Faculdade de Medicina Dentária da Universidade do Porto
Produção de
Proteínas
Recombinantes
Regente:Prof. Dra. Deolinda Lima
Orientadora: Dra. Alexandra Gouveia
Discentes: Andreia Pires
Benedita Aguiar
Bruna Gonçalves
Catarina Oliveira
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O que são proteínas recombinantes?
São proteínas produzidas artificialmente a partir de genes clonados.
Isto é, advêm da técnica de DNA recombinante.

Para que servem?
A produção de proteínas recombinantes permite obter benefícios em
várias áreas:
- saúde;
- biologia;
- bioquímica;
- microbiologia;
- genética;
- biotecnologia;
- agricultura;
- etc.
Algumas aplicações

Terapia génica
Possibilidade de introdução de um gene num organismo e
consequente correcção de doenças genéticas.

Melhoramento animal e vegetal
Plantas resistentes a pragas e a
diferentes meios nutritivos.
Animais de maiores dimensões,
mais férteis e carne com maior qualidade.

Criação de modelos animais
www.dqb.fc.ul.pt
Ideais para o estudo da estrutura, função e regulação de um gene, além
de facilitar a compreensão da fisiopatologia da doença.
Técnica de produção de proteínas recombinantes
• Isolar e preparar o DNA;
• Escolher o vector apropriado;
• O fragmento de DNA a clonar é
introduzido em vectores de
clonagem, formando-se o DNA
recombinante.
• O DNA recombinante é inserido na
célula hospedeira – transformação,
que possui mecanismos enzimáticos
para a replicação do DNA e para a
síntese proteica;
• Selecção e identificação de células
que incorporam o DNA
recombinante;
• Verificar se a proteína foi expressa;
• Remoção e purificação das
proteínas.
The Cell- A Molecular Approach;Cooper, Geoffrey M..
Algumas enzimas envolvidas no processo
Enzimas
Função
Tipo II (endonuclease de restrição)
Cortam os DNAs em sequências de
bases específicas.
DNA ligase
Juntam duas moléculas de DNA ou
fragmentos.
Taq DNA polimerase
Adiciona os nucleotídeos na
extremidade 3´ da cadeia de DNA.
Transcriptase reversa
Produz uma molécula de DNA
através de uma molécula de RNA.
● Enzimas de restrição- Endonucleases
Os fragmentos de DNA usados para criar moléculas
recombinantes são normalmente gerados por digestão através de
endonucleases de restrição.
. Conhecem pequenas sequências específicas com 4 a 6
pares de bases.
. São designadas por três letras: EcoRI, HindIII.
Vectores de clonagem
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

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Capaz de transportar uma sequência de DNA estranha dando
origem a um DNA híbrido ou recombinante.
Capacidade de se auto-replicar.
Conter pelo menos um gene que confira resistência a antibióticos.
Possuir locais de restrição únicos, polylinker.
Fácil de purificar.
Tipos de vectores de clonagem
•
Plasmídeos (pBR322)
•
Fasmídeos ou fagemídeos
•
Cosmídeos
•
Bacteriófagos λ
•
YACs, BACs e PACs
www.biologianaweb.com/ Livro2/C11/pbr322.html
Vectores de expressão
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Promotor
Codão de iniciação seguido de polylinker
Local de ligação ao ribossoma
Promotor
Local de ligação ao
ribossoma
Sítio de clonagem e
sequência codificante de 6
histidinas
www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html
www.icampus.ucl.ac.be/. ../expression.html
Transformação

Ocorre quando uma célula
incorpora e exprime um fragmento
de material genético.

Para a introdução do DNA
recombinante podem ser utilizados
vários métodos:
•
•
•
•
•
Células competentes;
Electroporação;
Bombardeamento de DNA
revestido de Tungsténio;
Microinjecção;
Transfecção.
Modern Genetic Analysis.
Extracção e purificação de proteínas
• Extracção
lise celular
• Purificação
Cromatografia de afinidade
Lehningher Principles of Biochemistry
Tags moleculares de fusão
Fusion Tag
Immobilized
Ligand
Binding Conditions
Elution Conditions
Available Formats
Glutathione (Stransferase(GS
T)
Reduced glutathione
Neutral (physiologic) pH,
and non-denaturing;
glutathione must be
reduced and GST must be
active
Free reduced
glutathione at neutral
pH (competitor)
Prepacked column
kits, spin cup column
kits, SwellGel Discs,
coated microplates
Histidine-tagged
Chelated Nickel or
Cobalt
Neutral (physiologic) pH
without reducing or
oxidizing agents; small tag
must be accessible in
fusion protein structure;
high ionic strength and
denaturants (chaotropes
such as 8 M urea)
compatible.
>200 mM Imidazole,
low pH, or strong
chelators
Prepacked column
kits, spin cup column
kits, SwellGel Discs,
Swell- Gel Discs in
96-well filter plates,
coated microplates
Maltose
Binding
Protein (MBP)
Dextrin
Neutral (physiologic) pH
and non-denaturing; NaCl
added to reduce
nonspecific binding
Maltose at neutral pH
(competitor)
Gel slurry, coated
microplates
Green
Fluorescent
Protein (GFP)
Anti-GFP antibody
Neutral (physiologic) pH
and non-denaturing
Usual
antibody/antigen
elution buffers (e.g.,
low pH or chaotropic
salts)
Coated microplates
Proteínas Recombinantes
Exemplos de Proteínas Recombinantes

Hormona de crescimento humano – a administração desta hormona
durante a infância permite a correcção dos casos de nanismo.

Anticoagulantes – activadores de tecido plasminogénio que por sua
vez activam a plasmina, enzima que dissolve os trombos (evita ataques
cardíacos).

Dismútase do superóxido – previne danificação de tecidos
quando este é exposto à falta de oxigénio.

Anticorpos monoclonais – são usados em testes
diagnósticos; transporte direccionado
(drogas, toxinas, componentes radioactivos
utilizados na terapia cancerígena), assim
como outras aplicações.
ioh.medstudents.com.br/ humoral.htm
Insulina
Referência cronológica

1922 - Frederick Grant Banting descobre a insulina.

1978 - É produzida insulina humana recombinante.

1982 - Esta insulina é disponibilizada no mercado.
Insulina
-
-
Duas cadeias peptídicas- cadeia A e cadeia B.
Duas pontes dissulfureto entre as cadeias A e B e outra na própria cadeia A.
Insulina recombinante
Monómeros- Insulina é
activa na forma de
monómeros.
Dímeros – pontes de
hidrogénio entre as
extremidades C da
cadeia B.
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm
Insulina lispro
http:\\bio.chm.nu.edu\resources\webproject\rasHol\tutorial\isulina4.htm
Hexameros – na
presença de Zn 2+
Produção de insulina

Insulina proveniente de suínos e bovinos

Insulina humana biossintética
Introduction to Genetic Analysis.
Purify β-gal- insulin
fusion proteins
Β-gal
X-PROT

Unidade de investigação e desenvolvimento na área da
biotecnologia molecular.

Produção de proteínas recombinantes de interesse para
a saúde humana.

Desde 2003, 5 novas proteínas.

Descoberta de proteína com enorme potencial para
terapia do cancro.

Prémio da Comissão Europeia em 2004.
Bibliografia
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"The Cell. A Molecular approach."- 3nd ed. G.M. Cooper, AMS Press,
U.S.A. 2004.
"Molecular Biology of the Cell." - 4 nd ed., Alberts, Bray, Lewis, Raff,
Roberts and Watson, Garland Publishing, Inc. New York, 2002.
Nelson D.L., Cox M.M.: Lehningher Principles of Biochemistry (4th Ed.).
W.H. Freeman and Company, New York. 2005.
http://www.fortunecity.com/campus/biology/752/dnarec.htm
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www.biotecnologia_na_escola.up.pt
www.terravista.pt/FerNoronha/5802/genetica.htm
www.institutovirtual.pt
www.dqb.fc.ul.pt
www.mces.pt
www.aidscongress.net
http://acl.com.sapo.pt/naodoping.htm
http://www.saudenainternet.pt/guia/?file=guia-artigo&cod=76
www.piercenet.com