratório de Micologia (LAMIC) e ao Prof. Dr. Luis Fernando P.
Gusmão.
Ao secretário do PPGBiotec, Helton Ricardo, pela pronta disposição.
À bolsista em iniciação científica Hellen Martins (UESC) pela grande
contribuição nas atividades deste projeto e pelos dias de convívio. Valeu muito,
Hellen!
À amiga Alinne Ambrósio pela ajuda incansável, valeu o apoio!
À orientanda Jakeline Carvalho pela dedicação a este projeto. Este projeto
passou a ser seu também, Jake!
Às colegas de pós-graduação e amigas, Catinha, Suiki e Lidiane, obrigada
pela contribuição indispensável!
Às lapemnetes: Carla, Suzana, Cissa, Alice e Tai. Meninas, vocês tornaram
tudo muito mais fácil e até divertido! Ah! E tem que entrar nesta lista também o João
Ronaldo e o Cléber, não como lapemnetes, é claro (risos)!
Aos colegas do LAPEM, todos (que não são poucos), valeu turminha!!!
Aos amigos conquistados através da pós-graduação, saibam que vocês
ganharam um lugar na minha vida: Ana Paula, Anderson, Fabrício, Juliana,
Cristiana, Wagner e Irailde!
Aos meus pais e meus irmãos, vocês também tornaram este momento uma
linda realidade.
Ao meu irmão, Tietre, muito obrigada pela ajuda nunca negada e por toda a
sua paciência (risos)!
Ao meu marido, Alex, você foi um grande amigo e incentivador para esta
realização. Obrigada meu amor!
À cada um que fez parte desta história!
vi
“Pondo de lado todo o impedimento... corramos com
perseverança a carreira que nos está proposta.”
(Hebreus, 12:1.)
vii
RESUMO
A espécie Arachis pintoi (amendoim forrageiro), é considerada uma
leguminosa de múltiplas utilizações, tais como em pastagens consorciadas, em
bancos de proteína, para cobertura verde em áreas de plantas perenes, em
ornamentação e na proteção do solo. O amendoim forrageiro apresenta relação de
associação e simbiose com diferentes bactérias do solo. As bactérias que se
associam às plantas colonizando suas raízes são denominadas rizobactérias e
dependendo do efeito no metabolismo da planta podem ser denominadas
promotoras de crescimento. As bactérias que formam nódulos nas raízes
catalisando a redução do nitrogênio atmosférico em amônia, tornando-o disponível
para a planta a qual em contrapartida fornece fotossintatos à bactéria, estabelecem
uma relação simbiótica mutualística. Os objetivos do presente trabalho foram o de
analisar diferentes acessos de A. pintoi procedentes do sul da Bahia quanto a sua
nodulação, estudando a morfoanatomia e ultra-estrutura dos seus nódulos, e o de
isolar, caracterizar e identificar as colônias de bactérias associativas e simbiontes
desses nódulos, com intuito de estabelecer um banco de bactérias para essa
espécie
vegetal
de
grande
importância
agropecuária.
Os
resultados
morfoanatômicos demonstraram que os nódulos desta planta podem ser
classificados como do tipo asquenomenóide com crescimento determinado. As
análises ultra-estruturais das células infectadas do nódulo evidenciaram a presença
de depósitos elétron-densos no simbiossomo, o qual encerra apenas um bacteróide
em seu interior. O tamanho desses bacteróides variou de 2 a 4 µm. Não foram
encontradas diferenças morfoanatômicas ou ultra-estruturais marcantes entre os
nódulos de A. pintoi coletados nos diferentes locais da região sul baiana. No total
foram isoladas 143 amostras de bactérias dos nódulos de A. pintoi e 11 gêneros
foram identificados utilizando o seqüenciamento parcial do rDNA 16S e comparação
através
da
Ochrobactrum,
ferramenta
Blastn
Pseudomonas,
do
GenBank:
Enterobacter,
Agrobacterium,
Serratia,
Rhizobium,
Pandorea,
Bacillus,
Paenibacillus, Brevibacillus e Corynebacteria. Os gêneros com maior número de
isolados foram Pseudomonas, Bacillus e Paenibacillus. Esses isolados constituíram
um banco de bactérias, o qual fornecerá inóculos para o amendoim forrageiro.
Palavras-chave: Nódulos. Bactérias simbiontes e associativas. Arachis pintoi.
viii
ABSTRACT
Arachis pintoi (perennial peanut) is considered a multiple use legume, like
consortiated pasture, protein bank, cover crop for perennial plants, ornamentation
and soil protection. Perennial peanut presents association and symbiosis
relationships with different soil bacteria. Bacteria that associated with plants
colonizing their roots are called rizobacteria and in according of effect on plant
metabolism are denominated growth promoters. Bacteria that form nodules on roots
converting atmospheric nitrogen on ammonia and transferring to the plant, which on
counterpart give photosyntates to bacteria, establish a mutualistic symbiosis
relationship. The goals of present study were to analyze different access of A. pintoi
from south of Bahia state on their nodulation, studying morphoanatomy and
ultrastructure of their nodules, and to isolate, to characterize and to identify bacteria
colonies associated and symbiont of these nodules, with aim to establish a bacteria
bank to this important agronomic plant species. The morphoanatomic results
demonstrated that the nodules of this plant could be classified as aeschynomenoid
type with determined growth. Ultrastructural analysis of nodule infection cells
evidenced the presence of eletron dense deposits on symbiosome, which surround
only one bacteroid in its interior. Bacteroid size was between 2 - 4 µm.
Morphoanatomic and ultrastructural differences were not found among A. pintoi
nodules collected on different localities from south of Bahia. On total were isolated
143 samples of A. pintoi nodule bacteria and 11 genera were identified using 16S
rDNA sequencing comparing by Blastn tool of GenBank: Agrobacterium, Rhizobium,
Ochrobactrum,
Pseudomonas,
Enterobacter,
Serratia,
Pandorea,
Bacillus,
Paenibacillus, Brevibacillus and Corynebacteria. Genera with most number of
isolates were: Pseudomonas, Bacillus and Paenibacillus. These isolates has
constituted a bacterial bank, which will provide inocula to test their effect on perennial
peanut.
Keywords: Nodules. Associatives and symbionts bacterias. Arachis pintoi.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1:
Características de A. pintoi.
Figura 2:
Esquema da reação de fixação de nitrogênio, com ação da
06
nitrogenase, nas condições normais de temperatura e pressão.
08
Figura 3:
Fases de formação da simbiose entre leguminosas e rizóbios.
13
Figura 4:
Esquema da invasão de Bradyrhizobium através das múltiplas
camadas de células de pelos da raiz.
Figura 5:
14
Mapa da Bahia. Municípios em que foram coletadas amostras de
nódulos de A. pintoi.
20
Figura 6:
Áreas de coleta dos nódulos de A. pintoi.
24
Figura 7:
Fotomicrografias de microscopia de luz dos nódulos radiculares de
A. pintoi.
Figura 8:
33
Fotomicrografias de microscopia de luz dos nódulos radiculares de
A. pintoi.
Figura 9:
34
Fotomicrografias de microscopia eletrônica de varredura dos
nódulos radiculares de A. pintoi.
35
Figura 10: Fotomicrografias de microscopia eletrônica de transmissão dos
nódulos radiculares de A. pintoi.
37
Figura 11: Aspectos morfológicos de colônias e de células de estirpes tipo e
isolados representativos dos nódulos de A. pintoi.
Figura 12: Resultados
da
amplificação
do
fragmento
eletroforese em gel de agarose 1%.
Figura 13: Esquema de um nódulo tipo asquenomenóide.
41
rDNA
16S,
via
42
68
x
LISTA DE TABELAS
Tabela 1:
Resultados analíticos da fertilidade completa + matéria orgânica dos
solos nos locais de coleta de nódulos de A. pintoi.
Tabela 2:
Resultados da composição granulométrica (g/kg) dos solos nos
locais de coleta de nódulos de A. pintoi. Dispersão com NaOH.
Tabela 3:
88
Caracterização morfológica das colônias selecionadas para extração
de DNA e seqüenciamento do rDNA 16S.
Tabela 7:
38
Características culturais dos isolados provenientes dos nódulos de
A. pintoi.
Tabela 6:
29
Quantidade de isolados obtidos dos diferentes cultivares de A. pintoi
nos diferentes locais de coleta.
Tabela 5:
22
Primers utilizados para amplificação e seqüenciamento do rDNA
16S.
Tabela 4:
22
40
Quantidade de isolados obtidos e seqüenciados dos diferentes
cultivares de A. pintoi nos diferentes locais de coleta.
42
Tabela 8:
Grupos obtidos através das análises de similaridade do GenBank.
44
Tabela 9:
Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I07 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
46
Tabela 10: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I22 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
48
Tabela 11: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I30 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
49
Tabela 12: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I67 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
50
Tabela 13: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I68 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
51
xi
no GenBank.
Tabela 14: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I82 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
52
Tabela 15: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I84 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
53
Tabela 16: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I85 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
54
Tabela 17: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I116 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
55
Tabela 18: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado IB13 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
56
Tabela 19: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado O01 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
57
Tabela 20: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado O21 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
58
Tabela 21: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado SF04 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
59
Tabela 22: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado SF14 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
60
Tabela 23: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado SF21 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
Tabela 24: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado SF23 do
61
62
xii
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
Tabela 25: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado B08 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
63
Tabela 26: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado B18 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
64
Tabela 27: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado B34 do
rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis
no GenBank.
65
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
%
Percentagem
ºC
Graus centígrados
µL
Microlitros
pb
Pares de bases
CEPLAC
Estação de Zootecnia do
PCR
Reação em cadeia da
Extremo Sul
polimerase
cv
Cultivar
Potencial
DNA
Ácido desoxirribonucléico
dNTP
Desoxirribonucleotídeo
EDTA
Embrapa
pH
hidrogeniônico
Ácido
pmol
Picomoles
etilenodiaminotetracético
q.s.p.
Quantidade suficiente
para
Empresa Brasileira de
pesquisa Agropecuária
RPM
Rotações por minuto
Formol álcool ácido
SDS
Sódio dodecil sulfato
acético glacial
seg
Segundos
h
Hora
TAE
Tampão Tris Acetato e
HUEFS
Herbário da Universidade
FAA
ILDIS
EDTA
Estadual de Feira de
TE
Tris - EDTA
Santana
Tris
Tri (hidroximetil)
International Legume
Database & Information
aminometano
UESC
Service
M
Molar
min
Minutos
mL
Mililitros
mm
Milímetros
mM
Milimolar
NCBI
National Center for
Biotechnology Information
Universidade Estadual
de Santa Cruz
UEFS
Universidade Estadual
de Feira de Santana
YMA
Yeast Mannitol Agar
xiv
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO
01
2
REVISÃO DA LITERATURA
07
2.1
FIXAÇÃO BIOLÓGICA DO NITROGÊNIO
07
2.2
BACTÉRIAS ASSOCIATIVAS
08
2.3
SIMBIOSE RIZÓBIO - LEGUMINOSA
11
2.4
NÓDULOS
12
2.5
RIZÓBIOS
15
2.6
RNA RIBOSSÔMICO 16S
18
3
MATERIAIS E MÉTODOS
20
3.1
LOCAIS DE COLETA DOS NÓDULOS, MATERIAL BOTÂNICO E SOLO
20
3.2
ISOLAMENTO DAS BACTÉRIAS
25
3.3
CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DAS COLÔNIAS DE RIZÓBIOS
25
3.4
PRESERVAÇÃO DAS BACTÉRIAS
26
3.5
MORFOANATOMIA E ULTRA-ESTRUTURA DOS NÓDULOS
26
3.5.1
Microscopia de luz
26
3.5.2
Microscopia eletrônica de varredura
27
3.5.3
Microscopia eletrônica de transmissão
27
3.6
EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO
28
3.7
AMPLIFICAÇÃO
POR
PCR
DO
FRAGMENTO
rDNA
16S
E
PURIFICAÇÃO
29
3.8
REAÇÃO DE SEQÜENCIAMENTO
30
3.9
ANÁLISE DAS SEQÜÊNCIAS OBTIDAS
30
4
RESULTADOS
31
4.1
MORFOLOGIA DOS NÓDULOS
31
4.2
ANATOMIA DOS NÓDULOS
31
4.3
ULTRA-ESTRUTURA DOS NÓDULOS
36
4.4
CARACTERIZAÇÃO DAS COLÔNIAS
38
xv
4.5
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS
42
5
DISCUSSÃO
67
5.1
MORFOLOGIA, ANATOMIA E ULTRA-ESTRUTURA DOS NÓDULOS
67
5.2
CARACTERIZAÇÃO DAS COLÔNIAS
70
5.3
CARACTERIZAÇÃO DO rDNA 16S
71
6
CONCLUSÕES
75
REFERÊNCIAS
76
APÊNDICE
88
ANEXO
95
1
1 INTRODUÇÃO
A introdução de leguminosa na pastagem promove incrementos na produção
animal, pelo aumento da qualidade e da quantidade da forragem em oferta,
resultante não só da participação da leguminosa na dieta do animal, mas também
dos efeitos indiretos relacionados com a fixação biológica de nitrogênio e seu
repasse ao ecossistema de pastagem (PEREIRA, 2007a).
Segundo Pereira (2007a), nas últimas duas décadas as pesquisas com
leguminosas forrageiras no Brasil ganharam impulso nunca antes registrado.
Centenas de novos acessos de leguminosas, de diferentes origens, foram avaliados
em ensaios individuais ou em redes nacionais ou internacionais.
A baixa persistência das leguminosas na pastagem tem sido citada como a
principal limitação à sua inclusão nos sistemas de produção ou até mesmo à
continuidade das pesquisas necessárias ao lançamento de novos materiais. Alguns
casos de sucesso são suficientes para estimular produtores e técnicos na
recomendação do uso de leguminosas e melhorar a produtividade e a
sustentabilidade da pastagem (PEREIRA, 2007a).
Praticamente todas as espécies do gênero Arachis produzem forragem de
boa qualidade e em quantidade razoável, quando comparadas com espécies de
outros gêneros de leguminosas utilizadas comercialmente (VALLS; SIMPSON,
1994). Dentre as várias espécies do gênero que apresentam potencial para
utilização em pastagens destaca-se Arachis pintoi Krapov. & W.C. Greg.
(KRAPOVICKAS; GREGORY, 1994) (Figura 1), conhecida como amendoim
forrageiro (VALLS, 1992).
As espécies do gênero Arachis ocorrem naturalmente em cinco países da
América do Sul: Argentina, Bolívia, Brasil, Paraguai e Uruguai. Existem
aproximadamente 80 espécies neste gênero e 64 destas ocorrem no Brasil, sendo
48 restritas ao território brasileiro; 15 estão distribuídas na Bolívia, 14 no Paraguai,
seis na Argentina e duas no Uruguai (VALLS; SIMPSON, 1994).
A família Leguminosae possui 727 gêneros e 19.327 espécies conhecidas e
está dividida em três subfamílias: Caesalpinioideae (4 tribos e 2250 espécies),
Mimosoideae (4 tribos e 3270 espécies) e Papilionoideae (28 tribos e 13800
espécies) (LEWIS et al., 2005). Arachis pintoi (amendoim forrageiro) é uma
2
Papilionoideae que pertence à Tribo Aeschynomeneae, seção Caulorrhizae, e o
gênero, que é sul-americano e que inclui também o amendoim (A. hypogaea),
apresenta 72 taxa aceitos pelo ILDIS (International Legume Database & Information
Service) atualmente (INTERNATIONAL..., 2007).
O amendoim forrageiro é uma leguminosa perene de hábito herbáceo, de
crescimento rasteiro e altura de 20 cm a 40 cm. A floração é indeterminada e
contínua, cálice bilabiado pubescente com um lábio inferior simples e um lábio
superior amplo com quatro dentes pequenos no ápice, provenientes da fusão de
quatro sépalas. A corola é formada por um estandarte de cor amarela, com asas
também amarelas e delgadas (Figura 1A e 1B). A quilha é pontiaguda, curvada e
aberta ventralmente na base, muito delgada e de cor amarelo claro. O caule é
ramificado, cilíndrico, com entrenós. Os nódulos geralmente encontram-se na raiz
(Figura 1C), podendo estar presente também no caule. As folhas são alternas,
glabras e apresentam pêlos sedosos nas margens (Figura 1D). Possui raiz pivotante
e é uma espécie geocárpica (PEREIRA, 2007b), ou seja, o fruto se desenvolve
dentro do solo (Figura 1E e 1F).
A principal expectativa do uso de leguminosas em pastagens é a melhoria da
produção animal em relação à pastagem de gramínea exclusiva com redução dos
custos de produção, quando comparados com estas mesmas pastagens submetidas
à adubação com nitrogênio mineral. Este benefício é reportado como sendo efeito da
participação direta da leguminosa melhorando e diversificando a dieta do animal e
também do aumento da disponibilidade de forragem pelo aporte de nitrogênio ao
sistema, através da sua reciclagem e transferência para a gramínea acompanhante
(PEREIRA, 2007a).
O melhor desempenho animal em pastagens consorciadas é explicado por
apresentarem em geral melhor valor alimentício em relação às gramíneas. Maiores
níveis de proteína bruta (PB) e de digestibilidade são os atributos mais marcantes.
Verifica-se ainda que, de uma maneira geral, a presença de leguminosa promove
melhoria nos níveis de PB da gramínea acompanhante, mesmo quando comparada
à adubação nitrogenada (PEREIRA et al., 1990 apud PEREIRA, 2007a).
Segundo LADEIRA et al. (2002) esta leguminosa forrageira de alta qualidade
possui valores médios de proteína bruta variando de 12,2% a 21,8% nas folhas
durante o período seco e chuvoso, respectivamente, e 9,3% e 13,5% nos ramos
durante os mesmos períodos (ARGEL; PIZARRO, 1992). Em experimento conduzido
3
em Itabela (BA) os valores de proteína bruta de dez genótipos de amendoim
forrageiro avaliados variaram de 23,29% a 26,99% (OLIVEIRA et al., 2005). A
digestibilidade média encontrada na época da seca foi de 67%, e na época chuvosa
de 62% (RINCÓN et al., 1992), além de apresentar grande aceitabilidade pelos
animais (LASCANO; THOMAS, 1988; CARULLA; LASCANO; WARD, 1991).
A. pintoi tem sido utilizada como cobertura do solo (“cover crop”) e adubo
verde (PERIN et al., 2003). Vários estudos corroboram a grande importância desta
espécie na cobertura do solo, não afetando a produção, o crescimento e o
desenvolvimento dos sistemas agroflorestais e silvipastoris, e auxiliando na
manutenção e mesmo melhoramento das características físicas, químicas e
biológicas edáficas (PÉREZ, 1996; PÉREZ-JIMÉNEZ et al., 1996; ANDRADE;
VALENTIM, 1997).
O amendoim forrageiro apresenta excelentes características agronômicas,
como adaptação a solos ácidos, resistência e tolerância a pestes e doenças, e é
prolífera na produção de sementes em alguns acessos (ARGEL; PIZARRO, 1992).
Persiste ao pastoreio, devido ao hábito de crescimento reptante e habilidade de
enraizar nos estolhos que protegem o solo dos efeitos erosivos das águas das
chuvas fortes, conferindo a alta resistência à desfolha e reserva de sementes no solo
(JONES, 1993; MIRANDA; VIEIRA; CADISCH, 2003; LIMA et al., 2006). A. pintoi
possui seus pontos de crescimento protegidos, permitindo que uma área foliar
residual satisfatória seja mantida, mesmo quando submetido a um pastejo contínuo
(GROF, 1985).
A habilidade das leguminosas em simbiose com rizóbios de fixar o N2 tem
grande importância tanto do ponto de vista ecológico como agronômico. De maneira
geral, as folhas das leguminosas apresentam maior conteúdo em nitrogênio que as
das demais plantas que crescem no mesmo local (SPRENT, 2001). Essa
característica tem importantes implicações práticas na ciclagem de nutrientes devido
à rápida mineralização das suas folhas ricas em nitrogênio (SPRENT, 2001) e no
uso como forrageira devido ao alto conteúdo de compostos nitrogenados (ALLEN;
ALLEN, 1981).
Segundo Evans e Burris (1992), as bactérias fixadoras de nitrogênio,
diazotróficas, tão importantes para o processo de ciclagem de nutrientes, podem ser
caracterizadas em três grupos: bactérias diazotróficas de vida livre, que fixam o
nitrogênio para o seu próprio uso; diazotrofos associativos, que contribuem para o
4
crescimento da planta sem a formação de estruturas diferenciadas, não
estabelecendo uma simbiose, e os diazotrofos simbiontes que estabelecem relação
com o macrossimbionte onde são formadas estruturas diferenciadas, os nódulos.
O amendoim forrageiro apresenta relação simbiótica com determinadas
bactérias fixadoras de nitrogênio atmosférico, conhecidas e aqui doravante
chamadas de rizóbios. A fixação biológica do nitrogênio (FBN) é um processo que
consome ATP ao invés de derivados de petróleo para a produção de amônia, sendo,
portanto, renovável e de baixo custo, não provocando impactos ambientais. Nos
nódulos localizados nas raízes e formados pela associação mutualística, a bactéria
reduz o nitrogênio atmosférico (N2) em amônia, tornando-o disponível para a planta,
a qual, em contrapartida, fornece fotossintatos ao rizóbio (ALLEN; ALLEN, 1981).
As bactérias fixadoras de nitrogênio, conforme a segunda edição do Manual
Bergey´s de Sistemática em Bacteriologia® (GARRITY; WINTERS; SEARLES,
2001), pertencem ao Filo Proteobacteria e às Classes Alfaproteobacteria,
Betaproteobacteria,
Gammaproteobacteria,
Deltaproteobacteria
e
Epsilonproteobacteria. O amendoim forrageiro geralmente forma associações com
alfaproteobactérias de crescimento lento e produtoras de álcalis do gênero
Bradyrhizobium.
Entretanto,
algumas
bactérias
do
gênero
Rhizobium
(de
crescimento rápido e produtoras de ácidos) já foram isoladas dos nódulos dessa
planta (PINTO et al., 2004). Essa simbiose é muito importante por poder dispensar
parcial ou totalmente a utilização de fertilizantes nitrogenados, contribuindo assim
para viabilizar programas de reflorestamento e minimizar possíveis impactos
ambientais (CHEN et al., 2003). Pesquisas que visam o isolamento e identificação
de estirpes de rizóbio eficientes no processo de fixação de nitrogênio podem
subsidiar a melhoria do estado nutricional da planta aumentando sua produtividade.
Vale ressaltar a presença de outros microrganismos no solo rizosférico que
podem contribuir para a decomposição e mineralização da matéria orgânica,
nitrificação, amonificação, agregação e estabilidade de agregados do solo, produção
de substâncias reguladoras de crescimento, de enzimas, vitaminas e co-fatores e
diferentes tipos de simbioses (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Os objetivos do presente trabalho foram o de analisar diferentes acessos de
A. pintoi procedentes do sul da Bahia quanto à sua nodulação, estudando a
morfoanatomia e ultra-estrutura dos seus nódulos, e o de isolar, caracterizar e
identificar as colônias de bactérias associativas e simbiontes desses nódulos, com
5
intuito de estabelecer um banco de bactérias para essa espécie vegetal de grande
importância agropecuária.
6
A
B
C
D
E
F
D
Figura 1: Características de Arachis pintoi. A. Flor em vista frontal. B. Vista geral do hábito reptante da
planta. C. Detalhe dos nódulos na raiz principal e raízes secundárias. D. Detalhe das folhas alternas e
glabras com folíolos. E. Sementes geocárpicas. F. Detalhe da semente no solo. Fig. 1A, 10 mm; Fig. 1B,
30 mm; Fig. 1C, 10 mm; Fig. 1D, 10 mm; Fig. 1E, 45 mm; Fig. 1F, 15 mm.
7
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 FIXAÇÃO BIOLÓGICA DE NITROGÊNIO
Com a exceção da água, o nitrogênio é geralmente considerado o recurso
mais limitante para o crescimento de plantas no seu ambiente natural (FRANCO;
DÖBEREINER, 1994). O nitrogênio, além do carbono, oxigênio e hidrogênio, é o
nutriente mais abundante na matéria viva, participando na composição de moléculas
de ácidos nucléicos e proteínas dentre outras. Entretanto, apesar de ser requerido
em quantidades significativas pelos seres vivos, na natureza este elemento é
encontrado em abundância em uma forma quimicamente muito estável, o nitrogênio
molecular (N2), e sua pronta assimilação pela maioria dos seres vivos é limitada,
requerendo sua transformação para uma forma combinada que facilite sua
assimilação (MARIN et al., 2007).
A atmosfera terrestre é composta por 78% de gás dinitrogênio (N2). A
introdução do nitrogênio atmosférico, via fixação biológica de nitrogênio (FBN), no
circuito dos ciclos biogeoquímicos do nitrogênio tem freqüentemente efeitos positivos
no ambiente e na economia (STACEY; BURRIS; EVANS, 1992).
O problema básico para a fixação do nitrogênio é a presença da tripla ligação
(N≡N) o que torna este gás extremamente estável à temperatura ambiente
(SPRENT; SPRENT, 1990; EVANS; BURRIS, 1992). Apesar do N2 ser bastante
abundante na atmosfera terrestre, apenas uma pequena parte das espécies de
procariotos possui a enzima nitrogenase, indispensável para reduzir o N2 para a
forma inorgânica combinada NH3 (amônia) que pode, então, tornar-se disponível
para plantas e outros organismos denominados fixadores de nitrogênio ou
diazotróficos e o mecanismo responsável pela incorporação de nitrogênio à
biomassa é conhecido como fixação biológica de nitrogênio (FBN) (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2006).
Portanto, a FBN é o processo pelo qual a maior parte do nitrogênio
atmosférico é incorporada à matéria viva, ao longo da evolução do nosso planeta.
Ainda hoje, este processo constitui a principal via de incorporação de nitrogênio ao
ecossistema, que constantemente é reciclado para a atmosfera principalmente por
8
organismos decompositores de matéria orgânica do solo (MARIN et al., 2007). A
FBN, além de garantir um ecossistema em equilíbrio, possibilita a redução na
aplicação de doses excessivas de compostos nitrogenados, como por exemplo, o
nitrato, que contamina as águas e os vegetais consumidos pelo homem,
contribuindo para o desenvolvimento de uma agricultura menos agressiva ao
ambiente. Embora a contribuição dos processos industriais seja bastante
significativa em se tratando dos sistemas manejados agrícolas e florestais, se forem
considerados também os ecossistemas naturais, o processo biológico contribui com
a maior parte do nitrogênio fixado anualmente no planeta – 175 x 106 toneladas, ou
seja, cerca de 65% do total (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Os rizóbios, organismos diazotróficos, possuem a enzima nitrogenase que é
capaz de reduzir o N2 para a forma inorgânica combinada NH3 (Figura 2), que pode
então se tornar disponível para as plantas com as quais essas bactérias fazem
simbiose (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
N2 + 8H+ + 16 ATP + 8e-
nitrogenase
2NH3 + H2 + 16 ADP + 16 Pi
Figura 2: Esquema da reação de fixação de nitrogênio, com ação da nitrogenase, nas condições
normais de temperatura e pressão.
2.2 BACTÉRIAS ASSOCIATIVAS
Rizosfera é a zona do solo sob influência do sistema radicular. As
propriedades físico-químicas da rizosfera têm elevada estabilidade, que associadas
ao fornecimento constante de substratos orgânicos e fatores de crescimento,
favorecem intensa atividade metabólica das populações de microrganismos,
influenciando direta e positivamente o tempo de geração microbiano (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2006). Segundo Kuss (2006), o crescimento e atividade microbianos são
intensos na rizosfera devido à presença de compostos orgânicos liberados pelas
raízes e que podem ser utilizados como fonte de energia e carbono.
Bactérias que se associam às plantas, colonizando suas raízes, são
denominadas rizobactérias, e podem ser classificadas de acordo com seus efeitos
9
sobre o crescimento vegetal: benéficas, deletérias ou neutras (DOBBELAERE;
VANDERLEYDEN; OKON, 2003). Quando benéficas, as bactérias colonizam o
sistema radicular e promovem o crescimento vegetal, sendo denominadas
rizobactérias promotoras de crescimento de plantas (RPCPs), em inglês “plant
growth promoting rhizobacteria” (KUSS, 2006).
Entre as rizobactérias existe um gradiente de proximidade e intimidade com a
raiz: (1) bactérias vivendo no solo ao redor das raízes (utilizando metabólitos
liberados pelas raízes como fontes de C e N); (2) bactérias colonizando o rizoplano
(superfície da raiz); (3) bactérias residindo no tecido radicular e; (4) bactérias
vivendo no interior das células em estruturas radiculares especializadas (nódulos,
como é o caso da interação rizóbio - leguminosa) (KUSS, 2006).
Rizobactérias que se instalam no interior das raízes das plantas, formando
associações, são endofíticas (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006), mas o conceito se
estende ainda para bactérias que podem ser isoladas de plantas cujos tecidos foram
desinfestados superficialmente ou extraídas do interior das plantas, e que não
causam prejuízo visível nas plantas (GRAY; SMITH, 2005).
As rizobactérias promotoras de crescimento em plantas podem afetar o
crescimento vegetal de forma direta ou indireta. A promoção direta envolve a
produção de compostos ou facilita a entrada de certos nutrientes do ambiente para
nutrir as plantas. Os mecanismos de ação direta incluem: fixação biológica de
nitrogênio (FBN), síntese de sideróforos e produção de fitormônios. Indiretamente,
promovem
o
crescimento
vegetal
reduzindo
ou
prevenindo
a
ação
de
microrganismos patogênicos, devido à produção de antibióticos ou sideróforos
(RODRIGUEZ; FRAGA, 1999).
Existem bactérias, como por exemplo, Pseudomonas fluorescens, que
produzem sideróforos, substâncias que têm alta afinidade por ferro e que formam
quelatos, tornando assim este composto menos disponível, principalmente para
patógenos da rizosfera (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Em relação à produção de fitormônios, estudos têm aumentado a evidência
de que bactérias diazotróficas apresentam papel importante no desenvolvimento
vegetal através da síntese e exportação de fitormônios ou reguladores de
crescimento vegetal. Os reguladores de crescimento vegetal são compostos
orgânicos que, sob concentrações muito baixas, influenciam processos fisiológicos
nas plantas, são estes: auxinas, giberelinas, citocininas, etileno e ácido abscísico
10
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Estas substâncias podem ser produzidas pela própria
planta (endógena) ou produzidas por microrganismos presentes na raiz (exógena),
podendo um mesmo organismo produzir mais de um tipo de fitormônio (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2006).
Kuss (2006) estima que 80% das bactérias isoladas da rizosfera têm a
capacidade de produzir auxinas reguladoras de crescimento vegetal e que mais de
90% dos microrganismos encontrados na rizosfera são capazes de liberar citocinina
quando cultivadas “in vitro”, estes microrganismos associados a plantas podem
produzir mais de 30 compostos promotores de crescimento do grupo das citocininas.
Em relação às giberelinas, muitas observações sugerem que este fitormônio pode
ser também produzido por microrganismos, induzindo ou promovendo o crescimento
de plantas hospedeiras, como por exemplo, Azospirillum spp. que apresentam um
importante papel nos primeiros estágios de crescimento em gramíneas devido às
giberelinas que produzem (CREUS; SUELDO; BARASSI, 2004).
Outra grande importância das rizobactérias é que elas são capazes de
secretar ácidos orgânicos e fosfatases que facilitam a conversão das formas
insolúveis de fósforo presente no solo em formas disponíveis para as mesmas,
disponibilizando o nutriente para as plantas hospedeiras (KIM; JORDAN;
McDONALD, 1998). Depois do nitrogênio, o fósforo é o segundo mineral limitante do
crescimento vegetal. Diferentes espécies de bactérias foram identificadas como
capazes de solubilizar compostos fosfatados inorgânicos, como Pseudomonas,
Bacillus, Rhizobium, Burkholderia (KUSS, 2006).
Vários são os exemplos da aplicação de microrganismos na produção
agrícola: aumento na produção por meio da síntese de fitormônios, promoção do
desenvolvimento e da proliferação das raízes (MEHNAZ et al., 2001), maior
resistência das plantas a doenças (CHEN et al., 1995), contribuição no manejo de
pragas e doenças (FAHEY et al., 1991), fixação do nitrogênio e maior resistência das
plantas a condições de estresse (BENSALIM; NOWAK; ASIEDU, 1998).
11
2.3 SIMBIOSE RIZÓBIO – LEGUMINOSA
Relações simbióticas significam parcerias criativas. A Terra não pode ser
vista nem como um ecossistema a ser preservado inalterado nem como um
canteiro para ser explorado por razões egoístas e econômicas de curto
prazo, mas como um jardim a ser cultivado para o desenvolvimento das
próprias potencialidades da aventura humana. O objetivo desta relação não
é a manutenção do status quo mas a emergência de novos fenômenos e de
novos valores [RENÉ DUBOIS, (1901-1982)].
A simbiose entre rizóbios e leguminosas é geralmente entendida como sendo
mutualística. Segundo Moreira e Siqueira (2006), as simbioses de rizóbios podem
ser parasíticas (quando há formação de nódulos inefetivos) ou mutualísticas (quando
há formação de nódulos efetivos). Porém, mesmo no caso de formar nódulos
efetivos, ocorre um estádio inicial parasítico transitório quando a bactéria está
recebendo fotossintatos da planta sem ainda fixar nitrogênio para transferi-lo para
esta (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Nos nódulos, o rizóbio, na forma pleiomórfica (bacteróide) realiza o processo
de redução do nitrogênio atmosférico para uma forma combinada (amônia), que
pode ser utilizada pela planta hospedeira. Em troca, a planta supre a bactéria com
fontes de energia e carbono para sua manutenção (MERCANTE; GOI; FRANCO,
2002).
O estabelecimento da simbiose entre leguminosa e rizóbio segue alguns
passos: a pré-infecção; a infecção da planta pela bactéria e formação do nódulo; e o
funcionamento do nódulo com fixação de nitrogênio. Esses passos dependem e
podem variar em função dos genótipos da planta e da estirpe de bactéria envolvidos,
assim como dos fatores ambientais (PATRIARCA; TATÉ; IACCARINO, 2002).
12
2.4 NÓDULOS
Durante a associação dos rizóbios com as leguminosas, são observadas
estruturas diferenciadas chamadas nódulos formadas devido à presença destas
bactérias nas raízes de leguminosas. Os nódulos se apresentam como estruturas
hipertróficas nas raízes e, excepcionalmente, no caule das plantas (MOREIRA;
SIQUEIRA, 2006) e são basicamente de dois tipos: determinados e indeterminados.
Os nódulos determinados apresentam formato globoso, devido o desenvolvimento
do meristema esférico temporário, já os indeterminados são alongados, por causa da
presença de um meristema persistente localizado no seu ápice (PATRIARCA; TATÉ;
IACCARINO, 2002; GAGE, 2004; PRELL; POOLE, 2006).
Nos estádios de pré-infecção as bactérias são atraídas por exsudados
liberados pela planta a ser infectada, essas substâncias promovem a colonização da
rizosfera por quimiotaxia (Figura 3A). Estes exsudados são percebidos pela bactéria
como sinais liberados na rizosfera e são basicamente compostos fenólicos
(flavonóides) e betaínas, que desencadeiam a expressão de genes nod envolvidos
na nodulação (LONG, 1989; MARTÍNEZ; ROMERO; PALACIOS, 1990; KRISHNAN;
KUO; PUEPPKE, 1995) e que, a depender da bactéria, podem estar localizados no
DNA cromossômico ou plasmidial (CHANDLER; DATE; ROUGHLEY, 1982;
PATRIARCA; TATÉ; IACCARINO, 2002; GAGE, 2004).
Após a colonização da rizosfera, as bactérias aderem-se aos pelos das raízes
das plantas, induzindo-lhes o encurvamento (Figura 3B) e, posteriormente, o início
da formação do meristema do nódulo (CHANDLER; DATE; ROUGHLEY, 1982;
SPRENT, 2001; PATRIARCA; TATÉ; IACCARINO, 2002; GAGE, 2004).
A formação do meristema do nódulo, segundo Cardoso, Tsai e Neves (1992),
é provocada pela sinalização que induz a mitose acelerada de células hipodérmicas,
determinada por fatores estimulantes provenientes da bactéria. Esse estímulo é
dirigido também às células localizadas nas proximidades dos pólos do xilema da
planta. No estágio inicial da divisão hipodérmica, forma-se o meristema primário do
nódulo. Quando a bactéria invade o pelo radicular, esse meristema primário induz a
divisão pericíclica de células próximas à região do xilema, formando o meristema
secundário do nódulo que se funde ao primário. Tanto as células em divisão quanto
às invadidas por rizóbios se fundem, e as células infectadas por bactérias aumentam
13
de volume rapidamente ficando restritas à zona central do nódulo, o qual cresce e se
diferencia (CARDOSO; TSAI; NEVES, 1992).
Figura 3: Fases de formação da simbiose entre leguminosas e rizóbios. (Adaptado de:
<www.plantphys.net>)
1. Liberação de flavonóides pela raiz da planta;
2. Quimiotaxia do rizóbio em direção à superfície da raiz;
3. Proliferação do rizóbio na rizosfera e indução da diferenciação do primórdio do nódulo;
4. Aderência do rizóbio à raiz;
5. Diferenciação do meristema secundário do nódulo (originando a conexão vascular);
6. Encurvamento do pêlo radicular e formação da corrente de infecção;
7. Múltipla infecção das células do nódulo e crescimento do nódulo;
8. Crescimento do nódulo, diferenciação dos bacteróides e começo da fixação simbiótica de
nitrogênio.
Ao contrário do que ocorre na maioria das leguminosas nodulíferas, no
gênero Arachis a penetração da bactéria na raiz pode se dá através dos pêlos
presentes na raiz jovem (UHEDA; DAIMON; YOSHIZAKO, 2001) ou através de
aberturas (fissuras) na epiderme da raiz (CHANDLER, 1978). Em um estudo
detalhado sobre nodulação em A. hyphogaea (amendoim), Chandler (1978)
observou que a infecção do rizóbio nessa espécie de planta ocorria através de
fissuras na superfície da raiz e que não havia a formação da corrente de infecção. O
rizóbio nodula o amendoim entrando onde o pêlo radicular ou a raiz lateral emerge,
ocupando o espaço entre a parede do pêlo e a da célula epidérmica adjacente. Após
14
a invasão da raiz, as bactérias são distribuídas intercelularmente via lamela média,
entrando nas células corticais através da parede celular estruturalmente alterada. O
rizóbio multiplica-se rapidamente dentro das células corticais e estas células
invadidas dividem-se repetidamente para formar o tecido infectado desse nódulo de
crescimento determinado (CHANDLER, 1978).
Segundo Uheda, Daimon e Yoshizako (2001), os bradirizóbios invadem
somente a lamela média entre as células de pêlos adjacentes (Figura 4). Nestes
locais a parede primária dos pelos é fracamente construída assim como a das
células epidérmicas da raiz primária. Os bradirizóbios provavelmente invadem a
lamela média através da produção de enzimas como a poligalactoronase (UHEDA;
DAIMON; YOSHIZAKO, 2001).
Figura 4: Esquema da invasão de Bradyrhizobium através das múltiplas camadas de células
de pelos da raiz (Adaptado de: UHEDA; DAIMON; YOSHIZAKO, 2001).
A. A emergência dos pêlos da raiz pode facilitar o desprendimento da camada exterior (seta).
A parede primária da base das células do pêlo da raiz tem construção frouxa. Bradyrhizobium
invade entre a lamela média e célula adjacente (pontas da seta), espalha-se na lamela média
e penetra eventualmente nas células. B. Vista ampliada da área do círculo.
A formação de nódulos através da invasão intercelular ou “entrada através de
fissura” foi primeiro descrita por Allen e Allen (1940), esta que ocorre em amendoim,
A. hypogaea, é comum também em outras simbioses como em Stylosanthes e
15
Rhizobium (CHANDLER; DATE; ROUGHLEY, 1982), Mimosa e Rhizobium (de
FARIA; HAY; SPRENT, 1988), e Sesbania e Azorhizobium (NDOYE et al., 1994).
Interessantemente, rizóbios que nodulam o amendoim através das fissuras
provocadas pela emergência da raiz lateral podem nodular outras leguminosas via
pelo radicular, formando nódulos determinados, como por exemplo, em Vigna
unguiculata inoculada com Bradyrhizobium (SPRENT, 2001).
Nódulo pode ser considerado um órgão da planta formado pela simbiose com
o rizóbio, entretanto, para eles serem efetivos, precisam manter o nível de oxigênio
baixo, pois a enzima responsável pela fixação de nitrogênio (a nitrogenase) é
extremamente sensível a O2. Para neutralizar a incompatibilidade de fixação de N2 e
o seu metabolismo aeróbio, os diazotróficos desenvolveram vários mecanismos para
protegerem o sítio ativo da nitrogenase da interferência do oxigênio, como por
exemplo, apresentar uma razão superfície / volume celular menor, o que seria um
modo de impedir o excesso de absorção de O2 (GAGE, 2004; MOREIRA;
SIQUEIRA, 2006; PRELL; POOLE, 2006). Além disso, os nódulos que fixam
nitrogênio apresentam um composto com função e composição semelhante à
hemoglobina, a leghemoglobina, que transporta oxigênio para os microrganismos. A
leghemoglobina possui uma alta afinidade pelo O2, agindo assim como um tampão,
mantendo a concentração de oxigênio baixa no meio e provendo O2 ao
microssimbionte numa taxa constante, prevenindo assim a flutuação excessiva
dessa molécula (GAGE, 2004; MOREIRA; SIQUEIRA, 2006; PRELL; POOLE, 2006).
A taxa de fixação de nitrogênio varia com a espécie de leguminosa e a estirpe
de rizóbio, mas é geralmente limitada pelas condições abióticas do solo, como: a sua
acidez (WOLFF et al., 1991; ANYANGO et al., 1995), o tipo de solo, sua textura e
composição (HEIJNEN; BURGERS; VAN VEEN, 1993), a temperatura e umidade
(WOLFF et al., 1991) e a presença de metais pesados (HIRSCH et al., 1993).
2.5 RIZÓBIOS
O termo “rizóbio”, no senso estrito da palavra, referiu-se, durante muito tempo,
aos membros do gênero Rhizobium. Com o passar dos anos, entretanto, este termo
foi sendo usado para todas as bactérias capazes de nodular e fixar nitrogênio em
16
associação com leguminosas (WILLEMS, 2006). O grupo denominado como
“rizóbio” são alfaproteobactérias Gram-negativas, aeróbias obrigatórias sem
endósporos, que produzem hipertrofias corticais em plantas, denominadas nódulos
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Dentre os diversos táxons de bactérias fixadoras de nitrogênio, os rizóbios
podem ser considerados como o grupo mais importante para a agricultura tropical
devido sua associação com leguminosas. Esta simbiose é responsável por uma
substancial parte do fluxo global de nitrogênio atmosférico fixado nas formas de
amônia, nitrato e compostos orgânicos (KAHINDI et al., 1997).
Segundo Straliotto e Rumjanek (1999), estudos taxonômicos e filogenéticos
são necessários para estabelecer a real diversidade de rizóbios nos solos tropicais,
a qual durante muito tempo foi negligenciada, em parte devido às dificuldades de
classificação impostas pelos métodos tradicionais, baseados essencialmente em
características fenotípicas, morfológicas e fisiológicas.
Nas últimas décadas, os métodos moleculares baseados no estudo do
genoma bacteriano constituíram uma fonte abundante de dados reproduzíveis e
passíveis de serem gerados sem a interferência de problemas técnicos importantes
como condições de cultivo, estado fisiológico e tantos outros fatores que, muitas
vezes, mascaram os dados fenotípicos (STRALIOTTO; RUMJANEK, 1999).
Segundo Willems (2006), a partir da década de 80, com a introdução de
características genéticas nos estudos de taxonomia de microrganismos, o
conhecimento sobre a diversidade de rizóbios foi expandido, além disso, a biologia
molecular permitiu o estudo entre os táxons de rizóbios e sua relação com outros
grupos de bactérias.
Segundo Moreira e Siqueira (2006), atualmente são reconhecidos e aceitos
três gêneros de diazotróficos da família Rhizobiaceae: Rhizobium (FRANK, 1889),
Sinorhizobium (CHEN; YAN; LI, 1988; de LAJUDIE et al., 1994) e Allorhizobium (de
LAJUDIE et al., 1998); dois gêneros da família Bradyrhizobiaceae: Bradyrhizobium
(JORDAN, 1984) e Blastobacter (van BERKUN; EARDLY, 2002); um gênero da
família Xanthobacteraceae: Azorhizobium (DREYFUS; GARCIA; GILLIS, 1988); um
gênero da família Hyphomicrobiaceae: Devosia (RIVAS et al., 2002); um gênero da
família Phyllobacteriaceae: Mesorhizobium (JARVIS et al., 1997); um gênero da
família Methylobacteriaceae: Methylobacterium (SY et al., 2001) e um gênero da
família Brucellaceae: Ochrobactrum (TRUJÍLLO et al., 2005).
17
Até 1982 apenas um gênero e seis espécies de rizóbio eram descritos.
Desde então, não só os avanços da biologia molecular, mas também o estudo de
novas simbioses contribuíram para a descrição de 13 novos gêneros e 54 novas
espécies (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006). Apesar disto, considera-se que o número
de espécies existentes ainda esteja bastante subestimado, uma vez que muitas
espécies de leguminosas (que perfazem algo em torno de 11.200 espécies no total)
ainda não foram pesquisadas quanto a sua capacidade de nodular e,
conseqüentemente, características das bactérias a elas associadas também são
desconhecidas. Além disso, parte significativa das bactérias fixadoras de nitrogênio
nodulíferas em leguminosas isoladas da maioria das espécies nodulíferas
conhecidas até o momento, principalmente as tropicais, precisa ser estudada
(MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
Recentemente foram descobertas espécies de betaproteobactérias que
formam nódulos funcionais em leguminosas tropicais (CHEN et al., 2001, 2003). A
família Burkolderiaceae pertence a estas betaproteobactérias e incluem estirpes de
Burkholderia (VANDAMME et al., 2002) (originalmente isoladas de Aspalathus
carnosa e Machaerium lunatum) e uma estirpe de Ralstonia taiwanensis (CHEN et
al., 2001) (isoladas de Mimosa pudica). Tais gêneros são conhecidos como sendo
patógenos de plantas e animais, e ocupam uma grande diversidade de ambientes.
Assim como outras alfaproteobactérias, que não os membros da família
Rhizobiaceae, essas betaproteobactérias metabolizam uma grande variedade de
fontes de carbono, que as permitem sobreviver como sapróbias nos tipos
particulares de solos tropicais, dos quais foram isoladas (CHEN et al., 2003). Vale
salientar ainda que a maioria das espécies da família Rhizobiaceae descritas até
hoje foram isoladas de leguminosas herbáceas de interesse econômico, tais como
feijão e soja, com poucas espécies descritas de rizóbios isolados a partir de
leguminosas herbáceas e arbóreas tropicais (SPRENT, 2001).
Tradicionalmente, separam-se estes gêneros em grupos de acordo com a
velocidade de crescimento, como sugerido por Lohnis e Hansen (1921), em rizóbios
de crescimento rápido (Rhizobium, Azorhizobium e Sinorhizobium), de crescimento
intermediário (Mesorhizobium) e de crescimento lento (Bradyrhizobium).
Como acima descrito, atualmente sabe-se que os rizóbios não se limitam às
bactérias pertencentes aos gêneros Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium,
Sinorhizobium
e
Mesorhizobium.
Outras
alfaproteobactérias
e
também
18
betaproteobactérias podem nodular leguminosas. Nos últimos 20 anos, a taxonomia
dos rizóbios tem se desenvolvido rapidamente e têm sido descritas muitas espécies
e gêneros novos (WANG; MARTÍNEZ-ROMERO, 2007).
2.6 RNA RIBOSSÔMICO 16S
Os ribossomos procarióticos consistem de três moléculas de RNA (5S, 16S e
23S) de diferentes tamanhos e cerca de 50 proteínas ribossomais. A molécula do
rRNA 16S contém cerca de 1.540 pares de nucleotídeos (STRALIOTTO;
RUMJANEK, 1999).
Segundo Rosado et al. (1997), as moléculas das diferentes espécies de rRNA
são particularmente importantes nos estudos de ecologia microbiana, sendo que são
consideradas cronômetros moleculares nos estudos de evolução, pois preenchem
todos os requisitos que definem um marcador filogenético:
(1) os rRNA’s estão presentes e têm a mesma função em todos os
microrganismos;
(2) eles se originaram de um ancestral comum, portanto são homólogos;
(3) suas seqüências de nucleotídeos são altamente conservadas em algumas
regiões e possuem regiões variáveis;
(4) as moléculas do rRNA 16S e 23S são relativamente grandes e contêm
suficiente seqüências informativas para permitir comparações estatisticamente
significativas;
(5) um grande número de seqüências está disponível via base de dados pela
internet, permitindo o alinhamento de seqüências e a identificação das regiões
distintas.
O fato de que os rRNAs tem uma função conservada sugere uma possível
semelhança estrutural entre as seqüências nucleotídicas codificadoras dos rRNA de
diferentes
organismos.
Essa
semelhança
foi
posteriormente
confirmada
demonstrando-se a ocorrência de mudanças coordenadas de nucleotídeos em
posições homólogas de seqüências de rRNA 16S de origens filogenéticas diversas
(WOESE, 1987).
19
As moléculas de rRNA apresentam regiões extremamente conservadas entre
todos os organismos que compartilham aquela espécie de rRNA e regiões altamente
variáveis, sendo que o grau de variação nessas regiões específicas pode ser maior
ou menor de um táxon a outro. A presença dessas regiões variáveis oferece grandes
possibilidades para o desenho de sondas genéticas reino-específicas, gêneroespecíficas e até espécie ou estirpe-específicas (WOESE, 1987). Assim, o fato de
estas moléculas possuírem sítios de rápida e outros de lenta evolução permitem que
se avaliem as relações filogenéticas tanto entre organismos muito proximamente
relacionados quanto entre os filogeneticamente muito distantes.
Straliotto e Rumjanek (1999), dentre outros trabalhos, afirmam que a
caracterização da seqüência do rRNA 16S tem sido amplamente utilizada em
estudos evolucionários, taxonômicos e ecológicos (FOX; WISOTZKEY; JURTSHUK,
1992; OLSEN; WOESE; OVERBEEK, 1994; WILLEMS, 2006). A amplificação direta
via reação em cadeia da polimerase (PCR) do rRNA 16s tornou possível, por
exemplo, o estudo da diversidade microbiana sem a necessidade de cultivar o
microrganismo (WARD; WLLER; BATESON, 1990).
Comparações entre as seqüências de nucleotídeos completas ou parciais do
rRNA 16S tem sido amplamente utilizadas para avaliar relações filogenéticas entre
muitas espécies de rizóbios (JARVIS; DOWNER; YOUNG, 1992; LAGUERRE et al.
1993; LUCAS et al., 1995; VAN BERKUM; BEYENE; EARDLY, 1996; BARRERA et
al., 1997).
20
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 LOCAIS DE COLETA DOS NÓDULOS, MATERIAL BOTÂNICO E SOLO
A coleta ocorreu em 18 de outubro de 2005, no campus da Universidade
Estadual de Santa Cruz (UESC) localizado no município de Ilhéus e no período de
12 a 16 de junho de 2006, novamente na UESC, na Estação de Zootecnia do
Extremo Sul da CEPLAC em Itabela, e nas Fazendas Ubirajara e São Francisco em
Belmonte. Os três municípios onde foram realizadas as coletas estão localizados na
região sul da Bahia (Figura 5). A descrição do holotipo A. pintoi está baseada em um
exemplar coletado às margens do rio Jequitinhonha, em Belmonte, Bahia, no ano de
1954 por Geraldo C. P. Pinto e Paulo D. T. Alvim, depositado no Herbário da
CEPLAC. Esta espécie é nativa da região sul baiana.
Figura 5: Mapa da Bahia. Municípios em que foram coletadas amostras de nódulos de A.
pintoi.
21
Para coleta dos nódulos de Arachis pintoi Krapov. & W. C. Gregory
(amendoim forrageiro), inicialmente, foi demarcado um círculo de cerca de 15 cm ao
redor da planta, correspondendo aproximadamente à área ocupada pelo sistema
radicular. A terra foi removida cuidadosamente para não danificar as raízes, estas
foram transportadas em sacos plásticos e depois lavadas, retirando-se o solo.
Os nódulos foram devidamente lavados, secados em papel toalha e
armazenados em recipientes contendo sílica gel e algodão. Amostras de nódulos
foram fixadas para estudo anatômico e ultra-estrutural (ver itens 3.5.1, 3.5.2 e 3.5.3
abaixo). Cada recipiente foi devidamente identificado com o número correspondente
à área e data de coleta.
Na Estação de Zootecnia do Extremo Sul da CEPLAC em Itabela foram
coletadas amostras de nódulos dos cultivares cv 31534 (Figura 6A) e Orozimbo
(Figura 6B). Amostras também foram coletadas no campus da UESC (Universidade
Estadual de Santa Cruz) localizado em Ilhéus (Figura 6C e 6D), e na Fazenda São
Francisco (Figura 6E) e Fazenda Ubirajara (Figura 6F), ambas no município de
Belmonte.
O material botânico (ramos férteis e estéreis) dos acessos foi coletado,
prensado, identificado e depositado no Herbário da Universidade Estadual de Feira
de Santana (HUEFS).
Amostras compostas de solo das principais áreas de estudo foram coletadas
para análise química e granulométrica. Esta análise foi realizada pelo Laboratório de
Solos e Nutrição de Plantas da EMBRAPA Mandioca e Fruticultura Tropical (Cruz
das Almas – BA). As análises químicas (Tabela 1) e granulométricas (Tabela 2) dos
solos nos locais de coleta dos nódulos são apresentadas a seguir.
22
Tabela 1: Resultados analíticos da fertilidade completa + matéria orgânica dos solos nos locais de
coleta de nódulos de Arachis pintoi.
Locais de
coleta
UESC
(Ilhéus)
CEPLAC
(Itabela)
Faz. São
Francisco
(Belmonte)
Faz.
Ubirajara
(Belmonte)
pH
em
H2O
P
mg/
3
dm
K
6,0
39
0,82
11,8
0,8
12,6
0,1
5,4
0,9
0,06
2,5
1,3
3,8
5,1
2
0,17
2,0
1,3
5,0
4
0,19
4,1
1,6
Ca
Mg
Ca+Mg
Al
Na
H+Al
S
CTC
V
%
M.O.
g/kg
0,30
4,73
13,72
18,45
74
68,82
0,2
0,04
4,18
3,90
8,08
48
79,89
3,3
0,3
0,05
3,74
3,52
7,26
48
12,32
5,7
0,4
0,08
6,71
5,97
12,68
47
30,61
cmole/dm
3
Tabela 2: Resultados da composição granulométrica (g/kg) dos solos nos locais de coleta de nódulos
de Arachis pintoi. Dispersão com NaOH.
Locais de
coleta
Areia
muito
grossa
Areia
grossa
Areia
média
Areia
fina
Areia
muito
fina
Areia
total
Silte
Argila
UESC
(Ilhéus)
3
158
136
144
55
496
232
272
CEPLAC
(Itabela)
42
213
202
218
40
715
63
222
1
5
8
296
286
596
283
121
Franco
arenoso
28
96
74
148
52
398
328
274
Franco
argiloso
Faz. São
Francisco
(Belmonte)
Faz.
Ubirajara
(Belmonte)
Classificação
textural
Franco
argilo
arenoso
Franco
argilo
arenoso
As amostras de solo foram analisadas de acordo com os padrões adotados
pelo Laboratório de Solos e Nutrição de Plantas (EMBRAPA, 1997).
A amostra de solo correspondente ao ponto de coleta UESC em Ilhéus, em
relação à granulometria, foi caracterizado como solo franco argilo arenoso,
apresentando acidez média (pH 6,0) e os valores para quantificações do fósforo (39
mg/dm3),
potássio
(0,82
cmole/dm3)
e
cálcio+magnésio
(12,6
cmole/dm3)
representativamente altos, o magnésio apresentou um valor médio (0,8 cmole/dm3) e
para o alumínio um baixo teor (0,1 cmole/dm3) (EMBRAPA, 1997).
23
O solo coletado em Itabela também foi caracterizado como um solo franco
argilo arenoso, a acidez foi considerada média (pH 5,4), os valores para o fósforo
(0,9 mg/dm3) e cálcio+magnésio (3,8 cmole/dm3) foram considerados também
médios, para o potássio (0,06 cmole/dm3) e alumínio (0,2 cmole/dm3) os valores
quantificados foram considerados baixo e para o magnésio (1,3 cmole/dm3), alto
(EMBRAPA, 1997).
O solo da Fazenda São Francisco, localizada na cidade de Belmonte, com
características granulométricas de um solo franco arenoso, apresentou acidez média
(pH 5,1) e os valores para o fósforo (2,0 mg/dm3) e alumínio (0,3 cmole/dm3) baixos,
para o potássio (0,17 cmole/dm3) médio-alto, para cálcio+magnésio (3,3 cmole/dm3)
os valores foram considerados médios e o valor para o alumínio (0,3 cmole/dm3),
baixo (EMBRAPA, 1997).
O solo da Fazenda Ubirajara, localizada na cidade de Belmonte,
caracterizado como solo franco argiloso, apresentou acidez considerada elevada (pH
5,0), para o fósforo (4,0 mg/dm3) o valor foi considerado baixo, para o potássio, (0,19
cmole/dm3) médio-alto e para cálcio+magnésio (5,7 cmole/dm3) o valor considerado
foi alto, o alumínio (0,4 cmole/dm3) apresentou um valor considerado médio
(EMBRAPA, 1997).
24
A
B
C
D
E
F
Figura 6: Áreas de coleta dos nódulos de Arachis pintoi. A. cv 31534, Itabela (CEPLAC/CEPED).
B. cv Orozimbo, Itabela (CEPLAC/CEPED). C. Campus da Universidade Estadual de Santa Cruz
(UESC), Ilhéus. D. Campus da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC), Ilhéus. E. Fazendo São
Francisco, Belmonte. F. Fazenda Ubirajara, Belmonte.
25
3.2 ISOLAMENTO DAS BACTÉRIAS
Em laboratório – Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM/UEFS) –
as bactérias foram isoladas a partir dos nódulos coletados. Os nódulos dessecados,
inicialmente foram reidratados, ficando em água destilada por 30 min. Após a
hidratação, os nódulos foram submetidos a um banho em álcool 95% durante 30 seg
para quebrar a tensão superficial da água e remover bolhas de ar no tecido. A
seguir, os nódulos foram transferidos para uma solução de hipoclorito de sódio 1%
durante 2 min e depois foram lavados com água destilada estéril por, no mínimo,
cinco vezes, para eliminar o excesso de hipoclorito.
Depois da desinfestação, os nódulos foram comprimidos com uma pinça
estéril, e este material foi inoculado em placa contendo meio 79 sólido (FRED;
WASKMAN, 1928). As placas foram incubadas a 28ºC. O crescimento das colônias
foi acompanhado diariamente, durante 10 dias. Depois de verificado o crescimento
das colônias foram feitos repiques dos isolados em meio de cultura 79 sólido em
câmara de fluxo laminar a fim de se obter culturas puras.
3.3 CARACTERIZAÇÃO MORFOLÓGICA DAS COLÔNIAS
Depois de purificadas, as colônias foram classificadas a partir da coloração
diferencial (método de Gram). Os isolados puros de bactérias obtidos a partir dos
nódulos de A. pintoi foram crescidos em meio 79 sólido (FRED; WAKSMAN, 1928)
com azul de bromotimol 0,5% a fim de avaliar a variação de pH no meio.
As características culturais das colônias puras, observadas após 2 dias de
crescimento, foram: mudança do pH no meio (avaliada pela alteração de cor do
indicador), velocidade de crescimento (em dias), diâmetro (em milímetros),
transparência, forma, coloração, borda, textura, produção de muco (avaliação visual
comparativa), elevação, características da superfície e morfologia da bactéria. Além
disso, foram feitas anotações de características diferenciais que o isolado
apresentasse.
26
Esses isolados constituem um banco de bactérias atualmente estabelecido na
UEFS, e que poderá servir de fonte de inóculo para o amendoim forrageiro.
3.4 PRESERVAÇÃO DAS BACTÉRIAS
As bactérias isoladas dos nódulos foram preservadas em tubos de vidro com
tampas de rosca contendo meio de cultura 79 sólido inclinado e após 24 h de
crescimento foi acrescentado aos tubos óleo mineral estéril (MARTINS; NEVES;
RUMJNEK, 1997). Os tubos foram mantidos em temperatura ambiente.
A preservação das bactérias também foi feita em microtubos de plástico com
200 µL de meio 79 líquido e foram incubadas a 28°C por a proximadamente 24 h.
Depois desse período de incubação foram acrescentados 100 µL de glicerol 50%, a
solução foi homogeneizada e armazenada em ultra-freezer a -80°C.
3.5 MORFOANATOMIA E ULTRA-ESTRUTURA DOS NÓDULOS
As amostras coletadas dos nódulos e raízes de A. pintoi foram estudadas
através de microscopia de luz, microscopia eletrônica de varredura e microscopia
eletrônica de transmissão.
3.5.1 Microscopia de luz
As amostras dos nódulos e raízes foram fixadas em solução fixadora
composta por glutaraldeído 2,5%, paraformaldeído 2,5% em tampão fosfato de sódio
0,125 M, pH 7,2 (Karnovisk modificado). Estas amostras foram desidratadas em
série crescente de etanol (50 - 95%), por 10 min cada, e emblocadas em resina a
base de hidroxietilmeta-crilato (Leica®). Para embebição, o material foi submetido a
uma mistura de etanol 95% e resina Leica Historesin® 1:1 por 96 h na geladeira,
27
seguido por uma embebição em resina pura sem ativador por mais 96 h também em
geladeira. As raízes e nódulos foram polimerizados na resina com ativador em estufa
à 60ºC por 24 h. O material assim emblocado foi cortado em micrótomo rotativo
Leica®.
Quinze nódulos foram emblocados e seccionados. Os cortes semifinos foram
corados com azul de toluidina, azul de metileno e/ou safranina, montados em
lâminas histológicas com Entellan®, observados e fotografados em fotomicroscópio
de campo claro Olympus BX-50®, no Departamento de Biologia da UESC.
3.5.2 Microscopia eletrônica de varredura
Amostras
de
nódulos
foram
fixadas
em
FAA
70
e
em
Karnov
sk modificado e desidratadas em série crescente de etanol (70 - 95%). A seguir
passaram por três banhos em álcool 100%, de 15 min cada, e um banho em acetona
e álcool 1:1, também durante 15 min. Após isto, as amostras foram colocadas em
banho de acetona 100%, por 10 min. As amostras foram processadas em ponto
crítico (Balzers CPD 030), onde foi retirado todo o líquido da amostra, e
posteriormente montadas em pequenos cilindros de aço (“stubs”) com fita adesiva
metálica e posteriormente recobertas com ouro em metalizador (Balzers SCD 050).
Quatro nódulos inteiros e oito nódulos cortados ao meio foram processados
para análise no microscópio eletrônico de varredura (MEV). As amostras assim
preparadas foram analisadas e fotografadas no microscópio eletrônico de varredura
(MEV) LEO 1430VP no Laboratório de Biologia da UEFS.
3.5.3 Microscopia eletrônica de transmissão
Amostras dos nódulos e raízes foram fixadas em glutaraldeído 2,5% em
tampão fosfato de sódio 0,1 M pH 7,2 para estudo da sua ultra-estrutura. Essas
amostras foram desidratadas em série crescente de etanol (50 - 95%) por 10 min
28
cada com três banhos em etanol 100%, embebidas em resina LR White® pura por
48 h sob agitação constante e polimerizadas com resina fresca em cápsulas de
gelatina seladas. O material assim emblocado foi seccionado em ultramicrótomo
Reichert-Jung®. Foram seccionados seis nódulos de A. pintoi. Os cortes semifinos
foram corados com azul de toluidina em bórax, montados em lâminas e observados
microscópio Zeiss Axioskope®. Os cortes ultrafinos foram recolhidos em grades de
cobre
(“grids”)
e
contrastados
com
acetato
de
uranila
aquoso
2%.
As
eletromicrografias foram obtidas em microscópio eletrônico de transmissão (MET)
FEI Tecnai a 80kV no “Centre for High Resolution Imaging and Processing” da
Universidade de Dundee (Escócia).
3.6 EXTRAÇÃO DE DNA GENÔMICO
O DNA genômico foi extraído das culturas usando-se o procedimento abaixo
descrito:
As células repicadas em 1.000 µL de meio caldo TY foram incubadas a 28ºC
e 180 RPM. Após 20 h de crescimento, as células bacterianas crescidas foram
centrifugadas (5 min/13.000 rpm) e o sobrenadante descartado. Posteriormente foi
adicionado aos tubos plásticos, 400 µL de tampão de extração (Tris-HCl 200 mM, pH
7,5; EDTA 25 mM, pH 8,0; NaCl 1 M; SDS 5%) e 200 µL de acetato de potássio 3 M.
O material foi mais uma vez centrifugado (10 min/13.000 rpm) e 500 µL do
sobrenadante foi transferido para outro tubo, adicionando-se 500 µL de clorofórmio:
álcool isoamílico (24:1, respectivamente). Após homogeneizado, centrifugou-se (15
min/13.000 rpm) e retirou-se novamente o sobrenadante, transferindo-o para outro
tubo plástico. Adicionou-se 125 µL de acetato de amônia 10 M e 375 µL de
isopropanol, homogeneizando e logo após incubando durante 15 min a uma
temperatura de -80°. Os tubos foram novamente centr ifugados (15 min / 13.000
rpm), e ao final do processo foi descartado todo o líquido dos tubos. Acrescentou-se
200 µL de álcool 70% nos tubos (para limpeza do pellet) e estes foram novamente
centrifugados (5 min / 13.000 rpm), repetindo este último passo por 2 vezes,
pipetando o álcool e deixando o pellet formado. Os tubos foram secos em
temperatura ambiente durante aproximadamente 30 min, logo após este período o
29
DNA foi resuspendido em 60 µL de TE (Tris-HCl 200 mM, pH 7,5; EDTA 1 mM, pH
8,0; NaCl 250 mM) e homogeneizado suavemente no vórtex. Os DNAs foram
conservados a -4ºC.
3.7. AMPLIFICAÇÃO POR PCR DO FRAGMENTO rDNA 16S E PURIFICAÇÃO
As reações de amplificação foram montados em volume final de 25 µL. O
sistema continha: 2,5 µL de tampão 10X de PCR, 1,0 µL de mix de dNTPs a 10 mM,
1,25 µL de MgCl2 a 50 mM, 1 µL de cada oligonucleotídio específico – FD1 e RP2
(Tabela 3) a 10 pMol, 5 µL de betaína, 1 µL de DNA do rizóbio, 0,3 µL de Taq DNA
polimerase. As amostras foram amplificadas em termociclador por 40 ciclos nas
temperaturas de 95ºC para a abertura da dupla hélice, 59ºC para anelamento dos
primers e 72ºC para polimerização da cadeia. Os produtos de amplificação do DNA
genômico foram purificados com 1/3 do volume do produto da amplificação de
exonuclease e 2/3 do volume do produto da amplificação de fosfatase alcalina e
quantificados com marcador Low DNA Mass Ladder, segundo instruções do
fabricante. Foi utilizado também o primer 926R, um oligonucleotídeo interno ao 16S
rDNA (Tabela 3), para a reação de seqüenciamento. 2 µL de cada amostra foram
aplicados em gel de agarose 1%, para verificar a qualidade das bandas do produto.
Tabela 3: Primers utilizados para amplificação e seqüenciamento do rDNA 16S
1
Primer
Posição
FD1
8 – 27
AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG
RP2
1492 – 1510
ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT
926R
907 – 926
CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT
1
Posição em Escherichia coli
(KHACHATRYAN, 2007)
Seqüência (5’ – 3’)
30
3.8. REAÇÃO DE SEQÜENCIAMENTO
As reações de seqüenciamento dos produtos de PCR das regiões 16S do
rDNA foram montados em volume final de 12 µL. Cada sistema foi constituído de 0,5
µL de um dos primers para os fragmentos rDNA 16S, 2,0 µL de tampão de
seqüenciamento, 0,4 µL do Kit ET Terminator da Amersham Biosciences®, 3 µL ou 4
µL do produto de PCR e água ultrapura em q.s.p. 10 µL.
Após a reação foi colocado em cada tubo 8 µL de água ultra pura, 2 µL de
acetato de sódio 3 M pH 4,6 e 50 µL de etanol absoluto. Os tubos foram
homogeneizados e deixados a temperatura ambiente durante 15 min no escuro.
Após esse período foram centrifugados por 30 min a 13.000 rpm. O sobrenadante foi
descartado e o precipitado foi lavado 2 vezes com 100 µL de etanol 70%. Após a
lavagem os tubos com as amostras foram deixados secando por 1 h. Após este
período foi adicionado 18 µL do tampão de injeção (0,02 mM EDTA em formamida
HiDi). Os precipitados foram resuspendidos 5 vezes e aplicados no Seqüenciador
Automático ABI PRISM® 3100 Applied Biosystems, da Escola Superior de
Agricultura Luiz de Queiróz, Universidade de São Paulo – USP, Piracicaba, SP.
3.9. ANÁLISE DAS SEQÜÊNCIAS OBTIDAS
Os eletroferogramas foram analisados utilizando o programa FinchTV 1.4.®
(Geospiza Inc.). A montagem dos contigs foi realizada no Programa LaserGene®
(BURLAND, 2000). As seqüências resultantes foram submetidas à pesquisa,
utilizando-se o programa BLASTn do NCBI (National Center for Biotechnology
Information – <www.ncbi.nlm.nih.gov>).
31
4 RESULTADOS
4.1 MORFOLOGIA DOS NÓDULOS
Os nódulos de A. pintoi possuem coloração externa creme ou marrom clara,
atingindo tamanho de até 2 mm e média de 1,12 mm (n = 34) de diâmetro ou em sua
maior dimensão. Foram encontrados tanto na raiz principal como nas raízes laterais
e adventícias. A maioria dos nódulos coletados apresentou forma oblonga, i.e. mais
compridos do que largos (Figuras 7A, 7C e 8A), entretanto a forma arredonda
também foi observada (Figura 8E). Todos os nódulos estavam diretamente ligados
às raízes (Figuras 7A, 8A e 9A). Observou-se no interior de alguns nódulos a
coloração avermelhada (dados não apresentados).
4.2 ANATOMIA DOS NÓDULOS
Dezenove nódulos de A. pintoi foram emblocados e cortados para estudo da
sua anatomia. O nódulo é constituído por um córtex, formado por células
parenquimáticas, que envolve o tecido infectado, localizado ao centro (Figuras 7 e
8). O córtex pode ser dividido em externo e interno, sendo que neste se localizam os
feixes vasculares (Figuras 7B, 7D, 8B, 8C, 8D e 8F). O tecido infectado é constituído
exclusivamente por células infectadas (que possuem bacteróides em seu interior)
que podem apresentar vacúolos (Figuras 7B, 7E, 8B). Em um dos nódulos
analisados, entretanto, foi observada a presença de células intersticiais (não
infectadas) no interior do tecido infectado (Figura 8F).
Os nódulos analisados mostraram uma clara diferenciação tecidual entre o
córtex e o tecido infectado (Figura 7A, 7D, 8A, 8E e 9B). As células parenquimáticas
localizadas no córtex apresentaram-se bastante vacuolizadas (7B, 7E e 8B)
podendo eventualmente conter depósitos de compostos fenólicos (Figuras 8D e 8F)
identificáveis pela coloração azul-esverdeada devido ao azul de metileno (dados não
apresentados) e depósitos de grãos de amido no seu interior (Figura 9F).
32
As células do tecido infectado eram preenchidas por bacteróides (Figuras 8C
e 8D), entretanto vacúolos foram também observados em seu interior (Figuras 7B,
7E e 8B) Os bacteróides eram envolvidos por membrana, a qual algumas vezes foi
visível ao MEV (Figura 9D) dependendo do fixador utilizado (no caso, Karnovski
modificado).
33
Figura 7: Fotomicrografias de microscopia de luz dos nódulos radiculares de Arachis pintoi. A e B
nódulo coletado no campus da UESC e C – F nódulos da variedade Itabela coletados na CEPLAC.
A. Corte transversal de nódulo: r, raiz; c, córtex; ti, tecido infectado. B. Detalhe dos tecidos do
nódulo: c, córtex; fv, feixe vascular; a seta indica vacúolo na célula infectada. C. Corte transversal
de nódulo mostrando córtex (c) e tecido infectado (ti). D. Detalhe da figura anterior mostrando os
tecidos: c, córtex; fv, feixe vascular; ti, tecido infectado. E. Detalhe da região de transição entre
córtex interno e tecido infectado. c, córtex; ci, células infectadas; v, vacúolo. F. Nódulos gêmeos
(n) e duas raízes laterais (rl) associadas.
34
Figura 8: Fotomicrografias de microscopia de luz dos nódulos radiculares de Arachis pintoi. A - D
nódulos coletados na Fazenda São Francisco e E e F nódulos coletados na Fazenda Ubirajara
ambas em Belmonte, BA. A. Corte transversal de nódulo: r, raiz; c, córtex; ti, tecido infectado. B.
Detalhe dos tecidos do nódulo: c, córtex; fv, feixe vascular; a seta indica vacúolo na célula
infectada C. Região do nódulo com feixes vasculares (fv), córtex (c) e células infectadas (ci). A
seta indica células corticais com parede espessada que separam o córtex externo do interno. D.
Detalhe da figura anterior mostrando o espessamento (seta) da parede das células do córtex, os
tecidos, o feixe vascular (fv) e as células infectadas (ci). E. Corte transversal de nódulo mostrando
o córtex (c) e o tecido infectado (ti). F. Tecido infectado (ti) com células não infetadas (intersticiais)
contendo amido (seta). Córtex (c) com feixe vascular (fv).
35
A
B
c
ti
200 µm
C
A
c
a
b
ti
a
Figura 9: Fotomicrografias de microscopia eletrônica de varredura dos nódulos radiculares de Arachis
pintoi. A. Nódulo ligado à raiz. B. Corte transversal no nódulo: c, córtex; ti, tecido infectado. C.
Bacteróides esféricos fixados em FAA. D. Bacteróides esféricos fixados em K4. E. Corte transversal no
nódulo: c, córtex; a, grão de amido. F. Detalhe das células do nódulo, presença de grão de amido e
bacteróides: a, grão de amido; b, bacteróides.
36
4.3 ULTRA-ESTRUTURA DOS NÓDULOS
A análise da ultra-estrutura dos nódulos mostrou que as células infectadas,
que constituem em sua totalidade o tecido infectado, são em grande parte
preenchidas pelos bacteróides (Figura 10A e 10B). O citoplasma dessas células está
localizado na periferia e se distribui por entre os simbiossomos (Figura 10A e 10B).
O simbiossomo geralmente contém em seu interior apenas um bacteróide, o
qual é separado do citoplasma da célula vegetal hospedeira pela membrana do
simbiossomo (Figura 10A e 10B). O espaço entre o bacteróide e a membrana do
simbiossomo eventualmente pode conter alguns depósitos elétron-densos (Figura
10A e 10B). O tamanho dos bacteróides pode variar de 2 a 4 µm em diâmetro e
apresentam forma circular (tridimensionalmente esféricos) com citoplasma granular e
eventualmente vesículas em seu interior (Figura 10A e 10B). Algumas vezes foram
observados espaços intercelulares no tecido infectado (Figura 10B). Esses espaços
também foram observados entre as células do córtex interno (Figura 10C e 10D), o
qual faz limite e envolve todo o tecido infectado (Figura 10C e 10D). As células
parenquimáticas do córtex interno se mostraram bastante vacuolizadas e
apresentaram uma estreita faixa de citoplasma localizada na periferia da célula
(Figura 10C e 10D). Nessas células também foram observados, com freqüência,
amiloplastos (Figura 10C e 10D).
37
Figura 10: Fotomicrografias de microscopia eletrônica de transmissão dos nódulos radiculares de
Arachis pintoi. A. Células infectadas totalmente preenchidas por simbiossomos contendo bacteróides (b)
envolvidos pela membrana do simbiossomo (ms). p = parede celular. B. Detalhe de células infectadas
mostrando a membrana do simbiossomo (ms) envolvendo o bacteróide (b). O citoplasma vegetal fica
disperso entre os simbiossomos e na periferia das células. C. Região do limite entre as células do córtex
interno (ci) e das células infectadas por bacteróides (b). Nas células corticais os vacúolos (v) ocupam
grande parte do volume celular limitando o citoplasma a uma fina camada periférica onde estão
localizados os amiloplastos (a). D. Detalhe de uma célula do córtex interno com um grande vacúolo (v)
central e o citoplasma com amiloplastos (a) na periferia. Entre a célula cortical e as células infectadas
pode ser visto um espaço intercelular (ei). Fig. 10A, 5 µm; Fig. 10B, 2 µm; Fig. 10C, 5 µm; Fig. 10D, 2
µm.
38
4.4 CARACTERIZAÇÃO DAS COLÔNIAS
A partir dos nódulos de A. pintoi foram cultivados cento e quarenta e dois
isolados (Tabela 4), todos os isolados estudados estão caracterizados na Tabela 5
(Apêndice – A).
Tabela 4: Quantidade de isolados obtidos dos diferentes cultivares de A. pintoi nos diferentes locais
de coleta.
Cultivar
Orozimbo (O)
Belmonte (B)
Belmonte (SF)
cv 31534 (IB)
Ilhéus (I)
Local de coleta
CEPLAC, Itabela
CEPLAC, Itabela e
Faz.Ubirajara, Belmonte
Faz. São Francisco, Belmonte
CEPLAC, Itabela
UESC, Ilhéus
Total
Quantidade de isolados
17
27
20
11
67
142
Dentre os isolados de bactérias, 25 foram selecionados para extração e
seqüenciamento do 16S rDNA. As colônias escolhidas para caracterização
molecular foram aquelas que apresentaram diferenças morfológicas marcantes
(classificados como diferentes morfotipos) quanto à coloração, produção de muco e
alteração do pH do meio após 2 dias de crescimento a 28ºC (Tabela 6).
A grande maioria dos isolados dos nódulos de A. pintoi apresentou
crescimento rápido (de até quatro dias a 28ºC) em meio de cultura e, em relação ao
pH, apresentou mudança no meio de cultura com o azul de bromotimol tornando-o
ácido (Figura 11 – B34). Também foram observados alguns isolados que não
alteraram o pH do meio de cultura (Figura 11 – I85) ou que alcalinizaram o meio
(Figura 11 – I30).
Quanto ao diâmetro das colônias, pode-se observar que aquelas com
diâmetro inferior a 1,0 mm foram caracterizadas como translúcidas e produziam
pouco muco ou não o produziam. As colônias que apresentaram tamanhos maiores
que 1,0 mm apresentaram alta produção de muco, podendo este ser translúcido ou
opaco. Quanto à produção de muco foram classificadas como: pouca produção de
muco (+), muita produção de muco (++), ausência da produção de muco (-). Das 19
colônias bacterianas estudadas 12 apresentaram pouca produção de muco (+), 4
produziram muito muco (++) (Figura 11 – I67) e em apenas duas não observou-se a
39
presença de muco (-) (Tabela 6). Nos dois isolados identificados como Rhizobium
sp. através do Blastn (NCBI) foi observada a alta produção de muco.
A transparência é definida pela passagem de luz através da colônia. Os
isolados aqui caracterizados variaram de opacos a translúcidos, a colônia compacta
não permite a passagem de luz e não evidencia o brilho característico das colônias
translúcidas.
A forma das colônias isoladas depende da consistência do muco produzido
podendo apresentar-se de forma circular a irregular. As bordas das colônias
variaram de lisa ou inteira a borda irregular, independente da forma da colônia.
As superfícies das colônias apresentaram-se secas ou mucóides. As colônias
dos isolados não produtores de muco foram definidas como secas e os que
produzem muco foram classificadas de acordo com a aparência apresentada:
floculosa (colônias que lembram flocos), gomosa (colônias semelhantes a gomos),
aquosa (colônias com muco pouco consistente) e leitosa (colônias com superfícies
com aspecto de leite).
A morfologia das bactérias também foi estudada e utilizada na caracterização
dos isolados. A grande maioria das bactérias apresentou forma de bastonetes,
podendo ser observados também cocobacilos (Figura 11 – I30) e bastonetes (Figura
11 – I82) isalados ou em arranjos (diplo) (Figura 11 – I67).
Das 19 amostras que foram seqüenciadas, todas as colônias apresentaram
forma circular. Em relação ao Gram, 8 apresentaram o resultado Gram-positivo e 11,
resultado Gram-negativo.
A diversidade da morfologia das colônias e da morfologia bacteriana em meio
de cultura é uma indicação das diferenças fundamentais entre os isolados e pode
ser um indício da diversidade genética.
40
Tabela 6: Caracterização morfológica das 19 colônias selecionadas para extração de DNA e seqüenciamento do rDNA 16S.
Descrição das colônias
Isolados
Gram
Morfologia da célula bacteriana
Prod.
Cor
Borda
Aparência
pH
Muco
I 07
negativo
I 22
negativo
I 30
negativo
I 67
Bastonete
Diâmetro Crescida colônia mento
(mm)
(dias)
Transparência
Elevação Superfície
branca
regular
++
leitoso
ácido
1,4
2
opaca
convexa
mucosa
vermelha
regular
++
aquosa
ácido
0,3
2
translúcida
convexa
mucosa
cocobacilos
azul
irregular
+
floculosa
neutro
1,4
2
translúcida
convexa
mucosa
negativo
Bastonete (2,5 - 0,6)
azul
regular
++
aquosa
neutro
0,7
2
translúcida
convexa
mucosa
I 68
negativo
Bastonete (3,0 - 0,5) curvado ou
vibriões
transp
regular
+
aquosa
neutro
1,06
1
translúcida
convexa
mucosa
I 82
positivo
Bastonete (0,5 - 0,3)
branca
regular
+
leitosa
neutro
1,04
1
opaca
convexa
seca
I 84
positivo
Bastonete (0,6 - 0,3)
branca
regular
+
leitosa
ácido
1,5
1
opaca
convexa
mucosa
I 85
positivo
transp
regular
++
aquosa
ácido
1,5
1
translúcida
convexa
mucosa
I 116
negativo
transp
regular
+
leitosa
ácido
0,26
2
translúcida
convexa
mucosa
IB 13
positivo
amarela
regular
+
transparente ácido
1,5
1
translúcida
convexa
mucosa
O 01
negativo
Bastonete
amarela
regular
+
floculosa
neutro
0,8
1
opaca
convexa
mucosa
O 21
Diplococobacilo
(0,5 - 1,0)
Bastonete
positivo
Bastonete
amarela
regular
-
floculosa
neutro
0,44
2
opaca
convexa
seca
SF 04 negativo
Cocobacilo
branca
regular
+
leitosa
ácido
0,7
2
opaca
convexa
mucosa
SF 14
positivo
Bastonete
branca
regular
+
leitosa
neutro
0,4
2
opaca
convexa
mucosa
SF 21
positivo
Bastonete
azul
irregular
+
floculosa
neutro
0,64
1
opaca
convexa
mucosa
SF 23 Positivo
Bastonete
azul
irregular
+
floculosa
neutro
0,4
1
opaca
convexa
mucosa
azul
regular
+
aquosa
neutro
1,5
2
translúcida
convexa
mucosa
B 08
Negativo Bastonete (1,2 - 0,6) corou bem clarinho
B 18
Negativo
Bastonete (2,0 - 0,8)
branca
irregular
-
gomosa
ácido
0,64
2
opaca
plana
seca
B 34
negativo
Bastonetes (1,0 - 0,6) agregados
branca
regular
+
aquosa
ácido
0,44
1
translúcida
convexa
mucosa
I – UESC, Ilhéus; IB – cv 31534, Itabela; O – Orozimbo, Itabela; SF- Faz. São Franscisco, Belmonte; B – Faz. Ubirajara, Belmonte.
40
41
CULTURA
CÉLULA
CULTURA
CÉLULA
B08
B08
B18
B18
B34
B34
I07
I07
I22
I22
I30
I30
I67
I67
I68
I68
I82
I82
I85
I85
I116
I116
O01
O01
O21
O21
SF04
SF04
Figura 11: Aspectos morfológicos de colônias e de células de estirpes tipo e isolados representativos
dos nódulos de Arachis pintoi. Figura das células, 10 µm.
42
4.5 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS
Foram selecionadas para caracterização molecular 25 amostras de diferentes
locais de coleta (Tabela 7). Os isolados escolhidos foram os que apresentaram as
maiores diferenças morfológicas entre si (coloração da colônia, mudança de pH no
meio de cultura, tipo de borda, produção ou não de muco, entre outras). Os
fragmentos amplificados pelos primers FD1 e RP2 apresentaram um tamanho
aproximado de 1500 pb (Figura 12).
Tabela 7: Quantidade de isolados obtidos e seqüenciados dos diferentes cultivares de A. pintoi nos
diferentes locais de coleta.
Cultivar
Orozimbo (O)
Belmonte (B)
Belmonte (SF)
cv 31534 (IB)
Ilhéus (I)
M
I07
I22 I30
Local de coleta
CEPLAC, Itabela
CEPLAC, Itabela e
Faz.Ubirajara, Belmonte
Faz. São Francisco,
Belmonte
CEPLAC, Itabela
UESC, Ilhéus
Total
I67 I68
18
Quantidade de
isolados
seqüenciados
3
27
6
19
5
11
68
143
1
10
25
Quantidade de
isolados obtidos
I82 I84 I85 I116 O01 O21 B08 B18 B34 SF04SF14
SF21SF23
2000 pb
100 pb
Figura 12: Resultados da amplificação do fragmento rDNA 16S, via eletroforese em gel de agarose
1%, com os primers FD1 e RP2. Marcador de massa molecular Mass Ladder Invitrogen® (100 pb –
200 pb – 400 pb – 800 pb – 1200pb – 2000 pb).
Do resultado do seqüenciamento do rDNA 16S dos 25 isolados selecionados,
19 amostras apresentaram mais de 1300 pb de toda a molécula rDNA 16S, a qual
é composta por cerca de 1540 pb de nucleotídeos (STRALIOTTO; RUMJANEK,
43
1999). Em 6 amostras não foi possível obter a seqüência consenso (contig) devido a
baixa qualidade do seqüenciamento, por este motivo decidiu-se não incluí-las nesta
análise molecular.
Um total de 11 gêneros foram reconhecidos depois de submetidos à
comparação com as seqüências do GenBank através do Blastn (NCBI) e foram
agrupados e identificados (Tabela 8) através de táxons com maior porcentagem de
similaridade disponíveis no GenBank (ver Tabelas 9 – 27). O grau de significância
(valor E) para todas as seqüências estudadas foi muito baixo, sugerindo
confiabilidade nas análises de similaridade (Tabelas 9 – 27).
A maioria dos isolados (I07, I22, I30, I67, I68, I82, I116, SF14, SF21, SF23,
B08, B18, O01, O21) apresentou similaridade com as seqüências do GenBank
acima de 97%, porém os demais (IB13, I84, I85, B34 e SF04) demonstraram
similaridade igual ou inferior a 96% (Tabelas 9 – 27).
Foram identificados três gêneros de bactérias conhecidamente nodulíferas e
fixadoras de nitrogênio em simbiose com leguminosas e pertencentes à Classe
Alfaproteobacteria: Ochrobaterium (TRUJÍLLO et al., 2005) pertencente à família
Brucelaceae, e Agrobacterium (MARTINÉZ; PALACIOS; SÁNCHEZ, 1987) e
Rhizobium (FRANK, 1889) pertencentes à Família Rhizobiaceae. Um gênero da
Classe Betapoteobacteria e pertencente à família Burkholderiaceae, Pandorea, foi
encontrado nos isolados de A. pintoi, acredita-se que este gênero também possa ser
capaz de fixar nitrogênio.
Foram identificadas outras bactérias associadas aos nódulos de A. pintoi,
destas, três gêneros pertencentes à Classe Gammaproteobacteria: Serratia,
Pseudomonas (BARRAQUIO; LADHA; WATANABE, 1983 et al, 1983; FERNANDES;
FERNANDES; RODRIGUES, 2001) e Enterobacter (KORHOREN et al., 1989;
FERNANDES; FERNANDES; RODRIGUES, 2001).
Pertencente à Classe Bacilli foram identificados três gêneros conhecidamente
associados a espécies vegetais: Brevibacillus (DING et al., 2005), Paenibacillus
(SELDIN; VAN ELSAS; PENIDO, 1984; SELDIN; DUBNAU, 1985) e Bacillus (NEAL;
LARSON, 1976; HEULIN, 1992, DING et al., 2005).
Segundo as análises obtidas pelo Blastn e os dados de morfologia celular,
pode-se observar a presença de dois grandes grupos de bactérias associadas aos
nódulos da leguminosa estudada: Gram-positivas (Filo Firmicutis) e Gram-negativas
(Filo Proteobacteria).
44
Tabela 8: Grupos obtidos através das análises de similaridade do GenBank.
Grupos
Gêneros
Isolados
Agrobacterium ou Rhizobium
I07
Rhizobium
I67
Ochrobactrum
I116
Pseudomonas ou Serratia
I22
Pseudomonas
I30
Pseudomonas
O01
Pseudomonas
SF04
Enterobacter
B34
Bacillus
B18
Bacillus
I82
Bacillus
SF14
Bacillus
SF21
Bacillus
SF23
Paenibacillus ou Corynebacterium
IB13
Paenibacillus
I68
Paenibacillus
I84
Paenibacillus
I85
V
Brevibacillus
O21
VI
Pandorea
BO8
I
II
III
IV
As amostras I07 (Agrobacterium ou Rhizobium), I67 (Rhizobium) e I116
(Ochrobactrum) formam um pequeno grupo (Grupo I) pertencente à Classe
Alfaproteobacteria e Ordem Rhizobiales.
O Grupo II foi formado pelos isolados I22, I30, O01 e SF04 que foram
identificados como bactérias da classe Gammaproteobacteria principalmente do
gênero (Pseudomonas), a amostra I22 também apresentou um alto grau de
similaridade (97%) com o gênero Serratia. O isolado B34 foi identificado através de
Blastn como pertencente ao gênero Enterobacter, incluído portanto no Grupo II.
O Grupo III, composto por 4 isolados (B18, SF14, SF21 e SF23),
correspondeu a isolados que no Blastn foram identificados como sendo do gênero
Bacillus. Já o Grupo IV foi formado por outros 4 isolados obtidos dos nódulos de A.
pintoi (IB13, I68, I84 e I85) que no Blastn foram identificados como pertencentes ao
gênero Paenibacillus. A amostra IB13 apresentou a possibilidade de ser do gênero
45
Corynebacterium
pertencente
à
Classe
Actinobacteria
e
à
Família
Corynebacteriaceae.
A amostra O21 foi separadamente incluída no Grupo V, pois foi identificada
como Brevibacillus, gênero também pertencente à Classe Bacilli.
A amostra B08 também foi a única amostra constituindo o Grupo VI, pois foi
identificada como uma bactéria pertencente à Classe Betaproteobacteria e a Família
Burkholderiaceae, Pandorea sp.
46
Tabela 9: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I07 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
DQ507210.1
Agrobacterium sp.
MTR35B 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2490
97
99
0.0
98
0
AY513492.1
Agrobacterium
tumefaciens
strain 2001025242 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2490
99
99
0.0
98
0
AY513491.1
Agrobacterium
tumefaciens
strain 2003015367 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2490
99
99
0.0
98
0
AY513490.1
Agrobacterium
tumefaciens
strain 2003018195 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2490
99
99
0.0
98
0
AY513489.1
Agrobacterium
tumefaciens
strain 2002000903 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2490
99
99
0.0
98
0
AF531767.1
Candidatus Rhizobium
massiliae
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
2490
97
99
0.0
98
0
AY174112.1
Agrobacterium sp.
JS71 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2490
94
99
0.0
98
0
AB116668.1
Agrobacterium
tumefaciens
gene for 16S rRNA
2490
99
99
0.0
98
0
AJ389908.1
Agrobacterium
tumefaciens
16S rRNA gene, strain
O363
2490
97
99
0.0
98
0
AJ389907.1
Agrobacterium
tumefaciens
16S rRNA gene, strain
0362
2490
97
99
0.0
98
0
46
47
... Continuação (isolado I07)
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
AJ389900.1
Agrobacterium
tumefaciens
16S rRNA gene, strain
CIP 43-76
2490
97
99
0.0
98
0
AJ389899.1
Agrobacterium
tumefaciens
16S rRNA gene, strain
CIP 28-75
2490
97
99
0.0
98
0
AJ389898.1
Agrobacterium
tumefaciens
16S rRNA gene, strain
CIP 127-76
2490
97
99
0.0
98
0
AJ389894.1
Agrobacterium
tumefaciens
16S rRNA gene, strain
CFBP2884
2490
97
99
0.0
98
0
AY850392.1
Agrobacterium
tumefaciens
isolate B8S 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2486
99
99
0.0
98
0
EF443163.1
Agrobacterium
tumefaciens
strain M5 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2484
95
99
0.0
98
0
DQ304800.1
Uncultured bacterium
clone
C9 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2484
94
99
0.0
98
0
AY043382.1
Agrobacterium
tumefaciens
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
2481
98
97
0.0
99
0
AJ971480.1
Rhizobium sp.
CO51 16S rRNA gene for
16S ribosomal RNA
2481
96
99
0.0
98
0
AY210716.1
Rhizobium sp.
Ho-1 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2473
96
99
0.0
98
0
47
48
Tabela 10: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I22 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
EF415649.1
Serratia marcescens
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
2422
92
99
0.0
97
1
AJ296308.1
Serratia marcescens
16S rRNA gene, isolate
CPO1(4)CU
2420
94
99
0.0
97
1
EF510326.1
Uncultured bacterium
clone
P6D1-448 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2416
93
99
0.0
97
1
EF510258.1
Uncultured bacterium
clone
P6D1-392 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2416
94
99
0.0
97
1
EF510239.1
Uncultured bacterium
clone
P6D1-469 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2416
96
99
0.0
97
1
EF510192.1
Uncultured bacterium
clone
P6D1-490 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2416
99
99
0.0
97
1
EF510180.1
Uncultured bacterium
clone
P6D1-435 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2416
99
99
0.0
97
1
DQ439976.1
Pseudomonas fluorescens
strain ost5 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2416
95
99
0.0
97
1
AY566180.1
Serratia marcescens
isolate SA Ant10(2) 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2416
93
99
0.0
97
1
AY043386.1
Serratia marcescens
strain AU736 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2416
93
99
0.0
97
1
48
49
Tabela 11: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I30 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
AF074383.1
Pseudomonas migulae
16S ribosomal RNA gene,
complete sequence
2449
93
99
0.0
97
1
AY959204.1
Uncultured bacterium
clone
rRNA431 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2438
94
99
0.0
97
1
AY958988.1
Uncultured bacterium
clone
rRNA215 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2438
93
99
0.0
97
1
DQ279329.1
Uncultured
Pseudomonas sp.
clone TM14_3 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2438
94
99
0.0
97
1
DQ777728.1
Pseudomonas sp.
Cam-1 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2429
96
99
0.0
97
1
DQ310485.1
Pseudomonas sp.
33/2 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2427
99
99
0.0
97
1
DQ310484.1
Pseudomonas sp.
33/1 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2427
99
99
0.0
97
1
AY747591.1
Pseudomonas sp.
HF3/S21027 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2427
95
99
0.0
97
1
AY047218.1
Pseudomonas migulae
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
2427
93
99
0.0
97
1
AY958838.1
Uncultured bacterium
clone
rRNA065 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2427
93
99
0.0
97
1
49
50
Tabela 12: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I67 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
AY490118.1
Rhizobium sp.
lebia-1 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2462
97
97
0.0
99
0
Z94806.1
Rhizobium
genosp. Q 16S rRNA
gene
2462
96
97
0.0
99
0
EF035065.1
Rhizobium sp.
CCBAU 83375 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2460
99
97
0.0
99
0
EF035062.1
Rhizobium sp.
CCBAU 83333 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2460
99
97
0.0
99
0
EF035059.1
Rhizobium sp.
CCBAU 83345 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2460
97
97
0.0
99
0
EF035067.1
Rhizobium sp.
CCBAU 83277 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2459
99
97
0.0
99
0
DQ648576.1
Rhizobium tropici
strain UPRM 8021 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2457
96
97
0.0
99
0
AY864736.1
Rhizobium sp.
ORS3177 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2457
92
97
0.0
99
0
EF035077.1
Rhizobium sp.
CCBAU 83523 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2455
97
97
0.0
99
0
EF035076.1
Rhizobium sp.
CCBAU 83503 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2455
97
97
0.0
99
0
50
51
Tabela 13: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I68 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
AB042938.1
Paenibacillus sp.
DS-1 gene for 16S rRNA
2436
97
99
0.0
97
1
DQ129555.1
Uncultured bacterium
clone
AKIW1098 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2435
95
99
0.0
97
0
DQ407280.1
Paenibacillus sp.
PALXIL06 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2418
92
99
0.0
97
1
AM162337.1
Paenibacillus sp.
H07-02 partial 16S rRNA
gene
2412
95
99
0.0
97
1
AM162340.1
Paenibacillus sp.
JS01-05 partial 16S rRNA
gene
2399
92
97
0.0
97
0
DQ180952.1
Paenibacillus sp.
MI-61a 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2377
99
97
0.0
97
1
DQ298278.1
Uncultured bacterium
clone
SR22 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2327
97
95
0.0
97
1
AM162349.1
Paenibacillus sp.
YO4-16 partial 16S rRNA
gene
2314
93
97
0.0
96
0
AY839868.1
Paenibacillus sp.
B538 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2313
90
97
0.0
96
1
AM162311.1
Paenibacillus sp.
YO4-14 partial 16S rRNA
gene
2302
92
97
0.0
96
0
51
52
Tabela 14: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I82 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
EF178451.1
Bacillus sp.
1Re28 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1539
58
96
0.0
99
0
DQ854983.1
Bacillus sp.
GPTSA100-8 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1539
58
96
0.0
99
0
AB116121.1
Bacillus mycoides
gene for 16S ribosomal
RNA, partial sequence,
strain:S31
1519
57
96
0.0
98
0
DQ339678.1
Bacillus fusiformis
isolate BRL02-52 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1495
97
96
0.0
98
0
EF154097.1
Unidentified bacterium
clone
MEB020 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1493
59
94
0.0
99
0
DQ219340.1
Bacillus sp.
LQC-4 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1467
58
96
0.0
97
0
AY373357.1
Bacillus mycoides
strain c2 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1467
56
96
0.0
97
0
DQ278904.1
Bacillus sp.
eg1 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
1467
59
96
0.0
97
0
EF210306.1
Bacillus mycoides
strain BGSC 6A19 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1461
58
96
0.0
97
0
CP000485.1
Bacillus thuringiensis
str. Al Hakam, complete
genome
2,04E+07
-
96
0.0
97
-
52
53
Tabela 15: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I84 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
DQ129555.1
Uncultured bacterium
clone
AKIW1098 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1410
56
97
0.0
95
1
AB042938.1
Paenibacillus sp.
DS-1 gene for 16S rRNA
1410
57
97
0.0
95
1
DQ407280.1
Paenibacillus sp.
PALXIL06 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1395
54
97
0.0
95
2
AM162337.1
Paenibacillus sp.
H07-02 partial 16S rRNA
gene
1395
56
97
0.0
95
1
DQ298278.1
Uncultured bacterium
clone
SR22 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
1386
60
97
0.0
94
1
DQ180952.1
Paenibacillus sp.
MI-61a 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1378
60
96
0.0
95
2
AJ863343.1
Uncultured bacterium
partial 16S rRNA gene,
clone 5RHF36
1376
57
97
0.0
94
1
AY839868.1
Paenibacillus sp.
B538 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
1315
53
93
0.0
94
1
AM162340.1
Paenibacillus sp.
JS01-05 partial 16S rRNA
gene
1314
54
93
0.0
94
1
AJ863344.1
Uncultured bacterium
partial 16S rRNA gene,
clone 17RHF17
1290
57
97
0.0
93
2
53
54
Tabela 16: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I85 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
DQ401862.1
Mercury-resistant
bacterium
mCFU 601 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1456
95
99
0.0
97
0
AJ863293.1
Uncultured bacterium
partial 16S rRNA gene,
clone 27RHU1
1450
80
99
0.0
96
0
AM162318.1
Paenibacillus sp.
H10-02 partial 16S rRNA
gene
1450
56
99
0.0
96
0
AM162298.1
Paenibacillus sp.
H42-08 partial 16S rRNA
gene
1450
55
99
0.0
96
0
EF073971.1
Uncultured
Paenibacillus sp.
clone GASP-WB2S2_E08
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
1437
95
99
0.0
96
0
AB073206.1
Paenibacillus
chondroitinus
gene for 16S rRNA, partial
sequence
1437
98
99
0.0
96
0
EF073315.1
Uncultured
Paenibacillus sp.
clone GASP-WB1S1_C04
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
1424
96
99
0.0
96
1
D82064.1
Paenibacillus
chondroitinus
DNA for 16S rRNA
1399
58
99
0.0
95
1
AB245386.1
Paenibacillus
pocheonensis
gene for 16S rRNA, partial
sequence, strain:Gsoil
1138
1397
56
99
0.0
95
1
EF516124.1
Uncultured bacterium
clone FCPP694 16S
ribosomal RNA gene,
complete sequence
1290
57
97
0.0
93
1
54
55
Tabela 17: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado I116 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
EF537010.1
Ochrobactrum sp.
15 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2453
91
99
0.0
98
0
AM490611.1
Ochrobactrum anthropi
partial 16S rRNA gene,
strain CCUG 43892
2451
94
99
0.0
98
0
AM422371.1
Ochrobactrum
pseudogrignonense
partial 16S rRNA gene,
type strain CCUG 30717T
2451
94
99
0.0
98
0
EF465412.1
Ochrobactrum sp.
WZUH09-1 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2446
94
99
0.0
98
0
EF537009.1
Ochrobactrum sp.
10 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2442
91
99
0.0
98
0
D63836.1
Ochrobactrum sp.
gene for 16S ribosomal
RNA, partial sequence
2433
91
99
0.0
98
0
DQ267116.1
Ochrobactrum sp.
CCBAU 61322 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2427
93
98
0.0
98
0
DQ985280.1
Ochrobactrum sp.
EV3 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2416
97
98
0.0
98
0
AM490617.1
Ochrobactrum anthropi
partial 16S rRNA gene,
strain DSM 7216
2396
94
99
0.0
97
0
AF452128.1
Ochrobactrum sp.
LMG 20564 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2392
91
99
0.0
97
0
55
56
Tabela 18: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado IB13 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no
GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
AM162330.1
Paenibacillus sp.
GP08-05 partial 16S rRNA
gene
1234
57
98
0.0
90
2
AB245384.1
Paenibacillus
panacisoli
gene for 16S rRNA, partial
sequence, strain:Gsoil
1411
1232
57
98
0.0
90
1
AY259129.1
Corynebacterium sp.
2301292 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1221
56
98
0.0
90
2
AY230766.1
Paenibacillus sp.
'Smarlab BioMol-2301065'
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
1221
62
98
0.0
90
2
AY323608.1
Paenibacillus sp.
'Smarlab BioMol-2301065'
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
1219
57
98
0.0
90
2
AY373364.1
Paenibacillus sp.
T7 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
1216
55
98
0.0
90
2
AJ604539.1
Uncultured Paenibacillus
sp.
partial 16S rRNA gene,
clone za19
1212
56
98
0.0
90
1
D85397.1
Paenibacillus illinoisensis
DNA for 16S rRNA
1208
59
98
0.0
90
2
AB073192.1
Paenibacillus illinoisensis
gene for 16S rRNA, partial
sequence
1208
56
98
0.0
90
2
EF074719.1
Uncultured Paenibacillus
sp.
clone GASP-WC1W2_B02
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
1205
93
94
0.0
91
1
56
57
Tabela 19: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado O01 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
AJ575816.1
Pseudomonas sp.
C36 16S rRNA gene,
strain C36
2510
96
98
0.0
98
0
AB175661.1
Pseudomonas sp.
CYN01B gene for 16S
rRNA, partial sequence
2507
92
98
0.0
98
0
AY177356.2
Pseudomonas sp.
M13 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2505
99
98
0.0
99
0
AM262973.1
Pseudomonas
oryzihabitans
partial 16S rRNA gene,
type strain IAM 1568T
2501
95
98
0.0
98
0
DQ129302.1
Uncultured bacterium
clone
AKIW1037 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2501
93
98
0.0
98
0
AY623816.1
Pseudomonas oleovorans
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
2495
93
98
0.0
98
0
DQ837571.1
Pseudomonas sp.
K3 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2494
96
98
0.0
98
0
AF479376.1
Glacial ice bacterium
M3C4.7K-2 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2494
96
98
0.0
98
0
EF550161.1
Pseudomonas sp.
GW11 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2492
99
97
0.0
99
0
EF157292.1
Pseudomonas sp.
OK-5 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2488
91
98
0.0
98
0
57
58
Tabela 20: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado O21 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
AY591911.1
Brevibacillus brevis
strain B15 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1502
56
97
0.0
98
0
AY887081.1
Brevibacillus brevis
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
1496
54
97
0.0
98
0
EF173465.1
Brevibacillus brevis
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
1491
60
97
0.0
98
0
EF061893.1
Brevibacillus sp.
M22 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
1489
60
96
0.0
98
0
DQ444284.1
Brevibacillus brevis
strain YJ009 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1489
56
97
0.0
98
0
DQ316786.1
Brevibacillus sp.
Y2 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
1489
59
96
0.0
98
0
AB090803.1
Brevibacillus sp.
YT-658 gene for 16S
rRNA, partial sequence
1485
57
97
0.0
98
0
AY822561.1
Bacterium
PSB-1-15 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1483
99
97
0.0
98
0
AB112731.1
Brevibacillus brevis
gene for 16S rRNA, partial
sequence, strain:DSM
5760
1480
57
97
0.0
98
0
DQ833765.1
Brevibacillus sp.
KN2 16 ribosomal RNA
gene, partial sequence
1478
97
95
0.0
98
0
58
59
Tabela 21: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado SF04 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no
GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
EF126756.1
Pseudomonas sp.
CBMB39 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2287
93
93
0.0
96
1
EF126755.1
Pseudomonas sp.
CBMB25 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2287
93
93
0.0
96
1
EF126753.1
Pseudomonas sp.
CBMB18 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2287
93
93
0.0
96
1
DQ885949.1
Pseudomonas trivialis
strain BIHB 749 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2287
87
93
0.0
96
1
DQ536520.1
Pseudomonas trivialis
strain BIHB 759 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2287
87
93
0.0
96
1
DQ536519.1
Pseudomonas trivialis
strain BIHB 757 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2287
87
93
0.0
96
1
DQ536516.1
Pseudomonas trivialis
strain BIHB 745 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2287
87
93
0.0
96
1
DQ536513.1
Pseudomonas poae
strain BIHB 730 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2287
87
93
0.0
96
1
AY599721.1
Pseudomonas sp.
TB3-6-I 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2287
90
93
0.0
96
1
AJ492829.1
Pseudomonas poae
partial 16S rRNA gene,
type strain DSM 14936T
2287
86
93
0.0
96
1
59
60
Tabela 22: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado SF14 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no
GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
DQ523503.1
Bacillus sphaericus
strain B586 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2237
86
98
0.0
98
0
DQ286310.1
Bacillus sphaericus
strain CIP5125 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2237
87
98
0.0
98
0
DQ870695.1
Bacillus sphaericus
strain KSC_SF3b 16S
ribosomal RNA (rrn) gene,
partial sequence
2235
85
98
0.0
98
0
DQ192210.1
Bacillus sp.
L15 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2235
90
97
0.0
98
0
AB116123.1
Bacillus sphaericus
gene for 16S ribosomal
RNA, partial sequence,
strain:S33
2235
83
98
0.0
98
0
AF435435.1
Bacillus sphaericus
strain 205y 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2231
81
98
0.0
98
0
AF169527.1
Bacillus sp.
NRS-1186 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2222
87
97
0.0
98
0
AF169494.1
Bacillus sp.
B-1876 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2217
87
97
0.0
98
0
EF503614.1
Bacillus sp.
ge05 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2213
86
97
0.0
98
0
EF503613.1
Bacillus sp.
ge04 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2213
86
97
0.0
98
0
60
61
Tabela 23: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado SF21 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no
GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
AF435435.1
Bacillus sphaericus
strain 205y 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1507
58
98
0.0
98
1
DQ870695.1
Bacillus sphaericus
strain KSC_SF3b 16S
ribosomal RNA (rrn) gene,
partial sequence
1502
58
98
0.0
98
1
DQ523503.1
Bacillus sphaericus
strain B586 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1496
58
98
0.0
98
0
AB116123.1
Bacillus sphaericus
gene for 16S ribosomal
RNA, partial sequence,
strain:S33
1496
56
98
0.0
98
1
AY043358.1
Bacillus sp.
ZYM 16S ribosomal RNA
gene, complete sequence
1491
57
98
0.0
98
0
AF169543.1
Bacillus sp.
NRS-752 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1491
57
98
0.0
98
1
AF169527.1
Bacillus sp.
NRS-1186 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1491
60
98
0.0
98
1
DQ286310.1
Bacillus sphaericus
strain CIP5125 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1491
59
98
0.0
98
1
AF169494.1
Bacillus sp.
B-1876 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1485
60
98
0.0
98
1
AF169521.1
Bacillus sp.
BD-89 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1480
60
98
0.0
97
1
61
62
Tabela 24: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado SF23 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no
GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
DQ523503.1
Bacillus sphaericus
strain B586 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2211
86
99
0.0
97
0
AB116123.1
Bacillus sphaericus
gene for 16S ribosomal RNA,
partial sequence, strain:S33
2211
83
99
0.0
97
0
DQ286310.1
Bacillus sphaericus
strain CIP5125 16S
ribosomal RNA gene, partial
sequence
2211
87
99
0.0
97
0
DQ870695.1
Bacillus sphaericus
strain KSC_SF3b 16S
ribosomal RNA (rrn) gene,
partial sequence
2187
85
98
0.0
97
0
AF435435.1
Bacillus sphaericus
strain 205y 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2187
85
98
0.0
97
0
EF472269.1
Bacillus fusiformis
strain LQ88 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2183
84
99
0.0
97
0
EF472267.1
Bacillus fusiformis
strain LQ104 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2183
81
99
0.0
97
0
EF473132.1
Bacillus fusiformis
isolate qd84 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2183
84
99
0.0
97
0
EF473129.1
Bacillus fusiformis
isolate ld84 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2183
84
99
0.0
97
0
DQ333300.1
Bacillus fusiformis
isolate LLP 16S ribosomal
RNA gene, partial sequence
2183
81
99
0.0
97
0
62
63
Tabela 25: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado B08 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
AF247693.1
Pandoraea sp.
G5084 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2479
92
95
0.0
98
1
AF139176.1
Pandoraea sputorum
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
2470
94
95
0.0
98
1
AF247699.1
Pandoraea sp.
G3307 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2459
92
95
0.0
98
1
AF247697.1
Pandoraea sp.
G9805 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2459
92
95
0.0
98
1
AY677092.1
Pandoraea sputorum
isolate TC84 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2435
98
95
0.0
97
1
AY268170.1
Pandoraea pnomenusa
strain CCUG 38742 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2433
96
95
0.0
97
1
EF191352.1
Pandoraea pnomenusa
strain LA-2 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2429
96
95
0.0
97
1
AF139174.1
Pandoraea pnomenusa
16S ribosomal RNA gene,
partial sequence
2429
95
95
0.0
97
1
DQ831002.1
Pandoraea sp.
LB-7 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2427
90
95
0.0
97
1
AY268168.1
Pandoraea pnomenusa
strain 2001008157 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2427
96
95
0.0
97
1
63
64
Tabela 26: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado B18 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
AB308441.1
Bacillus pumilus
gene for 16S rRNA, partial
sequence. strain:
TUT1346
2547
95
99
0.0
99
0
EF540447.1
Bacillus sp.
4_1V 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
2547
98
99
0.0
99
0
EF528291.1
Bacillus pumilus
strain CICCHLJ Q89 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2547
95
99
0.0
99
0
EF528287.1
Bacillus pumilus
strain CICCHLJ Q74 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
2547
95
99
0.0
99
0
EF197942.1
Bacillus pumilus
strain J 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2547
95
99
0.0
99
0
AY188840.1
Bacillus sp.
ROO40B 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2547
98
99
0.0
99
0
AJ831842.1
Bacillus sp.
41KF2b partial 16S rRNA
gene, strain 41KF2b
2547
95
99
0.0
99
0
AB098578.1
Bacillus pumilus
gene for 16S rRNA, partial
sequence
2547
95
99
0.0
99
0
AF479336.1
Glacial ice bacterium
G500K-16 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
2547
99
99
0.0
99
0
AM237349.1
Bacillus pumilus
partial 16S rRNA gene,
isolate OS-31.a
2545
96
99
0.0
99
0
64
65
Tabela 27: Dados obtidos das comparações da seqüência do isolado B34 do rDNA 16S com os primeiros resultados mais similares disponíveis no GenBank.
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
EF402329.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_06_49 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1411
55
98
0.0
95
1
EF402993.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_15_31 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1410
55
98
0.0
95
1
EF401960.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_01_86 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1410
55
98
0.0
95
1
EF402854.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_13_34 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1406
55
98
0.0
95
1
EF402630.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_10_44 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1406
55
98
0.0
95
1
EF402437.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_07_88 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1406
55
98
0.0
95
1
EF402046.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_02_87 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1406
55
98
0.0
95
1
EF401986.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_02_16 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1406
55
98
0.0
95
1
EF402103.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_03_68 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1404
55
98
0.0
95
1
EF634287.1
Gamma proteobacterium
X2 16S ribosomal RNA
gene, partial sequence
1400
97
97
0.0
95
1
65
66
... Continuação (isolado B34)
Acesso
Descrição
Comentário
Escore
Total
Cobertura da
seqüência
problema (%)
Cobertura da
seqüência do
banco (%)
Valor E
Identidade
(%)
Gaps (%)
EF402885.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_13_69 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1400
55
98
0.0
95
2
EF402397.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_07_39 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1400
55
98
0.0
95
2
EF402249.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_05_50 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1400
55
98
0.0
95
2
EF402187.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_04_72 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1400
55
98
0.0
95
2
EF402011.1
Uncultured bacterium
clone
SJTU_B_02_43 16S
ribosomal RNA gene,
partial sequence
1400
55
98
0.0
95
1
DQ857896.1
Enterobacter aerogenes
strain zjs04 16S ribosomal
RNA gene, partial
sequence
1400
55
98
0.0
95
2
AB099402.1
Enterobacter aerogenes
gene for 16S rRNA, partial
sequence
1400
59
98
0.0
95
2
AJ251468.1
Enterobacter aerogenes
partial 16S rRNA gene,
strain NCTC10006T
1399
55
98
0.0
95
2
U39556.1
Enterobacter sp.
16S rRNA gene, partial
sequence
1399
56
98
0.0
95
2
66
67
5 DISCUSSÃO
5.1 MORFOLOGIA, ANATOMIA E ULTRA-ESTRUTURA DOS NÓDULOS
A formação de nódulos nas raízes das leguminosas e a efetiva fixação
biológica de nitrogênio pelos bacteróides requerem uma seqüência complexa de
processos fisiológicos expressados por genes, os quais são ativados pela constante
troca de sinalizações entre a bactéria e a planta hospedeira (STACEY; BURRIS;
EVANS, 1992).
A contribuição das leguminosas, como fornecedoras de nitrogênio para o solo,
depende do estabelecimento de uma eficiente simbiose entre a planta e a bactéria.
Uma medida indireta dessa eficiência é a concentração de leghemoglobina no tecido
infectado, a qual confere coloração avermelhada ao interior dos nódulos (SPRENT,
2001), como a que foi evidenciada em alguns nódulos de amendoim forrageiro no
presente trabalho.
Os resultados das análises anatômicas aqui apresentados permitem
classificar os nódulos de A. pintoi como sendo do tipo asquenomenóide (CORBY,
1988). Os nódulos asquenomenóides apresentam crescimento determinado,
geralmente possuem vida curta (poucas semanas), tem forma de esfera achatada
nos pólos, estão associados com raízes laterais ou adventícias e a infecção ocorre
através de feridas onde as raízes emergem (SPRENT, 2001).
Os nódulos do tipo asquenomenóide possuem tecido infectado composto
exclusivamente por células infectadas e não apresentam um meristema permanente,
tendo, portanto, um período de crescimento e desenvolvimento determinado. Dos
cortes realizados para estudo da anatomia, apenas em um nódulo coletado na
Fazenda Ubirajara observou-se células não infectadas (intersticiais) em meio ao
tecido infectado. Sprent (2001) afirma que o tecido infectado pode apresentar
poucas células não infectadas (intersticiais).
De maneira geral a distribuição dos tecidos no nódulo de A. pintoi seguiu o
mesmo padrão relatado para nódulos determinados de outras leguminosas (ALLEN;
ALLEN, 1981).
88
68
Segundo Sprent (2001), os nódulos determinados são formados a partir da
invasão do rizóbio na raiz da planta. A divisão celular acontece no córtex externo da
raiz e em seguida diversas células meristemáticas são invadidas por correntes de
infecção que distribuem as bactérias, as quais, ao entrarem em contato com o
citoplasma da célula vegetal hospedeira, formarão o simbiossomo. Células
meristemáticas infectadas e não-infectadas continuam a se dividir formando o
nódulo, dentro de poucos dias as células param de se dividir e iniciam o processo de
fixação de nitrogênio (SPRENT, 2001). É importante salientar que as correntes de
infecção estão ausentes nos nódulos do tipo asquenomenóide (Figura 13)
(SPRENT, 2001). No presente estudo, em nenhum corte foi observado estas
estruturas tão comuns nos outros tipos de nódulos de leguminosas, como era
esperado.
Figura 13: Esquema de um nódulo tipo asquenomenóide: C, córtex do nódulo; R, raiz
(Adaptado de SPRENT, 2001).
Em um amplo estudo sobre nodulação em leguminosas Corby (1981) relatou
que a maioria dos nódulos de crescimento determinado é do tipo desmodióide. Os
nódulos determinados do tipo asquenomenóide e desmodióide ocorrem apenas
dentro da subfamília Papilionoideae (SPRENT, 2001).
Ao contrário do encontrado para A. hypogeae por Chandler (1978), Sprent
(1994) e Uheda; Daimon; Yoshizako (2001), onde pêlos radiculares multicelulares
geralmente circundam a área onde emerge a raiz lateral, em plantas adultas de A.
pintoi não foram encontrados pêlos radiculares (multicelulares ou unicelulares) em
nenhuma das raízes coletadas nos diferentes locais. Entretanto, pêlos multicelulares
foram encontrados nas raízes de plantas jovens de A. pintoi, corroborando o
69
trabalho de Uheda; Daimon; Yoshizako (2001) que afirmam, que os pêlos podem
estar presentes em raízes de plantas jovens e que são perdidos (descartados) no
decorrer do desenvolvimento da planta.
A formação de nódulos através da invasão intercelular do rizóbio ou “entrada
através de fissura”, que primeiro foi descrita em A. hypogaea no ano de 1940 por
Allen e Allen, está condicionada, segundo Uheda; Daimon; Yoshizako (2001), à
presença dos pêlos radiculares, e estes só foram encontrados em raízes jovens na
espécie do presente estudo. Entretanto, Sprent (2001) afirma que espécies de
amendoim que comumente não apresentam pêlos nas raízes pode tê-los em
condições de estresse e que a invasão do rizóbio nas raízes jovens pode acontecer
através das fissuras provocadas pela emergência das raízes secundárias.
A análise micromorfológica dos nódulos permitiu avaliar, além do tamanho
dos bacteróides, a sua forma, a qual é esférica e semelhante a de Bradyrhizobium,
uma bactéria fixadora de nitrogênio que comumente forma simbiose com
leguminosas do gênero Arachis (SPRENT, 2001). Os bacteróides dos nódulos de A.
pintoi, assim como os dos nódulos de A. hypogaea (SPRENT, 2001), apresentaram
a forma esférica e podem ser considerados grandes (atingindo até 4 µm de
diâmetro) quando comparados aos bacteróides de outros nódulos de leguminosas
(ALLEN; ALLEN, 1981).
A forma do bacteróide é em grande parte controlada pela planta hospedeira,
uma vez que, por exemplo, amendoim e caupi (Vigna unguiculata) podem ser
nodulados pela mesma estirpe de Bradyrhizobium e produzir bacteróides esféricos e
em forma de bacilo, respectivamente (SEN; WEAVER, 1984).
O espaço entre o bacteróide e a membrana do simbiossomo, observado nas
células infectadas do nódulo de A. pintoi pode ser, resultado da fixação química a
que foi submetido o nódulo, uma vez que esse espaço não foi identificado nos
simbiossomos de A. hypogaea submetidos à criofixação (SPRENT, 1994).
Duas características ultra-estruturais dos nódulos do amendoim que são
bastante incomuns nos de outras leguminosas são os vários tipos de oleossomos
(corpos lipídicos) e os corpos de armazenamento de proteínas (lectinas) presentes
nas
células
infectadas
(SPRENT,
2001).
Depósitos
elétron-densos
foram
encontrados nos espaços do simbiossomo de A. pintoi e podem ser comparados
pelo seu tamanho, posição e elétron-densidade com os depósitos de lectinas
encontrados em A. hypogaea.
70
Os espaços intercelulares encontrados tanto no tecido infectado como no
córtex interno do nódulo de amendoim forrageiro são importantes para permitir a
difusão do oxigênio, o qual é necessário para a respiração aeróbica e formação de
ATPs, que são consumidos em grande quantidade (16 ATPs por molécula de N2
transformada em 2 moléculas de NH3) durante a fixação biológica de nitrogênio que
ocorre no bacteróide (MOREIRA; SIQUEIRA, 2006).
As células do córtex interno do nódulo de A. pintoi apresentaram as
características ultra-estruturais típicas para as células corticais dos nódulos de
outras leguminosas como a presença de grãos de amido, que servem de reserva
para momentos de maior atividade metabólica do órgão (SPRENT, 2001). O nódulo
asquenomenóide de A. pintoi apresentou grandes semelhanças anatômicas,
morfológicas e ultra-estruturais com o nódulo de A. hypogaea (SPRENT, 2001).
5.2 CARACTERIZAÇÃO DAS COLÔNIAS
Para os gêneros da família Rhizobiaceae (Classe Alfaproteobacteria) e da
família Burkholderiaceae (Classe Betaproteobacteria), conhecidamente importantes
para o crescimento da planta e potencialmente nodulíferas, as características
culturais e morfológicas destas espécies bacterianas fornecem informações
importantes para sua identificação e agrupamento. Sabe-se que o processo de
fixação de nitrogênio é uma importante simbiose entre a bactéria e a leguminosa.
Esta interação tem despertado grande interesse da comunidade científica na busca
de melhorias para potencialização das pastagens associadas com A. pintoi.
As principais características das colônias, isoladas através deste trabalho e
observadas no meio de cultura 79 foram a mudança de pH do meio e produção de
muco (provavelmente uma mistura complexa de exopolissacarídeos) pelas bactérias.
Vale ressaltar que o meio de cultura 79 também conhecido com YMA (Yeast
Mannitol Agar) não é específico para culturas de rizóbios, portanto pode ser utilizado
e permite o cultivo de outros tipos de bactérias, fornecendo ainda a possibilidade de
avaliar a mudança de pH no referido meio.
Nos dois isolados identificados como Rhizobium sp. através do Blastn foi
observada a alta produção de muco. Foi observado que os isolados identificados
71
com Bacillus não produziam muco (-) ou quando produziam era em pequena
quantidade (+). Martins (1996) em seu estudo de rizóbios que nodulavam Vigna
unguiculata observou que a quantidade de muco produzida coincide com o tempo de
crescimento da colônia, onde as estirpes de crescimento rápido produziam uma
quantidade abundante de muco, enquanto as de crescimento lento e muito lento
produziam pouco ou nenhum muco. No presente trabalho não foi observado esta
relação, pois todas as colônias isoladas apresentaram crescimento rápido e a
produção de muco foi bastante variada.
Em relação à mudança de pH produzida no meio de cultura, foram
observadas três características bastante evidentes: algumas estirpes acidificaram o
meio de cultura, outras o alcalinizaram e já outras, não alteraram o pH. Segundo Tan
e Broughton (1981) a mudança de pH é decorrente da utilização preferencial de
açúcares pelas estirpes de crescimento rápido, seguida de excreção de ácidos
orgânicos e de compostos de nitrogenados pela estirpe.
O estudo das características culturais e morfológicas dos isolados de A. pintoi
revela uma diversidade bastante ampla. O conhecimento da diversidade das
comunidades nativas é a principal fonte para desenvolvimento da biotecnologia.
5.3 CARACTERIZAÇÃO DO rDNA 16S
Todos os gêneros isolados a partir dos nódulos de A. pintoi no decorrer do
presente estudo e identificados através da comparação com as seqüências do
GenBank (NCBI) são comumente encontrados no solo, com exceção do gênero
Corynebacterium.
No presente trabalho foram identificados três gêneros de bactérias
conhecidamente nodulíferas e fixadoras de nitrogênio em simbiose com leguminosas
e pertencentes à Classe Alfaproteobacteria: Agrobacterium (MARTÍNEZ; PALÁCIOS;
SÁNCHEZ, 1987), Ochrobaterium, (TRUJÍLLO et al., 2005) e Rhizobium (FRANK,
1889). Um gênero da Classe Betapoteobacteria e pertencente à família
Burkholderiaceae, Pandorea, também foi encontrado nos isolados de A. pintoi.
Acredita-se que este gênero também possa ser capaz de fixar nitrogênio.
Pertencente também a família supracitada encontra-se o gênero Burkholderia
72
descrito como nodulífero e capaz de fixar nitrogênio quando associado a
leguminosas (MOULIN et al., 2001; VANDAMME et al., 2002). Associadas aos
nódulos de A. pintoi também foram encontradas bactérias dos gêneros Bacillus,
Paenibacillus, Enterobacter e Pseudomonas, todos eles citados por Moreira e
Siqueira (2006) como sendo diazotróficos associativos na rizosfera de espécies
vegetais.
Na literatura algumas espécies de Bacillus são descritas como diazotróficas
associativas (NEAL; LARSON, 1976; HEULIN, 1992). Dentro da Classe Bacilli a
espécie Paenibacillus brasiliensis foi encontrada associada ao milho (VON DER
WEID et al., 2002) e é conhecida pela sua capacidade de fixar nitrogênio, assim
como Paenibacillus borealis espécie isolada de coníferas em florestas da Finlândia
(ELO et al., 2001). Outra espécie de Paenibacillus, Paenibacillus azotofixans, é
freqüentemente isolada de solo e raízes de cana-de-açúcar, trigo e outras gramíneas
(SELDIN, VAN ELSAS; PENIDO, 1984).
Espécies pertencentes à Classe Bacilli podem apresentar resultados diversos
para o teste de Gram, e isso explicaria alguns dos resultados obtidos no presente
estudo. Segundo Piao et al. (2005), algumas espécies do gênero Bacillus pode
apresentar reações de Gram instáveis, positivas ou negativas. O gênero
Paenibacillus pode apresentar coloração Gram-negativa por possuir uma parede
celular fina, com menor quantidade de peptideoglicanos (UETANABARO et al.,
2003).
O isolado B34 identificado como não cultivável ou Enterobacter apresentou
índice de cobertura da seqüência problema muito baixo, em média 56% e índice de
similaridade 95%. O gênero Enterobacter já foi citado como associado a raízes de
coqueiros, gramíneas, trigo cevada e arroz (KORHOREN et al., 1989; FERNANDES;
FERNANDES; RODRIGUES, 2001).
O gênero Pseudomonas pertencente à Classe Gammaproteobacteria, e
durante muito tempo foi questionada a capacidade de Pseudomonas spp. fixarem
nitrogênio. Entretanto, com novos estudos realizados sobre este gênero foi
comprovado que Pseudomonas stutzeri (XIE et al., 2006), dentre outras espécies,
pode reduzir o nitrogênio atmosférico à amônia. Pseudomonas spp. associadas às
raízes das plantas foram isoladas de arroz (BARRAQUIO; LADHA; WATANABE,
1983 et al., 1983) e coqueiro (FERNANDES; FERNANDES; RODRIGUES, 2001).
73
Dentre os grupos de bactérias mais estudados e de grande potencial para
utilização na agricultura encontram-se as rizobactérias promotoras de crescimento
de plantas, representando um subgrupo diverso de bactérias que colonizam as
raízes. O termo Rizobactérias Promotoras de Crescimento em Plantas (RPCPs) foi
adotado por Schroth e Hancock (1982) para descrever bactérias benéficas bem
adaptadas às raízes das plantas, e para diferenciá-las das bactérias do solo que não
as colonizam ou não o fazem tão agressivamente (BOTELHO, 1996).
A maioria das estirpes de rizobactérias promotoras de crescimento em plantas
documentadas na literatura pertence aos gêneros Pseudomonas e Bacillus. Sendo
que, dentre o gênero Pseudomonas, o maior número das espécies refere-se ao
grupo das fluorescentes. Pseudomonas spp. fluorescentes também estão envolvidas
na conservação do ambiente. Seu metabolismo de carbono e energia são
responsáveis pela dissimilação de nitrato e degradação de compostos xenobióticos.
A diversidade metabólica de Pseudomonas spp. fluorescentes dá a estas bactérias
uma grande habilidade para adaptação a vários ambientes, especialmente solo e
rizosfera (LATOUR; LEMANCEAU, 1997).
Existem registros da presença do gênero Brevibacillus, pertencente à Família
Paenibacillaceae, em solos (BAEK, 2006) já para o gênero Corynebacterium (56%
de cobertura da seqüência problema e 90% de similaridade), identificado através do
Blast, não foi encontrado nenhum registro sobre a sua presença em solo rizosférico.
Os isolados bacterianos de A. pintoi, identificados molecularmente através do
seqüenciamento do rDNA 16S, podem ser considerados como simbiontes,
endofíticos ou associativos dos nódulos, uma vez que foram tomados os devidos
cuidados no procedimento de desinfestação desses órgãos e no processo
isolamento em capela de fluxo laminar. Entretanto, não pode ser descartada a
hipótese de contaminação no procedimento de isolamento ou repicagem das
colônias bem como no processo de desinfestação dos nódulos.
O presente estudo apresentou informações sobre isolados bacterianos de
nódulos de A. pintoi, os quais foram provenientes da região sul baiana, onde essa
espécie vegetal é considerada nativa. As informações da morfologia das colônias e
das bactérias associativas e simbiontes dos nódulos dessa leguminosa forrageira
são importantes para caracterização do banco de isolados que foi, através deste
trabalho, constituído e que subsidiará através do fornecimento de inoculantes os
estudos posteriores para averiguar a influência destas bactérias no crescimento de
74
A. pintoi. Vale ainda ressaltar a grande importância do conhecimento sobre essas
bactérias que podem ser utilizadas em processos biotecnológicos de interesse
agropastoril em outras espécies vegetais.
75
6 CONCLUSÕES
• As características morfoanatômicas e ultra-estruturais observadas nos
nódulos
de
A.
pintoi
permitem
classificá-lo
como
sendo
do
tipo
asquenomenóide, portanto de crescimento determinado.
• A grande maioria (64) dos isolados dos nódulos de A. pintoi dos diferentes
locais de coleta acidificaram o meio de cultura 79, apresentaram crescimento
rápido e produziram muco.
• Dos 19 isolados selecionados quanto as diferenças morfológicas das colônias
(diferentes morfotipos) para seqüenciamento do rDNA 16S, 11 amostras
apresentaram similaridade (através de Blastn) com os gêneros Bacillus,
Paenibacillus,
Brevibacillus,
Pseudomonas,
Enterobacter,
Pandorea,
Rhizobium e Ochrobacterium.
• Foi estabelecido no Laboratório de Pesquisa em Microbiologia (LAPEM) da
UEFS um banco de bactérias isoladas a partir dos nódulos de A. pintoi
constituído por aproximadamente 150 isolados.
• Propõe-se estudos posteriores dos 19 isolados seqüenciados quanto a sua
capacidade de fixação biológica de nitrogênio, podendo-se averiguar a
presença no genoma desses isolados do gene nifH, e posteriores testes de
inoculação dessas bactérias em sementes de A. pintoi com intuito de avaliar
sua capacidade de nodulação, vale ressaltar ainda a necessidade de
posteriores estudos na identificação ao nível de espécie.
76
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67
APÊNDICE A – Tabela 5: Características culturais dos isolados provenientes dos nódulos de A. pintoi.
Descrição das colônias
Isolados
Gram
Morfologia da célula
bacteriana
I 01
I 03
I 04
Cor
Borda
Produção
de muco
Aparência
pH
Tamanho
Cresc.
(dias)
Transparência
Forma
Elevação
Superfície
branca
transp
vermelha
regular
regular
regular
+
+
+
gomoso
aquosa
aquosa
neutro
ácido
ácido
0,6
0,4
0,3
1
2
1
opaca
translúcida
translúcida
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
I 06
negativo
Cocobacilo
azul
regular
+
gomoso
ácido
0,7
2
opaca
circular
convexa
mucosa
I 07
I 08
I 10
I 11
I 12
negativo
Bastonete
negativo
negativo
negativo
Cocobacilo (0,5 - 1,0)
Cocobacilo (0,5 - 1,0)
Bastonete (3,0 - 1,2)
branca
transp
vermelha
branca
branca
regular
regular
regular
regular
irregular
++
++
++
++
+
leitoso
aquosa
aquosa
gomoso
gomoso
ácido
neutro
ácido
ácido
ácido
1,4
0,5
0,3
1,6
0,6
2
2
1
1
1
opaca
translúcida
translúcida
opaca
opaca
circular
circular
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
mucosa
mucosa
I 14
negativo
Bastonete (1,0 - 0,5)
branca
regular
++
leitoso
ácido
1,4
1
translúcida
circular
convexa
mucosa
I 15
I 17
negativo
Cocobacilo (0,6 - 1,0)
azul
branca
regular
regular
++
++
?
leitoso
neutro
ácido
1,1
2,2
2
1
opaca
translúcida
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
I 18
negativo
Cocobacilo (0,5 - 1,0)
vermelha
regular
++
aquosa
ácido
0,3
1
translúcida
circular
convexa
mucosa
I 19
I 20
negativo
vermelha
vermelha
regular
regular
++
++
aquosa
aquosa
ácido
ácido
0,8
0,6
1
1
translúcida
translúcida
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
I 22
negativo
vermelha
regular
++
aquosa
ácido
0,3
2
translúcida
circular
convexa
mucosa
I 23
I 25
negativo
negativo
vermelha
vermelha
regular
regular
++
++
aquosa
aquosa
ácido
ácido
0,2
0,3
1
1
translúcida
translúcida
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
I 26
positivo
branca
regular
+
leitoso
neutro
0,7
1
opaca
circular
convexa
mucosa
I 27
positivo
Cocobacilo (0,6 - 1,0)
Diplococobacilo
(0,5 - 1,0)
Cocobacilo (0,5 - 1,0)
Bastonete
Bastonete (2,0 - 3,0)
com pontos escuros
Bastonete (2,0 - 3,0)
com pontos escuros
branca
regular
+
gomoso
ácido
0,5
2
opaca
circular
convexa
seca
I 29
I 30
negativo
branca
azul
regular
irregular
++
+
leitoso
floculosa
ácido
neutro
0,6
1,4
1
2
translúcida
translúcida
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
cocobacilos
I – Local de coleta UESC (Ilhéus).
88
88
90
Descrição das colônias
Morfologia da célula
bacteriana
Cor
Borda
Produção
de muco
Aparência
pH
Tamanho
Cresc.
(dias)
Transparência
Forma
Elevação
Superfície
I 32
I 33
I 35
Bastonete (1,5 - 0,5)
Bastonete (2,5 - 1,0)
Bastonete (3,0 - 4,0)
branca
branca
amarela
regular
regular
regular
++
+
++
leitoso
floculosa
gomoso
ácido
ácido
neutro
1,6
0,7
1
1
1
1
opaca
opaca
translúcida
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
I 38
Cocobacilo (0,5 - 1,0)
azul
irregular
-
gomoso
básico
0,6
1
opaca
circular
plana
seca
I 39
I 40
I 46
I 49
I 51
Cocobacilo (0,5 - 1,0)
Cocobacilo (0,3 - 0,6)
azul
azul
branca
branca
branca
irregular
regular
irregular
irregular
regular
+
gomoso
aquosa
floculosa
floculosa
floculosa
básico
básico
básico
ácido
ácido
0,6
0,2
0,8
0,5
0,8
1
1
1
1
1
opaca
translúcida
opaca
opaca
opaca
circular
circular
irregular
irregular
circular
plana
convexa
convexa
convexa
convexa
seca
mucosa
seca
seca
mucosa
branca
regular
+
floculosa
ácido
0,8
1
opaca
circular
convexa
mucosa
branca
azul
regular
regular
+
++
floculosa
aquosa
ácido
neutro
0,7
0,7
1
4
opaca
translúcida
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
transp
regular
+
aquosa
neutro
1,06
1
translúcida
circular
convexa
mucosa
Isolados
Gram
I 54
I 57
I 67
negativo
I 68
negativo
Bastonete (2,5 - 0,6)
Bastonete (3,0 - 0,5)
curvado ou vibriões
I 70
I 72
Bastonete (0,5 - 0,2)
branca
azul
regular
regular
+
+
floculosa
floculosa
neutro
neutro
0,4
0,5
1
1
opaca
opaca
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
I 74
Cocobacilo (ø 2,0)
amarela
regular
+
floculosa
neutro
0,9
1
opaca
circular
convexa
mucosa
amarela
azul
amarela
branca
branca
branca
transp
regular
regular
irregular
regular
regular
regular
regular
++
+
+
+
+
+
++
aquosa
floculosa
gomosa
leitosa
floculosa
leitosa
aquosa
neutro
ácido
neutro
neutro
ácido
ácido
ácido
1,2
0,5
0,5
1,04
0,9
1,5
1,5
1
1
1
1
1
1
1
translúcida
opaca
opaca
opaca
translúcida
opaca
translúcida
circular
circular
circular
circular
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
convexa
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
seca
mucosa
mucosa
mucosa
I 76
I 78
I 79
I 82
I 83
I 84
I 85
positivo
positivo
positivo
Bastonete (0,5 - 0,3)
Bastonete (0,5 - 0,3)
Bastonete (0,6 - 0,3)
I – Local de coleta UESC (Ilhéus).
89
91
... Continuação
Descrição das colônias
Isolados
Gram
I 86
I 88
I 89
Morfologia da célula
bacteriana
Bastonete (0,5- 0,3)
I 90
Cor
Borda
Produção
de muco
Aparência
pH
Tamanho
Cresc.
(dias)
Transparência
Forma
Elevação
Superfície
azul
azul
branca
irregular
irregular
regular
++
floculosa
floculosa
aquosa
ácido
neutro
ácido
0,8
0,44
1
1
1
1
opaca
opaca
translúcida
circular
circular
circular
convexa
plana
convexa
seca
seca
mucosa
branca
regular
+
gomosa
ácido
0,2
1
opaca
circular
convexa
mucosa
regular
regular
regular
regular
regular
+
+
+
+
+
floculosa
aquosa
gomosa
floculosa
floculosa
ácido
neutro
ácido
neutro
neutro
0,86
0,4
1,14
0,7
0,2
1
1
1
1
1
opaca
opaca
opaca
opaca
opaca
circular
circular
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
mucosa
mucosa
I 91
I 92
I 93
I 96
I 97
Bastonete (1,2 - 0,5)
Cocobacilo (ø 1,0)
Bastonete (1,2 - 0,8)
branca
azul
branca
vermelha
amarela
I 98
Bastonete (1,2 - 0,5)
amarela
regular
+
floculosa
neutro
0,2
2
opaca
circular
convexa
mucosa
I 99
I 100
Cocobacilo (ø 1,3)
Bastonete (2,0 x 1,0)
azul
azul
regular
regular
+
+
aquosa
aquosa
neutro
neutro
0,7
0,7
1
1
opaca
opaca
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
I 101
branca
regular
+
gomosa
neutro
0,9
1
opaca
circular
convexa
mucosa
I 104
I 105
azul
amarela
regular
regular
+
+
floculosa
floculosa
neutro
neutro
0,6
1,1
4
1
opaca
opaca
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
branca
regular
+
leitosa
neutro
1,6
1
opaca
circular
convexa
mucosa
transp
regular
+
aquosa
ácido
0,3
1
translúcida
circular
convexa
mucosa
branca
regular
+
floculosa
ácido
0,8
1
opaca
circular
convexa
mucosa
amarela
branca
regular
regular
++
+
aquosa
leitosa
neutro
ácido
1,9
1,3
1
1
translúcida
opaca
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
azul
regular
+
leitosa
ácido
1,8
2
opaca
circular
convexa
mucosa
transp
regular
+
leitosa
ácido
0,26
2
translúcida
circular
convexa
mucosa
I 106
Diplococos (ø 1,3)
I 108
Bastonete (2,0 - 1,0)
com pontos escuros
bastonete (1,0 - 0,5)
I 111
I 112
I 113
I 115
I 116
negativo
Bastonete (1,2 - 0,5) e
irregulares
Bastonete
I – Local de coleta UESC (Ilhéus).
90
92
... Continuação
Descrição das colônias
Isolados
Gram
Morfologia da célula
bacteriana
Bastonete (1,2 - 0,6)
corou bem clarinho
B 01
B 03
B 04
Bastonete (2,5 - 1,5)
B 05
B 07
B 08
Negativo
B 09
B 11
B 12
Cocobacilo (ø 1,0)
Bastonete (1,2 - 0,6)
corou bem clarinho
Bastonetes (2,5 - 0,6)
Cor
Borda
Produção
de muco
Aparência
pH
Tamanho
Cresc.
(dias)
Transparência
Forma
Elevação
Superfície
branca
regular
+
aquosa
ácido
0,2
2
translúcida
circular
convexa
mucosa
branca
branca
regular
regular
+
++
gomosa
floculosa
neutro
neutro
0,14
37,5
2
1
opaca
translúcida
circular
circular
plana
convexa
mucosa
mucosa
azul
regular
+
gomosa
neutro
0,24
2
opaca
circular
plana
mucosa
transp
regular
+
aquosa
ácido
0,3
2
translúcida
circular
convexa
mucosa
azul
regular
+
aquosa
neutro
1,5
2
translúcida
circular
convexa
mucosa
azul
amarela
amarela
regular
regular
regular
+
+
gomosa
gomosa
gomosa
básico
ácido
ácido
0,5
0,3
0,64
1
1
1
opaca
opaca
opaca
circular
circular
circular
plana
plana
convexa
mucosa
seca
mucosa
B 13
Bastonete (2,0 - 0,8)
azul
regular
+
gomosa
básico
1
1
opaca
circular
convexa
mucosa
B 14
B 15
Bastonete (2 - 1,2 µm)
Bastonete (3,0 - 1,0)
branca
amarela
irregular
irregular
+
-
gomosa
não
neutro
ácido
1,54
0,2
1
1
opaca
opaca
circular
circular
convexa
plana
seca
seca
Bastonete (2,0 - 0,8)
branca
irregular
-
gomosa
ácido
0,64
2
opaca
circular
plana
seca
Cocobacilo (ø 0,5)
branca
branca
regular
irregular
+
-
gomosa
não
ácido
neutro
1,1
0,4
4
2
opaca
opaca
circular
circular
convexa
plana
mucosa
seca
branca
irregular
-
floculosa
neutro
0,8
1
opaca
circular
convexa
seca
branca
branca
azul
azul
regular
regular
regular
regular
+
+
+
floculosa
floculosa
floculosa
floculosa
neutro
neutro
ácido
ácido
1,4
0,4
0,2
0,2
2
2
2
2
opaca
opaca
opaca
opaca
circular
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
mucosa
branca
regular
+
aquosa
ácido
0,44
1
translúcida
circular
convexa
mucosa
branca
regular
+
leitosa
ácido
1,04
2
opaca
circular
convexa
mucosa
B 18
Negativo
B 21
B 25
B 26
B 28
B 29
B 32
B 33
B 34
B 35
Cocobacilo (ø 0,8)
negativo
Bastonetes (1,0 - 0,6)
agregados
B – Local de coleta Faz. Ubirajara, Belmonte e CEPLAC, Itabela.
91
93
... Continuação
Descrição das colônias
Isolados
Gram
Morfologia da célula
bacteriana
Cor
Borda
Produção
de muco
Aparência
pH
Tamanho
Cresc.
(dias)
Transparência
Forma
Elevação
Superfície
azul
azul
transp
regular
regular
regular
+
+
++
floculosa
floculosa
gomosa
neutro
ácido
ácido
0,4
0,2
0,68
2
2
1
opaca
opaca
translúcida
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
azul
regular
+
floculosa
ácido
0,7
1
opaca
circular
convexa
mucosa
transp
amarela
branca
branca
branca
regular
regular
regular
regular
regular
+
+
+
+
+
aquosa
floculosa
leitosa
leitosa
leitosa
ácido
neutro
ácido
ácido
ácido
0,7
0,8
1
1
0,8
1
1
1
1
1
translúcida
opaca
opaca
opaca
opaca
circular
circular
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
mucosa
mucosa
O 07
branca
regular
++
leitosa
neutro
0,84
1
opaca
circular
convexa
mucosa
O 08
O 10
branca
branca
regular
regular
+
+
leitosa
leitosa
ácido
ácido
1,06
0,7
1
1
opaca
opaca
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
O 11
branca
regular
+
leitosa
ácido
0,46
1
opaca
circular
convexa
mucosa
O 12
O 13
branca
branca
regular
regular
+
++
leitosa
aquosa
ácido
ácido
0,9
?
1
2
opaca
opaca
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
O 16
branca
regular
+
leitosa
ácido
0,9
1
opaca
circular
convexa
mucosa
branca
branca
branca
amarela
branca
branca
regular
regular
regular
regular
regular
regular
+
+
+
+
+
leitosa
leitosa
leitosa
floculosa
floculosa
leitosa
ácido
ácido
ácido
neutro
neutro
ácido
0,5
1
0,8
0,44
0,6
0,5
1
1
1
2
2
1
opaca
opaca
opaca
opaca
opaca
opaca
circular
circular
circular
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
seca
mucosa
mucosa
B 37
B 38
B 39
Gram -
B 42
B 45
O 01
O 03
O 04
O 06
O 17
O 18
O 20
O 21
O 22
O 23
negativo
Bastonete
Gram -
positivo
Bastonete
Gram -
B – Local de coleta Faz. Ubirajara, Belmonte, CEPLAC, Itabela e O – cv Orozimbo, Itabela.
92
94
... Continuação
Descrição das colônias
Isolados
Gram
SF 01
SF 02
SF 04
negativo
SF 05
Negativo
SF 07
SF 08
SF 10
SF 11
SF 12
SF 14
Morfologia da célula
bacteriana
Cor
Borda
Produção
de muco
Aparência
pH
Tamanho
Cresc.
(dias)
Transparência
Forma
Elevação
Superfície
Cocobacilo
azul
azul
branca
irregular
irregular
regular
+
+
+
floculosa
floculosa
leitosa
neutro
neutro
ácido
0,7
0,7
0,4
1
1
2
opaca
opaca
opaca
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
branca
regular
+
leitosa
ácido
0,46
1
opaca
circular
convexa
mucosa
branca
azul
azul
branca
amarela
branca
regular
regular
regular
regular
irregular
regular
+
+
+
+
+
floculosa
floculosa
floculosa
leitosa
gomosa
leitosa
neutro
neutro
neutro
ácido
ácido
neutro
0,7
0,6
0,4
0,5
0,4
0,4
1
1
2
2
1
2
opaca
opaca
opaca
opaca
opaca
opaca
circular
circular
circular
circular
disforme
circular
convexa
convexa
convexa
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
mucosa
seca
mucosa
azul
amarela
irregular
irregular
-
floculosa
gomosa
neutro
ácido
1,28
0,4
1
1
opaca
opaca
circular
disforme
convexa
convexa
seca
seca
Negativo
Bastonetes (2 x 0,6)
Negativo
positivo
Bastonete
SF 16
Negativo
SF 18
SF 19
Negativo
SF 20
Negativo
azul
regular
+
floculosa
neutro
0,4
2
opaca
circular
convexa
mucosa
SF 21
SF 22
positivo
Bastonete
azul
azul
irregular
irregular
+
+
floculosa
floculosa
neutro
neutro
0,64
0,7
1
1
opaca
opaca
circular
circular
convexa
convexa
mucosa
mucosa
SF 23
Positivo
Bastonete
azul
irregular
+
floculosa
neutro
0,4
1
opaca
circular
convexa
mucosa
SF 27
SF 28
SF 34
Negativo
branca
branca
amarela
regular
irregular
regular
+
+
leitosa
floculosa
floculosa
ácido
neutro
neutro
0,64
0,9
0,4
1
1
1
opaca
opaca
opaca
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
mucosa
seca
mucosa
SF – Local de coleta Faz. São Francisco, Belmonte.
93
95
... Conclusão.
Descrição das colônias
Isolados
Gram
IB 01
IB 02
IB 03
negativo
IB 04
Negativo
IB 05
IB 06
IB 07
IB 08
IB 09
IB 11
IB 13
Morfologia da célula
bacteriana
Cor
Borda
Produção
de muco
Aparência
pH
Tamanho
Cresc.
(dias)
Transparência
Forma
Elevação
Superfície
Cocobacilo
amarela
azul
amarela
regular
regular
regular
sim +
sim +
sim +
lisa
flocoso
flocoso
ácido
neutro
ácido
0,7
0,6
0,6
1
1
1
opaca
opaca
opaca
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
azul
amarela
amarela
regular
regular
regular
sim +
sim +
sim +
flocoso
lisa
lisa
neutro
ácido
ácido
0,7
0,8
0,6
1
1
1
opaca
opaca
opaca
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
azul
azul
amarela
regular
regular
regular
sim +
sim +
sim +
flocoso
flocoso
transp
neutro
neutro
ácido
1,4
0,8
1,5
1
1
1
opaca
opaca
transp
circular
circular
circular
convexa
convexa
convexa
mucosa
mucosa
mucosa
amarela
regular
+
transp
ácido
1,5
1
translúcida
circular
convexa
mucosa
Negativo
Bastonetes (2 x 0,6)
Negativo
positivo
Bastonete
positivo
IB – Local de coleta cv 31534 (CEPLAC), Itabela.
94
6795
ANEXO A – Protocolo para preparo de meios de cultura 79 e TY
MEIO 79
(FRED; WASKMAN, 1928)
-
10g de açúcar
-
1mL k2HPO4/L solução 10%
-
4mL KH2PO4/L solução 10%
-
2mL MgSO4. 7H2O/L solução 10%
-
1mL NaCl/L solução 10%
-
0,4g de extrato de levedura em pó/ L de meio
-
5mL de solução alcoólica 0,5% de azul de bromotimol
-
15g de ágar bacteriológico
• Completar para 1000mL com água destilada e ajustar o pH com NaOH 10%
para 6,8 - 7,0.
• Dissolver os reagentes em água destilada fervente.
• Esterilizar
MEIO TY (para extração de DNA)
-
5g de triptona
-
3g de extrato de levedura
-
0,9g CaCl2. 2H2O
-
Ágar 15g
-
Água destilada q.s.p. 1000mL
-
Esterilizar
88
96
ANEXO B – Protocolo para preparo dos reagentes para o teste de coloração
diferencial – Método de Gram
Solução de Cristal Violeta
-
110g de violeta cristal
-
4g de oxalato de amônio
-
100mL de etanol (álcool absoluto)
-
400mL de água destilada
Solução de Lugol
-
1g de iodo
-
2g de iodeto de potássio
-
25mL de etanol (álcool absoluto)
-
100mL de água destilada
Solução de descoloração
-
95mL de etanol (álcool absoluto)
-
5mL de água destilada
Solução de safranina
-
2,5g de safranina
-
90mL de água destilada
-
100mL de etanol (álcool absoluto)
97
ANEXO C – Protocolo para coloração pelo método diferencial de Gram
-
Cobrir o esfregaço já fixado em lâmina, com solução de violeta de cristal
durante 1 minuto.
-
Lavar com água corrente.
-
Cobrir o esfregaço com lugol durante 1 minuto.
-
Lavar com água corrente.
-
Descorar com álcool.
-
Lavar com água corrente.
-
Cobrir o esfregaço com safranina durante 1 minuto.
-
Lavar com água corrente.
-
Deixar secar