Polymerase Chain Reaction
Reação de polimerização em cadeia
ou
Polimerização em cadeia do DNA
PCR - consiste em fazer cópias de DNA “in vitro”, usando os
elementos básicos do processo de replicação natural do DNA.
PCR foi idealizada como um método para isolar
rapidamente sequências específicas a partir de uma mistura
complexa de seqüências genômicas ou de cDNAs.
PCR alcançou objetivos bem mais amplos que os propostos
inicialmente. PCR é comparada em importância à definição
da estrutura do DNA.
1984 - PCR foi apresentada pela primeira em
um encontro científico
Publicação:
Mullis and Faloona, 1987
Saiki at al. 1988
1976: Thomas D. Brock descobriu a DNA polimerase termoestável
de Thermus aquaticus.
1988: Esta DNA polimerase foi usada por Saiki para fazer PCR.
PCR requer 7 componentes essenciais:
- DNA polimerase termoestável
- Um par de oligonucleotídeos para iniciar a síntese de DNA
- Deoxinucleotídeos trifosfato (dNTPs)
- Cátion divalente: toda DNA pol. requer cátion divalente,
usualmente Mg2+
- Tampão para manter o pH
- Cátions monovalentes, usualmente K+ (KCl)
- Template de DNA
Virtualmente, qualquer seqüência alvo de DNA pode ser amplificada
por PCR.
A localização da seqüência alvo é feita pelos iniciadores (primers).
Oligonucleotídeos com 17 “mers” são usualmente seletivos o
suficiente para localizar um sítio único em um genoma de alta
complexidade, tal como o genoma humano.
Pareamento: pontes de hidrogênio
Watson e Crick:
A
T
C
G
A TÉCNICA DE PCR
PCR
A TÉCNICA DE PCR
PCR é um processo iterativo, consistindo de três elementos:
- Desnaturação da template por aquecimento
- Pareamento dos iniciadores à seqüência alvo fita única
- Extensão dos iniciadores pela DNA polimerase termoestável
Separação das fitas é denominada “FUSÃO” da molécula
de DNA - “MELTING”
MELTING POINT de “primers” para PCR:
TEMPERATURA NA QUAL 50% DAS TEMPLATES ALVO
ESTÃO PAREADAS COM OS “PRIMERS”
Cada uma das novas fitas de DNA extendidas a partir dos “primers” serve como
template para síntese de uma nova fita. Os “primers” presentes na reação fazem
o pareamento com as novas fitas, na região de complementariedade
antiparalela entre “primer”- “template”. Isso garante a aumento exponencial do
número de novas fitas.
 Todas as fitas de DNA sintetizadas durante a PCR têm a sequência de um dos
primers na extremidade 5’ e a seqüência complementar ao outro primer na
extremidade 3’
forward
reverse
“primers”
complemento dos “primers”
Amplificação específica
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
Amplificação inespecífica
5’
3’
5’
3’
3’
5’
3’
5’
Quando os produtos de PCR são usados como template eles já têm
“match” perfeito com os primers
É feito um
segmento
complementar
ao primer
5’
3’
5’
Produtos específicos
Produtos inespecíficos
Tanto produtos específicos como inespecíficos têm sítios para
pareamento perfeito dos primers e continuarão a ser amplificados nos
diversos ciclos da PCR
No = número inicial de
cópias de DNA-dupla fita
(template)
Nf = número final de cópias
da seqüência alvo (dupla
fita)
Y = eficiência da extensão
do “primer” por ciclo
n = número de ciclos
Cinética da PCR:
- Fase de “screening” - ciclos iniciais
• Os “primers” (ou iniciadores) procuram a “template” de DNA.
- Fase intermediária:
• Acúmulo exponencial do fragmento de DNA.
- Fase de amplificação linear:
• A amplificação já é sub-ótima.
- Fase de platô: a quantidade de produto é estável.
Cinética da reação
1 g de DNA
genômico tem
3 x 105 cópias do
genoma de
mamíferos
O crescimento linear (plot semi-log) do número de cópias ocorre até um determinado
número de ciclos. A saturação ocorre quando a concentração de produto amplificado atinge
~ 10-8 M ou ~ 1012 moléculas por 100 l.
As causas do platô são várias:
- Perda da atividade da enzima
- Todas as enzimas disponíveis estão ocupadas com a síntese de DNA
- Acúmulo de produtos amplificados que tendem a parear entre si, em detrimento do
pareamento com os “primers”. Nesse ponto, a possibilidade de amplificação de produtos
inespecíficos é maior.
- Gasto dos reagentes, especialmente inativação da DNA polimerase
- Acúmulo de pirofosfato (PiPi)
- Competição com outros produtos que vinham sendo amplificados com eficiência menor
mas que também foram se acumulando
etc
Eficiência da amplificação
A eficiência média de amplificação é 0,85. Pequenas alterações para menos
podem fazer com que o produto não seja detectado.
Redução de 1% na eficiência, redução de 15% no produto final após 25 ciclos.
Parâmetros mais importantes para a otimização de PCR:
- Temperatura de “annealing” dos primers
- Regime de ciclos
- Composição do tampão
Componentes do tampão para PCR (10 X):
- Tris.HCl - 100 mM (pH 8.3 a 25oC)
- KCl - 500 mM
- gelatina 1 g/L ou
- Albumina bovina
- 0,1% Tween-20 ou
estas substâncias aumentam a
- 0,1% Laureth 12 ou
estabilidade da enzima
- 0,1% NP-40
- MgCl2 - 15 mM
10 a 50 mM de Tris HCl - pH entre 8,3 e 8,8 (a 20oC) Usualmente 10 mM Tris-HCl/pH 8,3
O pH do tampão Tris varia muito com a temperatura (6,8 a 8.3
durante a PCR). O pH mais baixo é atingido em temperaturas
mais elevadas.
MgCl2: testar de 0,5 a 5 mM em steps de 0,5 ou 1 mM
(para multiplex, até 10 mM)
- Se a concentração de Mg2+ é muito baixa, temos pouco ou
nenhum produto
- Se a concentração de Mg2+ é muito elevada, a PCR tem baixa
especificidade. Observa-se muitas bandas ou “smear”.
A concentração de Mg2+ deve superar em 1,2 mM a
concentração total de dNTPs, porque esta é a concentração de
Mg2+ livre necessária para atividade ótima da enzima.
dNTPs:
Usar dNPTs preparados para PCR, pois são fornecidos com pH adequado (8.1) e
sem pirofosfato. Acúmulo de PiPi pode inibir a reação de polimerização.
Usar entre 20 e 200 M, procurando a concentração que forneça o máximo de
produto com o máximo de especificidade.
Menor concentração de dNTPs: maior especificidade, com pouco produto final.
Maior concentração de dNTPs: há aumento da quantidade de produto com
perda de especificidade.
Primers:
A concentração ótima de “primer” é entre 0,1 e 0,5 M
Ambos os membros do par devem ser usados na mesma
concentração.
Excesso de “primers” induz aparecimento de produtos
inespecíficos e formação de dímeros de “primers”.
Concentração de reactantes e produtos antes e após 30 ciclos de PCR
DNA polimerases utilizadas em PCR
DNA polimerases:
Todas sintetizam uma fita nova de DNA extendendo um “primer”, através da
incorporação de nucleotídeos do meio, na direção 5’  3’, tendo como orientação
para a incorporação dos nucleotídeos a informação contida na fita molde (template).
Todas são DNA-pol na direção 5’ 3’
As DNA polimerases usualmente têm também atividade exonucleásica:
na direção 3’ -> 5’: uma atividade corretiva - “proof reading”
na direção 5’ -> 3’: atividade de reparo do DNA (remoção de um segmento
de DNA que está na “ frente” da enzima)
DNA polimerases termoestáveis:
DNA polimerase de Thermus aquaticus (Taq - polimerase) - a primeira a ser
descoberta e a mais utilizada.
Esta DNA polimerase termófila não tem atividade de exonuclease 3’- 5’, ou seja,
não tem atividade corretiva, mas tem atividade exonucleásica 5’3’
A taxa de incorporação de bases erradas durante a PCR pode variar entre 10-3 a
10-6, dependendo especialmente das concentrações de Mg2+ e dNTPs
A incorporação de base errada (mismatch) reduz a estabilidade da interação da
enzima com o DNA.
Baixa temperatura de extensão e elevada concentração de dNTPs favorecem a
extensão de “primers” com pareamento imperfeito e a extensão após mismatch.
DNA polimerases podem adicionar uma base a mais na extremidade 3’ OH,
independetemente da “template”.
A probabilidade de adição é maior quanto maior a concentração de Mg2+ e de
enzima e se as últimas bases imporadas previamente forem A ou T.
A base a adicionada é quase sempre A.
5’xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx3’
3’ yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy5’
5’ xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxx3’
3’Ayyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5’
1º ciclo
5’ xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxA3’
3’ yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy5’
5’ xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxA3’
3’Ayyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5’
5’ xxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxxA3’
3’A yyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyyy 5’
2º ciclo
DNA polimerases termorresistentes com atividade corretiva:
Uemori et al. 1997: DNA polimerase de Pyrococcus furiosus (Pfu) - com duas
subunidades codificadas por genes dispostos em seqüência num único operon.
Tem forte atividade exonucleásica 3’5’ (proof reading).
Tli DNA polimerase: derivada do Thermoccocus litoralis. (Promega)
Vent DNA polimerase: é a forma recombinante da Tli (New England Biolabs)
Ambas têm atividade exonucleásica 3’ 5’ e são mais termoestáveis que a Taq
(meia vida de 6,7 h a 95oC). Sintetizam fragmentos de até 13 kpb.
DeepVent DNA polimerase: extraída do Pyroccocus GB-D. (New England)
Pwo polimerase (Boehringer Mannheim)
Ao usar DNA-polimerase com atividade “proof-reading” (exonuclease
3’ 5’), deve-se usar uma maior concentração de dNTPs (no mínimo
200 mM de cada), para evitar que a enzima destrua os “primers” ou
mesmo os produtos de PCR em forma de fita única. Estas polimerases
degradam DNA fita única.
Enzimas com atividade corretiva não adicionam uma base a mais na
extremidade 3’ (-A), como ocorre com a Taq polimerase usual e
outras enzimas sem atividade corretiva.
Avaliar o produto final da PCR
Eletroforese:
Tipo de tampão
Voltagem
Coloração
- Evitar produtos inespecíficos na PCR
- Otimizar a reação
Hot Start PCR
(Faloona et al. 1990)
A reação de amplificação é
iniciada em temperatura
elevada
Vantagem:
se não há amplificação de
produtos inespecíficos, há
aumento da especificidade e
do rendimento da reação de
amplificação.
Elimina “primer-dimers”
A polimerase é ativa em faixa ampla de temperatura.
A atividade da enzima varia em 2 duas ordens de
grandeza entre 20 e 85oC.
Como fazer “hot start PCR” ?
- Anticorpo anti-DNA polimerase (Life, Clontech, Sigma…)
- “High-affinity oligonucleotide ligands (aptamers)" - permanecem ligados à
polimerase a baixas temperaturas, inativando-a.
- Taq-polimerase modificada quimicamente:
O modificador é permanentemente liberado em temperatura elevada. A
liberação é gradual, diferentemente dos dois métodos anteriores
(AmpliTaq Gold - PE Applied Biosystems)
Alguns “aditivos” podem aumentar a especificidade e o
rendimento da PCR
• DMSO (1 - 10%) – (10% DMSO inibe a atividade da enzima em cerca
de 50%)
• PEG-6000 (5 - 15%)
• Glycerol (5 - 20%)
• Detergentes não iônicos
• Formamida (1,25 - 10%)
• Albumina sérica bovina (10 - 100 g/ml)
• Betaína
• Tetrametilamônio (TMAC)
Quantidade de enzima:
• Se não se observa produto de PCR ou se observa muito pouco
produto, o problema pode ser a quantidade de enzima.
• Quando se usa enzima com atividade corretiva, deve-se usar uma
quantidade maior, porque a processividade destas enzimas é
menor.
Se possível, reduza a temperatura e o tempo de desnaturação.
Caso não consiga amplificação com uma dada enzima, teste outras
enzimas.
A concentração de “primers”:
A proporção “primer-template” deve ser entre 107 a 108, no início da
PCR.
Se a quantidade inicial de moléculas alvo é menor que 100, inciar a
PCR com 1 pmol.
Após os 5 ciclos iniciais, aumentar a “concentração dos “primers”.
“Booster PCR”
Temperatura de annealing dos primers:
O pareamento específico depende criticamente da temperatura, além de ser
influenciado pela concentração de cátions, de “primers”, tempo na temperatura
de annealing e outros fatores, como presença de aditivos.
A temperatura de “annealing” deve ser a mais alta possível que permita o
pareamento.
Pode-se fazer também “touch down PCR”:
Exemplo: variar a temperatura de “annealing” entre 65oC e 55oC, reduzindo a
temperatura em 1oC a cada 2 ciclos, durante 20 ciclos. Fazer mais 10 ciclos a 55oC.
Usar ter,ocicladores com gradiente
Magnésio:
Concentração de Mg2+ afeta:
- annealing dos primers
- temperatura de desnaturação da template e dos
produtos amplificados
- especifidade da reação
- formação de dímeros de primers
- atividade e fidelidade da enzima
Usualmente se começa com 1,5 mM
Pode-se utilizar de 0,5 mM a 5 mM de Mg2+ na reação.
Template:
A quantidade de template a ser adicionada depende do
tipo de material que estamos utilizando.
DNA genômico: 50 a 250 ng
1 g de DNA genômico tem 3 X 105 moléculas de um gene único.
O mesmo número de moléculas está presente em:
- 10 ng de DNA genômico de levedura
- 1 ng de DNA genômico de E. coli.
- 1-2 pg de plasmídeo
- 2 pg de bacteriofago l
Parâmetros dos ciclos:
Temperatura e Tempo de desnaturação:
A desnaturação da template ocorre entre 90oC e 98oC
Primeira desnaturação: 2 a 5 min a 92oC a 95oC
Desnaturação nos demais ciclos: 94oC por 15/30 segundos
Falta de desnaturação da template é uma causa comum de falha na
PCR.
Tempo de desnaturação muito longo reduz a meia vida da enzima e
pode causar depurinação do DNA.
Temperatura e tempo de extensão:
Temperatura de extensão: usualmente 72oC
Nessa temperatura, há incorporação de 35 a 100 nucleotídeos
por segundo, dependendo da enzima, do tampão, do pH, da
concentração de sal, da natureza do DNA - template.
Tempo de extensão: depende do tamanho do amplicon;
1 minuto é suficiente para um amplicon de 2 kb
Processividade da Taq polimerase: - 0,25 nt/s a 22 oC
- 1,5 nt/s a 37 oC
- 24 nt/s a 55 oC
- > 60 nt/s a 70 oC
- 150 nt/s a 75 – 80 oC
Nested PCR pode ser uma alternativa para melhorar a
especificidade e a sensibilidade da PCR
Problemas comuns e algumas sugestões para solução:
1 – Nenhuma ou pouquíssima amplificação
• Desnaturação incompleta da “template”
Ferva o DNA antes de misturar os reagentes
• Fortes estruturas secundárias na “template”
Adicione 7-deaza-dGTP (3:1 ao dGTP)
Adicione DMSO até 10% e/ou glicerol até 12% e/ou formamida até 10%
Use Taq com deleção N-terminal
• Sua template alvo não está presente na amostra
Faça um controle positivo
• Desnaturação incompleta dos produtos de PCR
Aumente o tempo de desnaturação para 1 minuto
• Não pareamento dos primers
Abaixe a temperatura de annealing
• Seqüência dos primers pode estar incorreta
Verifique a seqüência dos primers
• Magnésio insuficiente
Teste concentrações a 1 a 10 mM em passos de 0,5 mM
Sugestões de solução para “smears”:
• Reduza a quantidade de DNA
• Aumente a temperatura de “annealing” – em passos de 2oC
(amplificador com gradiente)
• Reduza a concentração de enzima – em passos de 0,25 U
• Reduza a concentração de Mg2+ - em passos de 0,1 mM
• Aumente o tempo de desnaturação – em passos de 5 s
• Aumente a temperatura de desnaturação – em passos de 1oC
• Reduza o número de ciclos – em 5 a 10 ciclos
• Faça hot start
• Faça touch down
• Reduza o tempo de extensão
• Reveja o desenho dos “primers”
PCR a partir de RNA
RT-PCR
RT – PCR (Powell e col. Cell 1987, 50:831-840)
• DNA- Polimerase não usa RNA como “template”
• Primeiro é necessário fazer a transcrição reversa do RNA
em cDNA
• RT: Reverse Transcriptase
• Após a transcrição reversa, prossegue-se normalmente
com o PCR
RT-PCR eficiente:
• RNA da mais alta qualidade, íntegro, sem sinais de
degradação.
• RNA livre de DNA
• Livre de inibidores
• Livre de nucleases
Tipicamente, uma célula de mamífero tem ~10 pg de RNA por célula.
1 mg de RNA total representa ~ 100.000 células.
Abundância
No. de cópias
No. de mensagens
Abundância de
diferentes por célula cada mensagem
baixa
~ 10
~ 11.000
< 0,004%
intermediária
~ 200
~ 500
< 0,1%
alta
~ 12.000
~ 10
3%
TRANSCRIPATASE REVERSA é uma DNA polimerase que utiliza RNA como
“template”
Precisa de primer, como toda DNA polimerase
A polimerização é sempre na direção 5’  3’
Trancriptases reversas de origem viral não têm atividade exonucleásica
3’  5’ (“proof reading”) ou 5’ 3’
Transcriptases Reversas mais comumente usadas:
AMV-RT (de virus de aves)
M-MLV-RT (de virus de mamífero – mouse)
Transcriptases reversas
mesófilas
(funcionam bem a 37-42 oC)
Primers
Transcrição
Reversa
É altamente recomendável que o RNA a ser utilizado para RT-PCR seja
previamente tratado com DNase RNase-free.
Pequenas quantidades de DNA genômico podem permitir a
amplificação do produto procurado, dando-nos a falsa impressão de
que o amplicon é proveniente de cDNA sintetizado a partir de RNA
pela transcripase reversa.
Faça sempre um controle negativo, em que a reação de amplificação
é feita sem a adição de transcriptase reversa.
Cuidado com pseudo-genes completamente processados: cerca de 50% dos genes têm um
pseudogene correspondente processado
Exemplo de amplificação simultânea de fragmento de
DNA genômico e de fragmento de cDNA
A Transcrição Reversa é o passo menos reprodutível na RT-PCR
O sucesso da transcrição reversa depende de vários fatores:
• Integridade do RNA é o fator fundamental
• Ausência de contaminantes no RNA tais como LiCl, SDS, EDTA e outros
• As condições da reação - concentração e tipo de tampão, pH, Mg2+ ou
Mn2+, dNTPs etc - devem ser otimizados
• Estruturas secundárias estáveis no RNA dificultam a progressão da
enzima; regiões ricas em GC são difíceis de serem reversamente
transcritas.
mRNA
AAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTT
cDNA
AAAAAAAAAAAAAAA
TTTTTTT
Estruturas
secundárias
abortam a
transcrição
reversa
primers
oligo-dT
AAAAAAAAAAAAAA
TTTTTT
TTTT
AAAA
TTTT
AAAA
O RNA se degrada a 94oC,
em presença de íons
divalentes
Sendo esta a seqüência alvo para PCR, o primer
sense sintetisado para a PCR será o primer para a
sintese da 2a. fita de cDNA, que será sintetizada
pela Taq DNA polimerase
A eficiência da PCR após a transcrição reversa pode melhorar muito
com a adição de RNase H ou por desnaturação do cDNA a 97oC por
5 minutos, imediatamente antes da PCR.
fragmentos de RNA estáveis em regiões ricas em G e C
3’
5’
3’
TTTT 5’ 1a. fita de cDNA
Híbrido DNA/RNA tem Tm mais elevado que DNA/DNA
AMV-RT (de virus de aves)
Transcriptases reversas mesófilas
M-MLV-RT (de virus de mamífero – mouse)
(funcionam bem a 37-42 oC)
Não funcionam bem com RNAs com estruturas secundárias estáveis.
Thermo-Script RT
É uma enzima que permite realizar transcrição reversa em temperatura elevada
(60oC)
Essa enzima é proveniente da AMV-RT, que foi modificada para eliminar a atividade
de RNase H e para ter termoestabilidade.
rTth polimerase:
Isolada da eubatéria termofílica Thermus thermophilus
• DNA polimerase termófila que tem atividade de transcripatse reversa em
temp. elevada (60-70 oC). Como funciona em temperatura mais elevada, as
estruturas secundárias do RNA podem ser desfeitas nessa temperatura.
• Primer usado para RT deve ser específico, com Tm elevado.
• rTth tem atividade exonucleásica 5’3’ e atividade
de RNase H, mas não cliva híbrido RNA-DNA endonucleoliticamente, como
AMV e M-MLV.
rTth – a mesma enzima é usada para RT e PCR
Atividade de RT favorecida pela presença de Mn2+
Primeiros experimentos com rTth:
Mn2+ para RT
EGTA para quelar Mn2+
Adição de Mg2+ para PCR
Atualmente RT e PCR são realizadas com Mn2+
Inconvenientes do Mn2+: degrada RNA em temperatura elevada e
aumenta erros de incorporação de bases na PCR.
Nova geração de RT termófilas:
• T. Z05 DNA polimerase:
DNA polimerase com atividade de RT isolada de Thermus Z05.
Também dependente de Mn2+, porém mais estável que rTth
• rTth mutada para aumentar a eficiência de RT na presença de Mg2+
GeneAmp AccuRT RNA PCR Enzyme (Roche)
Montagem de um laboratório para PCR
Células
DNA
genômico
purificado
Lise e purificação
DNA
Possibilidade
de
contaminação
Hibridização,
dot, slot, e
microplaca
RNA viral
mRNA e
rRNA
cDNA
PCR
Sequenciamento de
DNA
PCR
em tempo
real
Eletroforese
Laboratório para PCR
Todas as salas devem ter: pipetadores, geladeira, freezer -20oC, bancada de
trabalho.
1 - Sala para preparo de reagentes
Equipamentos: microcentrífuga, vórtex, dH2O, máquina de gelo, balança,
pHmetro.
2 – Sala para preparo de amostras
Equipamentos: microcentrífuga, vórtex, fluxo laminar (p/ proteger a pessoa que
trabalha)
3 – Sala de 1ª. PCR: termocicladores
4 – Sala de 2ª. PCR: termocicladores
5 – Sala de pós-PCR: cubas de eletroforese, fontes de voltagem, micro-ondas,
transiluminador, sistema de documentação de imagem de gel.
• Pipetadores devem ser dedicados para as áreas específicas; e os
pipetadores para pipetar DNA nas misturas de PCR devem ser com
dispensadores positivos (que não provocam aerossol) ou com ponteiras
com filtro, nunca reutilizadas. Uma partícula de aerosol usualmente tem
24.000 cópias do DNA amplificado.
• Exposição da área de preparo, do material, e mesmo de alguns
reagentes, a luz ultravioleta (UV) danifica o DNA que eventualmente esteja
contaminando o local, tornando-o não amplificável. É mais fácil danificar
DNAs longos e ricos em pirimidinas.
400 mW/cm2 - reduz contaminação com moléculas de DNA.
Redução em 1000 vezes, com exposição por 4 h.
· Não reutilize os plásticos (tubos, ponteiras)
· Todo o material deve ser estéril. Autoclave as partes autoclaváveis do
pipetador.
· Todas as soluções devem ser autoclavadas.
· Não podem ser autoclavados: oligonucleotídeos, DNA, RNA, enzima DNA
polimerase, dNTPs.
· As ponteiras devem ter filtro protetor, o que evita contaminação por
formação de aerossol
· Avental específico para ser utilizado apenas na área para PCR, sendo que o
que foi usado na área de pós-PCR não pode ser usado nas demais áreas.
· A área pós-PCR deve estar distante das áreas de preparo de amostra e de
pipetagem dos reagentes.
• Use luvas descartáveis e troque-as com freqüência e sempre quando
entrar na área 1 ou 2. Tire as luvas e avental antes de sair da sala.
• Limpe a bancada de trabalho ao começar e ao terminar.
• Adicione o DNA por último na reação, para evitar transferência de
amostras de DNA de um tubo para outro.
• Faça sempre um controle negativo, sem template. Prepare o tubo
controle negativo por último, para que este seja representativo da
manipulação que ocorreu nos demais tubos.
• Para evitar contaminação na fase de eletroforese, lave bem a cubas de
eletroforese, bandejas e pentes com HCl 1 M.
Controles:
• Controle negativo: sem DNA
• Controle positivo: DNA sabidamente com a seqüência alvo
• Controle interno: primers para outra seqüência alvo
PCR: evitando contaminação por “carryover”
Lembre-se: 100 ml de uma reação de PCR usual, diluídos na água de uma
piscina olímpica, resulta em 400 moléculas por 100 ml da água da piscina !!
• Uso de Uracil-DNA-glicosilase (UNG) e deoxiuridina
trifosfato (dUTP)
• O produto de PCR com dUTP pode ser utilizado para praticamente todas
as aplicações de um produto de PCR usual com dTTP.
• DNA polimerase com atividade corretiva não incorpora dUTP !
• Tome o cuidado de desnaturar completamente a UNG, para que não haja
destruição de seu produto de PCR.
Uma alternativa ao uso de dUTP é sintetizar os primers com dUTP.
Ao final da PCR, uracil-DNA glicosilase destrói os primers nas extremidades dos
fragmentos amplificados, inutilizando-os para amplificação posterior