UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA DE
ALIMENTOS
TEREZA CECÍLIA SANTOS DA LUZ
EFEITO DO CONSUMO DE PREPARAÇÕES À BASE DE FARINHA DE
YACON (Smallanthus sonchifolius) NA PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
DE CADEIA CURTA, NO pH FECAL E NA MICROBIOTA INTESTINAL
PROBIÓTICA DE PRÉ-ESCOLARES.
ALEGRE-ES
2014
TEREZA CECÍLIA SANTOS DA LUZ
EFEITO DO CONSUMO DE PREPARAÇÕES À BASE DE FARINHA DE
YACON (Smallanthus sonchifolius) NA PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
DE CADEIA CURTA, NO pH FECAL E NA MICROBIOTA INTESTINAL
PROBIÓTICA DE PRÉ-ESCOLARES
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia
de Alimentos do Centro de Ciências
Agrárias da Universidade Federal do
Espírito Santo, como parte das exigências
para obtenção do Título de Mestre em
Ciência e Tecnologia de Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. Rogério Graça
Pedrosa
Co-Orientadores: Prof. Dr. Neuza M. B.
Costa e Prof. Dr. Olavo Pereira dos S.
Junior
ALEGRE-ES
2014
Dados Internacionais de Catalogação-na-publicação (CIP)
(Biblioteca Setorial de Ciências Agrárias, Universidade Federal do Espírito Santo, ES, Brasil)
L979e
Luz, Tereza Cecília Santos da, 1987Efeito do consumo de preparações à base de farinha de yacon
(Smallanthus sonchifolius) na produção de ácidos graxos de cadeia curta, no
ph fecal e na microbiota intestinal probiótica de pré-escolares / Tereza
Cecília Santos da Luz. – 2014.
73 f. : il.
Orientador: Rogério Graça Pedrosa.
Coorientador: Neuza Maria Brunoro Costa; Olavo Pereira dos Santos
Júnior.
Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) –
Universidade Federal do Espírito Santo, Centro de Ciências Agrárias.
1. Yacon. 2. Ph fecal. 3. Prebióticos. 4. Ácidos graxos de cadeia curta.
5. Fezes – Microbiologia. 6. Fruto-oligossacarídeos. I. Pedrosa, Rogério
Graça. II. Costa, Neuza Maria Brunoro. III. Santos Júnior, Olavo Pereira dos.
IV. Universidade Federal do Espírito Santo. Centro de Ciências Agrárias. V.
Título.
CDU: 664
EFEITO DO CONSUMO DE PREPARAÇÕES À BASE DE FARINHA DE
YACON (Smallanthus sonchifolius) NA PRODUÇÃO DE ÁCIDOS GRAXOS
DE CADEIA CURTA, NO pH FECAL E NA MICROBIOTA INTESTINAL
PROBIÓTICA DE PRÉ-ESCOLARES
TEREZA CECÍLIA SANTOS DA LUZ
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós-Graduação em
Ciência e Tecnologia de Alimentos
do Centro de Ciências Agrárias da
Universidade Federal do Espírito
Santo, como parte dasexigências
para obtenção do Título de Mestre
em Ciência e Tecnologia de
Alimentos.
Aprovado em 25 de Agosto de 2014
_______________________________
Prof. Dr. Jorge Luiz Fortuna
Universidade do Estado da Bahia
(Membro Externo)
_______________________________
Prof. Dr. Neuza Maria Brunoro Costa
Universidade Federal do Espírito
Santo
(Membro Interno)
______________________________
Prof. Dr. Mirelle Lomar Viana
Universidade Federal do Espírito
Santo
(Membro Externo)
_______________________________
Prof. Dr. Rogério Graça Pedrosa
Universidade Federal do Espírito
Santo
(Orientador)
“Canta alegremente, ó filha de Sião (...) O Senhor
afastou os teus juízos, exterminou o teu inimigo; o
Senhor, o rei de Israel, está no meio de ti; tu não
verás mais mal algum.”
(Bíblia Sagrada - Sofonias 3:14,15.)
iv
Dedico ao meu Deus. Porque é dEle todas as coisas.
v
AGRADECIMENTOS
Agradecer é admitir para si mesmo que se precisou de alguém. Por isso, expresso a
minha gratidão:
Ao Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito Santo;
Aos professores e funcionários do Programa de Ciência e Tecnologia de Alimentos,
em especial o secretário Antônio de Paula, pelo seu excelente trabalho;
À Fundação de Amparo a Pesquisa do estado do Espírito Santo (FAPES) pelo
financiamento do projeto e concessão da bolsa de mestrado;
À equipe de professores, cooredenadores e diretores do CEMEI Tio Teotônio
Barbosa que me recebeu tão bem e contribuiu de forma fundamental para o
desenvolvimento da pesquisa;
Ao Prof. Rogério pela orientação e autonomia;
À Prof. Neuza pela acolhida e apoio;
À prof. Olavo pelo auxílio;
À prof. Mariana Ignacchiti pela ajuda, parceria, boa vontade e generosidade;
Ao prof. Carlos Priminho Pirovani da Universidade Estadual de Santa Cruz (UESC),
que de uma forma tão generosa e humana, contribui para o avanço e concretização
da pesquisa científica do País;
Às professoras Graça Vaz Tostes e Mirelle Viana, da UFES, e a Prof. Aurizângela,
da UESC, pela parceria, cumplicidade, companheirismo, acolhida, zelo e cuidado.
Sem elas eu não teria conseguido...
À Prof. Ceres Mattos Della Lucia pelas dicas;
À prof. Raquel Vieira pelas contribuições;
À Prof. Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira, da Universidade Federal de Viçosa
(UFV), e toda sua “trupe” (Michele Harumi, Viviane Rafael, Elaine, Érika Costa e
Driene Gonzaga) pela doação das culturas puras de Bifidobactérias;
Ao Prof. Sérgio de Paula e ao colega Roberto Dias pela extraordinária ajuda com a
extração do DNA;
Ao Prof. Jorge Luiz Fortuna e a Prof. Édila Dalmaso Coswosk pelo aprendizado,
parceria e pela amizade (desde sempre);
À Prof. Elisabete Fantuzzi pelas contribuições, pelos ensinamentos e por ser uma
professora humanamente preciosa;
vi
Às estagiárias do curso de Nutrição do CCA-UFES: Sarah Carolina, Thaísa, Thays,
Tanísia, Carolina, Priscila e Mariana;
Aos técnicos de laboratório Eduardo, Amanda, Natália, Letícia, Jerusa e Sandra pela
ajuda tão eficiente;
À Conceição e Edvana por zelar pela limpeza dos laboratórios;
A galerinha do Laboratório de Bioquímica, pela acolhida;
Ao grande amigo José Dias pela ajuda, generosidade e companhia;
Aos professores e amigos da Universidade do Estado da Bahia, companheiros de
luta, com quem trilhei um caminho com muitos desafios e descobertas;
Aos amigos Letícia e Henrique pela hospitalidade e acolhida no momento em que
mais precisei;
Ao “PCTA-Uhull” pela companhia e pelos maravilhosos momentos;
À Tia Angélica, Tia Fabiana, ao meu Luquinhas e toda família EJC, pela amizade;
Aos amigos, mais que queridos Carol, Stheffan, Lorane e Michelle por ter feito toda
diferença;
À república Paraíso e a Carolzinha por terem cuidado de mim;
À Tarsila pela doce companhia e pela irmandade construída sob o mesmo teto;
Ao Denes e a Daiara por terem compreendido meu desespero e terem me ajudado;
Às amigas de sempre Raquel e Isabel, Marcela (Docinho), Manu, Keite, Mayne e
Vanessa por terem entendido a minha ausência;
À Dona Aurora e todos os seus filhos e netos por serem minha segunda família e a
Ana Beatriz por ter aceitado ser minha irmãzinha e encher minha vida de alegria;
Ao meu irmão Isaac por ser meu melhor amigo e companheiro de uma vida inteira;
Aos meus pais Francisco Anísio e Maria do Carmo por fazerem um ótimo trabalho,
pelas abdicações e todo amor. É a eles a quem devoto todas as minhas conquistas
e todo o meu amor;
Ao meu Deus por ter estado comigo em todos os momentos, ora me enchendo de
Graça ora me reerguendo, e por ter preparado e capacitado cada pessoa citada
acima a me ajudar a construir este trabalho, e por ter colocado em meu caminho
todas as outras que de alguma outra forma se dedicaram, me amaram e me
ajudaram.
vii
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1- Delineamento Experimental .....................................................
38
Quadro 1- Concentração dos iniciadores utilizados nas reações de rt- 42
PCR ...........................................................................................
Figura 2- Triagem da Amostra .................................................................
44
Índice de aceitação das preparações formuladas com farinha
Tabela 1- de yacon entre os pré-escolares participantes da pesquisa
.................................................................................................... 45
Determinação do pH fecal e AGCC de amostras de fezes
e
depois
do
período
de
intervenção
Tabela 2- antes
.................................................................................................... 48
Curva de dissociação da amplificação da reação de rt-PCR
Figura 3- das amostras de fezes coletadas antes da intervenção
53
alimentar ....................................................................................
Curva de dissociação da amplificação da reação de rt-PCR
Figura 4- das amostras de fezes coletadas após da intervenção
alimentar .................................................................................... 53
viii
LISTA DE ANEXOS APÊNDICES
Anexo 1- Parecer de aprovação do Comitê de Ética em pesquisa
Apêndice 1- Termo de consentimento livre e esclarecido.
Apêndice 2- Receitas elaboradas com farinha de yacon.
ix
LISTA DE SIGLAS, SÍMBOLOS E ABREVIATURAS
%
Por cento; Porcentagem
°C
Grau(s) Celsius
®
Marca Registrada
β
Beta
μL
Microlitro
DMH
1-2 Dimetil-hidrazina
ES
Espérito Santo
et al
Et Alli; E outros; E Colaboradores
EUA
Estados Unidos da América
F
Quantidade de Farinha de Yacon
FFOS
percentual de FOS na farinha de Yacon
g
Grama(s)
Kcal
Quilocaloria(s)
Kg
Quilograma(s)
Kgf
Quilograma(s) Força
L
Litro(s)
L.
Linnaeus (Lineu)
M
metro
mg
Miligrama(s)
mM
milimolar(es)
mmol
Milimol(s)
ng
Nanograma
P
Média do Peso Corporal dos Pré-escolares
ppm
Partes Por Milhão
SP
São Paulo
ssp.
Espécies
rpm
Rotações por minuto
NaCl
Cloreto de Sódio
ng
Nanograma(s)
mL
Mililitro(s)
Ad Libitum
À vontade
x
AGCC
Ácidos Graxos de Cadeia Curta
ANVISA
Agência Nacional de Vigilância Sanitária
AOAC
Association of Ofical Analytical Chemists
ATCC
American Type Culture Collection
CCA
Centro de Ciências Agrárias
CECANE
Centro Colaborador em Alimentação e Nutrição Escolar
CEP
Comitê de Ética em Pesquisa
CLAE
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
CEMEI
Centro Municipal de Educação Infantil
Ct
Cycle Threshold
DNA
Ácido Desoxirribonucleico
DV
Diarreia do viajante
FOS
Fruto-oligossacarídeo
GOS
Galacto-oligossacarídeo
GP
Grau de Polimerização
IgA
Imunoglobulina A
IgG
Imunoglobulina G
IUPAC
International Union of Pure and Applied Chemistry
MG
Minas gerais
MOS
manano-oligossacarídeo
PBS
Tampão Fosfato Salino
Ph
potencial Hidrogeniônico
PNAE
Programa Nacional de Alimentação Escolar
Rt-PCR
Reação em Cadeia de Polimerase em Tempo Real
SPSS
Statistical Package for Social Sciences
TD
Trato Digestório
UFC
Unidade Formadora de Colônia
UFES
Universidade federal do Espírito Santo
UFV
Universidade Federal de Viçosa
xi
SUMÁRIO
RESUMO ....................................................................................................................xvi
ABSTRACT .................................................................................................................xvii
1 INTRODUÇÃO ....................................................................................................... 16
2 REVISÃO DE LITERATURA .................................................................................. 18
2.1 MICROBIOTA INTESTINAL ............................................................................. 18
2.1.1 O papel da microbiota. ............................................................................... 20
2.1.2 Fisiologia do gênero Bifidobacterium e os reflexos na saúde do indivíduo.21
2.2 PREBIÓTICOS................................................................................................. 25
2.2.1 Mecanismos de ação e a interação com as bactérias probióticas. ............ 26
2.2.2 Fruto-oligossacarídeos: uma abordagem acerca dos benefícios à saúde. 30
2.2.3 Yacon: importante fonte de FOS ............................................................... 33
3 METODOLOGIA..................................................................................................... 37
3.1 CASUÍSTICA.................................................................................................... 37
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL ................................................................ 37
3.3 INTERVENÇÃO ALIMENTAR .......................................................................... 38
3.3.1 Protocolo de elaboração da farinha ........................................................... 38
3.3.2 Análise de FOS da Farinha de Yacon........................................................ 39
3.3.3 Formulação das preparações à base de farinha de yacon ........................ 39
3.3.4 Oferecimento e controle do consumo das preparações à base de farinha
de yacon ............................................................................................................. 39
3.4 ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE FEZES .......................................................... 40
3.4.1 Coleta das amostras de fezes ................................................................... 40
3.4.2 Análise de pH ............................................................................................ 40
3.4.3 Determinação da concentração de Ácidos Graxos de Cadeia Curta
(AGCC) ............................................................................................................... 41
3.4.4 Extração e quantificação do DNA das amostras de fezes ......................... 41
3.4.4.1 Obtenção da cultura pura .................................................................... 41
3.4.4.2 Otimização dos iniciadores .................................................................. 42
3.4.4.3 Quantificação de Bifidobacterium spp. ................................................ 42
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA .................................................................................. 43
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO.............................................................................. 44
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA ............................................................... 44
4.2 ACEITABILIDADE DAS PREPARAÇÕES ELABORADAS COM FARINHA DE
YACON .................................................................................................................. 44
4.3 ANÁLISE DE pH E AGCC ................................................................................ 48
4.4 QUANTIFICAÇÃO DE Bifidobacterium spp ..................................................... 52
5 CONCLUSÕES ...................................................................................................... 56
xii
REFERÊNCIAS ......................................................................................................... 57
xiii
RESUMO
LUZ, Tereza Cecília Santos da. Efeito do consumo de preparações à base de
farinha de yacon (Smallanthus sonchifolius) na produção de ácidos graxos de
cadeia curta, no pH fecal e na microbiota intestinal probiótica de pré-escolares.
2014. Dissertação (Mestrado em Ciência e Tecnologia de Alimentos) – Universidade
Federal do Espírito Santo, Alegre-ES. Orientador: Prof. Dr. Rogério Graça Pedrosa.
Co-orientadores: Prof. Dr. Neuza Maria Brunoro Costa e Prof. Dr. Olavo Pereira dos
Santos Junior.
O consumo da raiz de yacon (Smalanthus sonchifolius) pode trazer benefícios à
saúde dos indivíduos por ser uma importante fonte de Fruto-oligossacarídeo (FOS).
Este prebiótico promove o crescimento de bactérias Bifidobacterium spp. que podem
contribuir com a produção de ácidos graxos de cadeia curta (AGCC) e reduzir o pH
na região colônica. Objetivou-se com este estudo avaliar o efeito do consumo de
preparações elaboradas com farinha de yacon na produção de AGCC, no pH fecal e
na microbiota probiótica de pré-escolares. Foi conduzido um estudo longitudinal,
experimental do tipo pareado antes e após, onde foram oferecidas preparações à
base de farinha de yacon a crianças saudáveis por 18 semanas. Amostras de fezes
foram coletadas antes e após o período de intervenção alimentar para determinar as
concentrações de AGCC, pelo método de Cromatografia Líquida de Alta Eficiência
(CLAE); o pH fecal, utilizando um pHmetro e para quantificar Bifidobacterium spp.
utilizou-se a técnica de Reação em Cadeia de Polimerase em tempo real (rt-PCR).
As médias encontradas nos dois momentos foram submetidas ao teste t pareado
utilizando o programa Statistical Package for Social Sciences (SPSS) versão 13.0.
Houve aumento significativo nas concentrações de butirato antes (0,091±0,5 mg/mg
de fezes) e após (0,122±0,7 mg/mg de fezes) o período de intervenção. As médias
das concentrações dos momentos antes e após a intervenção para o acetato
(0,357±0,11 e 0,385±0,15 mg/mg de fezes, respectivamente), propionato
(0,052±0,04 e 0,064±0,05 mg/mg de fezes, respectivamente) e para o pH (6,76±0,43
e 6,61±0,45, respectivamente) se mantiveram iguais. Com as reações de rt-PCR,
encontrou-se valores médios de cycle threshold do DNA extraído das amostras de
fezes coletadas antes e após a intervenção alimentar de 17 e 19, respectivamente.
Como a eficiência da amplificação foi de 77%, considerou-se que as reações foram
de baixa sensibilidade e os valores encontrados podem não representar o valor real
da concentração de Bifidobacterium spp. Concluiu-se que o consumo das
preparações elaboradas com farinha de yacon pode ter influenciado a fisiologia da
microbiota intestinal probiótica das crianças por promover o aumento nas
concentrações do butirato.
Palavras-chave: Yacon, pH fecal Ácidos Graxos de Cadeia Curta, Bifidobacterium
spp., Microbiota intestinal.
xiv
ABSTRACT
LUZ, Tereza Cecília Santos da. Effect of consuming preparations of yacon flour
(Smallanthus sonchifolius) in the production of short chain fatty acids, faecal
pH and probiotic intestinal microbiota of pre-school. 2014. (MSc in Food Science
and Technology) – Universidade Federal do Espírito Santo, Alegre – ES. Adviser:
Prof. Dr. Rogério Graça Pedrosa. Co-adviser: Prof. Dr. Neuza Maria Brunoro Costa e
Prof. Dr. Olavo dos Santos Pereira Junior.
The consumption of yacon root (Smalanthus sonchifolius) can bring benefits to the
health of individuals by being a major source of Fructo-oligosaccharide (FOS). This
promotes the growth of probiotic bacteria Bifidobacterium spp. which may contribute
to the production of short chain fatty acids (SCFA) and reducing the pH in the colonic
region. The objective of this study was to evaluate the effect of consumption of
preparations with yacon flour in the production of SCFA in fecal pH and probiotic
microflora of preschool. A longitudinal, experimental study of type paired before and
after, where preparations of yacon meal for 18 weeks to healthy children were offered
was conducted. Stool samples were collected before and after the dietary
intervention to determine the concentrations of SCFA by the method of High
Performance Liquid Chromatography (HPLC); Faecal pH using a pH meter to
measure and Bifidobacterium spp. used the technique of Polymerase Chain Reaction
in real time (rt-PCR). The means found in the two moments were subjected to paired
t-test using the Statistical Package for Social Sciences (SPSS) version 13.0. A
significant increase in the concentrations of butyrate before (0.091±0.5 mg/mg of
feces) and after (0.122±0.7 mg/mg of feces) the intervention period. The mean
concentration of times before and after the intervention acetate (0.357±0.385 and
0.11±0.15 mg/mg faeces, respectively) propionate (0.052±0.064 and 0.04±0.05
mg/mg feces, respectively) and the pH (6.76±0.43 and 6.61±0.45, respectively)
remained equal. With the reactions of rt-PCR, we found average values of cycle
threshold of DNA extracted from stool samples collected before and after the dietary
intervention of 17 and 19, respectively. As amplification efficiency was 77%, it was
considered that the reactions were of low sensitivity and the values found may not
represent the actual value of the concentration of Bifidobacterium spp. It was
concluded that consumption of elaborate preparations with yacon flour may have
influenced the physiology of probiotic intestinal microbiota of children by promoting
increased concentrations of butyrate.
Keywords: FOS Yacon. fecal pH. of Short Chain Fatty Acids. Bifidobacterium spp.,
Intestinal microbiota.
xv
16
1 INTRODUÇÃO
As bactérias probióticas do gênero Bifidobacterium, que colonizam o intestino
de seres humanos, podem contribuir com a promoção da saúde, melhorando a
qualidade de vida dos indivíduos. Para isso, esse gênero deve prevalecer
quantitativamente sobre os demais gêneros eventualmente presentes no trato
digestório. Dessa forma, a ingestão de prebióticos é uma alternativa que pode
favorecer o crescimento dessas bactérias probióticas, pois, uma vez que esses
compostos não são digeridos no trato digestório superior, chegam ao intestino
grosso e servem como substrato para o crescimento das bifidobactérias (SAAD,
2012).
A correlação positiva entre a presença de bifidobactérias e a melhoria das
condições de saúde do indivíduo é mediada pela produção de ácidos graxos de
cadeia curta e redução do pH intestinal que favorecem o funcionamento do intestino
por contribuir com a diferenciação das células jovens da mucosa e apoptose das
células defeituosas, com o aumento das criptas intestinais e com a depleção das
bactérias patogênicas. (SAAD, 2012; ROLLER et al, 2004; FEMIA et al, 2002;
GOMES e MALCATA, 1999,).
O crescimento de bifidobactérias, por sua vez, pode ser favorecido pelo
consumo de fruto-oligossacarídeo (FOS), uma fibra prebiótica não digerida e ao
chegar ao intestino grosso lhes serve como substrato. Ocorre então a fermentação
dessas fibras, o que torna o meio levemente ácido, e essa condição favorece o
crescimento das bactérias bífidas, ao passo que desfavorece o crescimento das
bactérias potencialmente patogênicas. (BEN et al, 2004; PASSOS e PARK, 2003;
FOOKS et al, 1999).
O FOS pode ser abundantemente encontrado na raiz de yacon (Smallanthus
sonchifolius), uma tuberosa de origem andina muito valorizada por ser o alimento
natural com maior concentração deste prebiótico (FERREIRA, 2012; SEMINARIO et
al, 2003). O consumo desta raiz é apreciado por possuir sabor adocicado e suave e
por estar correlacionado com efeitos positivos conferidos à saúde. Pesquisas
envolvendo animais e humanos têm reportado que o consumo de yacon pode
melhorar o trânsito intestinal, aliviar a constipação e a diarreia, aumentar a
saciedade e resultar em benefícios sistêmicos como modulação da microbiota
intestinal, regulação de síndromes metabólicas e melhoria da resposta imune. No
17
entanto, a confirmação desta correlação ainda suporta mais estudos para verificar os
resultados no que tange a variação da quantidade consumida e frequência da
ingestão nos diversos grupos etários. (RODRIGUES et al, 2012; OJANSIVU et al.,
2011; BONET et at, 2010; SANTANA e CARDOSO, 2008; VALENTOVÁ et al, 2008).
É nos recém-nascidos que a população de bifidobactérias prevalece em
número de espécies e densidade. No entanto, devido a fatores diversos, com o
avançar da idade, a população de bactérias probióticas tende a diminuir ao passo
que a densidade de outros gêneros tende a aumentar. São poucos os estudos que
relacionam o consumo de yacon por criança e a manifestação de seus possíveis
benefícios à saúde. Mas é coerente afirmar que o consumo desta raiz ou de seus
produtos é uma alternativa que pode favorecer o crescimento das bactérias bífidas.
Esse tipo de intervenção alimentar pode ser indicado, principalmente durante os
primeiros anos de vida a fim de preservar as cepas ainda existentes desde o
nascimento (MELLO et al, 2009; BERNAL, 2004; MACPHERSON e HARRIS, 2004;
HOPKINS et al, 2002).
Deste modo, o oferecimento da raiz de yacon na alimentação de creches
pode representar uma alternativa para o seu consumo, o que pode favorecer o
crescimento da microbiota intestinal e contribuir com a produção de ácidos graxos de
cadeia curta em crianças em idade pré-escolar. Objetivou-se, então, com este
trabalho avaliar o efeito do consumo de preparações elaboradas com farinha de
yacon no metabolismo de bactérias do gênero Bifidobacterium presentes na
microbiota intestinal de pré-escolares. E como objetivos específicos pretendeu-se:
(1) verificar a aceitabilidade das preparações elaboradas com farinha de
yacon;
(2) Medir o pH das fezes de pré-escolares coletadas antes e depois do
período de intervenção alimentar;
(3) Determinar a concentração de Ácidos Graxos de Cadeia Curta (AGCC) do
conteúdo fecal antes e depois do período de intervenção com farinha de yacon;
(4) Verificar e quantificar a presença de bactérias do gênero Bifidobacterium
antes e depois do consumo de farinha de yacon.
18
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 MICROBIOTA INTESTINAL
No corpo humano existe uma quantidade numericamente maior de microorganismos do que de células (FIOCCHI; SOUZA, 2012). E o trato digestivo (TD) é
o local de maior densidade e diversidade bacteriana em relação às outras regiões
colonizadas do corpo humano. Embora as bactérias possam ser encontradas em
toda a sua extensão, elas não se distribuem de forma homogênea no TD, uma vez
que no estômago e no intestino delgado o ambiente tem elevado peristaltismo e
baixo pH que desfavorece a sua colonização. Ao passo que a porção do intestino
grosso apresenta as condições ideais para o crescimento de bactérias, como
ausência de secreções intestinais, peristaltismo lento, abundante suprimento
nutricional, além da ausência de oxigênio, condição essencial para a sobrevivência
das bactérias anaeróbias (FIOCCHI e SOUZA, 2012; BRANDT, 2006; TANNOK,
1999).
Deste modo, estima-se que a população bacteriana no intestino grosso
alcance a magnitude de 1010 a 1012 micro-organismos por grama de conteúdo
luminal.
Em
adição,
heterogeneamente
tem-se
pelos
reportado
segmentos
do
que
essa
cólon
quantidade
(ascendente,
se
divide
transversal,
descendente e sigmoide) e essa diferença também é válida para a variedade de
espécies, chegando a alojar 500 espécies diferentes (FIOCCHI e SOUZA, 2012;
LIÉVIN et al, 2000).
Ainda não está totalmente elucidado como se dá a colonização inicial do TD.
No entanto, pensa-se que as bactérias anaeróbias facultativas são as que primeiro
se instalam. No metabolismo bacteriano, o oxigênio será consumido tornando o
ambiente ideal para a colonização de anaeróbias estritas. Após a colonização da
microbiota, a sua aderência se dá pela participação de adesinas que compõem a
parede celular bacteriana e que se ligam a receptores específicos das células da
mucosa intestinal. A interação entre esses dois elementos garante a fixação dos
micro-organismos (PEREIRA, 2012; VAEL e DESAGER, 2009; THOMPSON et al,
2007).
O intestino humano começa a ser colonizado no momento seguinte ao
19
nascimento podendo ser influenciado por diversos fatores internos e externos.
Quanto aos fatores internos pode-se citar a anatomia e fisiologia do órgão, o pH
local, a genética e a resposta imunológica do indivíduo. E quanto aos fatores
externos tem-se o tipo de parto (natural ou cesáreo), a composição da microbiota
materna, constituintes ambientais, dieta e uso de medicamentos (FANARO, 2003).
Para verificar a contribuição das influências externas para a instalação da
microbiota intestinal na primeira infância, Penders et al (2006) realizaram um estudo
de coorte (KOALA, Holanda) envolvendo 1.032 crianças com um mês de vida.
Amostras de fezes foram coletadas e submetidas a análises moleculares
quantitativas para enumerar espécies como Escherichia coli e Clostridium difficile e
os grupos das Bifidobactérias, Bacteroides e Lactobacilos. E ainda foi aplicado um
questionário junto aos pais para coletar informações sobre saúde da mãe e sobre o
ambiente, composição e alimentação familiar.
Entre os principais resultados deste estudo, os pesquisadores observaram
que o uso de antibióticos reduziu as unidades formadoras de colônia (UFC) de
bifidobactérias, sendo encontradas 10,29 log10 UFC.g-1 de fezes em crianças que
fizeram antibioticoterapia e 10,7 log10 UFC.g-1 em crianças que não fizeram. A
população de bifidobactérias também foi diferente quando se relacionou com o tipo
de parto: crianças nascidas de parto natural (via vagina da mãe) tinham uma
população de bifidobactérias maior em relação às crianças nascidas de parto
artificial (cesariano), 10,80 e 10,38 log10 UFC.g-1 de fezes, respectivamente. Em
adição, observou-se que houve diferença quanto à colonização por E. coli, C.
difficiles e lactobacilos em crianças alimentadas com fórmulas (9,84, 7,43 e 8,93
log10 UFC.g-1, respectivamente) e crianças amamentadas (9,06, 4,53 e 8,54 log10
UFC.g-1, respectivamente). Os autores sugerem que fatores relacionados à mãe
como a dieta, o uso de probióticos e antibióticos parecem não interferir diretamente
na colonização dos bebês, ao passo que o tipo de alimentação, o uso de
antibióticos, o tipo de parto, hospitalização, prematuridade e a existência ou não de
irmãos mais velhos são fatores que se correlacionam fortemente com a instalação
da microbiota intestinal de neonatos.
Reporta-se que, só a partir dos 18 meses de vida, a microbiota intestinal do
indivíduo alcança a comunidade clímax, pois já se apresenta bem estabelecida e
com a densidade semelhante a encontrada em indivíduos adultos (MELLO et al,
2009; BERNAL, 2004; HOPKINS et al, 2002).
20
Apesar de permanecer quantitativamente estável, a composição da microbiota
intestinal pode sofrer alteração ao longo da vida. Em um estudo que avaliou a
diversidade de espécies de bactérias na microbiota fecal humana, Hopkins et al
(2002) afirmaram que a idade do indivíduo é um fator que interfere na composição
da microbiota. Os autores ainda sugeriram que a microbiota intestinal é menos
complexa em crianças do que em adultos e à medida que se envelhece, aumenta-se
a diversidade de espécies de bacterióides ao passo que reduz a população de
bactérias probióticas como as bifidobactérias. Isso acontece porque as mudanças
que ocorrem durante a vida interferem no metabolismo dos grupos bacterianos
ativos e reflete em sua capacidade bioquímica de avançar com o passar dos anos.
Kranich et al (2011) sugerem que a dieta e/ou o uso de antibióticos pode
influenciar a microbiota intestinal e reduzir os efeitos benéficos que lhe são
conferidos. Em um estudo com crianças que fizeram antibioticoterapia, foi observado
que apesar da quantidade de bifidobactérias encontradas nas fezes não ter sido
alterada nas análises antes e depois do tratamento, o uso de antibiótico pode ter
impacto em nível de espécie e diversidade de população (SERAFINI et al, 2013).
2.1.1 O Papel da microbiota intestinal
A composição da microbiota do TD chama a atenção de pesquisadores
devido a sua complexidade e dinamismo e por haver evidências de uma intrínseca e
direta relação com a saúde e bem estar do indivíduo. Os mecanismos pelos quais
essa relação acontece ainda não estão totalmente elucidados. No entanto supõe-se
que exista uma relação de mutualismo entre a microbiota e o hospedeiro, onde os
micro-organismos se beneficiam de um ambiente protegido com alto teor de
nutrientes, em troca de desempenhar funções vitais para o indivíduo (GASKINS et
al, 2008).
A microbiota tem um papel importante na proteção ecológica do hospedeiro e
através de um fenômeno conhecido como efeito barreira ou resistência à
colonização, onde bactérias probióticas impedem que bactérias patogênicas se
estabeleçam na mucosa. Pois, quando isso acontece, promove o desequilíbrio da
microbiota e torna o organismo mais suscetível a doenças (MECPHERSON e
HARRIS, 2004).
21
Este efeito de barreira ou resistência pode ocorrer seguindo três vias de ação:
quando as bactérias probióticas alteram o pH intraluminal ao produzirem compostos
orgânicos ácidos decorrentes da atividade fermentativa (inibindo assim as bactérias
patogênicas que não resistem aos ambientes ácidos); quando competem com as
bactérias patogênicas para obtenção de nutrientes; ou quando produzem muco e
proteínas metabolicamente ativas que auxiliam na destruição de micro-organismos
indesejáveis (MORAIS e JACOB, 2006; FOOKS e GIBSON, 2002).
Há indícios de que as bactérias probióticas da microbiota intestinal podem
atuar modulando o sistema imune em crianças com efeito que pode perdurar até a
fase adulta (ARSLANNOGLU et al, 2008; KALLIOMAKI et al, 2003). Abrahamsson
et al (2012) concluíram que a baixa diversidade da microbiota intestinal no início da
vida está associada ao aumento do risco de doenças alérgicas, pois, os autores
observaram maior incidência de eczemas atópicos subsequentes durante o primeiro
mês de vida em humanos com baixa diversidade microbiana intestinal.
Em adição, a microbiota intestinal influencia os processos metabólicos e
nutricionais, pois participam da síntese de vitaminas do complexo B e melhoram a
biodisponibilidade de micronutrientes. O aumento da superfície de absorção através
da proliferação de enterócitos é mediado por produtos da fermentação bacteriana
(predominantemente de lactato e butirato). A microbiota pode favorecer também o
aumento da expressão de proteínas específicas de ligação de minerais em conjunto
com a degradação da complexação mineral-fitato. Além disso, a partir do momento
que a microbiota fermenta os carboidratos não digeridos no TD superior, forma
compostos ácidos, como os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), que, em vez de
serem elminados juntamente com as fezes, são reabsorvidos pela mucosa intestinal
num processo conhecido como salvamento energético (SCHOLZ-AHRENS et al,
2007; KAUR e GUPTA, 2002).
Tem-se discutido que a ingestão de alimentos fonte de prebióticos ou
enriquecidos com bactérias probióticas é a alternativa mais eficaz para contribuir
com o desenvolvimento da microbiota benéfica e prevenir doenças infecciosas do
TD (BRANDT, 2006).
2.1.2 Fisiologia do gênero Bifidobacterium e os reflexos na saúde do
indivíduo.
22
O gênero Bifidobacterium é constituído de 30 espécies das quais 11 são de
origem humana (B. adolescentis, B. angulatum, B. bifidum, B. breve, B. catenulatum,
B. dentium, B. gallicum, B. infantis, B. longum, B. pseudocatenulatum e B. scardovii).
Estão agrupadas entre as bactérias láticas, mas se distancia dos demais gêneros
devido à forma de fermentação da glicose que ocorre pela via frutose-6-fosfato,
produzindo ácido acético e ácido lático numa proporção de 3:2. Devido a essa
peculiaridade, esta via de fermentação é conhecida como “via bífida”. O gênero
Bifidobacterium produz a enzima frutose-6-fosfato fosfoquetolase que degrada
frutose-6-fosfato em acetil-1-fosfato e eritrose-4-fosfato (GOMES e MALCATA,
1999).
Bifidobactérias são gram-positivas, não formadoras de esporos, desprovidas
de flagelos, anaeróbias estritas com morfologia celular variável. São organismos
heterofermentativos e capazes de utilizar a galactose, glicose, lactose e frutose
como fonte de carbono. A temperatura ótima para seu crescimento varia entre 37°C
e 41°C com pH entre 6 e 7 (GOMES e MALCATA, 1999).
estirpes de bifidobactérias são cada vez mais utilizadas em intervenções
terapêuticas devido
ao
seu
potencial probiótico.
Quando
probióticos
são
administrados em humanos traz benefícios à saúde, pois viabiliza a redução de
bactérias potencialmente patogênicas que tentam colonizar o TD (FANNING et al,
2012; SAVARD et al, 2011; BADARÓ et al. 2008).
A partir de estudo in vivo, tem-se reportado que estirpes do gênero
Bifidobacterium diminui o risco de infecção e alivia parcialmente danos nos tecidos
gástricos provocados pelo patógeno Heliobacter pylori (CHENOLL et al, 2010). Ainda
não está totalmente elucidado o mecanismo de ação das bactérias bífidas em
relação a este patógeno, mas há evidências de que essas bactérias probióticas
bloqueiam a função intracelular patogênica da espécie H. pylori por meio de
mecanismos moleculares. Outra possibilidade é que bifidobactérias, com sua
capacidade de suprimir processos inflamatórios, afetem negativamente a regulação
das vias de sinalização do fator nuclear kappa-Beta (NF-KB), um complexo proteico
que media as respostas inflamatórias da mucosa gástrica (SHIRASAWA et al, 2010).
O gênero Bifidobacterium é também conhecido por demonstrar efeito protetor
em relação à carcinogênese do cólon por induzir o aumento da apoptose de células
pré-cancerígenas da mucosa intestinal (ROLLER, 2004; FEMIA et al, 2002). LeBlanc
e Perdigón (2005) realizaram um estudo com camundongos Balb-c, onde foram
23
administrados diariamente, por seis semanas, bactérias probióticas (adicionadas ao
iogurte). Além disso, um dos seis grupos experimentais foi tratado com a substância
cancerígena 1-2 dimetil-hidrazina (DMH). Em seguida avaliou-se o efeito dessas
cepas probióticas na redução da atividade das enzimas β-glucuronidase e nitroredutase (enzimas relacionadas com o desenvolvimento de câncer de cólon) e
observaram que as atividades dessas enzimas foram maiores no grupo controle (que
recebeu leite desnatado) do que no grupo de ratos tratados com iogurte. Com isso,
concluíram que, a administração de bactérias probióticas reduziu a atividade das
enzimas β-glucuronidase e nitro-redutase por favorecer a resposta imunológica nos
ratos.
A ingestão de estirpes de bifidobactérias também pode reduzir a gravidade da
diarreia aguda, principalmente quando administrados em crianças (THIBAULT et al,
2004; D’SOUZA et al, 2002). Um estudo prospectivo e randomizado, realizado com
crianças de três a 36 meses de idade com diagnóstico de diarreia aguda, avaliou,
individualmente, o efeito de quatro preparações probióticas (contendo [1]
Lactobacillus casei, [2] Saccharomyces boulardii, [3] Bacillus clausii e [4] uma
mistura de L. delbrueckii variação bulgaricus, L. acidophilus, Streptococcus
thermophilus e Bifidobacterium bifidum). A duração total da diarreia foi menor nos
grupos que receberam as preparações 1 e 4 do que nos grupos 2 e 3, que por sua
vez, apresentaram resultados semelhantes ao grupo controle que só recebeu
reidratação oral. Recomenda-se então o uso de probióticos no tratamento de diarreia
aguda em crianças por ter demonstrado eficácia no reestabelecimento da saúde, no
entanto, mais estudos são necessário para padronizar a prescrição (CANANI et al,
2007).
Tem-se sugerido que a ação das bifidobactérias melhora a capacidade de
adesão na mucosa intestinal de humanos e, consequentemente, impede que
patógenos se instalem. Além disso, bifidobactérias produzem metabólitos que
melhoram as condições do lúmem. Os ácidos graxos de cadeia curta (AGCC), por
exemplo, influenciam positivamente a saúde do hospedeiro por meio de múltiplos
mecanismos de sinalização (RUSSEL, 2013). Para Smith et al (2013), os AGCC
promovem a homeostase da microbiota do cólon e corroborem com a atividade
metabólica por reduzirem o pH local. Esses ácidos orgânicos são compostos de um
a seis carbonos e constituem os principais ânions do conteúdo colônico,
compreendendo de 60 a 150 mmol/litro, sendo que, deste total, 90 a 95% são
24
formados de acetato (2C), propionato (3C) e butirato (4C) numa proporção de
60:25:15 (CAMPOS et al, 1999).
O butirato e o propionato são determinantes na fisiologia do intestino grosso,
e promovem com a saúde da mucosa (MACHINSKY, 2008). O butirato é utilizado
pelos colonócitos como a principal fonte de energia promovendo seu crescimento e
multiplicação e contribui com a formação de muco. Estes eventos implicam na
proteção da mucosa contra inflamação (SHIMOTOYODOME et al, 2005; STEVENS
e HUMES, 1998). Em seu estudo com ratos Wistar, Matias (2007) concluiu que o
butirato produzido pela fermentação colônica contribuiu para promoção de uma
mucosa mais resistente a patógenos e carcinógenos.
Entre outros objetivos, Haenen et al (2013) avaliaram a composição e
concentração luminal de AGCC em 20 suínas adultas. A dieta dos animais foi
complementada por duas semanas com amido resistente como forma de favorecer a
produção
desses ácidos.
Como
resultado,
os autores
observaram
maior
concentração de AGCC no ceco e no cólon que foi associado com a melhoria da
integridade do intestino, o que sugere que há uma interação entre a dieta, o
metabolismo da microbiota intestinal e o hospedeiro.
No que concerne às ações do acetato, ele é considerado importante fonte de
energia e estrutura para a síntese de ácidos graxos de cadeia longa. É o único dos
ácidos que alcança a circulação sistêmica podendo ser utilizado como fonte de
energia na lipogênese (BASSON e SGAMBATI, 1991). Para isso, é absorvido e
transportado pela veia porta-hepática podendo, inclusive, ser utilizado como
substrato para a neoglicogênese juntamente com o propionato.
À medida que aumenta a concentração de AGCC diminui o pH intraluminal
(MATIAS, 2007; WHELAN et al, 2005). Osuka et al (2012), em seu estudo com
pacientes internados em terapia intensiva, verificaram que o pH das fezes de
pacientes com bacteremia era mais alcalino (média de 7,14) quando comparados
com o pH das fezes de voluntários saudáveis (média de 6,63). A partir de análises
de regressão dos dados coletados, observaram que, quando o nível de pH se elevou
em uma unidade, a incidência de bacteremia triplicou e a mortalidade foi mais
recorrente. Com isso, os autores concluíram que o pH fecal pode ser utilizado como
parâmetro de avaliação da evolução clínica de paciente internados em terapia
intensiva. Em suma, a alta concentração de AGCC e pH reduzido são índices
indiretos que demonstram atividade probiótica e, conjuntamente, esses fatores
25
modulam a fisiologia colônica que favorecem o metabolismo de bifidobactérias
(TOPPING e CLIFTON, 2001)
Em adição, Sakata (2007) verificou que a administração de AGCC em ratos
proporcionou o aumento das criptas celulares. A ocorrência deste evento, tanto nas
células do ceco quanto nas células do cólon distal, reafirma a hipótese de que os
AGCC tem relevante importância nutricional, uma vez que pode ocasionar o
aumento da área de absorção de alguns nutrientes.
É sugerido que a produção de AGCC na região colônica implica na resposta
imune a bactérias aeróbias e nas doenças inflamatória que afetam o TD. O butirato,
por exemplo, altera a produção e liberação de citocinas pró e anti-inflamatórias,
regula o processo de apoptose, diferenciação e maturação de leucócitos (VINOLO,
2010). Royce (2013), por exemplo, demonstrou que os AGCC podem danificar a
integridade da parede celular de bactérias como E. coli por romper a camada lipídica
da membrana e inviabilizar o seu metabolismo.
A quantidade e proporção de AGCC no organismo são influenciadas pelo tipo
de dieta, porção do intestino e o tipo da microbiota presente. Sendo assim, os
mecanismos que implicam na produção e síntese de AGCC e as alterações que
causam na fisiologia do TD suportam mais estudos que correlacione esses dados.
2.2 PREBIÓTICOS
Inicialmente os prebióticos eram definidos como ingrediente não-digerível que
afeta beneficamente o hospedeiro por estimular seletivamente o crescimento e/ou
atividade das bactérias probióticas presentes no TD e assim melhora a saúde do
indivíduo (GIBSON e ROBERFROID, 1995). Em adição, um novo conceito foi
proposto por Gibson e colaboradores (2004), onde eles definiram prebióticos como
sendo ingredientes alimentares fermentáveis que provocam alterações específicas
tanto na composição quanto na atividade da microbiota gastrintestinal e confere
bem-estar e melhoria da saúde do hospedeiro.
Os prebióticos estão inseridos no grupo de alimentos/ingredientes com
alegação de propriedade funcional. Esta alegação pode ser utilizada desde que a
porção do produto pronto para consumo forneça no mínimo três gramas de fibras se
o alimento for sólido ou 1,5 gramas se o alimento for líquido (BRASIL, 2008).
Para um composto ser considerado prebiótico ele deve atender a três
26
critérios: (1) resistir à acidez gástrica, a hidrólise das enzimas digestivas e absorção
gastrintestinal; (2) ser fermentado pela microbiota intestinal; e, (3) estimular
seletivamente o crescimento de bactérias específicas de modo a transformar a
microbiota em uma microbiota saudável. Por sua vez, a microbiota intestinal é
considerada
saudável
quando
as
cepas
de
bifidobactérias
predominam
(quantitativamente e metabolicamente) sobre as espécies potencialmente nocivas ao
hospedeiro (ROBERFROID, 2007; SAAD, 2006; GIBSON e ROBERFROID, 1995).
2.2.1 Mecanismos de ação e a interação com as bactérias probióticas.
O avanço das pesquisas em prebióticos tem se intensificado desde que foi
elucidado que a ingestão deste composto na dieta pode favorecer o equilíbrio da
microbiota intestinal por estimular o crescimento e metabolismo de bifidobactérias.
Em vista disso, é atribuído aos prebióticos um enorme potencial de uso e aplicação
em vários campos da saúde humana, para o tratamento de infecções, alergias,
inflamações e neoplasias, principalmente, os que estão diretamente relacionados
com o TD (SAAD et al, 2011; SHANAHAN, 2003).
No Japão e em alguns países da Europa os prebióticos já são amplamente
consumidos como adoçantes funcionais, e são utilizados na produção de bebidas
lácteas, balas, doces, biscoitos, geleias, pudins e gomas de mascar (FERREIRA e
TESHIMA, 2000).
O Ministério da Saúde, por meio da Agência Nacional de Vigilância Sanitária
(ANVISA) pressupõe que administração de prebióticos em quantidades satisfatórias
tem como efeito a promoção da saúde relacionada à microbiota que pode incluir a
imunoestimulação, melhor digestão e absorção, inibição do crescimento de
enteropatógenos, redução do colesterol sérico, redução na formação de toxina,
redução de diarreia/constipação e inflamações e infecções intestinais (SAAD et al,
2011; BRASIL, 2008; MANNING e GIBSON, 2004).
Presume-se que a fermentação de prebióticos reduz os eventos diarreicos por
aumentar as criptas intestinais e por contribuir com a redução da microbiota
patogênica. A partir de um estudo placebo-controle, randomizado, duplo-cego
Drakoularakou et al (2009) avaliaram o efeito de um prebiótico, galactooligossacarídeo (GOS), sobre a gravidade e/ou incidência da diarreia do viajante
27
(DV) em indivíduos saudáveis. Pra isso, foram recrutados 201 voluntários que
viajaram por pelo menos duas semanas. Foi observado que houve diferença
significativa (p<0,05) entre o grupo que recebeu o prebiótico (grupo teste) e o grupo
que recebeu maltodextrina como placebo (grupo controle). O grupo teste apresentou
menor incidência de eventos diarreicos quando comparados ao grupo controle. Além
disso, mesmo as pessoas que ingeriram GOS e relataram ter diarreia, afirmaram que
a intensidade da dor e o número de evacuações foram significativamente menores
(p<0,05). Em vista disso, os autores sugerem que, o prebiótico, além de favorecer a
proteção direta contra a adesão de patógenos no intestino, estimulou a resposta
imune dos voluntários.
Tem-se investigado os possíveis mecanismos de ação dos prebióticos. Eles
atuam como fibras fermentáveis e por isso são caracterizados como composto
bifidogênico. Em vista disso, chegam intactos ao intestino e servem de substrato
para as bactérias probióticas, que, ao metabolizar torna o meio ótimo para o seu
crescimento em detrimento da ação contrária para as bactérias potencialmente
patogênicas (SAAD, 2006; GIBSON e ROBERFROID, 1995; FULLER, 1989).
Sabe-se que os prebióticos, de modo geral, favorecem o crescimento das
bactérias probióticas. No entanto, Oliveira e Pereira (2013) não encontraram
resultados significativamente positivos em um estudo que avaliou o efeito prebiótico
da farinha de banana verde (Musa paradisiaca L) no aumento da população de
lactobacilos no TD de ratos da raça Wistar. Os resultados foram estatisticamente
iguais quando se compararam os três grupos experimentais (tratamento com farinha
da casca da banana verde, farinha da polpa da banana verde e tratamento com
ração padrão). Utiyama et al (2006) também não encontraram resultados positivos
quando complementaram a dieta de suínos recém-desmamados com o prebiótico
mananoligossacarídeo (MOS). Neste estudo, o objetivo foi avaliar o efeito do MOS
como uma
das alternativas aos agentes antimicrobianos (promotores
do
crescimento), sobre a microbiota intestinal, a ocorrência de diarreia e o desempenho
de leitões desmamados.
Em relação a estudos realizados com humanos, os efeitos dos prebióticos
sobre a microbiota intestinal ainda são oscilantes. Whelan et al (2009), por exemplo,
não encontraram diferença significativa no estudo que verificou a quantidade de
bifidobactérias nas fezes de crianças quando se comparou o grupo que recebeu
fórmula enteral adicionada de prebiótico e o grupo que recebeu apenas a fórmula
28
enteral. Já Bakker-Zierikzee et al (2005) sugeriram que fórmula infantil adicionada
com uma mistura de Fruto-oligossacarídeo (FOS) e GOS (numa concentração de 6
g/L) pode proporcionar os mesmos benefícios à microbiota intestinal que o
aleitamento materno. Eles chegaram a essa conclusão após analisar e comparar a
composição da microbiota fecal de recém-nascidos que receberam os dois tipos de
alimentação durante os primeiros quatro meses de vida. Em adição, Ben et al (2004)
observaram que a composição da microbiota de crianças que receberam aleitamento
materno e fórmula com GOS foi estatisticamente semelhante entre si e diferente da
microbiota de crianças que se alimentaram da fórmula padrão.
A ingestão de prebióticos também pode contribuir com a redução de
alergenicidade e minimizar os eventos de alergia alimentar (MORAIS e JACOB,
2006). Com o intuito de avaliar se o efeito protetor dos prebióticos é duradouro,
Arslannoglu e outros autores (2008) realizaram um experimento em que foi ofertado
a lactentes saudáveis uma fórmula hipoalergênica contendo oito gramas de
prebiótico (GOS e FOS) durante os primeiros seis meses de vida. Essas mesmas
crianças foram acompanhadas até completarem dois anos de idade. Como resultado
os pesquisadores observaram menor incidência de alergias e urticárias no grupo
intervenção (7,6% e 1,5%, respectivamente) quando comparado ao grupo placebo
(20,6% e 10,3%, respectivamente). E como consequência, ao longo de dois anos, as
crianças que consumiram prebióticos tiveram menos episódios de infecção e menor
prescrição médica de antibióticos. Segundo os autores, a modulação do sistema
imunológico por meio da modificação da microbiota intestinal pode ser o mecanismo
que explica a ação benéfica do consumo de prebióticos.
É atribuída também a ingestão de prebiótico a proteção contra câncer de
cólon. Esta pode ocorrer devido ao aumento da resposta imune, redução da
resposta inflamatória, inibição de formação de células tumorais. Há evidências
quanto à habilidade que os lactobacilos e as bifidobactérias têm em modificar a
microbiota intestinal e diminuir o risco de câncer pela sua possível capacidade em
diminuir a atividade das enzimas β-glicuronidase e nitroredutase, produzidas por
bactérias patogênicas (DENIPOTE et al., 2010; LEBLANC e PERDIGÓN, 2005).
Brady et al (2000) discutem que o efeito correlato entre o consumo de
prebióticos e as bactérias probióticas do cólon pode implicar na atenuação do
desenvolvimento de câncer de cólon. Burns e Rowland (2000) concordam com a
afirmação, mas salienta que ainda são necessários estudos mais controlados com
29
humanos e que façam uso de biomarcadores das enzimas β-glicuronidase e
nitroredutase.
Quanto aos efeitos nutricionais, vários estudos tem tentado explicar a
influência do consumo de prebióticos no mecanismo na absorção de minerais. Por
ser bifidogênico, os prebióticos auxiliam na melhora das condições fisiológicas do
cólon mediando a proliferação de enterócitos, favorecendo a expressão de proteínas
específicas de ligação dos minerais (SCHOLZ-AHRENS et al, 2007; KAUR e
GUPTA, 2002).
Há evidências de que a fermentação de prebióticos favoreça a absorção de
cálcio. Uma possível explicação é que, quando pH colônico diminui, aumenta a
concentração de minerais ionizados como o cálcio e isso facilitaria a sua absorção.
Outra possibilidade é que haja um efeito osmótico dos prebióticos na transferência
do cálcio do intestino delgado para o intestino grosso. Isso faz com que a passagem
de água para o intestino grosso seja mais intensa, permitindo assim que o cálcio se
torne mais solúvel e mais biodisponível (FOOKS e GIBSON, 2002; KAUR e GUPTA,
2002; SCHOLZ-AHRENS e SCHREZENMEIR, 2002).
O consumo de prebióticos tem sido relacionado com o metabolismo de
minerais. E os indivíduos com alta demanda, como aqueles em fase de crescimento,
podem ser beneficiados com a adição de prebióticos na alimentação (SCHOLZAHRENS et al, 2007). No entanto, o consumo de 8g do prebiótico FOS, por 21 dias,
não melhorou a absorção de cálcio em meninas jovens (nove a 13 anos) na fase de
pré-menarca. Uma possível explicação discutida pelos autores é que, apesar da
proliferação de bifidobactérias viabilizar a absorção colônica, essa absorção é
realizada tardiamente, 36-48 horas após a ingestão, e a dosagem com marcadores
isotópicos antes desse intervalo fornecerá resultados imprecisos (GRIFFIN et al,
2002).
A maior ingestão de prebióticos tem sido recomendada para melhorar a saúde
do indivíduo, principalmente de grupos mais vulneráveis como crianças, idosos,
imunossuprimidos, mulheres grávidas ou indivíduos que fazem antibioticoterapia.
Porém, vale ressaltar que prebiótico não é uma droga administrada com a intenção
de curar uma doença, mas um alimento que é valorizado por contribuir com o bem
estar e melhoria da qualidade de vida dos indivíduos por atuar de forma pontual ou
sistêmica no bom funcionamento do TD e sistema imunológico (LICHT et al, 2012;
DELGADO et al, 2011).
30
Pelo fato do mecanismo de ação dos prebióticos no organismo ainda não
estar inteiramente elucidado, estudo de intervenção em humanos ainda são
necessários, principalmente para esclarecer qual o prebiótico mais eficaz, sua
origem e melhor forma de administração e consumo (LICHT et al, 2012; DELGADO
et al, 2011; GEIER et al, 2007).
2.2.2 Fruto-oligossacarídeos: uma abordagem acerca dos benefícios à
saúde.
O Fruto-oligossacarídeo (FOS) é classificado como prebiótico porque atende
aos três critérios básicos: resiste à acidez, hidrólise e absorção gastrintestinal, é
fermentado pela microbiota intestinal e estimula seletivamente o crescimento de
bactérias específicas. Essas características lhe são conferidas devido à configuração
beta de seus monômeros de frutose que o faz não-digerível pelas enzimas
digestivas, uma vez que essas enzimas só hidrolisam ligações do tipo alfaglicosídicas (FIGUEROA-GONZÁLEZ, 2011; ROBERFROID, 2007; GIBSON e
ROBERFROID, 1995).
O FOS, juntamente com a inulina, compõe um subgrupo dos frutanos que são
classificados como carboidratos de reserva com estrutura linear ou ramificada com
moléculas unidas por ligações frutosil-frutose do tipo beta-2,1. Este tipo de ligação,
além de ser responsável pela não-digestibilidade desses carboidratos (fazendo-os
semelhantes às fibras alimentares), confere ao FOS a característica de possuir baixo
valor calórico (aproximadamente 2 kcal/g) (BENKEBLIA, 2013; PEREIRA, 2013;
FAGUNDES e COSTA, 2003; MOLIS et al, 1996).
Existem características pontuais que diferem o FOS da inulina: quando usado
como ingrediente, não confere viscosidade às preparações e atribui sabor doce,
tendo seu grau de doçura equivalente a 1/3 da sacarose; e é considerado mais
higroscópico. Por isso, o FOS é muito valorizado como ingrediente dietético na
preparação de barras de cereais, pães, biscoitos e sobremesas como o sorvete,
fazendo com que o consumo por indivíduos diabéticos seja seguro. Além disso,
eleva a quantidade de fibras do produto final (BENKEBLIA, 2013; ROBERFROID,
2007; SILVA, 2007).
O grau de polimerização (GP) ainda é a forma mais evidente de diferenciar
31
FOS e inulina. O FOS pode ser considerado um hidrocarboneto com baixo GP em
comparação com outros frutanos e, consequentemente, tem baixo peso molecular
(YUN, 1996). Para Benkeblia (2013), a classificação do FOS ainda é confusa, pois
alguns autores defendem que para ser classificado como FOS deve possuir GP com
valores entre dois e 12, outros dizem que FOS é um polímero que agrupa de duas e
20 moléculas de monossacarídeos. Mas, segundo a mesma autora, é conveniente
aceitar a definição da IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry)
que afirma e considera FOS o frutano que possui GP inferior a 10.
O Japão ainda é o maior consumidor mundial de FOS, seguido dos países da
Europa. E este consumo elevado está mais associado às suas propriedades
funcionais do que às suas características sensoriais e seu amplo emprego em
preparações alimentares (PASSOS e PARK, 2003; NINESS, 1999).
O FOS é preferencialmente fermentado por bifidobactérias e, em virtude
disso, favorece seu crescimento e metabolismo (FOOKS et al, 1999). Rossi et al
(2005), em um estudo que avaliou a utilização dos frutanos FOS e inulina como fonte
de carbono de 55 estirpes diferente de bifidobactérias, observaram que 52
cresceram na presença de FOS e apenas oito estirpes cresceram na presença de
inulina. Quando adicionaram inulina e FOS em uma batelada única, observou-se que
o FOS foi primeiramente consumido e só depois a inulina foi utilizada. Com isso, os
autores sugeriram que o FOS tem um efeito bifidogênico mais evidente quando
comparado à inulina.
A ingestão de FOS pode ser benéfica à saúde humana pelo efeito prebiótico
que promove no organismo como melhorar a digestibilidade e trânsito gastrintestinal
(PASSOS e PARK, 2003). Dentre os benefícios relacionados com a ingestão de
FOS, Yasuda et al (2012) sugerem que este prebiótico pode aumentar a resposta
imunológica de indivíduos por ativar a mucosa intestinal por meio da proliferação de
bactérias probióticas. Os autores induziram alergia à proteína do ovo em
camundongos e, após suplementação dietética com FOS (2,5% em dieta ad libtum),
observaram que houve redução significativa do nível sérico de IgG, ao mesmo
tempo que aumentou os níveis de IgA quando comparados ao grupo controle. Isso
ocorre porque o IgA, mediado pelo FOS, é ativado e bloqueia competitivamente a
ativação do IgG. Com isso, os autores concluíram que a suplementação com FOS
pode prevenir e/ou atenuar a inflamação peritoneal alérgica induzida por
ovoalbulmina.
32
Alguns efeitos benéficos do consumo de FOS não foram satisfatoriamente
confirmados. Respondek et al (2013) observaram que a adição de 10% de FOS à
dieta hipercalórica oferecida aos ratos durante sete dias induziu à insulinemia, mas
essa concentração não foi suficiente para induzir a redução do peso corporal, uma
vez que o grupo suplementado ganhou 21% de peso corporal a mais do que o grupo
controle. Em adição, em um estudo com indivíduos saudáveis o consumo de 5 g e 8
g de FOS não modificou os relatos de fome e nível de saciedade (HESS et al, 2010)
Tem-se investigado o consumo de FOS por crianças e seus reflexos na
saúde. Quando adicionado conjuntamente com o GOS em fórmula infantil, o FOS
promoveu efeito bifidogênico no cólon de crianças alimentadas durante um período
de seis semanas. Após a análise das fezes, constatou-se que a mudança na
concentração de AGCC e lactato e na redução do pH foram semelhantes aos
mesmos parâmetros analisados em crianças amamentadas com leite materno
(HAARMAN e KNOL, 2005; KNOL et al. 2005; WHELAN et al 2005).
Em adição, Kapiki et al (2007) também associaram, a partir de um estudo
prospectivo e duplo-cego com 56 crianças prematuras, a maior colonização de
bifidobactérias e redução das colônias de E. coli e enterococos com a ingestão de
uma dieta com FOS numa concentração de 4 g/L. Os autores sugerem ainda que a
suplementação teve influência também no número de evacuações diárias. E por isso
aceitam a ideia de que a suplementação da dieta com FOS pode favorecer o rápido
crescimento de bifidobactérias no intestino de crianças prematuras e diminuir o
número de bactérias patogênicas, modulando a microbiota e viabilizando melhorias
na saúde do TD.
Guimber et al (2010) demonstraram que o consumo de FOS pode trazer
benefícios à saúde de crianças que fazem uso de alimentação enteral. Um estudo foi
realizado com vinte crianças com idade média de 11 anos que receberam
alimentação enteral suplementada com um mix de fibras contendo 10,3% de FOS.
Os autores observaram diferença significativa na composição da microbiota e pH do
lúmem quando comparou-se os resultados obtidos antes e após o período de
intervenção. Indicando que o uso de FOS, em conjunto com outras fibras, pode
melhorar a saúde intestinal de crianças que fazem uso da alimentação enteral.
No entanto, a administração de FOS em crianças suportam mais estudos uma
vez que ainda não está totalmente elucidado as condições de consumo e seus
efeitos. Duggan et al (2003) avaliaram os efeitos de suplementação alimentar com
33
FOS, com e sem adição de zinco, sobre a prevalência de diarreia em uma
comunidade com elevada carga de infecções gastrintestinais. Os autores
observaram que, após ingerir cereal matinal com FOS (numa proporção de 0,55g de
FOS/15 g de cereal), os indivíduos não apresentaram nenhuma mudança quanto a
prevalência de toxinfecções intestinais. E após suplementar a dieta enteral de
neonatos prematuros nos primeiros 7 dias de vida com uma mistura prebiótica (FOS
e GOS) e relacionar com permeabilidade intestinal, Westerbeek et al (2011)
sugeriram que a redução da permeabilidade intestinal não melhorou com a ingestão
dos prebióticos, mas benefícios como a modulação da microbiota colônica e melhora
na resposta inflamatória intestinal foram observados.
Apesar dos resultados serem ainda contraditórios, em muitas pesquisas
recomenda-se o consumo de FOS a diversos grupos populacionais (WHELAN et al
2005). No entanto as formas comerciais desse prebiótico ainda são escassas e
onerosas. Em vista disso, as fontes naturais representam uma alternativa importante
e os vegetais fonte de FOS tem sido alvo de pesquisas. E é neste cenário, a raiz de
Yacon tem chamado a atenção e por causa disso, seu cultivo e consumo tem sido
valorizado e disseminado pelo mundo (TESAN et al, 2009; PASSOS e
PARK,
2003).
2.2.3 Yacon: importante fonte de FOS
É reportado que a raiz de yacon é o alimento natural com maior teor de FOS
existente na natureza. Devido a demosntração de vários efeitos funcionais, este
tubérculo
tem
despertado o
interesse de
pesquisadores e
consumidores
(FERREIRA, 2012; SEMINARIO et al, 2003).
A yacon é uma planta da espécie Smallanthus sanchifolius, pertencente à
família Asteraceae, a mesma família do girassol (Helianthus annuus). É classificada
como herbácea perene que alcança até 2,5 m de altura quando atinge a maturidade
reprodutiva por volta dos sete meses após o plantio. A planta é constituída de um
sistema radicular que representa a parte de maior interesse comercial. Pode ter de
quatro a 20 raízes tuberosas com formatos irregulares medindo de dez a 25 cm e
pesando até 1,2 quilos (GRAU e REA, 1997).
A yacon é uma raiz de origem andina, cujo nome deriva da palavra “Yaku”
que significa “água”. Também é conhecida por outros nomes regionais como
34
arboloca, Illacon, Llacon, Jinquimila ou Yacon Strawberry (Estados Unidos) ou Poire
de Terre (França) (SEMINARIO et al, 2003; ZARDINI, 1991).
Nos Alpes andinos, o cultivo é feito entre os meses de setembro e novembro
para evitar o tempo seco e as geadas. Em 1982 o plantio foi introduzido na Nova
Zelândia e em 1985 no Japão, onde se intensificaram o consumo e as pesquisas
científicas. Atualmente, é também cultivada na Coreia, Rússia, Taiwan, Estados
Unidos e no Brasil, sendo que as maiores zonas de produção são no estado de São
Paulo, nos municípios de Capão Bonito e Botucatu, com o cultivo feito entre os
meses de julho a janeiro (SILVA, 2007; SEMINARIO et al, 2003).
A yacon apresenta coloração branco-amarelada a amarelo intenso. É muito
apreciada por possuir sabor agradável, ser adocicada, suculenta e refrescante e
geralmente é consumida crua. Desde 2003, o processamento da yacon tem sido
uma alternativa contra a alta perecibilidade e para oferecer outras formas de
consumo como xaropes, sucos concentrados e farinha (FERREIRA, 2012;
SEMINARIO et al, 2003).
Além de ser muito valorizada por possuir baixo teor calórico e baixo índice
glicêmico, a raiz de yacon representa uma boa fonte de cálcio e compostos
fenólicos. Ela é constituída, basicamente, de água e carboidratos, principalmente do
tipo FOS, representando cerca de 20 a 70% da matéria seca. Seu consumo pode
trazer benefício à saúde e contribuir para melhorar a qualidade de vida dos
indivíduos (OJANSIVU et al., 2011; SANTANA e CARDOSO, 2008; SEMINARIO et
al, 2003; TAKENAKA et al, 2003).
Já foram observados os benefícios da yacon em relação ao controle da
síndrome metabólica (VALENTOVÁ et al, 2008), redução dos níveis de glicemia e
resistência aà insulina (SATOH et al, 2013; GENTA et al, 2010; TEIXEIRA et al,
2009), diabetes associada a hiperlipidemia (HABIB et al, 2011) e na redução de risco
de doenças ósseas como a osteoporose (RODRIGUES et al, 2012)
Lobo et al (2011) utilizaram farinha de yacon para avaliar o efeito de frutanos
na biodisponibilidade de ferro em ratos machos da raça Wistar. Foi observado que
após serem depletados por 21 dias, os ratos apresentaram alta eficiência de
regeneração da hemoglobina quando consumiram 35 mg de ferro/kg em forma de
pirofosfato férrico com 7,5% de prebiótico do tipo inulina e FOS ou como farinha de
yacon. A partir daí, concluiu-se que a biodisponibilidade de ferro foi melhorada
quando os ratos consumiram o prebiótico e este resultado foi mais evidente no grupo
35
que consumiu farinha de yacon. Os autores sugerem ainda que, se esses efeitos
forem confirmados em humanos, pode-se pensar na formulação de dietas
enriquecidas com prebióticos para pessoas com deficiência de ferro.
Em adição, Habib et al (2011) analisaram os efeitos do FOS presente na
farinha de Yacon em ratos Wistar com diabetes induzida por estreptozotocina. Os
ratos ingeriram cápsulas contendo farinha de yacon com concentração de 340 mg
ou 680mg/kg/dia durante 90 dias. O FOS foi capaz de proteger os ratos diabéticos
de pico pós-prandial de triacilglicerol plasmático. O tratamento proporcionou uma
diminuição significativa nos níveis de triacilglicerol no plasma em jejum e da
lipoproteína de muito baixa densidade, mas não interferiu no peso corporal dos
ratos.
O consumo da yacon está diretamente associado com a melhoria da saúde
intestinal. Bonet et al (2010) avaliaram o efeito prebiótico da farinha de yacon sobre
a imunidade e a microbiota intestinal em um ensaio com ratos e observaram que
houve crescimento de lactobacilos e bifidobactérias, bem como aumento nos os
níveis de IgA e de diferentes citocinas. Campos et al (2012) avaliaram o potencial
prebiótico da raiz de yacon e recomendaram o consumo em forma de farinha como
alternativa para melhorar a saúde da região colônica e como importante fonte
nutracêutica que também possui atividade antioxidante.
Foi observado também que o consumo de yacon implica em benefícios na
prevenção da carcinogênese do cólon induzida com 1,2-dimetil-hidrazina. Após 20
semanas de ingestão de yacon, Moura et al (2012) observaram diminuição da
multiplicação celular nas criptas aberrantes e no número de adenocarcinomas
invasivos no grupo de ratos Wistar que recebeu dieta suplementada com 1% de
yacon. Com isso, os autores concluíram que a yacon pode reduzir o
desenvolvimento do câncer de cólon induzido quimicamente.
As pesquisas com a raiz de Yacon são promissoras, mas ainda não existe um
consenso quanto a quantidade ingerida e o tempo de consumo de yacon ou de seus
produtos para que sejam conferidos benefícios à saúde. Genta et al (2009), por
exemplo, ofertaram xarope de yacon a mulheres obesas e com resistência à insulina
na pré-menopausa em duas doses diferentes (0,14 e 0,29 g/kg/dia) durante 90 dias
e observaram que a menor concentração foi suficiente para aumentar a saciedade e
frequência da defecação, mas não foi suficiente para alterar a glicemia em jejum e
perfil lipídico. As mulheres que ingeriram o xarope com maior concentração
36
relataram desconfortos abdominais como dor, distensão e gases acumulados. Raga
et al (2009) ofertaram extrato da folha de yacon a ratos com diabetes induzida e
observaram que quando administrada uma dose única de 50 mg.kg-1 resultava na
melhoria discreta e imediata (observado por até uma hora após a ingestão) na
atividade
hipoglicêmica,
ao passo
que o
tempo de
efeito
da atividade
hipoglicemiante do extrato dobrou quando aumentou-se a dose para 100 mg.kg-1.
O cultivo de yacon disseminado por diversas regiões viabiliza o acesso do
consumidor e colabora com a inserção deste vegetal na dieta da população em
geral. Por ser uma importante fonte de FOS, seu consumo tem sido recomendado.
No entanto, percebe-se ainda a necessidade da confirmação da seguridade do seu
consumo e os efeitos benéficos inferidos aos diversos grupos populacionais. A
caracterização da microbiota intestinal, bem como a determinação do pH e produção
de AGCC são formas de verificar os possíveis efeitos da ingestão de Yacon (LOBO
et al, 2011; HABIB et al, 2011; GUIMBER et al, 2010).
37
3 METODOLOGIA
3.1 CASUÍSTICA
Essa pesquisa foi realizada com crianças que frequentavam o Centro
Municipal de Educação Infantil (CEMEI) Tio Teotônio Barbosa, escolhido por meio
de sorteio dentre todos os CEMEI’s registrados na Secretaria Municipal de Educação
de Alegre-ES. Após aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com seres humanos
(CEP) da Universidade Federal de Viçosa (UFV) sob número 028/2012 (Anexo 1),
iniciaram-se as atividades de recrutamento dos pré-escolares.
Todas as crianças incluídas na amostra tiveram sua participação autorizada
por escrito pelos pais ou responsáveis que receberam informações sobre a pesquisa
e assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (Apêndice 1). A partir
daí, utilizou-se uma amostra não probabilística de conveniência, na qual foram
incluídas as crianças saudáveis, com faixa etária entre dois e seis anos, que tiveram
uma frequência de ingestão das preparações à base de farinha de yacon igual ou
acima de 60% do que foi ofertado durante as dezoito semanas de intervenção e que
cujos pais entregaram as amostras de fezes nos momentos e condições
determinados pelos pesquisadores. Foram excluídas da pesquisa as crianças que se
apresentavam com alguma patologia ou fazendo uso de antibiótico.
3.2 DELINEAMENTO EXPERIMENTAL
Este
estudo
caracterizou-se
por
ser
uma
intervenção,
longitudinal,
experimental do tipo pareado avaliando os momentos antes e após a intervenção.
Os indivíduos foram alocados em um único grupo que recebeu uma porção
diária de preparações elaboradas com farinha de yacon, em substituição parcial ou
total a um ou mais ingredientes da formulação convencional, por um período de 18
semanas. Concomitante à intervenção alimentar foi feita uma investigação, por meio
de perguntas diretas aos pais ou responsáveis, sobre patologias clínicas e uso de
antibióticos.
As análises da microbiota foram feitas a partir de amostras de fezes das
crianças coletadas pelos pais em dois momentos distintos: antes e depois das 18
38
semanas de intervenção.
A Figura 1 representa o delineamento experimental.
Figura 1 - Delineamento experimental
3.3 INTERVENÇÃO ALIMENTAR
3.3.1 Protocolo de elaboração da farinha
As raízes de yacon foram adquiridas diretamente de um agricultor do
município de Santa Maria de Jetibá – ES e o processamento da farinha foi realizado
no Laboratório de Técnica Dietética e de Operações Unitárias do Centro de Ciências
Agrárias de Universidade Federal do Espírito Santo (CCA-UFES).
Para obtenção da farinha, as raízes foram lavadas em água corrente,
higienizadas em solução de hipoclorito de sódio a 50 ppm por 15 minutos. Em
seguida, foram descascadas manualmente, cortadas no sentido longitudinal e
trituradas em multiprocessador. Posteriormente, o produto resultante do trituramento
foi mergulhado em solução de ácido cítrico a 0,5% para inibir a oxidação e evitar o
escurecimento. Logo após, foram drenadas (primeiramente em peneiras de uso
doméstico e depois em telas de naylon) e encaminhadas para o secador de
39
bandejas com circulação de ar marca Polidryer, a 70°C por 24 horas.
Após desidratados, a yacon foi triturada em liquidificador doméstico. Depois
de pronta, a farinha foi armazenada em sacolas com fechamento hermético e
acondicionada em freezer a -20°C até o momento do uso.
3.3.2 Análise de FOS da Farinha de Yacon
A análise de FOS foi feita no Instituto de Tecnologia de Alimentos do Centro
de Ciências e Qualidade de Alimentos, Campinas-SP por meio do método
colorímetro-gravimétrico (AOAC, 997.08).
3.3.3 Formulação das preparações à base de farinha de yacon
Três formulações (Apêndice 2) foram elaboradas no laboratório de Técnica
Dietética do CCA-UFES. Essas formulações tinham a farinha da raiz de yacon como
ingrediente adicionado em substituição total ou parcial a um dos ingredientes da
receita convencional e por isso foram denominadas docinho de yacon, bolo de yacon
e biscoito de yacon.
Os critérios para adição da farinha de yacon foram estabelecidos para ofertar
0,14 g de FOS/Kg de peso corporal em cada porção e para manter o aspecto
característico de cada alimento.
3.3.4 Oferecimento e controle do consumo das preparações à base de
farinha de yacon
As preparações foram ofertadas uma vez ao dia em complementação a uma
das refeições feitas no CEMEI (café da manhã, almoço ou café da tarde) durante 18
semanas letivas, de julho à novembro do ano de 2012. A quantidade de farinha
ofertada às crianças foi determinada de acordo com o teor de FOS presente em sua
composição e a média do peso corporal dos pré-escolares, de modo que cada
indivíduo ingerisse diariamente 0,14g de FOS/Kg de peso corporal (GENTA et al,
2009), como segue:
40
Onde:
F= quantidade de farinha de Yacon a ser ingerida diariamente;
P= média do peso corporal dos pré-escolares; e,
FFOS= percentual de FOS na farinha de Yacon.
O controle do consumo das três preparações ofertadas foi feito aplicando-se o
teste de resto-ingestão (FNDE, 2014). Em três momentos não consecutivos (na
terceira, na oitava e na décima terceira semanas) da intervenção, as preparações
foram pesadas antes da oferta e em seguida pesou-se as sobras de cada criança e
fez o calculo de subtração para se obter o valor exato do que foi ingerido. A
aplicação deste teste foi necessário para estimar a aceitabilidade das preparações e
calcular a quantidade de FOS ingerida por cada criança ao final da intervenção.
3.4 ANÁLISE DAS AMOSTRAS DE FEZES
3.4.1 Coleta das amostras de fezes
As amostras de fezes foram coletadas pelos pais dos pré-escolares em
recipientes
estéreis
previamente
codificados
e
logo
após
entregue
aos
pesquisadores. Em seguida, as fezes foram armazenadas em freezer a -80°C até o
momento das análises.
3.4.2 Análise de pH
Para análise do pH fecal, 0,3 mg de fezes foram pesadas em balança
analítica da marca Shimadzu® e transferidas para recipiente de vidro. A partir daí,
adicionou-se 3,0 mL de tampão fosfato-salino (PBS) a 10% e então a solução foi
homogeneizada em agitador por um minuto.
Em seguida mediu-se o pH da solução com pHmetro digital da marca Del-
41
Lab®, modelo DLA-pH e eletrodo universal de vidro com faixa de leitura 0-14 pH.
3.4.3 Determinação da concentração de Ácidos Graxos de Cadeia Curta
(AGCC)
A determinação da concentração de AGCC (acético, butírico e propiônico) foi
feita a partir da pesagem de 100 mg de fezes em balança analítica da marca
Shimadzu® em adição a 1,0 mL de água destilada. A solução foi homogeneizada em
agitador por 30 segundos. Em seguida foi centrifugada por 30 minutos em centrífuga
para eppendorfs (Heraus Megafuge 16R®) calibrada em 13.500 rpm, à temperatura
de 4°C. Após esse período, separou-se o sobrenadante e a solução foi centrifugada
por mais duas vezes nas mesmas condições.
Para as análises, foram injetados 20 mL do sobrenadante em um
Cromatógrafo Líquido de Alta Eficiência (CLAE), marca Shimadzu, equipado com
coluna SCR-101H 300 mm x 7,9 mm, com fluxo da fase móvel de 0,8 mL.min-¹ e
pressão de 87 kgf. Para preparo da fase móvel foi utilizada água em ácido
ortofosfórico 1%. O resultado da concentração foi dado em mg de ácido graxo por
mg de fezes.
3.4.4 Extração e quantificação do DNA das amostras de fezes
3.4.4.1 Obtenção da cultura pura
As culturas de bactérias bífidas (ATCC 15707; ATCC 15703) pertencentes ao
Banco de Cultura do Laboratório de Culturas Láticas da Universidade Federal de
Viçosa-MG (UFV) foram mantidas em caldo MRS (Man, Rogosa e Sharpe)
modificado até o momento de extração do DNA.
A extração do DNA das culturas foi feita no Laboratório de Imunovirologia
Molecular da UFV. A partir da formação de um pelet que foi ressuspendido em 500
μL de tampão SET (200mM TRIS, 75 mM NaCl, 25 mM EDTA), adicionou-se então
lisozima (1mg/mL) e foi incubado a 37°C por 30 minutos. Em seguida, adicionou-se
50 μL de SDS 10% e 0,5 mg/mL de proteinase e reincubado a 55°C por uma hora.
Foram adicionados à solução 166,6 μL de NaCl e 721 μL de clorofórmio que foi
homogeneizada manualmente por 30 minutos à temperatura ambiente. A partir daí, a
42
solução foi centrifugada por 10 mim/12.000 rpm e logo em seguida o sobrenadante
foi recolhido e depositado em um novo eppendorf.
Foi adicionado 721μL de
isopropanol ao novo eppendorf que foi centrifugado por 10 min/12.000 rpm. Por
último o isopropanol foi descartado e o pelet foi lavado com álcool 70%. Quando o
álcool evaporou totalmente, a ressuspensão foi feita com 50uL de água ultra pura.
3.4.4.2 Otimização dos iniciadores
A otimização dos iniciadores foi feita para se determinar as concentrações
ideais de uso. Para tanto, utilizou-se diversas concentrações de iniciadores forward
(5’ GGG ATG CTG GTG TGG AGA 3’) e reverse (5’ TGC TCG CGT CCA CTA TCC
AGT 3’) (Quadro 1) em diferentes reações com o mesmo volume de DNA (10 μL) e
Sybr Green (11μL), a fim de se obter uma eficiência de 90% a 110%. A eficiência da
amplificação pode ser definida como sendo o valor exato com que um amplicon é
gerado.
Quadro 1- Concentração dos iniciadores utilizados nas reações de rt-PCR.
Iniciador Reverse
250 mM
500 mM
750 mM
1000 mM
250 mM
250/250
250/500
750/250
250/1000
500 mM
500/250
500/500
500/750
500/1000
750 mM
750/250
750/500
750/750
750/1000
1000 mM
1000/250
1000/500
1000/750
1000/1000
Iniciador Forward
3.4.4.3 Quantificação de Bifidobacterium spp.
As amostras de fezes foram descongeladas e a extração do DNA foi feita
utilizando o Kit ZR Fecal DNA miniprep® (Zimo Research), seguindo as
recomendações do fabricante, com modificação, a saber: foram utilizadas 100 mg de
43
amostra, como propõe Stauffer et al (2008). Para determinação da concentração de
DNA de cada amostra utilizou-se o equipamento Nanodrop® 2000 (Thermo
Scientific). Em seguida o DNA foi armazenado em eppendorffs a temperatura de 30ºC.
As reações de padronização, otimização, validação quantificação foram feitas
por meio da técnica de reação em cadeia de Polimerase em tempo real (rt-PCR)
utilizando o equipamento ABI 7500® (Applied Biosystems, EUA). O volume utilizado
em cada reação foi de 22 mL sendo 10 mL do DNA extraído (numa concentração de
5ng) e o restante constituído por um mix de corante intercalante (11 mL) e
iniciadores (1 mL).
Para a amplificação, utilizou-se um programa com: um ciclo de 95°C por 10
minutos, 45 ciclos (95°C por 30 segundos, 60°C por 1 minuto, 95°C por 30
segundos).
3.5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os dados obtidos com a triagem sobre as notificações de patologias e uso de
antibióticos, bem como os resultados das análises de pH, AGCC e microbiota fecal
foram tabulados em planilhas do programa Excel®. Utilizou-se o programa estatístico
Statistical Package for Social Sciences (SPSS) versão 13.0 para comparar os
resultados encontrados antes e depois da intervenção alimentar por meio do teste t
pareado (p<0,05).
44
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA AMOSTRA
A amostra foi constituída pelas crianças devidamente matriculadas no CEMEI Tio
Teotônio Barbosa e que se enquadraram nos critérios de inclusão/exclusão. Desta
forma, das 68 crianças que frequentavam o CEMEI, 20 compuseram a amostra
(Figura 2)
Figura 2 - Triagem da amostra
Dos 20 pré-escolares nove (45%) eram do sexo masculino e 11 (55%) do
sexo feminino. A idade variou entre 2 anos e 5 anos, com média de 3,4 anos para os
meninos e 3,7 para as meninas.
4.2 CONSUMO DAS PREPARAÇÕES ELABORADAS COM FARINHA DE YACON
A Tabela mostra o consumo das preparações por meio do índice de
aceitabilidade dos pré-escolares em relação às preparações elaboradas com farinha
45
de yacon. A paçoca de yacon, oferecida em complementação à refeição após o
almoço, foi a preparação que obteve maior aceitabilidade (média de 81,06%),
seguido do bolo de yacon (78,53%) e do biscoito de yacon (73,75%), ambos
ofertados ora no café da manhã, ora no lanche da tarde.
TABELA 1 - Índice de aceitação das preparações formuladas com farinha de yacon entre
os pré-escolares participantes da pesquisa.
Dia 1
Dia 2
Dia 3
Média
Bolo (%)
82,08
77,28
76,23
78,53
Biscoito (%)
73,55
65,50
82,22
73,75
Paçoca (%)
73,78
84,84
84,57
81,06
O teste de aceitabilidade deve ser aplicado numa creche ou escola pública
sempre que for necessário verificar os índices de aceitabilidade geral ou quando se
pretende introduzir no cardápio um alimento atípico ao hábito alimentar escolar.
Portanto, essa prática deve fazer parte do planejamento e efetivação da oferta da
alimentação escolar, pois a boa aceitação de um alimento pelo aluno é o principal
fator que determina a qualidade do serviço alimentar prestado pela escola, e
também pode contribuir para adesão do aluno à escola e para a formação de bons
hábitos alimentares (CECANE, 2010; MAGALHÃES et al, 2009).
Apesar de a yacon ser cultivada no estado do Espírito Santo, o consumo da
yacon ainda não é comum, desta forma, a aplicação do teste de aceitabilidade no
CEMEI Tio Teotônio Barbosa fez-se necessário para dar início ao experimento e
para avaliar as possibilidades de inserção, em definitivo, da farinha de yacon no
cardápio escolar.
Alguns estudos relatam a boa aceitabilidade de formulações elaboradas a
partir da farinha de yacon como bolo diet (PINHO e TORQUATO, 2012), bolo
convencional (ROSA et al, 2009), bolo de chocolate (PADILHA et al, 2010), iogurte
light (VASCONCELOS et al, 2012), pão de forma (ROLIM et al, 2010). Outros
estudos demonstram a importância e preocupação em se avaliar a aceitabilidade da
alimentação escolar dentre os alunos da primeira infância (FORMIGA, 2014;
JORGE, 2011; MATIHARA et al, 2010; SANTOS et al, 2008), mas não foram
encontrados outros trabalhos realizados com pré-escolares e que descrevessem os
resultados de testes de aceitabilidade com preparações elaboradas a partir da
46
farinha de yacon. Isso pode ser explicado pelo fato do consumo de yacon ainda não
estar popularizado e disseminado entre a ampla população, mesmo sendo um
alimento natural considerado uma importante fonte de prebiótico (FERREIRA, 2012;
OJANSIVU et al., 2011, SEMINARIO et al, 2003), ou também, pelo fato de os
dirigentes escolares ainda não terem criado estratégias para introdução deste
alimento no cardápio escolar.
A aceitabilidade das formulações foi considerada satisfatória, uma vez que
encontrou-se médias superiores a 70% e com isso, foi possível dar continuidade à
pesquisa. No entanto, as formulações testadas ainda não poderiam ser inseridas em
definitivo no cardápio da creche, pois, segundo o PNAE (Programa Nacional de
alimentação Escolar), quando se utiliza o método de resto ingestão para realizar o
teste de aceitabilidade de um novo alimento, os índices de aceitação devem ser
iguais ou superiores a 90% (FNDE, 2012).
Além dos princípios estabelecidos pelo PNAE, outro fator considerado como
um entrave para a inserção de um novo alimento no cardápio escolar é a neofobia
alimentar. Esta é mais recorrente entre as crianças em fase pré-escolar e
caracteriza-se pela recusa ou resistência da criança em ingerir um novo alimento
(OLIVEIRA, 2009). Medeiros (2008) considera a neofobia alimentar um fenômeno
complexo que pode estar relacionado a fatores como idade, sexo e condições
socioeconômicas. Por meio de um questionário investigativo aplicado aos pais e
responsáveis de crianças entre 3 e 6 anos de idade, ele observou que a neofobia
alimentar é mais frequente em crianças do sexo feminino, com idade entre 3 e 4
anos e como nível socioeconômico mais baixo. No entanto, o mesmo autor ainda
discute que a neofobia alimentar pode ser contornável por meio da diversificação e
insistência das formas de oferta do novo alimento da prática do alimento-estímulo.
Ambas as sugestões de Medeiros (2008) foram adotadas no momento da
oferta das preparações elaboradas com farinha de yacon: a diversificação e
insistência das formas de oferta se deram à medida que se alternava as preparações
e horário de oferta; e a prática do alimento-estímulo foi efetivada a partir do apelo
visual do alimento, uma vez que era adicionado açúcar granulado colorido às
preparações e as mesmas eram acondicionadas e servidas em forma de papel (a
mesma utilizada em doces de festas infantis).
Formiga (2014) utilizou de outra metodologia para deter a resistência de
crianças à ingestão de novos alimentos durante a alimentação escolar. Seu estudo
47
tinha como objetivo introduzir o mel de abelha na alimentação escolar de uma
instituição pública de ensino fundamental no município de São Domingos, na
Paraíba. A autora observou que alunos que participaram de atividades educativas e
receberam orientação nutricional sobre o mel apresentaram melhores índices de
aceitabilidade do produto (96,6%) em relação ao grupo que não participou das
mesmas atividades educativas, este último tendo percentual de aceitabilidade de
76,7%.
Com a orientação nutricional, a autora conseguiu atingir um índice de
aceitabilidade acima do exigido pelo PNAE para introdução de um novo alimento no
cardápio escolar, demonstrando que a metodologia adotada foi decisiva para elevar
os índices de aceitabilidade.
Um paralelo pode ser feito entre o presente estudo e o estudo realizado por
Formiga (2014), uma vez que, ambos os alimentos testados, diante das mesmas
circunstâncias
de
oferta
(sem
as
atividades
educacionais)
apresentaram
aceitabilidade semelhante. Além disso, tanto o mel de abelha quanto o yacon, são
alimentos com grande apelo nutricional e de fácil acesso em suas respectivas
regiões. Acredita-se então que, a oferta de preparações a base da farinha de yacon
aliada a orientação nutricional pode melhorar a aceitabilidade do produto por parte
dos pré-escolares do estado do Espírito Santo.
Salvi e Ceni (2008) finalizam afirmando que a realização de atividades de
educação nutricional para crianças na fase pré-escolar resulta na formação de novos
conhecimentos sobre nutrição e alimentação e influencia positivamente na
construção e manutenção de hábitos alimentares saudáveis. Desta forma, toda
tentativa de introdução de um novo alimento a merenda escolar deve ser planejada
de modo a conciliar a descoberta de novos sabores e a educação nutricional.
Esse esforço e preocupação em aumentar a aceitabilidade das formulações à
base de farinha de yacon por parte dos pré-escolares foram necessários para
averiguar e garantir que o maior número de crianças ingerissem as formulações
diariamente. Isso seria determinante para compor a amostra que daria continuidade
ao experimento, uma vez que era de interesse preliminar observar os efeitos da
ingestão da farinha de yacon na fisiologia da microbiota intestinal.
Ao analisar os dados obtidos após a intervenção alimentar, observou-se que
nenhum pré-escolar ingeriu as formulações diariamente ao longo das 18 semanas.
Este fato dói atribuído, primeiramente, à falta de assiduidade entre os estudantes e
depois, pela inapetência, bastante observada na primeira infância, ou pela simples
48
indisposição pontual em não consumir as preparações ofertadas. Diante disso,
ponderou-se que, fariam parte do grupo amostral as crianças que consumiram as
formulações pelo menos três vezes por semana, o que corresponde a ingestão de
0,08g de FOS/Kg de peso corporal.
4.3 ANÁLISE DE pH E AGCC
Os resultados da determinação do pH fecal e dos AGCC de amostras de
fezes coletadas de pré-escolares do CEMEI Tio Teotônio Barbosa antes e depois do
período de intervenção alimentar são mostrados na tabela 2.
Tabela 2 - Determinação do pH fecal e AGCC de amostras de fezes antes e depois do período
de intervenção.
pH
Período
AGCC (mg/mg de fezes)
Acetato
Butirato
Propionato
1
6,76 ± 0,43a
0,357 ± 0,11a
0,091 ± 0,5a
0,052 ± 0,04a
2
6,91 ± 0,45 a
0,385 ± 0,15a
0,122 ± 0,7b*
0,064 ± 0,05a
*Letras diferentes na mesma coluna representam diferença signisficativa pelo teste t pareado
(p<0,05). Legenda: Período 1 = antes da intervenção alimentar; Período 2 = após da interveção
alimentar; pH = potencial hidrogeniônico; AGCC = ácidos graxos de cadeia curta; DP = desvio
padrão.
As médias do pH fecal antes e após a intervenção alimentar com preparações
elaboradas com farinha de yacon não diferiram estatisticamente (p>0,05). O pH
ligeiramente ácido das fezes, observado neste estudo, pode ser decorrente da
fermentação ativa de hidrocarbonetos não digeríveis realizada por bactérias grampositivas (DUNCAN et al, 2009; BELENGUER et al, 2007 ).
A redução do pH fecal e a produção de AGCC são parâmetros que
evidenciam a atividade metabólica de bactérias bífidas (TOPPING E CLIFTON,
2001). Análises desta natureza podem fornecer informações preliminares ou
complementares das condições fisiológicas e metabólicas dos grupos bacterianos
que compõem a região colônica, uma vez que o pH tende a variar de acordo com a
composição microbiana do cólon (BELENGUER et al, 2006).
Esta variação da microbiota pode ser influenciada pelas condições de saúde
do indivíduo. Thompsom-Changoyan e seus colaboradores (2011) observaram que o
49
pH das fezes de crianças alérgicas ao leite de vaca (pH=6,0) era menos ácido do
que o pH das fezes de crianças sadias (pH=5,8). Já Guimber e colaboradores (2010)
observaram a redução do pH fecal de crianças com comprometimento neurológico
após serem alimentadas por 30 dias com um mix de fibras (contendo FOS). Os
autores encontraram diferença significativa (p<0,05) sendo que o pH das fezes após
o consumo foi 0,6 vezes menor do que o pH das fezes antes da intervenção
alimentar. Sugerindo assim, que a ingestão de FOS pode contribuir com a redução
do pH fecal e trazer benefícios à saúde do indivíduo.
O pH levemente ácido na região colônica implica em benefícios à saúde do
indivíduo porque bacterióides e bactérias gram-negativas, que são potencialmente
patogênicas, são sensíveis ao pH ácido, de modo que, seu metabolismo é
diminuído. Ao passo que, as bactérias gram-positivas são tolerantes e seu
metabolismo se torna mais ativo, sendo este grupo favorecido durante a competição
na região colônica (OSUKA et al, 2012). Ducan e colaboradores (2009) associaram a
afinidade das bactérias gram-positivas por pH ligeiramente ácido às características
filogenéticas peculiares deste grupo. Os autores utilizaram 33 isolados bacterianos
de fezes humanas e examinaram a sua capacidade de crescer em cultura anaeróbia
em diferentes níveis de pH. Quando os isolados foram submetidos a níveis de pH
iguais a 6,7, houve redução no crescimento de bacterióides, ao mesmo tempo que
favoreceu o crescimento de bactérias gram-positivas. Diante desses resultados, os
autores submeteram as bactérias gram-positivas ao pH de 5,5 e foi observado um
crescimento 50% maior do que quando foram submetidas ao pH de 6,7.
Ducan e colaboradores (2003) observaram que a redução do pH das fezes
estava associada com a presença de ácidos graxos de cadeia curta. Estes por sua
vez, estão relacionados com o metabolismo de bactérias presentes no cólon. Em um
experimento in vitro, com o objetivo de examinar as mudanças da comunidade
bacteriana de fezes humanas na presença e ausência de substâncias prebióticas, os
autores cultivaram bactérias em dois sistemas de fermentação anaeróbia: um
contendo amido e outro contendo inulina como substrato. A concentração de AGCC
no fermentador contendo inulina foi de 60 mM e no fermentador contendo amido foi
de 40 mM, além disso, a inulina favoreceu o crescimento de bactérias grampositivas, chegando a aumentar em cem vezes o crescimento de colônias do gênero
Eubacterium.
No presente estudo utilizou-se a técnica de cromatografia líquida de alta
50
eficiência (CLAE) para dosar AGCC (acetato, butirato e propioanato) em amostras
de fezes de pré-escolares do CEMEI Tio Teotônio Barbosa. Os resultados
encontrados quando comparados os períodos 1 e 2 (Tabela 2), respectivamente,
foram significativamente maior para as concentrações do butirato após a intervenção
alimentar e iguais para o acetato e proprionato no mesmo período.
É possível deduzir que, o aumento significativo da concentração do butirato,
mesmo que isoladamente, já implica em benefícios à saúde do cólon de préescolares, pois o butirato é o principal provedor de energia para a mucosa do cólon
(NAKAO et al, 2002). Outro indicativo da correlação entre a presença do butirato e a
saúde dos indivíduos foi sugerido por Thompson-Chagoyan et al (2011) que
encontraram maior concentração de butirato em fezes de crianças saudáveis (6,7
mmol/kg de fezes) do que em fezes de crianças com alergia ao leite de vaca (1,8
mmol/kg de fezes), sugerindo que a presença desse ácido está relacionada com
maior estabilidade do tecido e com maior permeabilidade intestinal
Acredita-se que aumento da concentração de butirato e outros AGCC está
relacionado com a quantidade de FOS ingerida pelo indivíduo (BELENGUER et al,
2006). Alguns autores atribuem à ingestão deste prebiótico como sendo a condição
primordial para o aumento da produção de AGCC Scheider et al (2006), encontraram
diferença significativa na produção de AGCC em humanos saudáveis quando
ofertaram 0,2 g de FOS por quilo de peso corporal. No grupo controle a
concentração de AGCC foi de 51,6 mmol/kg de fezes e no grupo suplementado foi
de 66,6 mmol/kg de fezes. Considerando apenas o ácido butirato, a significância
permaneceu, observando médias de 3,5 mmol/kg de fezes para o grupo de fórmula
sem fibra e 4,6 mmol/kg de fezes no grupo suplementado com mix de fibras. Whelan
et al (2005) compararam as concentrações de AGCC em amostras de fezes de dois
grupos de indivíduos adultos que consumiram fórmula dietética enteral. O grupo que
consumiu a fórmula suplementada com 12,8% de FOS teve maior concentração de
AGCC do que o grupo que recebeu fórmula enteral padrão, 332,4 uMol/g e 124,5
uMol/g, respectivamente, demonstrando desta forma, que fórmulas enterais causa
alterações no metabolismo do cólon e que a fortificação de fórmulas com FOS e
outras fibras pode intensificar estes benefícios.
Guimber et al (2010) não encontraram diferença significativa ao dosar AGCC
em fezes de crianças que se alimentaram de fórmula enteral adicionada de FOS e
atribuiu esses resultados ao fato de a quantidade de FOS ingerida diariamente pelas
51
crianças que participaram do estudo não ter ultrapassado 0,04g/Kg de peso
corporal, quantidade essa 50% menor do que a ingerida pelas crianças do CEMEI
Tio Teotônio Barbosa. Dessa forma, sugere-se que a os benefícios associado à
ingestão de FOS pode está diretamente relacionada com as quantidades ingeridas.
No entanto, a baixa concentração de AGCC nem sempre está associada a sua baixa
produção, pois a produção de AGCC contribui com a melhoria do funcionamento das
células que compõem a parede do cólon e esta situação, favorece a absorção
desses ácidos, tornando-a assim, mais rápida e eficaz (Koecher et al 2014).
São encontrados na literatura estudos que associam, de forma direta, o
crescimento do gênero Bifidobacterium com a produção de AGCC, principalmente o
butirato (MATIAS et al, 2007; FOOKS et al, 1999). No entanto, é sabido atualmente
que bifidobactérias não são os principais responsáveis pela produção de ácidos
graxos na região colônica (WALTON et al, 2012). Belenguer e colaboradores (2006)
demonstraram que, apesar do butirato não ser um produto do metabolismo de
bifidobactérias, esses micro-organismos participam de forma indireta, mas
determinante, da produção dos mesmos, que é realizado pelo gênero Eubacterium,
principalmente. Bactérias produtoras de butirato são capazes de fermentar produtos
do metabolismo de bifidobactérias quando estes micro-organismos utilizam
oligossacarídeos como substrato (GUILLOTEAU et al, 2010).
Por meio de um experimento in vitro Belenguer et al (2006) simularam como
B. adolescentis e bactérias butirogênicas atuariam de forma simbiôntica em um
ecossistema
do
intestino
humano.
Bactérias
do
gênero
Eubacterium
e
Bifidobacterium foram isoladas de fezes humanas e incubadas anaerobicamente em
meio sintético contento amido de batata ou FOS como fonte de energia. Os autores
observaram que quatro estirpes de Bifidobacterium cresceram na presença do amido
e nove estirpes na presença de FOS. Ao passo que nenhuma estirpe de
Eubacterium cresceu na presença de amido puro, mas cresceram quando cultivadas
em sistema de “co-culturas” com B. adolescentis. Nesta ocasião o butirato foi
formando indicando a fundamental importância de bifidobactérias na produção
desses AGCC, num processo conhecido como “Crossfeeding” ou alimentação
cruzada, onde o metabolismo de bactérias bífidas otimizam o meio, com a produção
de lactato e outro metabólitos, para, a partir daí o grupo de Eubacterium formar
butirato.
Ainda foi observado que a taxa de consumo dos metabólitos de B.
52
adolescentis decaiam a medida que se formava butirato numa forma mais intensa
quando o sistema foi submetido ao pH de 6,5, demonstrando mais uma vez a
importância do lúmem levemente ácido para atuação benéfica dos micro-organismos
gram-positivos. Isso porque, com o pH mais ácido, Eubacterium adquirem vantagem
competitiva sobre outro grupos gram-negativos (BELENGUER et al, 2006).
Não há consenso na literatura em relação à utilização de modelos com cultura
pura para simular as condições da região colônica com toda a sua complexidade,
uma vez que, há uma incerteza sobre a legitimidade dos processos envolvidos
(WATSON et al, 2012). No entanto, Guilloteau et al (2010) completam sugerindo
que, sob condições fisiológicas, o processo de “crossfeeding” resulta em outros
benefícios à saúde, devido ao fato de aumentar a biodisponibilidade de nutrientes
por retardar o esvaziamento gástrico e reduzir o pH do lúmem, contribuindo com a
depleção de bacterióides.
Diante do exposto, é coerente sugerir que o efeito butirogênico demonstrado
neste estudo com pré-escolares do CEMEI Tio Teotônio Barbosa poderia ser
resultado da ingestão contínua do FOS presente em preparações formuladas com
farinha de Yacon.
Em adição, Rossi et al, 2005 avaliaram a fermentação de FOS e inulina pelo
gênero Bifidobacterium e observaram uma diferença quantitativa e qualitativa entre
os dois processos. Enquanto que nas frações contendo Bifidobacterium spp. e
inulina houve maior concentração de ácido butírico e menores concentrações de
ácido acético, lático e propiônico. Nos lotes contendo FOS houve maior acumulação
de ácido lático e acético e o butirato apareceu em menor escala. Desta maneira,
investigações desta natureza fornecem evidências sobre a interação dos alimentos
com a microbiota colônica e ajudam na construção de uma dieta alimentar que
corroborem com a promoção da saúde do colón de modo que se reduza o risco de
doenças associadas ao intestino grosso (FAVA, 2013; HAENEN et al, 2013).
4.4 QUANTIFICAÇÃO DE Bifidobacterium spp
A reação de PCR em tempo real foi feita utilizando Sybr Green, corante
intercalante de DNA capaz de emitir fluorescência. As curvas de dissociação são
mostradas na Figura 3 e 4.
53
Figura 3 - Curva de dissociação da amplificação da reação de rt-PCR das amostras de fezes
coletadas antes da intervenção alimentar.
Figura 4 - Curva de dissociação da amplificação da reação de rt-PCR das amostras de fezes
coletadas após da intervenção alimentar.
54
A amplificação ocorreu com eficiência de 77% gerando valores de Ct (cycle
threshold) com média de 17 para a amplificação do DNA das amostras de fezes
coletadas antes da intervenção alimentar e média de 19 para a amplificação das
amostras coletadas após a intervenção alimentar com preparações à base de farinha
de yacon. Talarico (2012) também encontrou valores de Ct < 20 na amplificação de
Bifidobacterium spp. de amostras de fezes de crianças recém-nascidas.
A eficiência da amplificação é o valor estimado da quantidade do DNA-alvo
identificado pelos iniciadores foi amplificado na reação, de modo que é considerado
um parâmetro para estimar a sensibilidade da reação. Em condições satisfatórias,
esse valor se encontra entre 90% e 110%. Já o Ct é a interseção de amplificação e o
limiar de detecção. Pode ser considerada uma medida secundária da concentração
do DNA-alvo da reação de PCR em tempo real, de modo queé possível fazer uma
relação indireta entre o valor de Ct e quantidade de micro-organismos presente na
amostra, ou seja, quanto menor for a concentração de bactérias, maior o valor de Ct
e virse versa (APPLIED, 2011).
A curva de dissociação gerada para cada amostra apresentou mais de um
pico, o que representa que a amplificação teve baixa sensibilidade formando mais
amplicons do que suportaria as reais cópias do DNA-alvo contidas nas amostras.
Essa falta de sensibilidade gerou valores superestimados da concentração das
bactérias do gênero Bifidobacterium.
Apesar de ser bastante utilizado por aumentar a flexibilidade das reações e
por ter baixo custo e facilidade de manuseio, o corante intercalante Sybr Green® é
atribuído à sua utilização algum grau de inespecifidade das amplificações, mas que
nem sempre oferecem riscos às reações. Isso ocorre devido ao fato de ser um
fluocromo com capacidade de se ligar a qualquer dupla fita de DNA e não apenas ao
DNA-alvo (OLIVEIRA 2012).
Malinen et al (2003) observaram que reações feitas com o sistema Sybr
green® podem apresentar maior eficiência quando adiciona-se uma “Hot start
polimerase”, uma enzima que otimiza a reação e também reduz a formação de
dímeros.
Talarico (2012) e Brandt (2010) argumentam que a amplificação gerada com
o sistema Taqman® ainda é a melhor opção para amplificação do gênero
Bifidobacterium devido as limitações e exigências que esse gênero apresenta.
Nessas situações utiliza-se uma sonda que se liga especificamente a região do DNA
55
exclusiva desse gênero e impossibilita a amplificação de qualquer outra região do
gene 16S que não faz parte do gênero Bifidobacterium. O gene 16S é bastante
utilizado em reações de rt-PCR por ter regiões bastante conservadas dentro de cada
espécie bacteriana, o que facilita o desenho dos iniciadores e sondas utilizados nas
reações (LOURENÇÃO, 2010).
A técnica de rt-PCR ainda é a mais recomendada para a quantificação de
micro-organismos por ser uma técnica executada em condições in vitro, que
apresenta excelente precisão e resultados confiáveis e consistentes (OLIVEIRA,
2012; WALTON et al, 2011; HAARMAN e KNOL, 2005; RINTTILA et al, 2004;
MALINEN et al, 2003; MATSUKY et al, 1999)
De posse das inferências aqui apresentadas, sugere-se que outra
quantificação das mesmas amostras de DNA em estudo sejam feitas utilizando a
técnica de rt-PCR, adotando as modificações sugeridas, podendo inclusive, utilizar o
sistema sybr Green® com o acréscimo da enzima “hot start polimerase”, como
descrito por Malinen et al (2003) ou utilizando o sistema Taqman®, que é o mais
relatado na literatura por ser o mais específico, amplificando tão somente a região
sinalizada pelos iniciadores e sonda desenhados para o DNA alvo.
56
5 CONCLUSÕES
As preparações a base da farinha de yacon apresentaram boa aceitabilidade
por parte dos pré-escolares do CEMEI, com destaque para a paçoca de yacon. O
fato de ser similar ao dos doces servidos em festas infantis pode ter sido um fator
relevante para a sua melhor aceitação da paçoca de yacon em relação às outras
preparações, uma vez que as crianças têm como referência os alimentos que já lhes
são familiares por já fazerem parte de sua dieta.
Baseado nos resultados obtidos observou-se que a ingestão diária de 0,08g
de FOS/Kg de peso por 18 semanas resultou no aumento da concentração de
butirato, mas não influenciou no pH fecal. Além disso, não foi observada nenhuma
relação entre a ingestão de yacon e o surgimento de sintomas toxicológicos,
indicando que a ingestão de 0,08g de FOS/Kg de peso corporal pode ser
considerada segura.
O aumento do butirato aliado aos valores de Ct encontrados pode sugerir que
houve uma modificação da microbiota colônica das crianças do CEMEI Tio Teotônio
Barbosa, no entanto não se pode atribuir essas modificações ao crescimento de
Bifidobacterium spp. devido ao fato das reações de rt-PCR terem sido de baixa
sensibilidade, gerando amplificações inespecíficas.
Ainda é necessário verificar se os efeitos encontrados com este estudo são
resultantes do aumento da concentração de Bifidobacterium spp. na região colônicas
das crianças do CEMEI.
57
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2010. 40f. Dissertação (Doutorado em Fisiologia Humana) – Universidade de São
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WHELAN, K.; JUDD, P. A.; PREEDY, V. R.; SIMMERING, R.; JANN, A.; TAYLOR,
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Microbiota and Short-Chain Fatty Acid Concentrations Caused by Standard Enteral
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YASUDA, A.; INOUE, K.; SANBONGI, C.; YANAGISAWA, R.; ICHINOSE, T.;
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fructooligosaccharides attenuates allergic peritonitis in mice. Biochemical and
Biophysical Research Communications. v. 422, p. 546–550, 2012.
YUN,
J.W.
Fructooligosaccharides
Occurrence,
preparation
applications. Enzymes and Microbial Technology. v.19, p.107-117, 1996.
and
69
ANEXO
ANEXO 1 - Parecer de aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos
70
APÊNDICES
APÊNDICE 1 - Termo de consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
1 – Identificação do Responsável pela execução da pesquisa:
Título: Efeito do feijão biofortificado e da batata yacon no estado nutricional de ferro e zinco e
resposta imunológica de pré-escolares.
Pesquisadores Responsáveis: Neuza Maria Brunoro Costa/Maria das Graças Vaz Tostes/Rogério
Graça Pedrosa
Contato com pesquisador responsável
Endereço: Curso de Nutrição, Departamento de Zootecnia, CCA-UFES / Alto Universitário,
Guararema, Alegre, ES/ Telefone/FAX: 028-3552 8656/028-81161580/028-3552 8660/ E.mail:
[email protected]/[email protected]
2 – Informações ao participante ou responsável:
1) Você está sendo convidado a participar de uma pesquisa intitulada “Efeito do feijão
biofortificado e da batata yacon no estado nutricional de ferro e zinco e resposta
imunológica de pré-escolares”, que será realizada na cidade de Alegre-ES, por
pesquisadores da área de Nutrição e Saúde.
2) A pesquisa terá como objetivo geral: Avaliar o efeito do feijão biofortificado e da batata
yacon (Smallanthus sonchifolius) no estado nutricional de ferro e zinco e resposta
imunológica de pré-escolares do município de Alegre, ES, assistidos pelos Centros
Municipais de Educação Infantil (CEMEIs) de tempo integral.
3) Antes de aceitar participar da pesquisa, leia atentamente as explicações que informam
sobre o procedimento
3.1) Será ofertado a seu filho na alimentação escolar feijão biofortificado com ferro e
zinco e/ou batata yacon, durante 6 meses.
3.2) Seu filho será pesado e medido por profissionais e alunos do curso de Nutrição
para avaliar seu estado nutricional no início e novamente no final do estudo.
3.3) Serão colhidos cerca de 10 mL de sangue do seu filho, por punção venosa, com
seringas descartáveis, em ambiente apropriado nos próprios CEMEIs, por um profissional
farmacêutico no início do estudo e ao final do estudo. Essas amostras serão usadas para dosar
os níveis de ferro, zinco, glicose e resposta imunológica do seu filho.
3.4) O consumo alimentar do seu filho será avaliado nos CEMEIs por profissionais e
alunos do curso de Nutrição.
3.5) Você deverá responder questões referentes aos hábitos alimentares, perfil sócio
econômico e consumo alimentar da criança em casa.
3.6) Você deverá colher as fezes do seu filho, nos dias solicitados, em um frasco
fornecido pelos responsáveis pela pesquisa e deverá entregar no CEMEIs.
3.7) Antes do início do estudo, seu filho será tratado com medicamento anti helmíntico
para a eliminação de possíveis parasitas intestinais.
3.8) Você deverá comunicar aos pesquisadores a ocorrência de algum efeito
gastrointestinal no seu filho após o consumo dos alimentos citados acima.
3.9) Seu filho será avaliado por um profissional de Nutrição e caso seja evidenciada
alguma alteração clínica ou nutricional você será comunicado e seu filho será encaminhado
para o Serviço Médico do município para atendimento pediátrico
71
4) Durante sua participação, você poderá recusar responder a qualquer pergunta ou
participar de procedimento(s) que por ventura lhe causar algum constrangimento.
5) Você poderá se recusar ou não autorizar seu filho a participar da pesquisa ou poderá
abandonar o procedimento em qualquer momento, sem nenhuma penalização ou
prejuízo.
6) A sua participação e de seu filho na pesquisa será como voluntário, não recebendo
nenhum privilégio, seja ele de caráter financeiro ou de qualquer natureza. Entretanto, lhe
serão garantidos todos os cuidados necessários a sua participação de acordo com seus
direitos individuais e respeito ao seu bem-estar físico e psicológico.
7) Não se tem em vista que a sua participação ou de seu filho poderá envolver riscos. A
coleta de sangue poderá causar pequenos desconfortos no seu filho, como ardência
passageira no braço onde será colhido.
8) Prevêem-se como benefícios da realização dessa pesquisa a gratuidade dos exames
físicos, nutricionais, bioquímicos e de resposta imune realizados, além de ações de
educação nutricional.
9) Serão garantidos o sigilo e privacidade aos participantes e seus responsáveis,
assegurando-lhes o direito de omissão de sua identificação ou de dados que possam
comprometê-lo. Na apresentação dos resultados não serão citados os nomes dos
participantes.
10) Os resultados obtidos com a pesquisa serão apresentados em eventos ou publicações
científicas, além de palestras e trabalhos de educação nutricional nos CEMEIs do
município de Alegre.
Confirmo ter sido informado e esclarecido sobre o conteúdo deste termo. A minha
assinatura abaixo indica que concordo em participar desta pesquisa e por isso dou meu
livre consentimento.
Alegre, _____de _____de____________.
Nome da criança participante:______________________________
Assinatura do responsável:_________________________________
Assinatura do pesquisador responsável:
72
APÊNDICE 2 - Preparações com farinha de yacon
Bolo de Yacon
Quantidade*
Ingredientes
Receita 1
Receita 2
Receita 3
Açúcar
135 g
270 g
230 g
Farinha de Trigo
120 g
400 g
320 g
Farinha de Yacon
84 g
224 g
164 g
Margarina
15 g
40 g
30 g
Fermento químico
300 mL
58 g
(1 unidade)
12 g
820 mL
116 g
(2 unidades)
36 g
550 g
116 g
(2 unidades)
24 g
Rendimento
14 porções
32 porções
18 porções
Leite integral
Ovo
Modo de preparo: em uma tigela misture os ovos, o leite e a margarina. Em
seguida adicione os ingredientes sólidos começando pelo açúcar, farinha de
yacon, farinha de trigo e por último o fermento químico. Leve ao forno préaquecido em assadeira untada com margarina e farinha de trigo e deixa assar
com temperatura de 180°C-200°C.
*A quantidade dos ingredientes variaram entre as receitas 1, 2 e 3, não respeitando a
proporcionalidade para adaptar à quantidade de farinha de yacon, que foi estabelecida de
modo a dispor 6 gramas (receita 1), 7 gramas (receita 2) e 9 gramas (receita 3) em cada
porção das referidas receitas.
73
Biscoito de Yacon
Quantidade*
Ingredientes
Receita 1
Receita 2
Receita 3
Açúcar
86 g
137 g
120 g
Farinha de Trigo
135 g
180 g
150 g
Farinha de Yacon
84 g
224 g
164 g
Margarina
80 g
160 g
115 g
50 mL
175 mL
96 mL
60 g
6g
3g
120 g
13 g
13 g
80 g
10 g
10 g
14 porções
32 porções
18 porções
Leite integral
Amido de milho
Fermento químico
Sal amoníaco
Rendimento
Modo de preparo: em uma tigela misture todos os ingredientes secos e em
seguida acrescente os ovos e a margarina. Misture-os até formar uma massa
homogenia. Urilize duas colheres de sopa para formar e modelar. Acomode-os
em uma assadeira untada com margarina ou manteiga e leve ao forno préaquecido para assar com temperatura média de 220°C.
*A quantidade dos ingredientes variaram entre as receitas 1, 2 e 3, não respeitando a
proporcionalidade para adaptar à quantidade de farinha de yacon, que foi estabelecida de
modo a dispor 6 gramas (receita 1), 7 gramas (receita 2) e 9 gramas (receita 3) em cada
porção das referidas receitas.
Docinho de Yacon
Quantidade*
Ingredientes
Receita 1
Receita 2
Receita 3
21 mL
48 mL
27 mL
Paçoca de amendoim
8,4 gramas
22,4 gramas
16,4 gramas
Farinha de Yacon
84 gramas
224 gramas
164 gramas
Rendimento
14 porções
32 porções
18 porções
Água
Modo de preparo: desmanche a paçoca de amendoim e misture-a a farinha
de yacon. Em seguida adicione a água. Pegue pequenas porções, enrole e
polvilhe com açúcar de confeiteiro ou granulado de chocolate.
*A quantidade dos ingredientes variaram entre as receitas 1, 2 e 3, não respeitando a
proporcionalidade para adaptar à quantidade de farinha de yacon, que foi estabelecida de
modo a dispor 6 gramas (receita 1), 7 gramas (receita 2) e 9 gramas (receita 3) em cada
porção das referidas receitas.