0
UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ-UECE
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
ANNA CLARA ACCIOLY FERREIRA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE INSULINA E DO FSH NO CULTIVO DE
FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO
EM MEIO CONTENDO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO
FORTALEZA – CEARÁ
2015
1
ANNA CLARA ACCIOLY FERREIRA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE INSULINA E DO FSH NO CULTIVO DE
FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO EM
MEIO CONTENDO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos
Ruminantes.
Orientador: Prof. Dr. Claudio Cabral Campello.
FORTALEZA – CEARÁ
2015
2
3
ANNA CLARA ACCIOLY FERREIRA
EFEITO DA CONCENTRAÇÃO DE INSULINA E DO FSH NO CULTIVO DE
FOLÍCULOS OVARIANOS PRÉ-ANTRAIS CAPRINOS CULTIVADOS IN VITRO EM
MEIO CONTENDO HORMÔNIO DO CRESCIMENTO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial para
a obtenção do grau de Mestre em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de Pesquisa: Reprodução e Sanidade de Pequenos
Ruminantes.
Aprovada em: 17/07/2015
BANCA EXAMINADORA
4
A DEUS, SUSTENTÁCULO DIVINO,
A MINHA FAMÍLIA, SUSTENTÁCULO TERRENO
5
AGRADECIMENTOS
À Universidade Estadual do Ceará (UECE) e ao Programa de Pós-graduação em Ciências
Veterinárias (PPGCV) por minha formação e capacitação profissional.
A Deus, o sopro da vida, a seu filho Jesus, os divinos ensinamentos e ao Espírito Santo, a luz
que me guia os passos a cada despertar.
A minha mãe Anna Laura, grande amiga, irmã e companheira de jornada... o meu tudo! Amo
você!
Ao meu pai, pelo amor que me dedicou me fazendo quem sou.
Aos meus irmãos Romeu e João Paulo, por me ensinarem diariamente a tolerância, a
paciência e, principalmente, o amor! Pelo entendimento nas diferenças e o amor nas
igualdades.
Ao meu padrasto Gino, que me ajudou a chegar até aqui, com seu carinho e presteza.
A minha avó Stela, que agora habita na morada do Pai, deixando saudades de um colo e um
chamego que só avó sabe dar...
A minha família, que sempre torceu pela realização deste sonho.
A minha amiga Ana Maria, tia de coração, por todo o seu carinho e incentivo!
A minha amiga Ana Dina, pelos deliciosos “quitutes” e pela grande amizade.
À professora Lúcia de Fátima Lopes dos Santos, que me orientou com tanta maestria durante
minha vida acadêmica, a quem tenho bastante carinho e admiração.
Aos meus mestres, pelos conhecimentos transmitidos que pautarão minha vida profissional.
Aos funcionários do PPGCV, em especial a Adriana, ao Sr. João e ao Cesár que desde o início
me acolheram com carinho.
Ao meu orientador, professor Cláudio Cabral, por quem tenho tamanha admiração, obrigada
por toda a paciência, confiança e ensinamentos transmitidos.
Ao prof. José Ricardo de Figueiredo e à profa. Ana Paula Ribeiro Rodrigues, por todo auxílio
e incentivo profissional, pela confiança depositada em mim.
6
À Carolina Maside Mielgo, por toda sua contribuição, incentivo, entusiasmo e amizade
durante a finalização deste trabalho! Ao Carlos Henrique Lobo, por todo o conhecimento
transmitido e amizade!
Ao Dr. Felipe Zandonadi Brandão e ao Dr. Gary Apgar pela contribuição na realização deste
trabalho.
Aos membros da banca Dr. José Ricardo de Figueiredo, Dra. Valdevane Rocha Araújo e Dra.
Carolina Maside Mielgo, pelo auxílio na finalização desse trabalho e por gentilmente terem
aceitado ao convite de participar da minha banca examinadora.
A minha equipe de trabalho, Denise Damasceno Guerreiro, Hudson Henrique Vieira Correia,
Naiza Arcângela Ribeiro Sá, Valdevane Rocha Araújo e agregados (Johanna Leiva, Jesús
Cadenas e Érica Leal), pela dedicação e apoio técnico durante os experimentos, por terem
tornado esses momentos mais leves e agradáveis durante as madrugas!
As minhas Bruxinhas Johanna Leiva Revilla, Denise Damasceno Guerreiro, Érica Suzane
Leal e Andréa Moreira por toda a amizade e companheirismo nos momentos difíceis e pelos
bons momentos que passamos juntas!
Ao grupo religioso formado por professores e colegas do laboratório (grupo espírita), onde
encontrei equilíbrio, sabedoria e força!
A toda equipe do Lamofopa, que contribuíram direta ou indiretamente, por toda a amizade e
carinho.
Enfim, a todos vocês, meu muito obrigada!
7
RESUMO
O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito de diferentes concentrações de insulina, sozinha ou
associada a concentrações fixa ou crescentes de FSH no cultivo in vitro de folículos préantrais caprinos isolados. Folículos secundários foram cultivados individualmente durante 18
dias em meio de base contendo 50 ng/mL de GH suplementado com insulina em baixa
concentração (INS-LW: 10 ng/mL) ou alta concentração (INS-HG: 10 µg/mL) sozinha ou
associada ao FSH em concentrações fixa (FSH100: 100 ng/mL) ou crescentes (FSH-SEQ: 100
ng/mL, dias 0 ao 6; 500 ng/mL, dias 6 ao 12; 1000 ng/mL, dias 12 ao 18 ). Após o cultivo, os
seguintes pontos foram avaliados: morfologia e taxas de crescimento folicular, formação de
antro, produção de estradiol (E2), expressão do mRNA para os genes para FSHR, GHR, INSR,
CYP19A1, CYP17, 3ßHSD, bem como as taxas de viabilidade e de maturação oocitária. O
tratamento INS-LW mostrou uma taxa mais elevada (P < 0,05) de folículos normais no dia 18
de cultivo. No entanto, aumento global (P < 0,05) no crescimento folicular, diâmetro oocitário
e taxa de retomada da meiose foram obtidos utilizando INS-HG+FSH100. Os tratamentos
INS-HG e INS-HG+FSH100 apresentaram maiores níveis de produção de estradiol e dos
níveis de mRNA para CYP19A1, CYP17, 3ßHSD quando comparado aos tratamentos INS-LW
e INS-LW+FSH100. Em conclusão, na presença de GH, o meio básico suplementado com 10
µg/mL de insulina e 100 ng/mL de FSH durante todo o período de cultivo, melhorou o
crescimento folicular e oocitário, a retomada da meiose oocitária e a produção de E2 a partir
de foliculos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro.
Palavras-chave: Cabra. Desenvolvimento follicular. Maturação oocitária. Hormônios.
Esteroidogênese.
8
ABSTRACT
The aim of this study was to evaluate the effect of different insulin concentrations, alone or
associated with either a fixed FSH concentration or increasing FSH concentrations on in vitro
culture of isolated goat preantral follicles. Secondary follicles were individually cultured for
18 days in a basic medium containing 50 ng/mL GH supplemented with low insulin
concentration (INS-LW: 10 ng/mL) or high insulin concentration (INS-HG: 10 µg/mL) alone
or with a fixed FSH concentration (FSH100: 100 ng/mL) or with increasing FSH
concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL
days 12 to 18). After culture the following end points were evaluated: follicle morphology and
growth rates, antrum formation, , estradiol (E2) production, gene expression for FSHR, GHR,
INSR, CYP19A1, CYP17, 3ßHSD as well as oocyte viability and maturation. INS-LW
treatment showed a higher (P < 0.05) incidence of normal follicles at day 18 of culture.
However, overall higher (P < 0.05) follicular growth, oocyte diameter and meiotic resumption
rates were obtained using INS-HG + FSH 100. INS-HG and INS-HG+FSH100 showed higher
E2 production and mRNA levels for CYP19A1, CYP17, 3ßHSD when compared to INS-LW
and INS-LW+FSH100. In conclusion, in presence of GH, a basic medium supplemented with
10 µg/mL insulin and 100 µg/mL FSH throughout the culture period, improved follicular and
oocyte growth, oocyte meiotic resumption and E2 production from isolated preantral caprine
follicles cultured in vitro.
Keywords: Goat. Follicle development. Oocyte maturation. Hormones. Steroidogenesis.
9
LISTA DE FIGURAS
Revisão de Literatura
Figura 1-
Ilustração do ovário de mamíferos e suas estruturas. Adaptado de
http://www.tarleton.edu/Departments/anatomy/ovary.html...................... 18
Figura 2-
Esquema ilustrativo da formação dos oócitos e folículos, destacando a
relação dos processos de oogênese e foliculogênese na maioria dos
mamíferos. LH, horônio luteinizante; MCI, massa celular interna........... 20
Figura 3-
Ilustração caracterizando a morfologia de folículos ovarianos préantrais (A, B e C) e antrais (D e E). (A) folículo primordial; (B)
folículo primário; (C) folículo secundário; (D) folículo terciário; (E)
folículo pré-ovulatório. 1. Oócito; 2. Células da granulosa; 3. Zona
pelúcida; 4. Células da teca; 5. Células da teca interna; 6. Células da
teca externa; 7. Antro; 8. Células do cumulus; 9. Lâmina basal............... 21
Figura 4-
A) Ilustração de um folículo de Graaf. Co, cumulus oophorus; Ge,
epitélio germinativo; Lf, líquido folicular; Mg, membrana granulosa;
Te, teca externa; Ti, teca interna. (B) Estrutura da parede do folículo de
Graaf mostrando como as células granulosas são privadas de um
suprimento sanguíneo pela membrana basal............................................. 23
Capítulo 1
Figure 1-
Percentage of antrum formation in caprine preantral follicles cultured
with insulin (INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the
absence or presence of FSH administered in a fixed concentration
(FSH100: 100 ng/mL) or increasing concentrations (FSH-SEQ: 100
ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to
18) for 18 days. Regardless the treatment all culture media contained
50 ng/mL GH. A - B: Differs significantly among treatments within the
same culture period (P < 0.05). a – b: Differs significantly among
culture periods within the same treatment (P < 0.05)…………………...
Figure 2-
45
Mean (± SEM) estradiol production (ng/mL) after culture medium of
caprine preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/mL or
INS-HG: 10 µg/mL), in the absence or presence of FSH administred in
a
fixed
concentration
(FSH100:
100
ng/mL)
or
increasing
concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 48
10
to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) and GH (50 ng/mL). Regardless the
treatment all culture media contained 50 ng/mL GH. A – C: Differs
significantly among treatments within the same culture period (P <
0.05). a – b: Differs significantly among culture periods within the
same treatment (P < 0.05)……………………………………………….
Figure 3-
Relative mean (± SEM) expression of mRNA of FSHR (A), INSR (B),
and GHR (C) in caprine preantral follicles cultured with insulin (INSLW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the absence or presence of
FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/mL) or
increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500
ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) for 18 days.
Regardless the treatment all culture media contained 50 ng/mL GH.
Different letters denote significant differences (P < 0.05)……………… 49
Figure 4-
Relative mean (± SEM) expression of mRNA of 3βHSD (A), CYP19A1
(B), and CYP17 (C) in caprine preantral follicles cultured with insulin
(INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the absence or
presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100
ng/mL) or increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to
6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) for 18 days.
Regardless the treatment all culture media contained 50 ng/mL GH.
Different letters denote significant differences (P < 0.05)........................ 50
11
LISTA DE TABELAS
Table 1-
Oligonucleotide primers used for PCR analysis of goat follicles………...
Table 2-
Percentage of morphologically intact and extruded preantral follicles
43
cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the
absence or presence of FSH administered in a fixed concentration
(FSH100: 100 ng/mL) or in increasing concentrations (FSH-SEQ: 100
ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18)
for 18 days………………………………………………………………... 45
Table 3-
Mean (± SEM) diameter (µm) and follicular growth rate (µm) of caprine
preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG:
10 µg/mL), in the absence or presence of FSH administered in a fixed
concentration (FSH100: 100 ng/mL) or in increasing concentrations
(FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000
ng/mL days 12 to 18) for 18 days………………………………………...
Table 4-
46
Meiotic stages of caprine oocytes from preantral follicles cultured with
insulin (INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the absence or
presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100
ng/mL) or in increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to
6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) for 18 days…….
Table 5-
47
Mean (± SEM) diameter (µm) of oocytes matured in vitro and oocyte
recovery rate from caprine preantral follicles cultured with insulin (INSLW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the absence or presence of
FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/mL) or in
increased concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500
ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) for 18 days……………
47
12
LISTA DE ABREVIAÇÕES
BSA
Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina)
°C
Graus Celsius
cDNA
Complementary DNA (DNA Complementar)
CGs
Células da granulosa
CGPs
Células germinativas primordiais
Calceína - AM
Calceína acetoximetil
CAPES
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CNPq
Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico
CO2
Carbon dioxide (Dióxido de Carbono)
CYP17
Cytochrome P450 17-alpha hydroxylase
CYP19A1
(Aromatase)
COCs
Cumulus–oocyte complexes (Complexos cumulus-oócito)
D0/D6/D12/D18
Day 0/ day 6/ day 12 /day 18 (Dia 0/ dia 6/ dia 12/ dia 18)
DNA
Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucleico)
Dr.
Doctor (Doutor)
Dra.
Doctor (Doutora)
E2
Estradiol
EGF
Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal)
FGF
Fibroblast growth factor (Fator de crescimento de fibroblastos)
FOPA
Folículo pré-antral
FSH
Follicle Stimulating Hormone (Hormônio Folículo Estimulante)
FSH100
100 ng/mL FSH
FSH-SEQ
increasing FSH concentrations (FSH em concentrações crescentes)
FSHR
Receptor for FSH (Receptor para FSH)
G
Gauge
GDF-9
Growth differentiation factor 9 (Fator de crescimento e diferenciação-9)
GH
Growth hormone (Hormônio do crescimento)
GHR
Receptor for GH (Receptor para GH)
GV (VG)
Germinal vesicle (Vesícula germinal)
h
Horas
IGF-I
Insulin-like growth factor-I (Fator de crescimento semelhante à insulina-I)
INS
Insulin (Insulina)
13
INS-HG
High insulin concentration (alta concentração de insulina)
INS-LW
Low insulin concentration (baixa concentração de insulina)
INSR
Receptor for insulin (Receptor para insulina)
IVC (CIV)
In vitro culture (Cultivo in vitro)
IVF (FIV)
In vitro fertilization (Fertilização in vitro)
IVM (MIV)
In vitro maturation (Maturação in vitro)
kg
Quilograma
LH
Luteinizing hormone (Hormônio Luteinizante)
LAMOFOPA
Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Pré-Antrais
M
Molar
MEM
Minimal essential medium (Meio essencial mínimo)
Mm
mili-molar
mm
milímetro
mg
Miligrama
MI
Metaphase I (Metáfase I)
MII
Metaphase II (Metáfase II)
MCI
Massa celular interna
min
Minutos
mL
Mililitro
MOIFOPA
Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais
mRNA
Messenger ribonucleic acid (Ácido ribonucléico mensageiro)
ng
Nanograma
P < 0.05
Probabilidade de erro menor do que 5%
p.
Página
PBS
Phosphate buffered saline
PCR
Polymerase Chain Reaction (Reação em cadeia da polimerase)
pg
Picograma
PH
potencial hidrogeniônico
PPGCV
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
PPIA
Peptidylprolyl Isomerase A
qPCR
Quantitaive PCR
RENORBIO
Rede Nordeste de Biotecnologia
RIA
Radioimmunoassay (radioimunoensaio)
rFSH
Recombinant FSH (FSH recombinante)
14
RT-PCR
Real time PCR (PCR em gtempo real)
SAS
Statistical analysis system (Sistema de análise estatística)
s
Second (Segundo)
SEM
Standard error of means (Erro padrão da média)
T4
Tiroxina 4
TCM-199
Tissue culture medium (Meio de cultivo tecidual- 199)
U
Unidade
UECE
Universidade Estadual do Ceará
VGBD
Germinal vesicle breakdown (Quebra da vesícula germinal)
α-MEM
Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa)
μg
Microgramas
μL
Microlitro
μm
Micrômetro
µM
Micromolar
3βHSD
3β-hydroxysteroid dehydrogenase
2D
Bidimensional
3D
Tridimensional
%
Porcentagem
~
Aproximadamente
<
Menor
=
Igual
>
Maior
≥
Maior ou igual
+
Mais
±
Mais ou Menos
15
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO........................................................................................................
16
2
REVISÃO BIBLIORÁFICA...................................................................................
17
2.1
Ovário dos mamíferos................................................................................................
17
2.2
Oogênese e foliculogênese.........................................................................................
18
2.3
Folículos ovarianos....................................................................................................
20
2.4
População e atresia folicular......................................................................................
23
2.5
MOIFOPA.................................................................................................................
24
2.6
Cultivo in vitro de folículos pré-antrais.....................................................................
24
2.7
Insulina.......................................................................................................................
26
2.8
Hormônio folículo estimulante (FSH)........................................................................
26
2.9
Hormônio do crescimento (GH).................................................................................
28
3
JUSTIFICATIVA.....................................................................................................
29
4
HIPÓTESES CIENTÍFICAS..................................................................................
31
5
OBJETIVOS.............................................................................................................
32
5.1
Objetivo geral.............................................................................................................
32
5.2
Objetivos específicos..................................................................................................
32
6
CAPÍTULO 1............................................................................................................
33
7
CONCLUSÃO..........................................................................................................
61
8
PERSPECTIVAS.....................................................................................................
62
REFERÊNCIAS.......................................................................................................
63
16
1
INTRODUÇÃO
O desenvolvimento folicular depende de uma sequência complexa de interações
celulares. No decorrer do desenvolvimento, o folículo pode atingir diversos estágios, desde
pré-antral até folículo pré-ovulatório. No entanto, a maioria desses folículos morre em
decorrência do processo de atresia (NAYUDU & OSBORN, 1992). Neste sentido, diversas
biotecnologias vêm sendo desenvolvidas como alternativas para recuperar os folículos antes
do processo de atresia. Dentre essas biotécnicas, a manipulação de oócitos inclusos em
folículos ovarianos pré-antrais (MOIFOPA) é uma dessas alternativas, uma vez que folículos
são destinados ao cultivo in vitro (CIV), seguido da maturação e da fecundação in vitro (FIV)
dos oócitos. Dentre os sistemas para cultivo folicular, pode-se destacar o cultivo de folículos
isolados do córtex ovariano, o qual, além de possibilitar o acompanhamento individual dos
folículos, permite uma maior perfusão do meio durante o cultivo (ABIR et al., 2006).
Além do sistema de cultivo utilizado, a composição do meio é um fator chave para
promover o desenvolvimento de folículos ovarianos pré-antrais in vitro a estágios mais
avançados (PENG et al., 2010). Sabe-se que os folículos podem ser potencialmente
influenciados pelos fatores de crescimento e hormônios produzidos pelas células do estroma,
por outros folículos ou por eles mesmos (Fortune, 2003). Essas substâncias exercem
importantes papeis no controle da foliculogênese inicial, atuando na ativação (SKINNER,
2005), no crescimento (OJEDA et al., 2000), na esteroidogênese (GREISEN et al., 2001), na
inibição da atresia folicular (FORTUNE, 2003) e no estímulo à competência oocitária
(ARAÚJO et al., 2011). Dentre os hormônios que podem potencialmente influenciar o
crescimento e desenvolvimento folicular in vitro, destacam-se a insulina (INS), o hormônio
folículo estimulante (FSH) e o hormônio do crescimento (GH).
Baseado em estudos in vitro, a utilização de FSH, adicionado em momentos
específicos do cultivo e de forma progressiva (100 ng/mL, do dia 0 ao 6; 500 ng/mL do dia 6
ao 12; 1000 ng/mL, do dia 12 ao 18) combinada à insulina na concentração 10 µg/mL
promoveu melhores taxas de sobrevivência, de formação de antro, de crescimento e de
retomada da meiose no cultivo de folículos pré-antrais isolados caprinos, (SARAIVA et al.,
2011). A adição de GH (50 ng/mL) ao meio de cultivado mencionado anteriormente resultou
na produção do primeiro embrião caprino a partir de folículo pré-antral crescido in vitro,
sendo o melhor resultado reportado na literatura para a espécie caprina até o momento
(MAGALHÃES et al., 2011). Em ambos estudos anteriores, a insulin foi utilizada em altas
concentrações (10 µg/mL). No entanto, em outro estudo, a adição de baixas concentrações de
17
insulina (10 ng/mL) mostrou-se mais eficaz na manutenção da sobrevivência e na promoção
do desenvolvimento folicular e na da retomada da meiose (CHAVES et al., 2012). Embora a
insulina, o FSH e o GH tenham sido utilizados no cultivo in vitro de folículos pré-antrais
caprinos, o equilíbrio adequado das concentrações de insulina e do FSH em meio de cultivo
contendo GH ainda permanece desconhecido.
Tendo em vista a importância do presente estudo, a revisão de literatura a seguir
abordará aspectos relacionados ao (à): ovário dos mamíferos, oogênese e foliculogênese,
folículos ovarianos, população e atresia folicular, MOIFOPA, cultivo in vitro de folículos préantrais, insulina (INS), hormônio folículo estimulante (FSH) e hormônio do crescimento
(GH).
2
REVISÃO DE LITERATURA
2.1 O ovário dos mamíferos
O ovário da maioria dos mamíferos está dividido em duas regiões: 1) medular,
localizada na porção mais interna; 2) cortical, localizada na porção mais externa (Fig. 1)
(NASCIMENTO et al., 2008). Externamente, o córtex ovariano está circundado por epitélio
germinativo. No córtex ovariano estão presentes os folículos ovarianos e/ou corpos lúteos em
vários estágios de desenvolvimento. A medula ovariana, por sua vez, é composta por tecido
conjuntivo fibroelástico, nervos e vasos sanguíneos e linfáticos (HAFEZ, 2004). Esta
distribuição ocorre na maioria dos mamíferos. Entretanto, a égua tem a particularidade de
apresentar a inversão entre essas duas regiões, de modo que o córtex está situado mais
internamente e a medula, externamente (NASCIMENTO et al., 2008).
O ovário exerce duas importantes funções fisiológicas: 1) gametogênica, liberação
de oócitos maturos (ovulação) aptos a serem fecundados (BARNETT et al., 2006) e 2)
endócrina, produção de hormônios, fatores de crescimento e peptídeos (HIRSHFIELD, 1991).
Outra função importante exercida pelos folículos está relacionada à manutenção da
viabilidade oocitária, assegurando o crescimento e a maturação dos oócitos.
18
Túnica
albugínea
Corpo lúteo
(copo albicans)
Oócito
Células da
granulosa
Folículo
secundário
Mesovário e
vasos sanguíneos
Folículo Córtex
primário
Folículo de Graaf
Epitélio
germinativo
Folículo
primordial
Antro
Oócito
Zona
pelúcida
Ligamento
do
ovário
Teca
Medula
Oócito
ovulado
Corpo lúteo
Desenvolvimento
Corpo lúteo
Figura 1. Ilustração do ovário de mamíferos e suas estruturas. Adaptado de
http://www.tarleton.edu/Departments/anatomy/ovary.html
2.2 Oogênese e foliculogênese
A oogênese pode ser definida pelo processo de formação e de diferenciação das
células germinativas primordiais (CGP) da fêmea até a formação do oócito haplóide
fecundado (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005).
A quantidade de oócitos presentes nos ovários adultos origina-se a partir de um
número definido de CGP que são derivadas da massa celular interna do blastocisto durante o
desenvolvimento embrionário (PICTON, 2000). O blastocisto é constituído pelo trofoblasto e
pelo botão embrionário. O botão embrionário dará origem ao ectoderma, mesoderma e
endoderma. O saco vitelínico tem origem a partir do endoderma, que, por sua vez, dará
origem às CGP. Estas se multiplicam por mitose e diferenciam-se em oogônias
(FIGUEIREDO et al., 2008). A população de oogônias se expande através de um número prédeterminado, espécie específica, de divisões mitóticas até que as células entrem em meiose e
tornem-se os oócitos primários. Na primeira divisão meiótica das oogônias, estas estão
localizadas nas zonas mais internas do córtex ovariano e durante o desenvolvimento seguem
para zonas mais externas. Após o início da meiose, os oócitos primários progridem para as
fases de leptóteno, zigóteno e paquíteno até atingir a fase de diplóteno, da primeira divisão
meiótica. Ocorre um aumento no tamanho das células à medida que o desenvolvimento do
oócito progride à fase de diplóteno. Várias alterações importantes ocorrem no oócito primário:
19
recombinação do material genético materno e paterno; polarização nuclear de organelas, que é
essencial para o metabolismo do oócito, dependente da atividade dos microtúbulos. Após essa
reorganização, no estádio de diplóteno da prófase I, ocorre a primeira interrupção da divisão
meiótica, em que os oócitos permanecem em vesícula germinativa (VG) até a puberdade
(PICTON, 2000). O início da meiose nos oócitos coincide com o início da foliculogêse, que
compreende a formação, o crescimento e a maturação folicular, tendo início desde a formação
do folículo primordial e culminando com o folículo maturado ou pré-ovulatório. Quando o
animal atinge a puberdade, com o pico do FSH e do hormônio luteinizante (LH), os oócitos
crescidos retomam a meiose e o núcleo sai de VG para diacinese. Em seguida, inicia-se o
processo de rompimento da VG, quando ocorrerá a expulsão do primeiro corpúsculo polar,
resultando na formação do oócito secundário e ocorrendo a segunda parada da meiose. O
oócito retomará a meiose somente se for fecundado (FIGUEIREDO et al., 2008).
20
Oogônia
Figura 2. Esquema ilustrativo da formação dos oócitos e folículos, destacando a relação dos
processos de oogênese e foliculogênese na maioria dos mamíferos. LH, hormônio
luteinizante; MCI, massa celular interna.
2.3 Folículos ovarianos
O folículo é considerado a unidade morfofuncional do ovário e é constituído por
um oócito circundado por células somáticas (células da granulosa e da teca).
21
Os folículos podem ser classificados, de acordo com o grau de desenvolvimento,
em folículos pré-antrais ou não cavitários e em folículos antrais ou cavitários (FIGUEIREDO
et al., 2008) (Fig. 3).
Figura 3. Ilustração caracterizando a morfologia de folículos ovarianos pré-antrais (A, B e C)
e antrais (D e E). (A) folículo primordial; (B) folículo primário; (C) folículo secundário; (D)
folículo terciário; (E) folículo pré-ovulatório. 1. Oócito; 2. Células da granulosa; 3. Zona
pelúcida; 4. Células da teca; 5. Células da teca interna; 6. Células da teca externa; 7. Antro; 8.
Células do cumulus; 9. Lâmina basal. Fonte: www.embryology.ch/anglais
2.3.1 Folículos pré-antrais
Os folículos pré-antrais constituem o pool de reserva ovariano não renovável, que
será utilizado ao longo da vida reprodutiva da fêmea (SILVA-SANTOS et al., 2011). O
desenvolvimento folicular inicia quando um pool de folículos primordiais sai do estádio de
quiescência (fase diplóteno da prófase I) e são recrutados a crescerem de forma gradual e
contínua. Esta fase de desenvolvimento folicular inicial é independendente das gonadotrofinas
hipofisárias. Ainda que folículos nesta fase inicial de desenvolvimento possam expressar o
receptor de FSH, no entanto, as gonadotrofinas não parecem ser essenciais para o crescimento
folicular inicial (THOMAS et al., 2003). Os folículos ovarianos pré-antrais são representados
pelos folículos primordiais, de transição, primários e secundários, que podem ser
diferenciados entre si pela forma e pelo número de camadas de células da granulosa que
envolve o oócito imaturo.

Folículos primordiais: representam 95% da totalidade da população folicular
ovariana; são os menores folículos, constituídos por um oócito quiescente, imaturo
e circundado por uma camada de células da granulosa de morfologia pavimentosa
(SILVA, 2005) (Fig. 3A). O núcleo do oócito é relativamente grande e ocupa uma
22
posição central. O pool de folículos primordiais é mantido em quiescência até que
ocorra a ativação folicular (KIM, 2012).

Folículos de transição: a mudança na morfologia das células da granulosa (CG) de
pavimentosa para cúbica, marca a ativação folicular dando início ao
desenvolvimento de folículos primordiais (HIRSHFIELD, 1991). Esta fase de
transição entre os estádios primordial e primário dá origem a folículos com CG
pavimentosas e cúbicas, caracterizando o folículo de transição (FORTUNE et al.,
2003).

Folículos primários: caracterizam-se por apresentarem uma única camada de
células cúbicas da granulosa circundando o oócito imaturo (SILVA, 2005) (Fig.
3B).

Folículos secundários: caracterizam-se com o desenvolvimento de uma segunda
camada de CG, progride através da proliferação de até seis ou sete camadas e
termina com o início do desenvolvimento de uma cavidade antral (FORTUNE et
al., 2003) (Fig. 3C). A partir de estádios mais avançados, pode ocorrer a presença
de células da teca (CT) e, também, pode ser visualizada a zona pelúcida
(FIGUEIREDO et al., 2008).
2.3.2 Folículos antrais
Os folículos são denominados antrais quando ocorre uma intensa proliferação de
células da granulosa formando uma cavidade preenchida por fuido chamada de antro
(FIGUEIREDO et al., 2008). O fluido antral é um composto rico em substâncias reguladoras
derivadas do sangue ou das secreções das células foliculares, como por exemplo,
gonadotrofinas, esteroides e fatores de crescimento. A produção desse fluido é intensificada
pelo aumento da vascularização folicular e permeabilidade dos vasos sanguíneos, que
ocorrem com o desenvolvimento do folículo (VAN DEN HURK & ZHAO, 2005).
No estádio antral, as células da granulosa são diferenciadas em células do cumulus
(mais próximas ao oócito) e células murais (mais afastadas do oócito) (FIGUEIREDO et al.,
2008), também as células da teca começam a se diferenciar das células circundantes do
estroma (THOMAS et al., 2003). Quando este estádio é alcançado, os folículos se tornam
dependentes das gonadotrofinas para um maior crescimento e desenvolvimento folicular
(NAYUDU & OSBORN, 1992). Em pequenos folículos antrais, as células da teca expressam
enzimas envolvidas na biossíntese de não há expressão de mRNA para aromatase nas CG
desses pequenos folículos antrais. Isso pode indicar que a progesterona e andrógenos e
23
estrógenos não são os principais hormônios esteróides formados pelos primeiros folículos
antrais (VAN DEN HURK et al., 2005).
Os folículos antrais podem ser subdivididos em duas classes: 1) terciários (Fig.
3D), que ainda possuem o oócito imaturo; 2) pré-ovulatório ou de Graaf (Fig. 3E; Fig. 4), que,
na maioria das espécies, contém um oócito maturado (FIGUEIREDO et al., 2008).
A
B
Figura 4. A) Ilustração de um folículo de Graaf. Co, cumulus oophorus; Ge, epitélio
germinativo; Lf, líquido folicular; Mg, membrana granulosa; Te, teca externa; Ti, teca interna.
(B) Estrutura da parede do folículo de Graaf mostrando como as células granulosas são
privadas de um suprimento sanguíneo pela membrana basal.
2.4 População e atresia folicular
O número de folículos ovarianos é bastante variável entre as espécies, podendo
variar de milhares (1.500 na camundonga: SHAW et al., 2000; 35.000 na cabra: LUCCI et al.,
1999; 160.000 na ovelha: DRIANCOURT, 2001; 235.000 na vaca: BETTERIDGE et al.,
1989) à milhões (2.000.000 na mulher: ERICKSON, 1986).
O ovário das fêmeas dos mamíferos apresenta, ao nascerem, milhares de folículos
primordiais que têm o potencial de serem utilizados para a produção in vitro de embriões em
larga escala. No entanto, a maioria desses folículos (99,9%) não chega a ovular, sendo
eliminados por um processo natural conhecido como atresia folicular, seja por via
degenerativa e/ou apoptótica (FIGUEIREDO et al., 2008).
As células envolvidas no mecanismo de apostose são na maioria GC; no entanto,
CT ocasionalmente também sofrem apoptose. Folículos antrais iniciais são mais susceptíveis
a sofrer atresia do que folículos pré-antrais (DANILOVISH et al., 2000).
24
Diversos fatores e hormônios adicionados ao meio de cultivo in vitro vêm sendo
estudados, visando reduzir a atresia folicular em diversos estádios de desenvolvimento.
2.5 MOIFOPA
A manipulação de oócitos inclusos em folículos ovarianos pré-antrais
(MOIFOPA) é uma biotécnica da reprodução que vem sendo desenvolvida como alternativa
para a recuperação de folículos pré-antrais (FOPAs), visando à obtenção de um grande
número de oócitos competentes para a produção de embriões, bem como poderá contribuir
com importantes aplicações para a pesquisa fundamental. Esta biotécnica consiste no
isolamento, conservação (resfriamento e criopreservação) e cultivo in vitro (CIV) de folículos
pré-antrais e, posteriormente, os oócitos poderão ser utilizados na maturação in vitro (MIV) e
na fecundação in vitro (FIV) (FIGUEIREDO et al., 2008).
Até o presente momento, o resultado mais promissor proveniente dessa biotécnica
foi o nascimento de crias vivas na espécie murina (O´BRIEN et al., 2003). No entanto, nas
espécies domésticas, apenas um número restrito e variável de embriões têm sido relatado
(suíno: WU et al., 2007; bubalino: GUPTA et al., 2008; ovino: ARUNAKUMARI et al.,
2010, LUZ et al., 2012; caprino: MAGAHÃES et al., 2011). Embora esses resultados sejam
promissores, estudos acerca dos fatores e processos que afetam o desenvolvimento dos
folículos pré-antrais são imprescindíveis para aumentar as taxas de produção in vitro de
embriões.
2.6 Cultivo in vitro de folículos pré-antrais
Uma variedade de métodos foi desenvolvida para a manutenção e/ou crescimento
de folículos pré-antrais in vitro (FORTUNE et al., 2003). O sistema de cultivo e a composição
do meio são fatores fundamentais para promover o desenvolvimento durante o cultivo in vitro
de folículos ovarianos pré-antrais a estágios mais avançados (PENG et al., 2010).
Diferentes sistemas de cultivo têm sido desenvolvidos para manter a viabilidade e
promover o crescimento de folículos pré-antrais in vitro (VAN DEN HURK et al., 2000).
Podemos citar dois sistemas de cultivo utilizados na MOIFOPA: 1) cultivo de fragmentos de
córtex ovariano ou do ovário inteiro, que apresenta como vantagens a facilidade para executar
este modelo experimental, a manutenção da integridade estrutural do tecido e das interações
entre as células do estroma circundante com os folículos; 2) cultivo de folículos isolados, que
além de possibilitar o acompanhamento individual durante o cultivo, permite uma maior
perfusão do meio para o folículo (ABIR et al., 2006). O sistema de cultivo em fragmento
25
ovariano ou do órgão inteiro é importante para o estudo de fatores que podem afetar a
ativação e o desenvolvimento folicular, sendo que ovários murinos são suficientemente
pequenos e, por esse motivo, cultivados inteiros; em contraste, ovários dos mamíferos
domésticos são grandes e, portanto, cultivados em fragmentos do córtex ovariano (FORTUNE
et al., 2003). Em relação ao sistema de cultivo do tipo isolado, este pode ser realizado de duas
formas: 1) bidimensional (2D), quando o folículo se desenvolve sobre a própria placa de
cultivo ou sobre uma matriz extracelular, como por exemplo, de colágeno (DEMEESTERE et
al., 2005); 2) tridimensional (3D), quando o folículo se desenvolve encapsulado em gota de
alginato (XU et al., 2010). Avanços no sistema de cultivo 3D também fornecem um modelo
para estudar os índices de desenvolvimento folicular individualmente, caracterizando a função
endócrina e a parácrina sobre o crescimento folicular e a maturação oocitária (XU et al.,
2010). Outra estratégia de cultivo pode ser realizada em dois passos: inicialmente ocorre a
ativação e o desenvolvimento folicular no sistema de cultivo em fragmento do córtex
ovariano; em seguida, os folículos são isolados a partir desses fragmentos e cultivados
isoladamente (O’BRIEN et al., 2003).
Ainda, em alguns estudos de cultivo in vitro de folículos pré-antrais, tem sido
utilizado o sistema de cultivo com co-cultivo em animais domésticos como suínos (WU et al.,
2001), bubalinos (GUPTA et al., 2008) e caprinos (DUARTE et al., 2011). O cultivo de
FOPA em grupo ou co-cultivados com células do cumulus, da granulosa e mesenquimais
ovarianas demonstrou efeito benéfico sobre o desenvolvimento folicular (GUPTA et al.,
2008; DUARTE et al., 2011). Podem ocorrer interações através das vias endócrina, da
parácrina e da autócrina entre os grupos de folículos na mesma fase de desenvolvimento,
estabelecendo diferenças que estimulem ou que inibam o crescimento uns dos outros
(BAKER, 1999).
A composição do meio é um importante fator para a obtenção de sucesso durante
o cultivo de folículos pré-antrais in vitro. Sabe-se que os folículos podem ser potencialmente
influenciados por fatores de crescimento produzidos pelas células do estroma e por outros
folículos, ou por fatores produzidos dentro dos próprios folículos (hormônios e fatores de
crescimento) (FORTUNE, 2003). Assim, diversos autores têm investigado o efeito de vários
componentes no cultivo in vitro de folículos pré-antrais, tanto de animais de laboratório como
de animais domésticos. Desta forma, a avaliação do efeito de hormônios como, por exemplo,
a insulina, o FSH e o GH, sobre o crescimento e a maturação oocitária poderá contribuir para
uma melhor compreensão da foliculogênese.
26
2.7 Insulina
A insulina é produzida na porção endócrina do pâncreas, organizada como
discretas ilhotas (ilhotas de Langerhans), que contêm quatro tipos de células para a síntese de
diferentes hormônios. As células Beta (β) são as mais numerosas e as responsáveis pela
produção de insulina. Este hormônio é uma proteína que consiste em duas cadeias de
aminoácidos, designadas A e B, contendo 21 e 30 aminoácidos, respectivamente, sendo
ligadas por duas pontes dissulfeto. Embora haja algumas diferenças na composição de
aminoácidos ente as espécies de mamíferos, essas diferenças são pequenas; como resultado,
as atividades biológicas da insulina não são altamente espécie-específica (CUNNINGHAM,
2008).
Receptores de insulina estão expressos em quase todos os tecidos dos mamíferos,
inclusive no estroma e nas células foliculares ovarianas (EL-ROEIY et al., 1993). A
expressão de receptores de insulina (INSR) é regulada por ação hormonal e pode agir como
uma resposta de sinalização intracelular em GC durante o desenvolvimento folicular bovino,
bem como o sistema insulina-receptor pode suportar o desenvolvimento de folículos préovulatórios (SHIMIZU et al., 2008). Além disso, a interação do FSH com a insulina
influencia positivamente a expressão do mRNA para INSR no cultivo in vitro de folículos préantrais caprinos (CHAVES et al., 2012).
A insulina além de participar da regulação da glicose também participa de outros
mecanismos celulares, como o transporte de aminoácidos, o metabolismo lipídico e a síntese
proteica (CHEATHAM & KHAN, 1995). A insulina promove o desenvolvimento folicular e
proporciona benefícios à maturação oocitária durante o cultivo in vitro de folículos pré-antrais
caprinos (CHAVES et al., 2011). A ação desse hormônio foi capaz de manter a viabilidade e a
morfologia de folículos humanos cultivados in vitro (LOUHIO et al., 2000), além
de
promover o desenvolvimento folicular em caprinos (CHAVES et al., 2012) e em bovinos
(ITOH et al., 2008). Além disso, a associação de insulina às gonadotropinas (FSH e LH)
exerce uma ação sinérgica, promovendo a formação do antro e o crescimento folicular em
macacos rhesus (XU et al., 2010), em cabras (SARAIVA et al., 2011) e em vacas (ITOH, et
al., 2008); bem como o crescimento oocitário e a proliferação de células da granulosa e da
teca em vacas (ITOH, et al. , 2008).
2.8 Hormônio folículo estimulante
O hormônio folículo estimulante (FSH), assim como o hormônio luteinizante
(LH), são gonadotrofinas produzidas na hipófise (adenohipófise). Esses hormônios exercem
27
uma ação sinérgica no desenvolvimento folicular e na ovulação. Enquanto o papel do FSH é
mais dominante durante o crescimento folicular, o LH passa a ter maior desempenho durante
os estádios finais da maturação folicular (CUNNINGHAM, 2008).
Os receptores para FSH (FSHR) são do tipo acoplado à proteína G, sendo
divididos
em
três
domínios
(extracelular,
transmembranário
e
intramembranário)
(GUDERMANN et al., 1995). A expressão de mRNA para FSHR foi observada em células da
granulosa de folículos pré-antrais em crescimento logo após a ativação quanto em folículos
antrais na espécie bovina (XU et al., 1995) e em complexos cumulus-oócito (CCOs) e em
células da granulosa e da teca de pequenos folículos antrais em caprinos (SARAIVA et al.,
2011).
Folículos em estádio de desenvolvimento mais precoce são relativamente
independentes das gonadotrofinas (VAN DEN HURK et al., 2005). Em sistemas de cultivo in
vitro, o FSH exerce efeito sobre o desenvolvimento folicular, provando a responsividade in
vitro de folículos em fases iniciais a esta gonadotrofina (ADRIAENS et al., 2004). O FSH
promoveu a manutenção da sobrevivência e a proliferação de células da granulosa de folículos
pré-antrais de ratas (ADRIAENS et al., 2004) e de mulheres (WRIGHT et al., 1999). Além
disso, o FSH parece desempenhar um papel importante na atresia folicular, prevenindo a
apoptose em folículos pré-antrais e antrais (WRIGHT et al., 1999).
A combinação do FSH com outros hormônios ou fatores de crescimento pode
exercer uma ação sinérgica ou inibitória no desenvolvimento de folículos cultivados in vitro.
Quando associado à tiroxina 4 (T4), ao GH e ao fator de crescimento epidermal (EGF) no
meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais de fetos caprinos promove o crescimento, a
formação do antro e a extrusão de oócitos (Amin et al., 2013). Em outros estudos, meios que
foram suplementados com FSH em combinação com o fator de diferenciação do crescimento9 (GDF-9) ou com fator de crescimento de fibroblastos (FGF) mantiveram a sobrevivência e o
crescimento folicular, além de induzir a ativação de folículos primordiais após o cultivo de
fragmentos do córtex ovariano bovino (TANG et al., 2012). A associação das gonadotropinas
(FSH e LH) com a insulina induz a formação inicial do antro, e aumenta o diâmetro folicular
e oocitário e promove a proliferação de células da granulosa e da teca em bovinos (ITOH et
al. , 2008).
28
2.9 Hormônio do crescimento
O hormônio do crescimento (GH) é produzido pelos somatótrofos acidófilos da
hipófise anterior. Este hormônio é espécie-específica, liga-se a receptores nos tecidos-alvo
com a finalidade de promover o crescimento (CUNNINGHAM, 2008).
A presença de receptores de GH (GHR) e da proteína em COCs de pequenos e
grandes folículos antrais e em células da granulosa/teca de grandes folículos antrais caprinos
sugere o controle do GH nos estádios finais da foliculogênese. Entretanto, apesar de não ter
sido observado a presença de GHR em folículos pré-antrais (primordial, primário e
secundário), esses receptores estavam presentes nas células do estroma ao redor desses
folículos, sugerindo o controle indireto nas fases iniciais da foliculogênese através da
regulação da expressão de fatores intraovarianos de células do estroma (MARTINS et al.,
2014).
Estudos in vitro e in vivo têm revelado a importância deste hormônio durante o
desenvolvimento folicular (SIROTKIN; MAKAREVICH, 2002), induzindo o crescimento de
folículos pré-antrais murinos (LIU et al., 1998; NAKAMURA et al., 2012) e caprinos
(MARTINS et al., 2014), além de promover a maturação dos oócitos murinos (NAKAMURA
et al., 2012) e reduzir a apoptose em folículos pré-antrais em camundongos (DANILOVICH
et al., 2000). Ainda, desempenha um papel importante na proliferação de células da teca em
folículos pré-antrais isolados murinos (KOBAYASHI et al., 2000) e em células da granulosa
bovinas (LANGHOUT et al., 1991). Outra função desse hormônio é a sua ação antioxidante,
reduzindo os danos de isquemia/reperfusão em tecidos ovarianos, com base em achados
clínicos e bioquímicos (YIGITER et al., 2011). O efeito do GH combinado ao FSH no cultivo
de fragmentos ovarianos caprinos promoveu a manutenção da sobrevivência folicular e da
integridade ultra-estrutural e a ativação de folículos primordiais (MAGALHÃES-PADILHA
et al., 2012), além de modular a produção de estradiol e progesterona em células da granulosa
de ratas (NAKAMURA et al., 2012). Quando combinado à insulina estimulou a proliferação
de células da granulosa bovinas (LANGHOUT et al., 1991). Recentemente, foi descrito que a
utilização do GH no meio de maturação contendo IGF-I promoveu o desenvolvimento de
oócitos equinos cultivados in vitro (PEREIRA et al., 2012), bem como foi observada a
presença de GHR em estruturas foliculares ovarianas, mediando um efeito positivo durante a
maturação oocitária equina (PEREIRA et al., 2013).
29
3 JUSTIFICATIVA
A execução de um projeto de pesquisa se justifica pela contribuição original dos
resultados à ciência. Dessa forma, serão abordados a seguir três aspectos que justificaram a
execução deste trabalho: importânca do modelo animal, relevância e originalidade do
protocolo utilizado.
a. Escolha da espécie:
A criação de pequenos ruminantes na região Nordeste do Brasil, sobretudo da
espécie caprina, onde representam mais de 90,0% do rebanho nacional, desempenha extrema
importância socioeconômica, em função do seu importante papel na produção de carne, de
leite e de pele.
A espécie caprina pode ser utilizada como modelo experimental por apresentar
semelhanças morfofisiológicas com o ovário humano, além de contribuir para o
aperfeiçoamento de biotécnicas reprodutivas, visando maximizar o potencial reprodutivo de
animais domésticos de alto valor zootécnico ou em processo de extinção, bem como auxiliar
no tratamento de mulheres com problemas de infertilidade.
b. Relevância do protocolo:
A maturação de oócitos e a produção de embriões a partir do cultivo in vitro de
folículos pré-antrais já foram relatadas em caprinos (MAGALHÃES et al., 2011). Entretanto,
apesar de ter representado um avanço na técnica, as taxas de maturação de oócitos a partir de
folículos pré-antrais caprinos, bem como de outras espécies domésticas, são ainda muito
baixas quando comparadas a oócitos crescidos in vivo recuperadosdos a partir de folículos
antrais. Este fato pode ser devido a falhas no desenvolvimento folicular ocorridas in vitro,
bem como às condições inadequadas de maturação e de fertilização in vitro.
Na tentativa de melhorar os meios de desenvolvimento de folículos pré-antrais in
vitro, o Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-antrais
(LAMOFOPA) vem testando dezenas de hormônios e fatores de crescimento. Dentre os
vários hormônios estudados, destacam-se a insulina (INS), o hormônio folículo estimulante
(FSH) e o hormônio do crescimento (GH), que desempenham um papel importante na
regulação do desenvolvimento folicular. Baseado em estudos in vitro no cultivo de folículos
pré-antrais caprinos isolados, a utilização de FSH, adicionado em momentos específicos do
cultivo e de forma progressiva (FSH-SEQ: 100 ng/mL, do dia 0 ao 6; 500 ng/mL, do dia 6 ao
30
12; 1000 ng/mL, do dia 12 ao 18) combinada à insulina na concentração 10 µg/mL promoveu
melhores taxas de sobrevivência, de formação de antro, de crescimento e de retomada da
meiose, quando comparado à utilização do FSH em concentração fixa (100 ng/mL)
(SARAIVA et al., 2011). Com a mesma concentração de insulina (10 µg/mL) combinada com
FSH-SEQ e GH (50 ng/mL), observou-se um papel importante no crescimento in vitro e na
maturação de oócitos, culminando com a obtenção do primeiro embrião caprino
(MAGALHÃES et al., 2011). No entanto, o FSH-SEQ associado à insulina na concentração
de 10 ng/mL foi mais eficiente na manutenção da sobrevivência, no desenvolvimento folicular
e na promoção da retomada da meiose (CHAVES et al., 2012). Embora a importância da INS,
do FSH e do GH no controle da foliculogênese tenha sido bem estabelecida, os efeitos desses
hormônios quando utilizados em diferentes concentrações e combinações têm evidenciado
resultados divergentes.
c. Originalidade do protocolo:
O presente estudo demonstra, pela primeira vez, a influência da insulina e do
FSH, em diferentes concentrações e combinações, em meio contendo GH no cultivo in vitro
de folículos pré-antrais caprinos e os seus efeitos sobre a expressão relativa de mRNA para
FSHR, GHR, INSR, CYP19A1, CYP17 e 3ßHSD e sobre a produção de estradiol.
31
4
HIPÓTESES CIENTÍFICAS
Diante do exposto, foram formuladas as seguintes hipóteses científicas:

A insulina e o FSH, de forma concentração-dependente, influenciam positivamente na
manutenção da sobrevivência e no crescimento de folículos pré-antrais caprinos isolados
cultivados in vitro na presença de GH, permitindo que seus oócitos se tornem
meioticamente competentes.

A insulina e o FSH, de forma concentração-dependente, induzem a secreção de estradiol e
a expressão do mRNA para FSHR, INSR, GHR, 3βHSD, CYP17 e CYP19A1, a partir
folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro em meio contendo GH.
32
5
OBJETIVOS
5.1 Geral:

Avaliar o efeito de diferentes concentrações e combinações da insulina e do FSH em
meios de cultivo contendo GH sobre o desenvolvimento folicular e a maturação oocitária
a partir de folículos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro.
5.2 Específicos:

Estudar o efeito de diferentes concentrações da insulina na ausência ou presença do FSH
em concentração fixa ou em concentrações crescentes em meios de cultivo contendo GH
sobre:
o
a sobrevivência, formação de antro e crescimento folicular e a maturação de
oócitos de folículos pré-antrais caprinos isolados

A produção de estradiol, bem como sobre a expressão gêncica para FSHR, INSR, GHR e
para as enzimas esteroidogênicas a partir de folículos pré-antrais caprinos isolados.
33
6
CAPÍTULO 1
Balanço nas concentrações da insulina e do FSH melhora o desenvolvimento in vitro de
folículos pré-antrais caprinos isolados em meio contendo GH
Balance of insulin and FSH concentrations improves the in vitro development of isolated goat
preantral follicles in medium containing GH
Artigo submetido ao periódico: Animal Reproduction Science
Em: junho de 2015
34
Balance of insulin and FSH concentrations improves the in vitro development of isolated
goat preantral follicles in medium containing GH
A.C.A. Ferreira*, a, N.A.R. Sáa, D.D. Guerreiroa, H.H.V. Correiaa, J. Leiva-Revillaa, C.H.
Lobob, C. Masidea, V.R. Araújoa,c, G.A. Apgard, F.Z. Brandãoe, J.R. Figueiredoa, and C.C.
Campelloa
a
Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles, Faculty of Veterinary, State
University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
b
Laboratory of Animal Physiology, Department of Animal Science, Federal University of
Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
c
Professor of the Health Sciences Center, State University of Ceará, Fortaleza-CE, Brazil.
d
Professor of Department of Animal Science, Food and Nutrition, Southern Illinois
University-Carbondale, USA.
e
Associate Professor of Department of Animal Reproduction, Faculty of Veterinary, Federal
University Fluminense, Rio de Janeiro-RJ, Brazil.
*Corresponding address: A.C.A. Ferreira, Programa de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias (PPGCV), Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos PréAntrais (LAMOFOPA), Universidade Estadual do Ceará (UECE), Av. Silas Munguba, 1700,
Campus do Itaperi, Fortaleza, CE Brasil, CEP: 60740903. Tel.: +55.85. 3101.9852; Fax:
+55.85 3101.9840 E-mail: [email protected]
35
Abstract
The aim of this study was to evaluate the effect of different insulin concentrations,
alone or associated with either a fixed FSH concentration or increasing FSH concentrations on
in vitro culture of isolated goat preantral follicles. Secondary follicles were individually
cultured for 18 days in a basic medium containing 50 ng/mL GH supplemented with low
insulin concentration (INS-LW: 10 ng/mL) or high insulin concentration (INS-HG: 10
µg/mL) alone or with a fixed FSH concentration (FSH100: 100 ng/mL) or with increasing
FSH concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000
ng/mL days 12 to 18). After culture the following end points were evaluated: follicle
morphology and growth rates, antrum formation, estradiol (E2) production, oocyte viability
and maturation as well as gene expression for FSHR, GHR, INSR, CYP19A1, CYP17, 3ßHSD.
INS-LW treatment showed a higher (P < 0.05) incidence of normal follicles at day 18 of
culture. However, overall higher (P < 0.05) follicular growth, oocyte diameter and meiotic
resumption rates were obtained using INS-HG + FSH 100. INS-HG and INS-HG+FSH100
showed higher E2 production and mRNA levels for CYP19A1, CYP17, 3ßHSD when
compared to INS-LW and INS-LW+FSH100. In conclusion, in presence of GH, a basic
medium supplemented with 10 µg/mL insulin and 100 µg/mL FSH throughout the culture
period, improved follicular and oocyte growth, oocyte meiotic resumption and E2 production
from isolated preantral caprine follicles cultured in vitro.
Keywords: goat; follicle development; oocyte maturation; hormones; steroidogenesis.
36
1. Introduction
The follicular development depends upon a complex sequence of reactions within the
cells during folliculogenesis. However, most follicles cultured in vitro gradually undergo
atresia (Nayudu and Osborn, 1992). Therefore, the ultimate objective of in vitro culturing of
ovarian tissue aims to recue the preantral follicles before they become atretic in order to
culture them up to maturation for the purpose of improving the relative yield of mature
oocytes.
The composition of the culture medium is a key factor to promote the in vitro
development of preantral follicles to more advanced stages. It is well known, follicles can be
potentially influenced by growth factors and hormones produced by themselves, by stroma
cells, or by other follicles (Fortune, 2003). These substances play a key role in controlling
early folliculogenesis, acting by increasing steroidogenesis (Greisen et al., 2001), follicle
activation (Ojeda et al, 2000; Martins et al., 2008; Celestino et al., 2010), growth (Skinner,
2005; Magalhães et al., 2009), inhibition of follicular atresia (Fortune, 2003), and stimulating
oocyte competence (Araújo et al., 2011). Among the various hormones studied, it is important
to highlight the influence of insulin, follicle-stimulating hormone (FSH) and growth hormone
(GH).
The in vitro survival, antrum formation, growth and oocyte meiotic resumption rates
of isolated goat preantral follicles were improved in a medium supplemented with increasing
FSH concentration (from 100 to 1000 ng/mL) or in the presence of high insulin concentration
(10 µg/mL) (Saraiva et al., 2011). The addition of 50 ng/mL of GH, to the latter mentioned
medium resulted in the production of the first caprine embryo from preantral follicles grown
in vitro and marks the greatest result reported in the literature for caprine species so far
(Magalhães et al., 2011). However, it has been recently reported that the addition of lower
concentrations of insulin (10 ng/mL) proved to be more efficient in maintaining survival,
37
promoting follicular development and meiosis resumption when the culture was performed
with increasing FSH concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6
to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) (Chaves et al., 2012). Although insulin, FSH and GH have
been commonly used for the in vitro culture of caprine preantral follicle, the suitable balance
of insulin and FSH concentration in medium containing GH is not known. Therefore, the aim
of this study was to evaluate the effect of different combinations of insulin and FSH
concentrations in culture media containing GH on the in vitro follicle morphology, antrum
formation, growth, estradiol (E2) production, oocyte viability and maturation as well as gene
expression for FSHR, GHR, INSR, CYP19A1, CYP17, 3ßHSD.
2. Materials and methods
2.1. Chemicals and media
The reagents and chemical used in this study were obtained from Sigma Chemical Co.
(St. Louis, MO, USA) unless otherwise indicated.
2.2. Collection of ovaries, isolation, selection and culture of preantral follicles
Ovaries were collected at a local slaughterhouse from 25 adult (ages 1 to 3 years old)
cross-breed goats, for a total of five repetitions. Immediately postmortem, the ovaries were
washed in alcohol (70%) followed by two washes in minimum essential medium (MEM)
supplemented with penicillin (100 µg/mL), streptomycin (100 µg/mL) and HEPES (25 mM).
The ovaries were transported to the laboratory in MEM within 1 h at 4 °C (Chaves et al.,
2008).
In the laboratory, fat and connective tissue surrounding the ovaries were removed.
Cortical slices (1 to 2 mm thick) were obtained with a surgical blade (under sterile conditions)
and placed in a holding medium consisting of HEPES-buffered MEM. Preantral follicles that
were approximately 200 µm in diameter were visualized under a stereomicroscope (SMZ 645
38
Nikon, Tokyo, Japan) and manually dissected from strips of ovarian cortex using 26-gauge
(26 G) needles. After isolation, follicles were transferred to 100 µL drops containing fresh
culture medium under mineral oil to further evaluate follicular quality. Follicles with a visible
oocyte that were surrounded by granulosa cells and had an intact basement membrane and no
antrum formation were selected for culture.
After selection, follicles were individually cultured in 100 µL drops of culture medium
in Petri dishes (60 X 15 mm, Corning Incorporated, Corning, NY, USA). The basic culture
medium consisted of α-MEM (pH 7.2–7.4) (Gibco; Invitrogen, Karlsruhe, Germany)
supplemented with 3 mg/mL bovine serum albumin (BSA), 5.5 µg/mL transferrin, 5 ng/mL
selenium, 2 mM glutamine, 2 mM hypoxanthine, 50 µg/mL ascorbic acid and 50 ng/mL
Growth Hormone bovine from Bovine Pituitary Gland (GH). The GH concentration (50
ng/mL) was established in previous experiment (Magalhães et al., 2011). Fresh media was
prepared immediately before use and pre-equilibrated for at least 1 h prior to use. Basic
culture medium was supplemented according to the experimental design. The culture was
carried out at 39 °C, in 5% CO2 in air for 18 days. Every other day, 60 µL of medium was
replaced in each drop, and at days 6 and 12 of culture all medium (100 µL) was replaced. The
experiment was repeated five times with at least 40 follicles used in each treatment.
2.3. Experimental design
For the experimental conditions, preantral follicles were randomly distributed in the
following treatments: (1) INS-LW, basic culture medium supplemented with low
concentration (10 ng/mL) of human recombinant insulin; (2) INS-HG, basic culture medium
supplemented with high concentration (10 µg/mL) of human recombinant insulin; (3) INSLW+FSH100, basic culture medium supplemented with low concentration (10 ng/mL) of
insulin associated with a fixed concentration (100 ng/mL) of bovine recombinant FSH (rFSH,
Nanocore, Campinas, São Paulo, Brazil) throughout the entire culture period; (4) INS-
39
HG+FSH100, basic culture medium supplemented with high concentration (10 µg/mL) of
human recombinant insulin associated with a fixed concentration (100 ng/mL) of bovine
recombinant FSH throughout the entire culture period; (5) INS-LW+FSH-SEQ, basic culture
medium supplemented with low concentration (10 ng/mL) of human recombinant insulin
associated with in increasing FSH concentration (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500
ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18); (6) INS-HG+FSH-SEQ, basic culture
medium supplemented with high concentration (10 μg/mL) of human recombinant insulin
associated with in increasing FSH concentration (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500
ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18). The insulin concentrations (10 ng/mL and
10 µg/mL), as well as the sequential FSH concentration (100, 500 and 1000 ng/mL on day 0,
6 and 12) were defined in previous experiments (Chaves et al., 2012; Saraiva et al., 2011,
respectively).
2.4. Assessment of follicle development
During and after culture, follicles were classified in three types according to their
morphological characteristics: extruded follicles were characterized by having a ruptured
basement membrane; degenerated follicles exhibited an irregular contour, a darkened oocyte
and/or granulosa cells, and a reduced diameter; and intact follicles, were characterized as
translucent with an intact basement membrane and surrounded by homogeneous and bright
granulosa cells with no signals of degeneration or extrusion. The growth rate was calculated
by dividing the follicular diameter (diameter of viable follicles after 18 days of culture minus
diameter on day 0) by the period of culture. Follicular diameter was measured only in intact
follicles and calculated from the basement membrane using the mean of two perpendicular
measures of each follicle by an ocular micrometer (100X magnification) inserted into a
stereomicroscope (SMZ 645 Nikon, Tokyo, Japan) every six days of culture (at days 0, 6, 12
40
and 18 of culture). Antrum formation was defined as a visible translucent cavity within the
granulosa cell layers.
2.5. In vitro maturation (IVM)
Following culture, healthy follicles were carefully and mechanically opened with 26 G
needles under a stereomicroscope for oocyte retrieval. Only oocytes with homogeneous
cytoplasm that were surrounded by at least one compact layer of cumulus cells were selected
for IVM. Cumulus oocyte complexes (COCs) selected for use in this study were washed three
times in IVM medium composed of tissue culture medium 199 (TCM 199) supplemented
with 1 µg/mL 17β-estradiol, 5 µg/mL luteinizing hormone (LH), 0.5 µg/mL rFSH, 10 ng/mL
epidermal growth factor (EGF), 1 mg/mL BSA, 22 µg/mL pyruvate, 50 ng/mL insulin-like
growth factor 1 (IGF-I), and 100 µM/L cysteamine. After washing, oocytes were placed in
100 µL of maturation medium under mineral oil and incubated for 32 h at 39 °C with 5% CO2
in air. The oocyte recovery rate was calculated as follows: the total number of oocytes beyond
(≥110 μm) divided by the total number of oocytes selected for in vitro maturation.
2.6. Assessment of oocyte viability and maturation
Assessment of oocyte viability and maturation was performed by fluorescence
microscopy. Oocytes were incubated in 100 µL of PBS supplemented with 2 µM Ethidium
homodimer-1, 4 µM Calcein-AM (Molecular Probes – LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity
Kit for mammalian cells – L3224, Invitrogen, Karlsruhe, Germany), 5.5 µg/mL Hoechst
33342 and 1% glutaraldehyde followed by incubation at room temperature for 30 min. After
incubation, oocytes were washed three times in PBS and mounted with mounting medium
containing 5 µg/mL Hoechst 33342. Thereafter, oocytes were examined under a fluorescence
microscope (Nikon, Eclipse 80i, Tokyo, Japan) for evaluation of live/dead fluorescent
staining and chromatin configuration. The emitted fluorescent signals of calcein-AM and
41
ethidium homodimer-1 were collected at 488 and 568 nm, respectively. Oocytes were
considered alive if the cytoplasm was stained positively with calcein-AM (green) and if
chromatin was not labeled with ethidium homodimer-1 (red). The chromatin configuration
was assessed as germinal vesicle (GV), germinal vesicle breakdown (GVBD), metaphase I
(MI) or metaphase II (MII). Meiotic resumption was defined when a GV was absent or the
nucleus was in MII.
2.7. RNA extraction and Real-time PCR (qPCR)
For RNA isolation, three pools of 10 viable mural cells (granulosa and theca cells)
were collected from antral follicles of each experimental group after 18 days of culture.
The samples were stored in microcentrifuge tubes (1.5 mL) in ice and stored at -80 ºC
until RNA extraction. Total RNA was isolated with Trizol® Plus RNA Purification Kit
(Invitrogen, São Paulo, SP, Brazil). The isolated RNA preparations were treated with DNase I
and Pure LinkTM RNA Mini Kit (Invitrogen, São Paulo, SP, Brazil). Complementary DNA
(cDNA) was synthesized from the isolated RNA using SuperscriptTM II RNase H-Reverse
Transcriptase (Invitrogen, São Paulo, Brazil). The quantitative PCR (qPCR) reactions had a
final volume of 20 µL and contained the following components: 1 µL cDNA as a template in
7.5 µL of SYBR Green Master Mix (PE Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), 5.5 µL
of ultra-pure water and 0.5 µL of each primer. The primers were designed to perform the
amplification of FSHR, GHR, INSR, CYP19A1, CYP17, 3ßHSD mRNA levels (Table 1). Two
candidate reference genes, glyceraldehyde-3-phosphate-dehydrogenase and peptidylprolyl
Isomerase A (PPIA), were selected as endogenous controls to study the expression, stability
and for normalization of gene expression in all samples. Primer specificity and amplification
efficiency were verified for each gene. The expression stability of these genes was analyzed
using BestKeeper software. BestKeeper highlighted PPIA as the reference gene with the least
overall variation. The thermal cycling profile for the first round of RT-PCR was as follows:
42
initial denaturation and activation of the polymerase for 15 min at 94 °C, followed by 40
cycles of 15 s at 94 °C, 30 s at 60 °C and 45 s at 72 °C. The final extension was for 10 min at
72 °C. All reactions were performed in a real-time PCR Mastercycler (Eppendorf, Germany,
Hamburg, Germany, USA). The delta-delta-CT method (Livak and Schmittgen, 2001) was
used to transform threshold cycle values (Ct) into normalized relative expression levels of
mRNA (Silva et al., 2011).
2.8. Hormonal Assay
To evaluate the relationship between follicle development and hormone production,
the conditioned culture were collected on days 6 and 18 of in vitro culture and stored at -80
°C until assay to measure E2 levels. For this evaluation, it was used the commercial kit in
radioimmunoassay ultra-sensitive estradiol RIA (DSL 4800 – Beckman Coulter). The intraassay coefficient of variation and sensitivity of the assay were 8.9 % and 2.2 pg/mL,
respectively.
43
Table 1
Oligonucleotide primers used for PCR analysis of goat follicles.
2.9. Statistical analysis
Ovarian fragments of the five goats yielded different numbers of isolated preantral
follicles. Thus they were pooled and randomly distributed among treatments and the isolated
follicles were considered as the experimental units. Data for follicular morphology and
antrum formation were analyzed by dispersion of frequency using Chi-square test, with the
results expressed in percentages. Observed frequency of extrusion rate was lower than that
required for Chi-square application and was analyzed by Fisher's Exact test. Follicular
diameter data were initially submitted to the Shapiro-Wilk and Bartlett test to verify the
normality of residual distribution and homoscedasticity, respectively. Confirmed both
requirements underlying analysis of variance (ANOVA), it was performed according to a
completely randomized design in a 2x3x4 factorial arrangement (two insulin concentrations,
three procedures for FSH use, four culture periods and its interactions). Student-NewmanKeuls (SNK) test was applied to compare means when the main effects or their interactions
were significant. Due to heterogeneity of variances, Kruskal-Wallis test was used to evaluate
44
the results of hormonal and PCR assays. Results were expressed as mean ± SEM and
differences considered significant when P < 0.05.
3. Results
3.1 Morphologically analysis and follicle growth of goat preantral follicles
A total of 278 goat preantral follicles were cultured individually for 18 days and
randomly assigned for all treatments. While the degeneration rate was not different among
treatments after 18 days of culture (range: 2.08 % – 9.09 %, data not show), the INS-LW
treatment had a significantly higher percentage of intact follicles and a lower rate of extruded
follicles (Table 2). INS-LW was the only treatment in which the percentage of antrum
formation increased significantly from day 6 to day 18 of culture (Figure 1). Additionally the
INS-LW treatment exhibited a significantly higher percentage of antrum formation except
when compared to treatments containing increasing FSH concentration (INS-LW+FSH-SEQ
and INS-HG+FSH-SEQ; Figure 1).
Overall, media containing high insulin concentration showed, after 18 day of culture,
greater follicular diameters and higher growth rates regardless the presence of FSH. Except
for the combination of low insulin concentration with increasing FSH concentration (INSLW+FSH-SEQ), the association of FSH with both insulin concentration tested did not
significantly improve follicular growth (Table 3).
45
Table 2
Percentage of morphologically intact and extruded preantral follicles cultured with insulin
(INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the absence or presence of FSH administered
in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/mL) or in increasing concentrations (FSH-SEQ:
100 ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) for 18 days.*
Figure 1. Percentage of antrum formation in caprine preantral follicles cultured with insulin
(INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the absence or presence of FSH administered
in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/mL) or increasing concentrations (FSH-SEQ: 100
ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) for 18 days.
Regardless the treatment all culture media contained 50 ng/mL GH. A - B: Differs
significantly among treatments within the same culture period (P < 0.05). a – b: Differs
significantly among culture periods within the same treatment (P < 0.05).
46
Table 3
Mean (± SEM) diameter (µm) and follicular growth rate (µm) of caprine preantral follicles
cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the absence or presence
of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/mL) or in increasing
concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL
days 12 to 18) for 18 days.*
3.2 In vitro maturation and meiosis stages of oocytes grown in vitro from goat preantral
follicles
The chromatin configuration after IVM of caprine oocytes from preantral follicles
cultured for 18 days is shown in Table 4. There was no significant difference in the oocytes
recovery rate among treatments (ranged from 52.27 - 65.22%, data not shown). However,
there was an increase of meiotic resumption rates (P < 0.05) in the follicles cultured in the
presence of FSH100 regardless of insulin concentration (INS-LW+FSH100, and INSHG+FSH100). Moreover, INS-HG+FSH100 treatment showed at the end of culture the
highest oocyte diameter and greatest oocyte recovery rate (P < 0.05) (Table 5).
47
Table 4
Meiotic stages of caprine oocytes from preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10
ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the absence or presence of FSH administered in a fixed
concentration (FSH100: 100 ng/mL) or in increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL,
days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) for 18 days.*
Table 5
Mean (± SEM) diameter (µm) of oocytes matured in vitro and oocyte recovery rate from
caprine preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL),
in the absence or presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100
ng/mL) or in increased concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6
to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) for 18 days.*
3.3 Concentrations of E2 after in vitro culture of goat preantral follicles
The E2 production levels in culture medium from ovarian follicles cultured with low
or high insulin concentration (10 ng/ml or 10 µg/mL) with or without different FSH
concentrations (FSH100 or FSH-SEQ) are represented in Figure 2. On day 6 and day 18 of
culture, treatments that contained high insulin concentration alone (INS-HG) or with FSH100
48
showed higher (P < 0.05) E2 production with compared to INS-LW and INS-LW+FSH100,
respectively. The association of low insulin concentration in absence or presence of FSH100
did not increase E2 production (P > 0.05). However, at day 6 of culture, the combination of
increasing FSH concentration with high insulin concentration (INS-HG+FSH-SEQ)
significantly reduced the E2 production when compared to high insulin concentration alone
(INS-HG). Conversely, the association of low insulin concentration with increasing FSH
concentration (INS-LW+FSH-SEQ) significantly increased the E2 production as compared
with the low insulin concentration alone (INS-LW).
Figure 2. Mean (± SEM) E2 production (ng/mL) after culture medium of caprine preantral
follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG: 10 µg/mL), in the absence or
presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100: 100 ng/mL) or increasing
concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL
days 12 to 18). Regardless the treatment all culture media contained 50 ng/mL GH. A – C:
Differs significantly among treatments within the same culture period (P < 0.05). a – b:
Differs significantly among culture periods within the same treatment (P < 0.05).
49
3.4 mRNA levels for FSHR, INSR, GHR, 3βHSD, CYP19A1 and CYP17 after in vitro culture
of goat preantral follicles
The mRNA expression levels for FSHR, INSR, GHR, 3βHSD, CYP19A1 and CYP17
are shown in Figure 3 and Figure 4. After 18 days of culture, INS-LW+FSH-SEQ treatment
significantly increases in mRNA levels for FSHR and GHR compared to the other treatments
(P<0.05), except INS-LW+FSH100 treatment. There was no significant difference among
groups for relative mRNA expression levels of INSR.
Figure 3. Relative mean (± SEM) expression of mRNA of FSHR (A), INSR (B), and GHR (C)
in caprine preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/mL or INS-HG: 10
µg/mL), in the absence or presence of FSH administered in a fixed concentration (FSH100:
100 ng/mL) or increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500 ng/mL,
days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18) for 18 days. Regardless the treatment all culture
media contained 50 ng/mL GH. Different letters denote significant differences (P < 0.05).
Overall in the absence of FSH, the mRNA expression for 3βHSD, CYP17 and
CYP19A1 was higher in high insulin concentration (INS-HG) than low insulin concentration
(INS-LW). INS-HG showed a significantly higher mRNA expression for 3βHSD, when
50
compared to INS-HG+FSH-SEQ. No mRNA expression for CYP19A1 was observed in INSLW and INS-LW+ FSH100 treatments.
Figure 4. Relative mean (± SEM) expression of mRNA of 3βHSD (A), CYP19A1 (B), and
CYP17 (C) in caprine preantral follicles cultured with insulin (INS-LW: 10 ng/mL or INSHG: 10 µg/mL), in the absence or presence of FSH administered in a fixed concentration
(FSH100: 100 ng/mL) or increasing concentrations (FSH-SEQ: 100 ng/mL, days 0 to 6; 500
ng/mL, days 6 to 12; 1000 ng/mL days 12 to 18). Regardless the treatment all culture media
contained 50 ng/mL GH. Different letters denote significant differences (P < 0.05).
51
4. Discussion
The present study shows for the first time in goats that the balance of insulin and
FSH concentrations in media affects follicular morphology, antrum formation, growth
rate, E2 production, gene expression for key stereoidogenic enzymes as well as oocyte
growth and ability to resume meiosis.
In this study there was a high rate of intact follicles observed in the presence of
low insulin concentration after 18 days of culture. This finding is in agreement with
previous studies on in vitro preantral follicle culture in caprine (Chaves et al., 2012) and
bovine (Itoh et al., 2002). Other studies reported that high insulin concentration had
detrimental effects on preantral follicle culture (Chaves et al., 2010; Faustino et al.,
2011). Nevertheless, harmful effects of insulin were not observed in our study because
the percentage of degenerated follicles was similar among the treatments. However, in
the present work, follicles cultured with high insulin concentration, regardless of the
presence of FSH, were able to develop an antrum cavity and higher growth rates. These
results are supported by previous studies reporting that high concentration of insulin
combined with FSH improved antrum formation and stimulated growth of isolated
secondary follicles in rhesus monkeys (Xu et al., 2010) and goats (Saraiva et al., 2011).
Furthermore, Itoh et al. (2002) reported that the association of the insulin with
gonadotropins (FSH or LH) increased follicular and oocyte diameter as well as the
proliferation of granulosa and theca cells. In addition, it has been reported that the
combination of insulin and FSH in culture enhances the differentiation of the granulosa
cell, stimulates gap junctions and induces proliferation of cytoplasmic organelles
(Amsterdam et al., 1988; Eppig et al., 2000).
The production of a metaphase II oocyte after in vitro culture of caprine
preantral follicle has been a major challenge facing in vitro maturation today. The
52
percentage of MII oocyte (11 %) obtained in our study is comparable with previous
studies in goat (Saraiva et al., 2010; Magalhães et al., 2011; Araújo et al., 2011; Duarte
et al., 2013; Brito et al., 2014) (range from 6.25 to 29.4 %). The ability of cultured
oocytes to resume meiosis in this study shows that a higher percentage of meiotic
resumption was observed in medium containing a fixed FSH concentration (FSH100)
regardless of the concentration of insulin. Nevertheless, some studies achieved better
meiotic resumption rates when caprine follicles were cultured in increasing FSH
concentration (100, 500 and 1000 ng/mL) in medium containing low insulin (Chaves et
al., 2012) or high insulin concentrations (Saraiva et al., 2011). The differences between
this and the aforementioned studies in goats may be due to the presence of GH in the
culture medium, which clearly shows the novel finding of the present paper. We suggest
that in the presence of GH, a lower concentration of FSH is required and both insulin
concentrations can be used. We were the first group to report the embryo production
(morula stage) after in vitro maturation and fertilization of caprine oocyte growth in
vitro. This result was achieved using a basic culture medium (α-MEM plus 3 mg/mL
BSA, 10 μg/mL insulin, 5.5 μg/mL transferrin, 5 ng/mL selenium, 2 mM glutamine, 2
mM hypoxanthine, 50 μg/mL ascorbic acid) supplemented with bovine recombinant
FSH in increasing concentrations (Saraiva et al., 2011) and GH (50 ng/mL); (Magalhães
et al., 2011). However, the present study shows that the balance of insulin and FSH
used previously is not appropriate as it reported significantly lower rates of meiotic
resumption. In addition, it has been reported that high levels of FSH in combination
with insulin can affect negatively further embryonic development (Eppig et al., 1998;
Santos et al., 2010; 2012).
In this work, a high concentration of insulin alone or associated with a fixed
FSH concentration showed higher E2 production compared to low insulin concentration
53
alone or associated with a fixed FSH concentration. Additionally, only the addition of
increasing FSH concentration in the medium contained low insulin concentration
significantly increased E2 production, which is in agreement with previous studies
performed in caprine (Chaves et al., 2012). Itoh et al. (2002) reported that only the
presence of low insulin concentrations (20 ng/mL) promoted E2 production in the
bovine follicles. Hence, these findings suggest a synergistic action of insulin in
association with gonadotropins (FSH and LH) as being able to promote the proliferation
of granulosa and theca cells to further induces the production of E2 (Itoh et al., 2008;
Silva and Price, 2000). On the other hand, the addition of FSH, either in fixed and
increasing concentration did not affect of the E2 production. Xu et al. (2010) reported
that high concentrations of insulin combined with FSH increased E2 production after in
vitro culture of secondary follicles in monkey. This difference may be due to the source
of FSH, the basic medium composition and the species used.
In mice (Sanchéz et al., 2011) and caprine (Chaves et al., 2012) follicles cultured
with low insulin concentration in presence of increasing FSH did not affect the relative
mRNA expression levels for FSHR. In our study, it was observed a significant increase
in the mRNA levels for FSHR and GHR in follicles cultured with low insulin and
increasing FSH concentrations compared to the other treatments, except to the culture
performed with fixed FSH concentration with low insulin concentration. However, the
variation in levels of gene expression was not associated with improvement in the
follicular development and resumption of meiosis. The relative mRNA expression for
3βHSD, CYP17 and CYP19A1 was higher in all of follicles cultured with high insulin
concentration regardless of the presence of FSH and low insulin concentration with
increasing FSH concentrations, in which also it were observed the highest E2 levels.
This suggests that the insulin and FSH in combination are able to increase the
54
steroidogenesis in isolated caprine follicles, which is in agreement with previous studies
(caprine: Chaves et al., 2011; mouse: Kandiel et al., 2010). The relative mRNA
expression of CYP19A1 and E2 level were higher in the culture with high insulin
concentration and increasing FSH concentration which is similar to other caprine
studies (Chaves et al., 2011). CYP19A1 is the key enzyme responsible for estrogen
synthesis from androgens (Kandiel et al., 2010). Therefore, it has been reported that
both FSH (Campbell et al., 1996; Gutierrez et al., 1997) as insulin (Silva and Price,
2000) play an important role in CYP19A1 expression, and this association promotes
theca and granulosa cell steroidogenesis corroborating our results.
In conclusion, in the presence of GH, a basic medium supplemented with 10
µg/mL insulin and 100 µg/mL FSH throughout the culture period improved follicular
and oocyte growth, oocyte meiotic resumption and E2 production from isolated
preantral caprine follicles cultured in vitro.
Conflict of interest
The authors declare that there is no conflict of interest that would prejudice the
impartiality of this scientific work.
Acknowledgments
This research was supported by grants from the National Council for Scientific
and Technological Development (CNPq-79/2013 linha 3 – Rede Nordeste de
Biotecnologia (Rede de pesquisa do ovário artificial) – Processo N° 407594/2013-2).
Anna Clara Accioly Ferreira is the recipient of a grant from FUNCAP/CE (Brazil). The
authors thank Dr. Felipe Zandonadi Brandão for contribution in hormonal assay and Dr.
Gary A. Apgar for assistance in manuscript preparation.
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7
CONCLUSÕES
Em conclusão, na presença de 50 ng/mL de GH, um meio básico suplementado
com 10 µg/mL de insulina e 100 ng/mL de FSH durante todo o período de cultivo
melhorou o crescimento folicular e oocitário, a retomada da meiose oocitária e a
produção de E2 a partir de foliculos pré-antrais caprinos isolados cultivados in vitro.
62
8
PERPECTIVAS
O presente trabalho definiu condições básicas do meio de cultivo in vitro para
folículos pré-antrais caprinos, ou seja, a concentração e o tempo de exposição da insulina e do
hormônio do crescimento que melhor influenciram durante o desenvolvimento folicular e
proporcionaram melhores taxas de retomada da meiose. A etapa seguinte será avaliar o esse
efeito nas taxas de produção embrionária in vitro a partir de oócitos crescidos in vivo
(aspiração folicular) e in vitro (cultivo de folículos pré-antrais) caprinos.
62
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