Microscopia de
contraste diferencial
de fase
Contraste diferencial de fase

Contraste: diferença de iluminação entre
amostras e os arredores ou o plano de fundo.
Transmissão = luz + fluorescência – (absorção + refração
+ reflexão)
fluorescência
refração
absorção
LUZ
reflexão
Contraste diferencial de fase

Conceito
Técnica de contraste em que a luz plana polarizada
incidente sobre a amostra passa por diferentes caminhos
ópticos em pontos diversos da amostra, causando diferenças
de intensidade de luz que passam por um 2º polarizador.
Os caminhos ópticos diferentes podem ser causados
por diferenças nos índices de refração e/ou nas espessuras
das estruturas.
Contraste = (If - Ia) x 100
If
Contraste diferencial de fase

Indicações
- Amostras vivas ou fixadas não coradas;
- Observação de células (incluindo organelas)
em cultura:
- Aplicar coloração óptica;
- Melhorar contraste de certas estruturas em
amostras coradas;
- Aplicação da técnica de seccionamento
óptico.
Contraste diferencial de fase

Configurações
1) Tradicional (Normanski, 1952): usa prismas Wollaston e
polarizadores. Também conhecida como conatrste de
Normanski.
2) Alternativa (Inoué, 1989): usa polarizadores e
compensadores de retardo de fase. Também conhecida
como técnica DIC com compensador de fase. Pode-se
usar compensador de Senarmont, compesador de Berek
ou filtro l com analisador giratório.
Contraste diferencial de fase

O que o contraste diferencial faz?
- Variações nos caminhos ópticos dos raios desviados são
ajustadas para dar um contraste com impressão de imagem
tridimensional;
- partes da amostra podem ficar mais escuras ou mais claras
que o campo de visão ao redor.
- não há halos de fase ao redor das células/estruturas;
- produz melhor resolução do que o contraste de fase pela
ausência dos anéis de fase nas objetivas e condensador;
- há formação de sombras acompanhando um eixo no plano
da imagem.
Contraste diferencial de fase

Configuração tradicional
Analisador
Wollaston
Wollaston
Filtro 1/4 l
Polarizador
Trabalha-se nos planos
da imagem conoscópica
Contraste diferencial de fase

Configuração alternativa (de Senarmont)
Analisador
Compensador de Senarmont:
Consiste num filtro ¼ de l e um
polarizador (pode ser o
analisador) giratório.
Objetiva
Amostra
Diafragma do
condensador
Filtro ¼ de l
Polarizador
giratório
Fonte de luz
Contraste diferencial de fase

Configurações de compensador de
Senarmont
Analisador
Controle
Giratório
removível
Analisador
Trava
Fenda para
inserir filtro
Graduação de
180 ou 360º
Filtro de
¼ de l
Escala vernier
(a)
(b)
Contraste diferencial de fase

Configuração alternativa (de Senarmont)
1) Faz-se ajuste koehler;
2) coloca-se polarizadores cruzados, com
o 1º na posição 45º e o 2º a 90º do 1º
(campo de visão fica escuro);
3) Insere-se o filtro ¼ de l na fenda apropriada;
Contraste diferencial de fase

Configuração alternativa (de Senarmont)
4) Gira-se o analisador até criar um retardo de fase
adequado para se obter o melhor contraste para cada caso.
O retardo de fase é dado por: l*q/180 (q é o angulo
movido no analisador).
Contraste diferencial de fase

Configuração alternativa (de Senarmont)
5) Pode-se inserir um filtro vermelho 1 (entre o polarizador
e a amostra ou entre a objetiva e o analisador) para fazer
coloração óptica.
Contraste diferencial de fase

Configuração alternativa (de Senarmont)
É mais prática que a configuração tradicional e está sendo
responsável pela crescente popularidade da técnica de DIC.
Contraste diferencial de fase

Eixos das sombras
Contraste diferencial de fase

1)
Dados técnicos
Acessórios obrigatórios (método
alternativo): dois polarizadores (sendo um
deles giratório) e um filtro de ¼ de l ou
filtro l; ou compensador de Berek.
2) Acessórios extras (método tradicional):
prismas Wollaston (no diafragma do
condensador e perto do plano retro-focal
da objetiva) (para a técnica clássica de
DIC).
Contraste diferencial de fase

Técnicas e contraste
Amostra
Transparente
Corada
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Técnica
Contraste
Campo claro
Campo claro
Contraste de fase
Contraste diferencial
de interferência
Campo escuro
Fluorescência
2-5%
25%
15-20%
15-20%
60-75%
60-75%
Contraste diferencial de fase

Técnica de coloração óptica
Sem filtro vermelho 1
Com filtro vermelho 1
Contraste diferencial de fase

Secionamento óptico
É a técnica de observar planos específicos da amostra
separadamente, trabalhando com o ajuste micrométrico em
certas técnicas de contraste.
Observação de diversos planos de uma colônia de Volvox
(microorganismos aquáticos)
Contraste diferencial de fase

Contraste de fase x DIC: diferenças
DIC
Contraste de fase