Objetivos
PPGCF e PPGQ da UNIFAL-MG
Disciplina QUI022
PREPARO DE AMOSTRAS PARA
ANÁLISE DE COMPOSTOS
ORGÂNICOS
Fornecer aos alunos do curso de PPGQ e PPGCF
conhecimentos básicos sobre as principais
técnicas e estratégias de preparo de amostras
destinadas à análise de compostos orgânicos.
Prof. Dr. Eduardo C. Figueiredo
[email protected]
www.unifal-mg.edu.br/latf
Outline da disciplina
Introdução ao Preparo de amostras
Extração líquido-líquido
Microextração em fase líquida
Extração por fluido supercrítico
Extração por Soxhlet
Extração em fase sólida
Microextração em fase sólida
Extração sortiva em barra de agitação
Microextração em sorbente empacotado
Preparo de amostras empregando polímeros de impressão molecular
Preparo de amostras empregando meios de acesso restrito
Filtração e diálise
Headspace
QuEChers
Extração por micro-ondas
Extração por ultrassom
Column swiching
Microextração em fase sólida no capilar
Por quê é necessário o preparo da amostra??
Amostra coletada
HPLC, LC-MS/MS,...
Critérios de Avaliação
Prova teórica (P): 10 pontos
Relatórios de aulas práticas (R): 5 pontos
Trabalho (T): 10 pontos
Nota final = (P+R+T)/2,5
Datas:
Entrega do trabalho: 06-05-2013
Prova teórica: 20-05-2013
Resultado final: 24-05-2013
Etapas do procedimento analítico
saída
entrada
Resultado
analítico
Informação
inicial
processo
Preparo de amostra
Amostra = não apropriada para a análise...POR QUE??
• Muito “suja” – contém outros componentes na matriz que interferem
com a análise
• Muito diluída – analitos não estão concentrados suficientemente para
perimitir a detecção
• Matriz não compatível ou perigosa para a coluna/sistema
cromatográfico, ou outras metodologias analíticas
Amostragem
Preparo de
amostra
Identificação
e/ou
quantificação
Análise
dos dados
HPLC; GC; CE; MS
1
Amostragem
Coleta de amostras representativas do
material a ser analisado
Preparo das
amostras
Eliminação de interferentes e
isolamento dos analitos de interesse
Fontes de erro em cromatografia
Contaminação (4%)
Introdução da amostra (6%)
Cromatografia (7%)
Colunas (11%)
Integração (6%)
Identificação e/ou
quantificação
Separação, identificação e quantificação
dos analitos
Análise dos dados
Métodos algébricos/ estatísticos para
estimar quantidades e incertezas
Instrumento (8%)
Operador (19%)
Calibração (9%)
Avaliação dos
resultados
Processamento da amostra (30%)
Decisão sobre ações a serem tomadas
em face aos resultados
Erros X Equívocos
Tempo gasto na análise
• Erros sempre existem e são tratados estatísticamente
Tratamento dos
dados (27%)
• Equívocos provem da falta de conhecimento de
analistas destreinados, devem ser banidos.
Coleta (6%)
“... em laboratórios de química analítica, o preparo de amostra
não é reconhecido como uma etapa importante em todo o
esquema analítico e freqüentemente é dado para os analistas
menos treinados...”
Análise (6%)
Processamento da
amostra (61%)
Método idealizado de preparo de amostra
Analitos orgânicos
PREPARO DE
AMOSTRAS:
FUNDAMENTOS
interferente
analito
matriz
Separar analitos
quantitativamente dos
interferentes da matriz
Processo suave
Volume da amostra
Vam contendo n gramas
de analito
Identificar/
quantificar
n g de analito
concentrados em
um volume Vfinal
Vfinal << Vam
Cfinal >> Cam
Concentração = Cam
2
A
M
O
S
T
R
A
Método idealizado de preparo de amostra
Analitos inorgânicos (metais)
interferente
analito
matriz
1. Purificação (clean up) da amostra
Queimar a matéria
orgânica (matriz)
Identificar/
quantificar
Processo drástico
Volume da amostra
Vam contendo n gramas
de analito
Finalidades do preparo de
amostras
n g de analito
concentrados em
um volume Vfinal
- eliminação a matriz e interferentes que possam
danificar o sistema cromatográfico ou que possam
interferir na identificação e/ou quantificação dos
analitos.
2. Pré concentração dos analitos
Vfinal << Vam
Cfinal >> Cam
Concentração = Cam
Benefícios do preparo de
amostras
Benefícios do preparo de
amostras
1. Tornar a matriz compatível com a técnica de análise.
3. Remover interferências:
2. Proteger o sistema e coluna cromatográfica de
contaminação por partículas e material de elevado
peso molecular:
- simplificando a extração;
- diminuindo o tempo de análise;
- aumentando a sensibilidade.
- aumento da vida útil da coluna;
- menor gasto com manutenção;
- menos problemas operacionais.
4. Concentrar componentes de interesse:
- aumentando a sensibilidade (detectabilidade);
- aumentando a reprodutibilidade.
Preparo de amostras
biológicas
Materiais biológicos são complexos: contêm proteínas,
sais, bases, lipídeos, carboidratos e compostos
orgânicos, às vezes similares quimicamente aos
analitos.
Analitos: presentes em quantidades muito pequenas
na amostra e ainda ligados às proteínas.
COMO SEPARAR ANALITOS, MATRIZ E
INTERFERENTES?
1. Propriedades físico-químicas dos constituintes da amostra
- analitos, interferentes e matriz são voláteis?
- polares? apolares?
- amostra: sólida? líquida? gasosa?
- analitos são quimicamente e/ou termicamente estáveis?
2. Concentração de analitos e interferentes na amostra
- Quais as concentrações esperadas de analitos e de
interferentes na amostra?
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COMO SEPARAR ANALITOS, MATRIZ E
INTERFERENTES?
Preparo de amostras
3. Características da instrumentação disponível
Quesitos para um eficiente preparo da amostra:
-O detector é sensível? seletivo? específico? para o analito
- Algum componente do sistema é incompatível com constituintes
da amostra ou reagentes usados?
4. Requisitos técnico-gerenciais
- Existe metodologia oficial a ser seguida?
- Quantas amostras serão analisadas por dia?
a) Perda mínima da amostra e boa recuperação do analito;
b) Interferentes da amostra devem ser removidos
eficientemente;
c) O procedimento deve ser feito de forma conveniente e
rápida;
d) O custo da análise deve ser baixo.
- Existe pessoal capacitado para cumprir estas demandas?
Preparo de amostras:
tipos de técnicas
Preparo de amostras:
tipos de técnicas
Trabalho aqui
Trabalho aqui
1) Exaustivas
2) Não-exaustivas
Na fase
extratora
O objetivo é a remoção
completa dos analitos da matriz
e sua transferência para a fase
extratora.
baseadas em princípios de
equilíbrio
Na amostra
Na fase extratora
2.1 Pequeno volume da fase
extratora: SPME, LPME
- técnicas flow trough (SPE),
Na amostra
extração em fluido supercrítico
(SFE), Soxhlet
Extração de 100%
2.2 Baixa constante de
distribuição amostra/fase
extratora: headspace
mesmo ser no equilíbrio?
? Precisa
Técnicas de preparo “on-line“
Preparo de amostras x calibração
????
Calibração para análise de amostras biológicas?
Padrão interno!?
O que fazer???
plasma
bco
padrão de
fármaco
plasma de paciente
Como calibrar??
Orgânicos x Inorgânicos
= ou ≠ ?
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Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
Desproteinização requer:
Análise química
Preparo de amostra
Curva ideal
(a) temperaturas elevadas
(b) alteração da força iônica ou osmótica ou do pH;
(c) agentes orgânicos de precipitação;
(d) enzimas proteolíticas.
Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
PROBLEMAS
VANTAGENS
(a) Simplicidade
(b) Baixo custo
(c) Facilidade de automação
Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
-
precipitação incompleta das proteínas (e algumas
globulinas podem permanecer no sobrenadante e
passarem para o sistema de detecção);
-
diluição da amostra (mais usado para concentrações
mais elevadas de analitos);
-
geração de picos no CLAE ou interferência na leitura
espectrofotométrica devido ao agente precipitante
usado.
Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
Teoria de precipitação
Análise de fármacos em
amostras biológicas: Leite,
soro, plasma, urina, ...
Proteoma: precipitação
seletiva de proteínas de
cereais trangênicos,.
Estruturas primária, secundária,
terciária e quaternária
Interação com íons, solventes,
compostos orgânicos, ...
Principais aplicações
Análise de toxicantes em
alimentos: MP,
micotoxinas,
inceticidas,...
Análise de proteínas em
amostras biológicas: Leite,
soro, plasma, urina, ...
As interações podem ocorrer na
superfície ou no interior.
Qualquer modificação na
estabilidade da proteína no meio
pode causar precipitação
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Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
Teoria de precipitação
Teoria de precipitação
Fatores que estabilizam as proteínas
Complexidade na estrutura
+
Complexidade da amostra
⇓
Dificuldade em explicar
mecanismos de precipitação
Processos de precipitação
Modificação do pH
Ligações íon-íon
Modificação da força iônica
Ligações íon-dipolo
Modificação da temperatura
Ligações de hidrogênio
Adição de sais
Ligações dipolo-dipolo
Adição de solventes (acetona, metanol, acetonitrila,..)
Interações hidrofóbicas
Adição de cátions (Zn2+, Cd2+, Ba2+)
Natureza do meio
Adição de ânions (picrato, tungstato, molibidato,...)
Alguns processos causam desnaturação das proteínas
Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
Método
Plasma
Agentes precipitantes mais comuns empregados em amostras
biológicas
Agente
precipitante
Coletar
Sobrenadante
⇓
Análise
Agitação
Centrifugação
Acetona, metanol, etanol,
acetonitrila, ácido trifluoracático,
ácido tricloroacético, acido
tricloroacético, dentre outros
Principal mecanismo de
precipitação
⇓
Mudança na camada de
solvatação (água) das proteinas
Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
Tratamento prévio de amostras
Precipitação de proteínas
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Tratamento prévio de
amostras
Tratamento prévio de
amostras
HIDRÓLISE DE CONJUGADOS
HIDRÓLISE DE CONJUGADOS
(a) Específica ou enzimática, onde são utilizadas
enzimas como as β-glicuronidases e as aril-sulfatases
(a) Específica ou enzimática, onde são utilizadas
enzimas como as β-glicuronidases e as aril-sulfatases
Fontes: Helix pomatia (tbém sulfatases) e a Patella vulgata,
Helix aspersa e a Escherichia coli.
- mais lenta, porém, menos vigorosa e mais seletiva, e não
degrada os analitos;
- exige que a atividade da enzima seja avaliada periodicamente,
através do estudo de sua eficiência no processo de hidrólise; além
disto, a atividade da enzima pode ser inibida por componentes da
matriz.
Tratamento prévio de
amostras
HIDRÓLISE DE CONJUGADOS
b) Não-específicos, utilizando-se a hidrólise ácida ou
alcalina.
- utiliza condições extremas de pH e de temperatura;
- formação de produtos que interferem na extração e
derivatização, ou no perfil cromatográfico dos analitos.
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