Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI
Projeto Vencedor 2012
Manutenção da homeostasia intestinal através da relação entre microbiota
intestinal, epitélio intestinal e sistema imune: importância dos ácidos graxos de
cadeia curta.
Vinicius Andrade Oliveira
Abstract: the inflammatory bowel diseases (IBD) affect many individuals worldwide, both in
childhood and in adulthood. These diseases are multifactorial and have a chronic inflammatory
component; although feeding habits, smoking, genetic, and composition of the intestinal
microbiota and/or products of the intestinal microbiota are also associated. Thus, the triad
relationship between intestinal microbiota and their products, intestinal epithelium and intestinal
immune system do play an enormous importance. The short chain fatty acids (SCFA) such as
acetate, propionate and butyrate, are products released by the gut microbiota fermentation of
complex carbohydrates by intestinal microbiota with anti-inflammatory and inhibition of histone
deacetylases (HDAC) properties. Here, we hypothesize that SCFA have a broad action,
namely, in epithelial cells, in intestinal immune cells and in microbiota composition. Then, the
aim of this study is to evaluate whether SCFA could induce tissue protect animals in a model of
experimental colitis and unveil the mechanisms underlying. We believe that the understanding
of the SCFA action in intestinal immune cells, gut microbiota and epithelial cells will contribute
for the management of inflammatory response in IBD patients.
Introdução: as doenças inflamatórias intestinais têm acometidos diversos indivíduos em todo
mundo, tanto na infância como na vida adulta. São doenças multifatoriais, com componente
inflamatório crônico, e suas principais formas são a síndrome de Crohn e a colite ulcerativa
(Podolski et al., 2002). Os fatores associados podem ser: hábitos alimentares, fumo, genético,
produtos além da composição e dos produtos liberados pela microbiota intestinal (Cabré &
Domènech, 2012; Bashashati et al., 2012). Desse modo, a relação da tríade: microbiota
intestinal e seus produtos, epitélio intestinal e sistema imune intestinal exercem enorme
importância (Shulzhenko et al., 2011; Hooper, 2012). Os ácidos graxos de cadeia curta
(AGCC) como acetato, propionato e butirato, são produtos liberados pela microbiota intestinal
a partir da fermentação de carboidratos complexos pela microb iota intestinal, com funções
anti-inflamatórias e de inibidores de histonas desacetilases (HDAC) (Vinolo et al., 2012).
Estudos publicados previamente (Maslowski et al., 2009) e nosso (figura 1) mostram que o
tratamento oral com os AGCCs na água melhora a sobrevida e a perda de peso em um
modelo de colite com Dextran Sulfato de Sódio (DSS), mas pouco tem se aprofundamento no
mecanismo real de como os AGCCs atuam neste modelo considerando sua atuação específica
na microbiota intestinal, epitélio intestinal e células do sistema imune. Pudemos observar em
dados recentes do nosso laboratório in vitro, que os AGCCs podem atuar na diferenciação e
maturação de células dendríticas. Estamos estendendo o estudo para outras populações do
sistema imune que são importantes para a manutenção da homeostasia intestinal. Nós
acreditamos que o estudo dos AGCCs no contexto citado auxiliará no entendimento da
participação deles nesta complexa rede de interação e num futuro próximo pode ser útil como
ferramenta no gerenciamento da inflamação em pacientes com doenças inflamatórias
intestinais.
R. Alexandre Dumas, 1976 - São Paulo, SP 04717-004 Brazil | 0800 771 71 57 | [email protected] | bdbiosciences.com/br
Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI
Projeto Vencedor 2012
Figura 1. Variação no peso e sobrevida dos animais submetidos à colite com DSS e tratados
com AGCC
Hipótese: AGCCs inibem o processo inflamatório, alterando a composição da microbiota
intestinal e diminuindo a produção de citocinas inflamatórias nas células epiteliais e nas células
do sistema imune intestinal.
Objetivo: Investigar a participação dos AGCCs como protetores da inflamação em um modelo
de colite experimental e os mecanismos adjacentes a esta melhora.
Objetivos específicos:
In vivo
I – Avaliar, no intestino grosso e no linfonodo mesentérico, se o tratamento com AGCC modula
a frequência das seguintes populações celulares: linfócitos T ; células linfóide inata (células
produtoras de IL-22), ativação de macrófagos CXCR3+, ativação de células dendríticas
CD103+ e células T reguladoras e células Th17 e Th1;
II – Avaliar a composição da microbiota intestinal após o tratamento com os AGCCs nas fezes
dos animais e no intestino delgado e grosso nos intestinos dos animais tratados com AGCC
III - Mensurar a produção de citocinas e quimiocinas no lisado intestinal
IV – Analisar a permeabilidade intestinal pela expressão de moléculas de adesão celular
intestinal e pelo nível de LPS circulante
VI – Verificar o nível de acetilação em Histonas e a expressão das HDAC no lisado intestinal
In vitro
I – Avaliar em cultura de explants do intestino, a produção de citocinas e quimiocinas após o
tratamento com AGCCs;
II – Avaliar a capacidade de células dendríticas geradas in vitro e tratadas com AGCC em
estimular a proliferação e diferenciação de linfócitos TCD4 e TCD8 III– Verificar o exressão das
HDAC bem cada sua atividade em células dendríticas tratadas com os AGCCs
Métodos principais
Indução de colite e tratamento com AGCCs: a colite será induzida pela adição de 3% de DSS
na água dos animais por 7 dias, seguindo com tratamento com água normalmente. O
R. Alexandre Dumas, 1976 - São Paulo, SP 04717-004 Brazil | 0800 771 71 57 | [email protected] | bdbiosciences.com/br
Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI
Projeto Vencedor 2012
tratamento se dará pela adição 5 dias antes do início da adição do DSS, dos AGCC
individualmente a 150 mM e permanecido até o fim do período do DSS.
Citometria de fluxo: serão utilizados anticorpos monoclonais específicos, previamente
conjugado a FITC, PE, PercP, Pacific blue ou APC. Após procedimento de marcação celular os
materiais, de diferentes fontes, serão encaminhados para aquisição no citômetro (FACSCanto
II, Beckton Dickson) e a análise dos dados feita através dos programa FlowJo. A marcação
intracelular será feita utilizando o kit BD Cytofix/Cytoperm. Para análise do extrato intestinal, e
da cultura de explants, será utilizado o kit CBA para citocinas Th1/Th2/Th17 e o kit CBA
inflammation (BD Cytometric Bead Array).
Purificação das células intestinais: Células da lâmina própria e linfócitos intraepiteliais do
intestino serão purificados a partir do protocolo de Li et al., 2012. Serão utilizadas as seguintes
marcações com anticorpos monoclonais: macrófagos (CD11b; CxCR3; F4/80) células
dendríticas (CD11c+; CD103+; CD80; CD86; CD40) Linfócitos T (TCR ) Treg (CD4+;
Foxp3+;CD25+; CTLA4; GITR) Th17/Th1(CD4+; CD25+; IL17+; IFN- +;) células linfoides
inatas serão avaliadas pelos marcadores CD45+Lin-Thy1+SCA1+
Cultura de explants: será realizada de acordo com o protocolo proposto por Elinav et al.,
2011. Brevemente, dois pedaços do colon proximal serão removidos, lavados com PBS e
pesados. O tecido será cultivado por 24h em meio DMEM contendo 10% soro fetal bovino e
antibiótico. Após, o meio será coletado, centrifugado (1200 x g 7minutos a 4ºC) e o
sobrenadante será coletado). Os níveis de citocinas e quimiocinas produzidas serão avaliados
por CBA (BD Cytometric Bead Array)
Análise estatística dos dados: para a comparação entre dois grupos experimentais será
utilizado o teste t de Student e para comparação entre mais de dois grupos experimentais será
usado o ANOVA e como pós-teste Tukey`s considerando um p < 0,05 como estatisticamente
significante. Software – Graphpad Prism.
O concurso BD Biosciences Pesquisador SBI visa o reconhecimento e apoio aos
pesquisadores que promovem o constante avanço científico através do incentivo à técnica
de Citometria de Fluxo com Múltipla Marcação no Brasil.
Saiba mais em bdbiosciences.com/br/pesquisador
R. Alexandre Dumas, 1976 - São Paulo, SP 04717-004 Brazil | 0800 771 71 57 | [email protected] | bdbiosciences.com/br