Proteome analysis of X-ray
irradiated human
erythroleukemia cells
Eleuterio, E.; Di Giuseppe, F.; Sulpizio, M.; Di
Giacomo, V.; Rapino, M.; Cataldi, A.; Di Ilio,
C.; Angelucci, S.
Biochimica et Biophysica Acta 1784 (2008) 611-620
Kelly Tino
Letícia Oyamada
Thays Nogueira
nº USP: 5413841
nº USP: 5672034
nº USP: 5414157
Introdução





Radioterapia  atingir o máximo de controle do tumor com o
mínimo de complicações para os tecidos normais
Radioterapia apresenta um efeito deletério em sistemas
biológicos  tratamento de câncer
Dose normal: 20-30 frações de 2-3 Gy cada, durante 5 a 6
semanas
Principal complicação da radioterapia  dano do tecido normal
 ROS interagem com DNA e proteínas  morte celular
Efeitos radioresistentes
 Alteração da expressão de proteínas – reparo de DNA,
apoptose, controle do ciclo celular, resposta a estresse
oxidativo
Objetivo



Identificação de proteínas envolvidas na resistência à radiação.
Modelo: linhagem celular humana K562 de eritroleucemia radioresistente
Mecanismo de resistência: oncoproteína com atividade tirosina
quinase (PTK) desregulada  envolvida na inibição da indução
da apoptose e morte celular promovendo sobrevivência dessas
células
Desenho do estudo




Linhagem K562 submetida a 6 Gy de raio-X
 Dose subótima protocolo de tratamento tumoral com
radioterapia em humanos
Análise de alterações no ciclo celular e microscopia
1 hora após tratamento análise proteômica
Identificação de proteínas relacionadas e sua expressão:
 Proteína stress-70


Glutationa transferase pi e ômega
Complexo mitocondrial de síntese de ATP
Método
Cultura celular e tratamento com radiação
ionizante


Células K562 foram cultivadas em suspensão em meio RPMI
1640, suplementada com SFB, glutamina, HEPES,
penicilina/estreptomicina em atmosfera controlada, a
temperatura ambiente
Irradiação com 6 Gy
Método
Avaliação do ciclo celular e apoptose
prematura



Após 24h após irradiação
2-5 x 105 células  centrifugação, (200g/10min/4ºC), fixação
com etanol, ressuspensão, RNAse
Ciclo celular Citometria de Fluxo


Avaliação da apoptose tardia  DNA subdiploide
calculado e expresso em porcentagem de células
apoptóticas versus não apoptóticas
Detecção de células em apoptose precoce – Ensaio
Annexin V - translocação de resíduo de fosfatidilserina
para a parte externa da membrana plasmática
Resultados
4,6 % células
apoptóticas
confluência de
células na transição
G2/M
Resultados
14,2%
apoptose
precoce
Método
Microscopia eletrônica


Fixação, desidratação, adição de resina e polimerização com
UV, corte ultrafino e fixação com acetato de uranila e citrato de
chumbo  preservação da morfologia
Fotografia com microscópio eletrônico
Resultados
Não tratada
Apoptose
precoce:
Condensação da
cromatina e
emarginação do
núcleo (seta)
Apoptose tardia:
retração da
membrana,
separação de
vesículas e
cromatina densa
Método
Preparação da amostra para Eletroforese
Bidimensional (2DE)




Suspensão de células foi centrifugada (1200 g), lavada com SFB
gelado (3x)
Extração das proteínas de 107 células com tampão de lise
Sonicação do extrato (3 x/20 s), centrifugação, incubação com
endonuclease, purificação
Determinação da concentração de proteína  2D Quantin kit
Métodos
Eletroforese bidimensional



Triplicata das amostras
1ª dimensão: separação das proteínas de acordo com seu pI em
fita de 18cm, pH 3-10
2ª dimensão: separação das proteínas por massa molecular (gel
com gradiente de 9-16% de poliacrilamida)
Coloração


Géis analíticos - nitrato de prata amoniacal
Géis para espectrometria – prata sem glutaraldeído
Método
Análise das imagens



Proteínas marcadoras: proteína de choque térmico Hsp 90-alfa,
Peroxiendoxina 1, Subunidade beta tipo 3 de Proteosoma
(distribuídas nos géis e identificadas por espectrometria de
massa)
3 géis para cada condição
Parâmetros de comparação:


% volume para quantificar os spots
média (entre o menor limite de uma classe e o maior
limite de outra classe)
Resultados
Não tratadas – 1430 ±
79 proteínas
Irradiadas – 1590 ± 98
proteínas
83 % de proteínas coincidentes – coeficiente de correlação: 0,9
Método
Análise por Western-Blot




As proteínas das amostras controle e tratadas foram separadas
em eletroforese uni e bidimensional e transferidas para
membranas de nitrocelulose.
Anticorpos primários diluídos 1:1000
Anticorpos secundários diluídos 1:3000
Medidas das bandas mono e bidimensionais
Resultados
5,4
6,2
EXPERIMENTOS MONO E BIDIMENSIONAIS – resultados
semelhantes à análise do proteoma
Método
Digestão de proteínas e MALDI-TOFEspectrometria de Massa



Recorte dos spots do gel 2-DE
Análise por mass finger printing (PMF) com MALDI-TOFespectrômetro de massa
Comparação com banco de dados
Resultados

39 proteínas foram expressas diferentemente nas células não
tratadas e nas tratadas
 29 super-reguladas

10 sub-reguladas
Resultados
5,4
6,2
EXPRESSÃO CELULAR – análise do proteoma
Discussão


Análise Annexin V  evidências de radioresistência
 Proliferação celular mais lenta (porcentagem de G2/M
aumentada)
 Sensibilidade celular diminuída em situação de estresse

Resposta apoptótica à radiação baixa (14,2 %) se comparada
com outras linhagens celulares
Análise proteômica
 Diferenças entre as proteínas expressas nos grupos estudados
 Associação dessas proteínas com atividades celulares
importantes


Metabolismo energético, motilidade do citoesqueleto, biossíntese proteica,
detoxicação, entre outros.
Super expressão de proteínas envolvidas no metabolismo de
carboidratos
Discussão
PROTEÍNA
EXPRESSÃO
ATIVIDADE
OBSERVAÇÃO
3 isoformas dos fatores
de elongação (EF1A1)
AUMENTADA
Crescimento celular/
inibição da apoptose/
tumorigênese/ regulação
do citoesqueleto
Relato de resistência à
cisplatina de células de
câncer de cabeça e
pescoço
Proteínas de choquetérmico (Hsp) –
Stress-70 e proteínas 1
do complexo T
AUMENTADA
Atuam como chaperonas
para reconhecimento de
proteínas com
conformação anormal /
defesa celular em
condições de estresse
RESITÊNCIA /
SOBREVIVÊNCIA /
PROLIFERAÇÃO
CELULAR
Enzimas conjugadas da
Fase II (Glutationa
transferase P1-1 e O1-1)
AUMENTADA
Resistência a fármacos
quimioterápicos
(etoposide, cisplatina,
docetaxol, tamoxifeno)
Aumentadas em células
radioresistentes – fator
indicativo de dificuldades
no tratamento
quimioterápico
DJ-1
AUMENTADA
Proteção celular contra
ROS
Proteção contra
radioterapia
Discussão
PROTEÍNA
EXPRESSÃO
ATIVIDADE
OBSERVAÇÃO
Creatina Quinase B
AUMENTADA
Transferência de fosfato
entre o ATP e fosfógenos
RADIORESISTÊNCIA
2 comp. do complexo
mitocondrial ATP sintase
DIMINUÍDA
Síntese ATP
também encontrada em
células resistentes de
câncer de cólon RADIORESISTÊNCIA
Proteína Actin-like 3 /
tropomiosina cadeia alfa
3
AUMENTADA /
DIMINUÍDA
Polimerização da actina /
ligação aos filamentos de
actina e estabilização do
citoesqueleto
Desorganização do
citoesqueleto/aumento
da plasticidade =
RESISTÊNCIA
RuvB like2
AUMENTADA
Helicase dependente de
ATP – reparo da dupla
fita de DNA após
exposição à radiação
Proteção da célula
tumoral contra radiação
(observada no estudo)
Conclusão




Identificação de inúmeras proteínas com alteração da expressão
após radiação
 Stress-70, Glutationa transferase e ATP sintase
Também relacionadas à resistência a fármacos antitumorais
 Mecanismo de radio e farmacoresistência podem ser
semelhantes
Análise proteômica ferramenta simples e útil para identificação
de biomarcadores da resistência celular
Novas investigações com as proteínas descritas
 Novas estratégias para o tratamento de câncer
 Tratamentos radio e quimioterápicos combinados na terapia de
leucemia humana