21º Congresso Brasileiro de Engenharia Sanitária e Ambiental
VI-011 - TESTE DE TOXICIDADE AGUDA: MONITORAÇÃO DA RESPIRAÇÃO
DA BACTÉRIA KLEBSIELLA OXYTOCA USANDO UM SISTEMA
FIA/CONDUTOMÉTRICO
Carolina Rittes Turato Farah(1)
Engenheira Química pela Fundação Álvares Penteado. Mestranda em ENGENHARIA
Civil - UNICAMP, na Área de Saneamento e Ambiente.
José Roberto Guimarães(2)
Professor assistente doutor do Departamento de Saneamento e Ambiente da Faculdade de
Engenharia Civil - UNICAMP. Atualmente trabalha com testes de toxicidade com
bactérias, química sanitária/ambiental, qualidade de águas e tratamento de águas de
abastecimento e residuárias.
Endereço(1): Rua Domingos Aldemar Boldrini nº 240 - Parque Nova Campinas - Campinas - SP - CEP: 13095-490
- Brasil - Tel: (19) 3253-2686 - e-mail: [email protected]
RESUMO
No presente trabalho foram realizados bioensaios, em triplicata, expondo-se a bactéria Klebsiella oxytoca
(CCT 0182/CIP79.32) aos metais pesados Hg2+ e Cu2+, e ao antibiótico Tetraciclina. Neste teste de toxicidade
o crescimento bacteriano é quantificado pela determinação do CO2 produzido, utilizando, para isto, o sistema
de análise por injeção em fluxo (FIA). As médias das concentrações efetivas (EC50) destes testes foram
55,6 ± 4,0 µg L-1 para o Hg2+, 4,19 ± 1,2 mg L-1 para o Cu2+ e 0,08 ± 0,007 mg L-1 para a Tetraciclina. A
média dos tempos de duplicação (tD) para as concentrações de Hg2+ de 10, 25, 50 e 100 µg L-1 e para o
controle, foram, respectivamente, 32,1, 32,4, 50,1, 750,6 e 32,1 minutos, para as concentrações de Cu2+ de
0,5, 1, 2,5, 5 e 10 mg L-1 e para o controle, foram, respectivamente, 42,7, 59,7, 100,1, 203,5, 351,1 e 31,5
minutos, e, para as concentrações de Tetraciclina de 0,01, 0,02, 0,05, 0,10, 0,15, 0,25, 0,50, 1,00 mg L-1 e
para o controle foram, respectivamente, 31,5, 33,7, 44,3, 58,1, 75,7, 121,6, 222,0, 327,5 e 33,3 minutos.
PALAVRAS-CHAVE: Toxicidade aguda, bactéria, Klebsiella oxytoca, metais pesados.
INTRODUÇÃO
A toxicidade é uma resposta biológica (FERNÁNDEZ-ALBA, 2001), ou seja, é a resposta de um organismo a
uma toxina. Os testes de toxicidade utilizam organismos para identificar a concentração que lhe é nociva e,
assim poder estimar a concentração segura (NIPPER, 2000), ou a qual não é deletéria ao organismo em
questão.
Existem vários sistemas de avaliação da toxicidade e, basicamente 2 tipos de testes, o agudo e o crônico. O
que os diferencia é o período de exposição do organismo à toxina, sendo curto para o teste agudo e longo,
para o crônico; e, portanto, fornecendo respostas rápidas e, demoradas.
Os organismos comumente utilizados em testes de toxicidade que contribuem para uma avaliação e
caracterização dos efeitos agudos e crônicos aos agentes tóxicos, são: bactérias, algas, moluscos, crustáceos,
poliquetos e peixes. A resposta de apenas um teste é insuficiente para se estimar a concentração segura, pois
a sensibilidade entre as espécies de organismos de um determinado ecossistema ao agente tóxico é muito
diferente, portanto é recomendável empregar simultaneamente no mínimo 3 espécies de diferentes níveis da
cadeia alimentar, a fim de se obter a toxicidade adequada (NIPPER, 2000).
Os ensaios toxicológicos podem ser usados para fornecer a toxicidade de compostos químicos que pretendem
ser lançados no mercado, para se saber o provável efeito que efluentes, em geral, vão causar ao serem
lançados no ambiente, para avaliar a qualidade de águas superficiais, e para verificar a eficiência e monitorar
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a qualidade do sistema de tratamento de efluentes (REGINATTO, 1998). Nestes últimos exemplos citados, a
avaliação da toxicidade é um parâmetro importante pois fornece uma resposta completa considerando todos
os seus constituintes, desconhecidos ou não esperados de um efluente, os efeitos aditivos, sinérgicos e
antagônicos e uma estimativa de biodisponibilidade.
No trabalho de TISLER (1999), é apontada a importância da medida da toxicidade do efluente com vários
organismos, ao lado de determinações químicas. Em seu estudo, 3 amostras compostas de efluentes foram
testadas com 2 diferentes espécies de organismos, Daphnia magna e Vibrio fisheri, e a comparação entre as
análises químicas e toxicológicas mostraram a causa principal do efeito tóxico inerente a apenas um
organismo: o zinco é tóxico à Daphnia magna. Por outro lado, as abreviações TIE (Toxicity Identification
Evaluation) e TRE (Toxicity Reduction Evaluation), ou seja, avaliação e identificação de componentes
tóxicos e avaliação de redução de toxicidade, promovem apenas a aplicação de testes de toxicidade.
O TIE é um "procedimento que auxilia na identificação dos agentes tóxicos dos efluentes" consistindo de 3
fases: caracterização de categorias de componentes tóxicos, identificação e confirmação destes, enquanto o
TRE é um "estudo localizado para isolar o agente causador da toxicidade, avaliar a eficácia de opções de
controle da toxicidade, e confirmar a redução da toxicidade do efluente". Segundo NIPPER (2000), estes
procedimentos, apesar de trabalhosos, são eficazes na identificação dos agentes tóxicos dos efluentes,
podendo também ser uma ferramenta para auxiliar em decisões sobre sistemas de tratamento de efluentes
industriais ou domésticos.
Na Dinamarca, USA e Suécia, segundo PETERSEN e PEDERSEN (1996), é obrigatória avaliação
toxicológica utilizando ensaios de toxicidade com vários organismos de diferentes níveis tróficos; tanto da
substância química individual como da mistura delas, para a descarga do efluente industrial em águas
superficiais. No Estado de São Paulo a partir da Resolução SMA-3 de 22/02/2000 que aprova a necessidade
do controle ecotoxicológico de efluentes líquidos, começou a se exigir estudos de toxicidade de efluente
industrial, considerando no mínimo 3 organismos aquáticos, assim incluindo mais um item ao artigo 18 da
Lei n. 997 de 31/03/1976 e, a necessidade de testes de toxicidade de baixo custo, de montagem simples, de
fácil operação, sensível e rápido na determinação.
Com o intuito de colaborar com mais uma espécie para a realização de testes de toxicidade, este trabalho tem
como finalidade propor um teste de toxicidade aguda com a bactéria Klebsiella oxytoca, monitorando o
processo de sua respiração, utilizando um sistema FIA/condutométrico. Dentre todos os processos
bioquímicos que acontecem no interior das células/bactérias, provavelmente a respiração é um dos mais
significativos como controle de crescimento da cultura microbiana. A monitoração desse parâmetro, ou seja,
a produção de dióxido de carbono (CO2), fornece de maneira precisa se está havendo o desenvolvimento
microbiológico. Diferentemente, quando realizado pelo método mais usual, onde é monitorizada a turbidez
do meio de cultura, e conseqüentemente são computados tantos as células/microorganismos vivos quanto os
mortos.
Dentre os vários métodos analíticos para determinação do dióxido de carbono em meio aquoso os mais
importantes são: via alcalinidade, por arraste após acidificação da amostra, manometricamente, utilizando-se
eletrodo íon-sensível, dentre outros. No entanto, em trabalhos envolvendo monitoração de crescimento
bacteriano é importante a utilização de um método simples, que utiliza pouca amostra e que seja rápido, o
que vem ao encontro do sistema de Análise por Injeção em Fluxo (FIA) (GUIMARÃES, 1990).
MATERIAIS E MÉTODOS
DETERMINAÇÃO DO CO2 PELO SISTEMA FIA
O sistema FIA utilizado é o mesmo desenvolvido por JARDIM e colaboradores (1990) em testes de
toxicidade aguda, onde foi monitorado o crescimento bacteriano (Escherichia coli) através da produção de
CO2 proveniente do processo de respiração desse microrganismo.
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O sistema FIA, para o ensaio de toxicidade, é constituído de bomba peristáltica, injetor de amostras ou
padrões, cela de difusão, cela de condutividade, tubos condutores de reagentes, resinas de troca iônica,
condutivímetro, registrador e banho-maria. O esquema está apresentado na figura 1.
Condutivímetro
Bomba
Peristáltica
Água
Cela de
Condutividade
Resina de
troca iônica
H2SO4
Cela de
Difusão
Injetor
Descarte
Descarte
Registrador
Amostra
Banho-maria
Figura 1: Esquema do sistema FIA/condutométrico utilizado para a determinação da concentração de
CO2 em Ensaios de Toxicidade.
O procedimento de análises é o seguinte: uma alíquota de 100 µL, a qual pode ser da amostra a ser analisada
ou de uma solução padrão, contendo as espécies carbônicas de interesse, é manualmente injetada no fluxo
carregador de ácido sulfúrico, na concentração de aproximadamente 0,2 mol L-1. Segundo a equação 1, o
equilíbrio é deslocado para a formação de CO2 e H2O.
CO2( aq ) + H 2 O ⇔ H 2 CO3 ( aq ) ⇔ H (+aq ) + HCO3−( aq) ⇔ H (+aq) + CO32(−aq )
equação (1)
Uma fração do dióxido de carbono gasoso formado permeia na cela de difusão, através de uma membrana de
Teflon, para um outro fluxo de água desionizada e o equilíbrio é novamente favorecido principalmente para a
+
−
2−
formação das espécies H (aq ) , HCO3( aq ) e CO3 ( aq ) . Como esse último fluxo vem sendo monitorado
constantemente quanto a sua condutividade, a presença desses íons provoca um incremento nesse parâmetro
o qual é proporcional à concentração das espécies carbônicas na amostra, ou seja, o CO2.
PROCEDIMENTO DO TESTE DE TOXICIDADE
Os testes de toxicidade aguda com a Klebsiella oxytoca são baseados na inibição/estimulação da respiração
microbiana (medida via CO2) causada pelos compostos a serem avaliados quanto a sua toxicidade.
O meio de cultura é inoculado com a bactéria e deixado em estufa à 37 ºC até que a suspensão bacteriana se
torne turva. Em seguida, é colocado em um banho-maria à 37 ºC e feito o monitoramento do CO2 até que sua
concentração atinja aproximadamente 0,50 mmol L-1 de CO2. Alíquotas de 100 mL são transferidas dessa
suspensão estoque de bactérias para Erlenmeyers de 125 mL, também mantidos a 37 ºC. A cultura é então
contaminada com o agente potencialmente tóxico. O frasco que não recebe nenhuma adição atua como
controle. Um meio de cultura sem bactérias atua como prova em branco. O monitoramento é feito a cada 20
minutos de acordo com a seguinte ordem de análise: primeiramente analisa-se o controle; em seguida o
branco, depois, as culturas contaminadas e finalmente o controle novamente, até a concentração do controle
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atingir o pico da concentração do maior padrão no registrador, que é de 4 mmol L-1. A concentração de CO2
nos diversos frascos é obtida por interpolação na curva de calibração (GUIMARÃES e JARDIM, 1996).
O meio de cultura básico utilizado foi preparado segundo DOWARD e BARISAS (1984) com apenas uma
diminuição de 0,6 g na quantidade de MgSO4 para evitar a formação do precipitado Mg(NH4)(PO4)s
(KPS=2,5x10-13). Em um Erlenmeyer com aproximadamente 800 mL foi colocado 1,6 g de KH2PO4, 1,6 de
K2HPO4, 1,0 de NaCl, 4,0 de (NH4)2SO4, 0,1 de MgSO4, e 0,5 de ácido cítrico em água desionizada, depois
acertado o pH para 7,2 com uma solução de 4 mol L-1 e avolumado para 1 L, aquecido até a ebulição e após o
resfriamento até 90 ºC, adicionado 2,5 g de glicose. O meio à temperatura ambiente está pronto para o
procedimento da inoculação da bactéria.
AGENTES TÓXICOS ANALISADOS
As substâncias potencialmente tóxicas estudadas nesse trabalho foram os metais pesados Hg2+, Cu2+, bem
como o antibiótico Tetraciclina.
A Tetraciclina é um antibiótico bacteriostático ativo contra um grande número de organismos Grampositivos e Gram-negativos e, tem-se mostrado eficaz contra, além de muitos outros organismos, à Klebsiella
(infecções respiratórias e urinárias). Com o intuito de aplicá-la como substância de referência, um grande
número de concentrações foram testadas. A solução de tetraciclina foi preparada dissolvendo 500 mg de
tetraciclina (EMS) contidas numa cápsula e avolumando para 2 L. Esta solução foi armazenada em tubos de
Ependorff de 1,5 mL, protegidos da luz e congelados, para ser utilizada em cada ensaio.
Tanto para o mercúrio quanto o cobre foram utilizadas soluções padronizadas, diluídas em balão calibrado
para se obter 1 g L-1, depois diluídas para o intervalo das concentrações analisadas.
CÁLCULO DA CONCENTRAÇÃO DE CO2, DO TEMPO DE DUPLICAÇÃO (TD) E DA
CONCENTRAÇÃO EFETIVA (EC)
Os parâmetros calculados para efeito de comparação entre os vários níveis de concentração foram: EC 50
120
que é a concentração efetiva que inibe a respiração das bactérias em 50%, ao tempo de exposição de 120
minutos; e tD que é o tempo de duplicação da concentração de dióxido de carbono (ou do número de
bactérias).
O crescimento bacteriano é verificado através do aumento da concentração de CO2, do controle (suspensão
bacteriana sem o agente tóxico), pelo tempo. Na figura 2, pode ser observado o crescimento bacteriano do
controle, e também das suspensões com concentrações crescentes do antibiótico tetraciclina.
Crescimento bacteriano: Klebsiella oxytoca e
Tetraciclina
4,5
4,0
Controle 1
[CO2] mM
3,5
0,008 mg/L
3,0
0,01 mg/L
2,5
0,02 mg/L
2,0
0,05 mg/L
1,5
0,1 mg/L
1,0
Controle 2
0,5
0,0
0
20
40
60
80
Tempo (min)
100
120
140
Figura 2: Comportamento bacteriano ao agente estressante tetraciclina
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O cálculo do tempo de duplicação (tD) da população de bactérias é feito através da equação 2:
ln [[CCt0]] = kt
equação (2)
onde Ct é a concentração do CO2 (mM) num tempo qualquer, C0 é a concentração do CO2 (mM) presente no
meio de cultura no início de cada bioensaio, k (1/min) é a constante relacionada com o crescimento
bacteriano e t é o tempo expresso em minutos. O tempo de duplicação (tD) será aquele na qual a concentração
(Ct) for igual a 2 vezes a concentração inicial (C0). Desta forma, a equação 3. ficará:
ln 2 = kt D
equação (3)
Note que (ln2)/k, fornece o tempo de duplicação da biomassa bacteriana (em minutos) nas condições
experimentais utilizadas.
Para o cálculo do tempo de duplicação, é necessária a identificação da fase log do crescimento bacteriano.
Observando o controle, na figura 2, identifica-se esta fase a partir do tempo 60. Na figura 3 é apresentado o
gráfico do ln da concentração de CO2 pelo tempo dos 4 últimos pontos participantes da fase log do controle.
Tempo de duplicação t D
1,5
y = 0,0204x - 0,0767
R2 = 0,9975
ln[CO2]
1,0
Controle 1
0,5
Linear (Controle 1)
0,0
0
10
20
30
40
50
60
70
-0,5
Tempo (minutos)
Figura 3: Tempo de duplicação
A EC50 (concentração efetiva) é retirada do gráfico da % de inibição pela concentração do agente tóxico à um
tempo de exposição pré-determinado. A equação 4 apresenta o cálculo da concentração efetiva:
EC = [
(C − A)
] × 100
C
equação (4)
onde, C é a diferença da concentração final e inicial de CO2 do controle e; A, a diferença da concentração
final e inicial de CO2 da amostra.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A caracterização físico-química de uma determinada substância química ou mesmo de uma mistura de
substâncias é muito importante, porém não fornece o verdadeiro potencial tóxico. Neste contexto, a utilização
de ensaios com organismos, ou seja, aplicação de testes de toxicidade, avaliam os efeitos causados sobre a
biota. Para uma avaliação mais adequada com relação ao efeito tóxico de substâncias em geral, recomenda-se
o uso de uma bateria de ensaios com organismos representantes de diferentes níveis da cadeia alimentar. A
título de comparação, foram extraídos da literatura alguns dados de testes de toxicidade, onde foram
utilizados outros organismos e comparados com os dados do presente trabalho, com o objetivo de verificar a
sensibilidade da bactéria estudada aos mesmos agentes tóxicos.
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Na tabela 1 estão apresentados os resultados dos testes de toxicidade com as bactérias Klebsiella oxytoca,
Klebsiella pneumonia (ISHII e YOSHIKAWA, 1993) Escherichia coli (GIMENEZ, 1994), Photobacterium
phosphoreum, Vibrio fisheri ou Microtox® (GREENE et alii apud GUIMARÃES (1990) e Microtox®
(SILLANPÃÃ e OIKARI, 1996), e com o microcrustáceo Daphnia magna (SORVARI e SILLANPÃÃ,
1996), quando expostos aos agentes tóxicos Hg2+ e Cu2+.
Como era de se esperar, há uma grande variação entre os resultados para os vários organismos. Como já
comentado anteriormente, os agentes tóxicos agem diferentemente sobre as diferentes espécies e, para se
determinar a concentração segura testes diversos devem ser feitos simultaneamente. Além disso os ensaios
foram realizados em diferentes condições. Com relação aos metais analisados, houve um consenso entre os
organismos com relação à toxicidade deles: o Hg2+ se revelou mais tóxico que o Cu2+.
Tabela 1: Comparação dos resultados de EC50 e IC50 obtidos em 6 testes de toxicidade ao Hg2+ e Cu2+
em mg L-1
Testes de toxicidade
Agentes
Klebsiella
Klebsiella
Escherichia
Microtox®
Microtox®
Daphnia
120
tóxicos
pneumonia
coli
(15
min)
magna
(24h)
oxytoca EC 50
180
IC50, 18h
EC
Hg2+
0,0556 ± 0,004
Cu2+
4,19 ± 1,2
(1)
Resultado extrapolado
50
0,9
7,5
35,7
0,03 ± 0,01
0,38(15min)(1
1,29 ± 1,69
1,02(5min)
0,0016
)
0,022
O tempo de duplicação foi um parâmetro calculado neste trabalho. Esta medida pode ajudar na interpretação
de resultados. No trabalho de GIMENEZ (1994), a bactéria Escherichia coli foi utilizada em teste de
toxicidade aguda e testada com os metais cobre e cádmio. A autora fez a comparação entre a toxicidade dos
metais, quando adicionado no meio de cultura a mesma quantidade em mol L-1 destes, com o do tempo de
duplicação (tD).
Os resultados obtidos no presente trabalho do teste dos metais e tetraciclina foram analisados criticamente em
relação à concentração dos compostos no meio, tempo de duplicação, concentração efetiva, etc.
Para o teste com Hg2+, na figura 5 é mostrada a resposta da bactéria Klebsiella oxytoca frente as suas várias
concentrações. Pode-se observar que nenhum efeito foi notado durante as duas horas de experimento quando
submetida à concentração de até 25 µg L-1. A inibição começou a ser notada a partir da concentração de 50
µg L-1, e ser total a partir de 75 µg L-1. A média da EC 50 foi 55,6 ± 4,0 µg L-1. A média dos tempos de
120
duplicação (tD) para as concentrações 10, 25, 50, 100 µg L-1 e para o controle foram, respectivamente, 32,1;
32,4; 50,1; 750,6 e 32,1 minutos.
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5,0
4,5
C o ntrole 1
10 ug/L
25 ug/L
50 ug/L
75 ug/L
100 ug/L
C o ntrole 2
4,0
[CO2] mM
3,5
3,0
2,5
2,0
1,5
1,0
0,5
0,0
0
20
40
60
80
100
120
140
T e mpo (min)
Figura 5: Crescimento/inibição da bactéria Klebsiella oxytoca ao agente estressante Hg2+.
Para o teste com Cu2+, a bactéria foi exposta às concentrações de 0,5; 1; 2,5; 5; 10 e 20 mg L-1. A inibição
começou a ser observada desde a concentração de 1 mg L-1. A média da EC 50 foi de 4,19 ± 1,2 mg L-1 e a
120
média dos tempos de duplicação (tD) para as concentrações 0,5; 1; 2,5; 5; 10 mg L-1 e para o controle foram,
respectivamente, 42,7; 59,7; 100,1; 203,5; 351,1 e 31,5 minutos.
Para o antibiótico Tetraciclina, foram realizados testes utilizando concentrações de 0,01 até 1 mg L-1. Na
figura 2 está mostrado o comportamento bacteriano frente a esse antibiótico. A inibição começou a ser
observada desde a concentração de 0,05 mg L-1. Como mencionado acima, com o intuito de sua utilização
como substância de referência, muitos ensaios foram realizados, com proximidade entre as concentrações. Na
figura 6 está apresentado o gráfico da concentração efetiva com a respectiva curva de inibição. A média da
120
EC 50
foi de 0,08 ± 0,007 mg L-1. A média dos tempos de duplicação (tD) para as concentrações 0,01; 0,02;
0,05; 0,10; 0,15; 0,25; 0,50; 1,00 mg L-1 e para o controle foram, respectivamente, 31,5; 33,7; 44,3; 58,1;
75,7; 121,6; 222,0; 327,5 e 33,3 minutos.
Concentração efetiva (EC)
120
% de inibição
100
80
60
40
20
0
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
[Tetraciclina] m g/L
0,8
0,9
1
1,1
Figura 6: Gráfico da concentração efetiva (EC)
CONCLUSÕES
Com base nos agentes tóxicos testados com a bactéria Klebsiella oxytoca, concluiu-se que:
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A utilização da bactéria Klebsiella oxytoca como organismo em teste de toxicidade pode colaborar com a
bateria de testes, pois foram obtidos EC 50 com desvios padrões baixos o que confere à bactéria estabilidade
120
genética e uniformidade das populações.
A tetraciclina pode ser utilizada como substância de referência, pois a bactéria se mostrou bastante sensível a
essa droga, e os ensaios apresentaram um desvio padrão muito baixo, ou seja, pode ser considerada como um
padrão nos ensaios, principalmente para confirmar se a cepa de bactérias não sofreu modificações durante o
período de estocagem.
Finalmente, é importante salientar que o ensaio de toxicidade proposto pode ser um teste complementar para
a bateria de ensaios de toxicidade de compostos puros ou da mistura deles, como por exemplo águas
residuárias. O sistema utilizado no presente trabalho, ou seja, FIA, para determinação e monitoração de CO2
produzido pelas bactérias mostrou-se bastante adequado para o ensaio proposto. É um sistema de baixo custo,
de montagem simples, que utiliza um volume bem reduzido de amostra, com operação extremamente simples
e finalmente é bastante sensível e possui uma alta freqüência analítica.
AGRADECIMENTOS
Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo - FAPESP; processo nº 99/06693-9.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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