UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
Torque teno vírus
(TTV)
(Exame de qualificação)
Thais Fumaco Teixeira
Histórico
• 1997: Torque teno vírus (TTV)
▫ Paciente com hepatite pós-transfusional de
etiologia desconhecida
 Iniciais do nome do paciente (T.T.)
 “transfusion transmitted virus”
Histórico
• 2000: “TTV-like mini virus” (TLMV)
• 2005: Novo significado para TTV e TLMV
▫ Torque teno vírus (TTV)
▫ Torque teno mini vírus (TTMV)
 “Torque” = colar
 “teno” = pequeno
Histórico
• 2007: Torque teno midi-vírus (TTMDV)
▫ Vírus relacionado ao TTV
▫ Tamanho intermediário
Histórico
• Infecção por TTV não é restrita a humanos
▫
▫
▫
▫
▫
▫
▫
Chimpanzés
Tupaias
Suínos
Bovinos
Cães
Gatos
Leões marinhos
Taxonomia
• Família Anelloviridae
• Gênero Anellovirus
▫ Sub-classificados em genogrupos
Taxonomia
Características moleculares
• DNA circular
• Variabilidade no
tamanho
• Fita simples
• Polaridade negativa
▫ TTV humano (3,4 kb – 3,9
kb)
▫ TTMDV (3,2 kb)
▫ TTMV (2,8 kb – 2,9 kb)
▫ TTSuV (2,9 kb)
▫ TTV felino (2,1 kb)
Epidemiologia
• Amplamente difundidos
▫ Distribuição não está associada com a sua origem
geográfica
• Prevalência TTSuV1 varia de 24% a 100%
• Prevalência de TTSuV2 na Espanha (77%)
Epidemiologia
• TTV estaria associado a diferentes patologias
auto-imunes:
▫ Doenças reumáticas
▫ Patologias hepáticas
▫ Disturbios respiratórios
• Não existem dados definitivos indicando que
TTV é responsável por qualquer doença em
humanos
▫ Vírus órfão
Epidemiologia
• Em suínos: TTSuV infecta uma elevada
proporção de animais aparentemente saudáveis
• Co-infecção com outros patógenos
• Prevalência de TTSuV2 em suínos com SMDS
(91%) e em suínos saudáveis (72%) (Kekarainen et al.,
2006)
• TTSuV1 facilita indução da SMDS pelo PCV2
(Ellis et al., 2008)
Patogenia
• DNA de TTV tem sido identificado em:
▫
▫
▫
▫
▫
▫
Células mononucleares de sangue periférico;
Células hematopoiéticas da medula óssea;
Plasma;
Fezes;
Saliva;
Suabes nasais e de garganta.
• Aparentemente necessita de células em
multiplicação ativa para se replicar
Transmissão
• Principal transmissão TTSuV: oral-fecal (soro, plasma,
fezes)
• Transmissão vertical: colostro, útero, soro de porcas e
seus natimortos
• Sêmen
• Trato respiratório: pulmões, secreções nasais e saliva
Detecção de Torque teno vírus
suíno 1 (TTSuV1) em diferentes
tecidos de suínos
Introdução
• Aparentemente TTSuV não tem associação com
qualquer patologia
• Estudo mostrou uma aparente associação negativa entre
a presença de TTSuV1 e a ocorrência da SMDS (Teixeira
et al., 2008)
• Estudo de distribuição de TTSuV em tecidos detectou
uma maior prevalência de TTSuV no pulmão (Bigarré et
al., 2005)
Introdução
• Replicação do TTSuV não parece estar restrita a este
órgão
• Formas replicativas intermediárias de fita dupla de TTV
foram encontradas:
▫
▫
▫
▫
▫
▫
Fígado
Células da medula óssea
Pulmão
Pâncreas
Baço
Outros tecidos linfóides
Objetivos
• Detecção de TTSuV em órgãos de suínos com e sem a
Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos
Suínos;
Material e Métodos
• Amostras
▫ Órgãos de suínos (pulmão, fígado, rim, baço e linfonodo)
 11 suínos saudáveis
 76 suínos com SMDS
• Extração de DNA
• Quantificação (100 ng)
• PCR
Material e Métodos
• Sensibilidade da PCR
▫ Produto da PCR de TTSuV1 (349 pb) e TTSuV2 (572 pb) clonado
no vetor pCR2.1;
▫ Sequenciamento;
▫ Plasmídeo: C+1 e C+2;
▫ DNA plasmidial foi quantificado;
▫ Diluição seriada na base 10.
Material e Métodos
• Construção do controle interno
▫ Mesmos primers usados na PCR para TTSuV1 e 2;
▫ PCR com temperatura de anelamento de 40 °C;
▫ TTSuV1: célula de linhagem de rim de suíno (SK6);
 Produto de 293 pb foi clonado e sequenciado;
 Plasmídeo: CI1;
▫ TTSuV2: célula de linhagem de rim de suíno livre de PCV1 (PKsC3);
 Produto de 441 pb foi clonado e sequenciado;
 Plasmídeo: CI2;
▫ DNA plasmidial foi quantificado;
▫ Diluição seriada na base 10.
Resultados
A)
1
2
3
4
5
6
7
349 bp
293 bp
400 bp
200 bp
B)
500 bp
1
2
3
4
5
6
7
572 bp
441 bp
Figura1.
A) Sensibilidade da PCR para detecção de TTSuV1
B) Sensibilidade da PCR para detecção de TTSuV2
Resultados
Tabela 1. Prevalência de TTSuV1 e 2 em tecidos de suínos saudáveis e com Síndrome
Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS). Com um tecido positivo o animal foi
considerado positivo para TTSuV.
% de suínos positivos
para sTTV1
% de suínos positivos
para sTTV2
Suínos saudáveis (n=11)
100 (11/11)
100 (11/11)
Suínos com SMDS (n=76)
48.7 (37 /76)
94.7 (72 /76)
Total (n=87)
55.17 (48/87)
93.1 (81/87)
Resultados
Tabela 2. Prevalência de TTSuV1 e 2 em 5 diferentes amostras de tecidos de suínos saudáveis e com a
Síndrome Multissistêmica do Definhamento dos Suínos (SMDS).
Grupos
Órgãos
Pulmão
Fígado
TTSuV1
100% (11/11)
saudáveis TTSuV2
Suínos
Suínos com TTSuV1
SMDS
TTSuV2
Rim
Baço
Linfonodo
100% (11/11)
90.9% (10/11)
100% (11/11)
100% (11/11)
81.8% (9/11)
81.8% (9/11)
81.8% (9/11)
100% (11/11)
90.9% (10/11)
37.7% (26/69)
41.9% (31/74)
37.8% (28/74)
38.5% (27/70)
30.4% (21/69)
76.8% (53/69)
81.1% (60/74)
59.4% (44/74)
77.1% (54/70)
68.1% (47/69)
Resultados
Figura 2. árvore filogenética baseada na sequência de nucleotídeos da região não traduzida do genoma do TTSuV.
Número de acesso do GenBank das sequências de referência para TTSuV1 (AB076001 e AY823990) e TTSuV2
(AY823991).
Discussão
• Bigarré et al. (2005) relatou que o TTSuV foi encontrado
mais frequentemente no pulmão.
(11,2% pulmão; 8,1% linfonodo inguinal; 5,6% linfonodo mesentérico; 4,4% tonsila; 3,1% ileo)
• Difere dos resultados encontrados por Ellis et al. (2008)
e Kekarainen et al.(2006).
Conclusão
• Trabalho mostra que a distribuição de TTSuV1 em
tecidos aparentemente não apresenta em particular um
órgão alvo.
• Resultados reforçam uma aparente correlação inversa
entre a presença de TTSuV1 e o desenvolvimento da
SMDS.
• Corrobora com trabalho prévio realizado por nossa
equipe.
Torque teno vírus suíno
(TTSuV) em cultivos celulares e
tripsina
Introdução
• Interação entre TTSuV e PCV2
• Sistema eficaz de replicação para o TTSuV
• Nenhum cultivo que permita a propagação de TTSuV foi
identificado
• Nenhum cultivo foi avaliado em busca de TTSuV como
contaminante
Objetivos
• Detectar a presença de genomas de TTSuV em
células de linhagem, soro e tripsina
Material e Métodos
• Amostras
▫ 25 células de linhagem
 10 células em cultivo
 15 ampoladas e estocadas em nitrogênio líquido
▫ 9 lotes de soros (diferentes fornecedores)




Soro fetal bovino
Soro de equíno
Soro de ovino
Soro de terneiro
▫ 5 lotes de tripsina
Material e Métodos
• Extração de DNA
• Quantificação (100 ng)
• PCR
▫ forward-1: 5’ GGG AGC TCA AGT CCT CAT TTG 3’
▫ forward-2: 5’ GGG CCW GAA GTC CTC ATT AG 3’
▫ reverso: 5’ GCG GCA TAA ACT CAG CCA TTC 3’
(Rijsewijk,2008)
• TTSuV1: 106 pb
• TTSuV2: 103 pb
Material e Métodos
• Todos os produtos de PCR foram clonados e
sequenciados
• Sequências obtidas foram depositadas no GenBank n° de
acesso (GU574709 A GU574729)
• Análise filogenética
Resultados
Presença de
DNA viral de
TTSuV1
Presença de
DNA viral de
TTSuV2
Baby hamster kidney (BHK-21)
-
+
Chicken embryo related (CER)
-
+
Crandell feline kidney (CRFK)
-
+
Human embryonic intestine (H407)
+
-
Human leukemic cell (K562) (28/05/04)*
+
-
African green monkey kidney embryonic (MA-104) (28/04/93)*
+
-
Madin-darby bovine kidney (MDBK) (17/08/01)*
+
-
Madin-darby canine kidney (MDCK) (25/10/05)*
+
-
Porcine kidney PK(15)
+
+
Porcine kidney (PK-2a)
-
+
Porcine kidney sub-clone 3 PCV1 free (PKsC3)
+
+
Swine kidney (SK6)
-
+
Swine testicle (ST)
+
+
Bovine thyroid cell (TB) (27/02/85)*
+
-
African green monkey kidney (Vero)
-
+
Células de linhagem
Resultados
Presença de
DNA viral de
TTSuV1
Presença de
DNA viral de
TTSuV2
Canine Carcinoma (A-72) (2/07/08)*
-
-
Mutant MDBK Resistant to BVDV Infection (CRIB) (16/01/06)*
-
-
Embryonic Bovine Trachea (EBTr) (29/12/04)*
-
-
Equine Dermis (ED) (9/07/08)*
-
-
Foetal Lamb Kidney (FLK) (6/12/90)*
-
-
Murine Fibrosarcoma (L929) (3/06/08)*
-
-
Monkey Kidney (LLC-MK2) (15/07/86)*
-
-
Murine Neuroblastoma (N2A) (18/10/04)*
-
-
Rabbit Kidney (RK13) (13/01/93)*
-
-
Murine myeloma (SP2/O-Ag14)
-
-
Células de linhagem
Resultados
Presença de
DNA viral de sTTV1
Presença de
DNA viral de sTTV2
Fetal Bovine Serum (supplier A)
-
-
Fetal Bovine Serum (supplier B)
-
-
Fetal Bovine Serum (supplier C)
-
-
Calf Serum (treated in house with polyethylene glycol)
-
-
Horse serum (inactivated)
-
-
Horse serum (1 donor)
-
-
Horse serum (pool)
-
-
Ovine serum
-
-
Calf serum
-
-
Trypsin (supplier A)
+
+
Trypsin (supplier B)
-
-
Trypsin (supplier C)
-
-
Trypsin (supplier D)
-
-
Trypsin (supplier E)
-
-
Soro e tripsina
Resultados
Fig. 1. Árvore filogenética baseada nas sequências
de nucleotídeos da região não codificante do
genoma dos sTTVs. AB076001 e AY823990 são as
sequências de referência para sTTV1 e AY823991
é a sequência referência para sTTV2.
Discussão
• Devido a natureza ubíqua do TTSuV fontes comuns de
transmissão devem existir (McKeown et al., 2004)
▫ Vacinas preparadas em células contaminadas
• Kekarainen et al. (2009) relataram presença de TTSuV1
e 2 em enzimas e vacinas.
• Segales et al. (2009) também detectaram TTSuV1 e 2 em
soro de suínos desde 1985.
Conclusão
• Primeira evidência de TTSuV como contaminante
celular.
• Resultados sugerem que a fonte da contaminação pode
ter sido a tripsina.
• Contaminação existente no laboratório desde 1985
(Tireóide bovina-TB).
Obrigada !
Thais Fumaco Teixeira
Doutoranda PPGCV