UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
CENTRO DE ENERGIA NUCLEAR NA AGRICULTURA
LUCIANA REGINA MANGETI BARRETO MOURÃO
Estudo in vivo da atividade antioxidante da
própolis vermelha brasileira
Piracicaba
2013
LUCIANA REGINA MANGETI BARRETO MOURÃO
Estudo in vivo da atividade antioxidante da
própolis vermelha brasileira
Versão revisada de acordo com a Resolução CoPGr 6018 de 2011
Tese apresentada ao Centro de Energia
Nuclear na Agricultura da Universidade de
São Paulo para a obtenção do título de
Doutor em Ciências
Área de Concentração: Energia Nuclear na
Agricultura e no Ambiente
Orientador: Prof. Dr. Severino Matias de
Alencar
Coorientador: Prof. Dr. Pedro Luiz Rosalen
Piracicaba
2013
AUTORIZO A DIVULGAÇÃO TOTAL OU PARCIAL DESTE TRABALHO, POR QUALQUER
MEIO CONVENCIONAL OU ELETRÔNICO, PARA FINS DE ESTUDO E PESQUISA,
DESDE QUE CITADA A FONTE.
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Seção Técnica de Biblioteca - CENA/USP
Mourão, Luciana Regina Mangeti Barreto
Estudo in vivo da atividade antioxidante da própolis vermelha brasileira /
Luciana Regina Mangeti Barreto Mourão; orientador Severino Matias de Alencar;
coorientador Pedro Luiz Rosalen. - - Versão revisada de acordo com a
Resolução CoPGr 6018 de 2011Piracicaba, 2013.
93 f.: il.
Tese (Doutorado – Programa de Pós-Graduação em Ciências. Área de
Concentração: Energia Nuclear na Agricultura e no Ambiente) – Centro de
Energia Nuclear na Agricultura da Universidade de São Paulo.
1. Antiinflamatórios não-esteróides 2. Estresse oxidativo 3. Experimentos
animais 4. Isoflavonas 5. Produtos naturais 6. Radicais livres 7. Ratos Wistar
8. Resinas vegetais I. Título
CDU (635.077 + 66.094.3-097.8) : 636.028
Ao meu esposo Gerson e aos meus pequenos raios de luz
Gabriel e Giovana, razões do meu viver e os pilares
que sustentam meu castelo encantado.
Ofereço
Aos meus pais Jair e Toninha, meus exemplos maiores
de amor, dedicação e moral.
Dedico
AGRADECIMENTOS
Meu primeiro agradecimento vai a Ele, o Pai, aquele que não desampara nem
abandona. Aquele que mesmo quando me esquecia de que Ele estava ali, bem do
meu lado, me envolvia em seus braços e sussurrava em meus ouvidos sem que eu
percebesse “Vá, continue, eu estou aqui”. Obrigada Deus, obrigada Jesus, meu
Mestre.
Agradeço eternamente aos meus pequenos “monstrinhos”, meus filhos
Gabriel e Giovana por todo o apoio e paciência comigo em todos os momentos em
que eles foram os alvos de minhas explosões de estresse. Um obrigada especial ao
Gabriel que me dizia: “mãe, tá acabando, aguenta mais um pouco, você vai
conseguir”. Te amo filho, e você tinha razão!!!
Agradeço ao meu eterno amor Gerson, que sempre confiou mais em mim do
que eu mesma, e que mesmo me puxando as orelhas às vezes, me mostrava o lado
racional do trabalho e me dizia todas as vezes que não tinha nenhuma dúvida que
eu conseguiria.
Aos meus pais Jair e Toninha pela eterna ajuda com os pequenos, comigo,
por sempre nos amar tanto... amor esse que nos impulsiona pra vida e nos faz
seguir o caminho reto, aquele caminho que vocês sempre me mostraram e que
agora mostro para os meu filhos. Amo vocês!
Agradecimento muito especial ao meu orientador Professor Dr. Severino, meu
professor, o cientista admirável que me mostrou que a simplicidade e a honestidade,
acima de tudo, valem sempre a pena. Obrigada por todos os ensinamentos e toda
compreensão.
Ao Professor Dr. Pedro Rosalen, que além de ser meu co-orientador, foi muito
mais do que isso. Obrigada pela ajuda em todas as dificuldades, os ensinamentos, a
amizade e a possibilidade de realização de nossos experimentos, mesmo quando
nem tudo corria bem como imaginávamos.
À minha querida amiga e coorientadora Rosângela que me ensinou
praticamente tudo que sei hoje sobre experimentação com animais de laboratório.
Rô, sem você muita coisa não teria sido feita. Sou eternamente grata.
Aos amigos queridos José Bento e Fernanda Rezende que sempre torceram
tanto por mim e que se tornaram amigos e parceiros tão especiais. Amo vocês
queridos!
Às minhas queridas amigas e as técnicas mais competentes que conheço:
Ivani e Adna. Muito obrigada por toda ajuda, pelas conversas, pela paciência
comigo.
Às minhas queridas amigas e companheiras de laboratório: Priscila, Patrícia,
Juliana, Maria Augusta, Keityane, Valéria, Heloisa e até os que já se foram: Gilberto,
Margarida e minha eterna “Tata” Tatiane Oldoni... você me faz muita falta. Todos
moram no meu coração em um lugar especial que se manterá intacto para sempre.
Um agradecimento especial à Lucimara (Lú), por tudo! Por toda ajuda técnica,
por toda força moral, pelo companheirismo, pelas conversas, pelas noites no
biotério, por ficar com meus filhos... nossa, tanta coisa!!! Você se tornou minha
irmãzinha mais nova que amarei pra sempre.
Outro agradecimento especial á minha amiga Ana Paula, por toda a
dedicação em me ajudar nos momentos que tinha dúvida em desenvolver qualquer
assunto que diz respeito à própolis. Ana você é demais! Super obrigada.
Ao órgão de fomento e pesquisa CNPq pelo auxílio financeiro para a
realização do trabalho.
A todos os integrantes da seção de Pós Graduação do CENA/USP: Neuda,
Cláudia, Fábio, Sônia e Daiane, por toda compreensão, ajuda e apoio em todas as
horas solicitadas.
À
Professora
Dra.
Adriana
Martinelli
pela
compreensão,
amizade
principalmente nos momentos em que precisava me ausentar das disciplinas para
amamentar minha pequena Giovana.
A todos que de uma forma ou de outra, sempre torceram por mim, me
ajudaram e rezaram, para que essa etapa da minha vida fosse concluída. Obrigada!
Término de uma etapa... início de outras que virão...vamos lá, a fila anda, e o
tempo não para! O negócio é continuar!
“Por vezes sentimos que aquilo que
fazemos é senão uma gota de água
no mar. Mas o mar seria menor se
lhe faltasse uma gota.”
Madre Teresa de Calcutá
RESUMO
MOURÃO, L. R. M. B. Estudo in vivo da atividade antioxidante da própolis
vermelha brasileira. 2013. 90 f. Tese (Doutorado) - Centro de Energia Nuclear na
Agricultura, Universidade de São Paulo, Piracicaba, 2013.
Dentre os produtos naturais que contém compostos secundários com atividade
biológica, está a própolis, uma resina coletada por abelhas Apis mellifera de
diversas partes da planta com atividades biológicas tais como, antimicrobiana, antiinflamatória, cicatrizante, anestésica, antiviral e antioxidante. Um tipo diferente de
própolis e com perfil químico peculiar, foi denominada de própolis vermelha, a qual
possui alto teor de compostos fenólicos, principalmente da classe dos
isoflavonoides. De acordo com a literatura, esta própolis possui alta atividade
antioxidante in vitro, porém estudos sobre o efeito antioxidante in vivo ainda não são
conhecidos. Portanto, o objetivo desse trabalho foi avaliar a atividade antioxidante in
vivo do extrato etanólico da própolis vermelha brasileira (EEP) por modelo de
experimentação animal, assim como comparar o desempenho in vivo do EEP com
antioxidantes de alta atividade e efetividade em sistemas biológicos. Para
certificação do alto potencial antioxidante da própolis vermelha utilizada, conforme
relatado na literatura , o EEP foi caracterizado quanto ao seu potencial antioxidante
por várias metodologias in vitro, além de análises da composição química das
substâncias não voláteis e voláteis. A avaliação do perfil químico do EEP incluiu
análises como espectrofotometria na região ultravioleta visível, teor de compostos
fenólicos totais, cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE), cromatografia
gasosa acoplada com espectrometria de massas (CG-EM) e CG/EM-Headspace.
Para as análises da atividade antioxidante in vitro foram utilizadas as metodologias
de CLAE on-line, sequestro do radical ABTS•+; poder de redução do ferro (FRAP) e
capacidade de absorbância de radicais de oxigênio (ORAC). No ensaio de avaliação
da atividade antioxidante in vivo foi utilizado um delineamento experimental com 50
ratos Wistar machos, divididos em 7 tratamentos: Controle Normal (CTL/N), Controle
estressado (CTL-J/APAP), Ácido Ascórbico (AA–J/APAP), Quercetina (Q-J/APAP),
Própolis na dose de 150mg/kg (P150-J/APAP), 300mg/kg (P300-J/APAP) e
600mg/kg (P600-J/APAP). Todos os animais, com exceção do grupo CTL/N, foram
tratados por 15 dias com os antioxidantes via intragástrica, e, ao 16º dia foram
estressados com 800mg/kg de acetaminofen (APAP), via intragástrica, submetidos a
12 horas de jejum e então anestesiados e sacrificados para retirada de sangue e
fígado para as análises de função hepática (enzimas ALT, AST e γGT), atividade de
sequestro de radical superóxido no plasma pela enzima Superóxido Dismutase
(SOD), Western Blot para as enzimas SOD e CAT, análise ORAC de plasma e
fígado e histopatologia do tecido hepático. O EEP apresentou alto teor de compostos
fenólicos (266,8 mg/g) e a presença de isoflavonoides e pterocarpanos, tais como
liquiritigenina, isoliquiritigenina, vestitol, neovestitol, formononetina, biochanina,
medicarpina, 3,4-diidroxi-9-metoxipterocaroano e 3,8-diidroxi-9-metoxipterocarpano,
os quais são peculiares da própolis vermelha. Além disto, foram encontradas altas
concentrações das substâncias voláteis -cubebeno e germacreno D, as quais não
são as substâncias majoritárias da própolis vermelha de outras regiões. O EEP
também apresentou elevado potencial antioxidante in vitro, tendo o valor de 4,26
mmol/g equivalente de Fe++ para o FRAP, 4,84 e 19.779,7 mmol de trolox para o
ABTS e o ORAC, respectivamente. O APAP na dose e via de administração utilizada
não gerou um estresse intenso para ser detectável por meio de alguns
intermediários de vias e/ou rotas que respondem ao alto potencial oxidante. Porém,
e de acordo com os resultados dos ensaios in vivo, a concentração para uso como
antioxidante contra o estresse oxidativo se situa entre 150 a 300mg/kg. Portanto, a
própolis vermelha brasileira além de alto potencial antioxidante in vitro também
apresenta potencial antioxidante benéfico in vivo.
Palavras chave: Própolis vermelha. Atividade antioxidante in vivo. Estresse
oxidativo. Acetaminofen.
ABSTRACT
MOURÃO, L. R. M. B. In vivo antioxidant activity study of Brazilian Red
Propolis. 2013. 90 f. Thesis (PhD). Center for Nuclear Energy in Agriculture,
University of São Paulo. Piracicaba, 2013.
Propolis is one of the natural products containing secondary compounds with
biological activity. Propolis is a resin collected by honeybees from various plant parts
and has several biological activities such as antimicrobial, anti-inflammatory, healing,
anesthetic, antioxidant and antiviral. The Brazilian red propolis is a different type of
propolis with a peculiar chemical profile compared to other types of Brazilian propolis,
containing a high content of phenolic compounds, especially isoflavones. The
literature reports that this propolis has high in vitro antioxidant activity, but studies on
the in vivo antioxidant effects are still scarce. Therefore, this study investigated the in
vivo antioxidant activity of the ethanol extract of Brazilian propolis (EEP) using animal
experiments model. We also compared the in vivo EEP performance with high
antioxidant activity and effectiveness in biological systems. To evaluate the high
antioxidant propolis potential, as reported in the literature, the EEP was characterized
for its in vitro antioxidant potential in various methodologies, as well as in analyses of
the chemical composition of volatile and non-volatile substances. The evaluation of
EEP chemical analyses included visible spectrophotometry in the ultraviolet region,
total phenolic content, high performance liquid chromatography (HPLC), gas
chromatography coupled with mass spectrometry (GC-MS) and GC/MS-Headspace.
For in vitro analyses of antioxidant activity, we used the online HPLC methods,
sequestration of ABTS•+ radicals, Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP) and
Oxygen-Radical Absorbance Capacity (ORAC). To assess in vivo antioxidant activity,
we used an experimental design with 50 male Wistar rats divided into 7 treatments:
Normal Control (N/CTL), Stressed Control (CTL-J/APAP), Ascorbic Acid (AAJ/APAP), Quercetin (QJ/APAP), Propolis at 150mg/kg (P150-J/APAP), 300mg/kg
(P300-J/APAP) and 600mg/kg (P600-J/APAP). All animals, except for the N/CTL
group, were treated for 15 days with intragastric antioxidants, and on the 16th day,
they were stressed with 800mg/kg of acetaminophen (APAP), intragastrically.
Afterwards, they underwent a 12-hour fast, then, anesthetized and sacrificed to
collect blood and liver for analyses of liver function (ALT, AST and GT enzymes),
activity of superoxide radical sequestration in plasma by the enzyme Superoxide
Dismutase (SOD), Western Blot for SOD and CAT enzymes, ORAC analysis of
plasma and liver histopathology and liver tissue. The EEP showed high content of
phenolic compounds (266.8 mg/g) and the presence of isoflavones and pterocarpans
such as liquiritigenin, isoliquiritigenin, vestitol, neovestitol, formononetin, biochanin,
medicarpin, 3,4-dihydroxy-9-methoxy pterocarn and 3,8-dihydroxy-9-methoxy
pterocarpan, which are peculiar to the red propolis. Moreover, we found high
concentrations of volatile -cubebeno and germacrene D, which are not the majority
of substances in propolis from other regions. The EEP also showed high in vitro
antioxidant activity, with 4.26 mmol/g equivalent of Fe++ for FRAP, 4.84 and 19779.7
mmol of trolox for ABTS and ORAC, respectively. The APAP in the dose and route of
administration used did not generate intense stress detectable through some
intermediate routes and/or routes that respond to the high oxidizing potential.
However, according to the results of in vivo analysis, the concentration for use as an
antioxidant against oxidative stress ranges from 150 to 300mg/kg. Therefore, the
Brazilian red propolis has high in vitro antioxidant potential as well as beneficial in
vivo antioxidant potential.
Keywords: Propolis. In vivo antioxidant activity. Oxidative stress. Acetaminophen.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Fontes exógenas e endógenas de produção de ERO e ERN. Sistemas de
defesa antioxidante enzimático e não enzimático, quando eficientes mantendo a
homeostase e quando ineficientes, instalando estresse oxidativo causando danos às
macromoléculas como DNA, proteínas, lipídios, que se expressam como
envelhecimento ou doença (VASCONCELOS et al., 2007). ............................ 27
Figura 2 - Aspecto da exudação da resina vermelha pela leguminosa Dalbergia
ecastophyllus (L) taub (a); Elaboração da própolis vermelha pelas abelhas Apis
mellifera com a resina coletada (b e c); Aspecto do extrato etanólico da própolis
vermelha (EEP) após extração e evaporação sob baixa pressão (d)............... 34
Figura 3 - Curva de decaimento de diferentes concentrações de Trolox. Pontos de
concentração utilizados como curva de calibração para análise de ORAC (OU,
HAMPSCH-WOODILL e PRIOR, 2001). .......................................................... 38
Figura 4 - Esquema da instrumentação para a análise CLAE-FR-DPPH on line45
Figura 5 - Esquema de cores do marcador de peso molecular Bio-Kaleidoscope
Prestained Standards catalog #161-0324 para identificação e detecção de proteínas.
......................................................................................................................... 51
Figura 6 - Esquema representativo do funcionamento de um micrótomo tipo rotativo
(ALBERTS et al., 2004). ................................................................................... 53
Figura 7 - Espectro de absorção UV-Visível do EEP da propolis vermelha brasileira
......................................................................................................................... 54
Figura 8 - Cromatograma obtido pela técnica de HPLC (CLAE) do EEP detectado a
280 nm; Compostos identificados para EEP: 1-ácido ferúlico; 2-liquiritigenina; 3quercetina; 4-vestitol; 5-neovestitol; 6-isoliquiritigenina; 7-formononetina; 8biochanina. ....................................................................................................... 56
Figura 9 - Cromatograma obtido por CG-EM do EEP da própolis vermelha. O nome
do composto referente a cada pico está descrito na tabela 1. ......................... 58
Figura 10 - Cromatogramas obtidos pela técnica HPLC. A:Comatograma do EEP
detectado a 280 nm; B: Cromatograma da atividade antioxidante on-line, após
reação com DPPH. Compostos identificados para EEP: 1-ácido ferúlico; 2liquiritigenina; 3-quercetina; 4-vestitol; 5-neovestitol; 6-isoliquiritigenina; 7formononetina; 8-biochanina A. Para os picos da atividade antioxidante on-line,
númERO iguais correspondem ao mesmo composto. ..................................... 63
Figura 11 - Tabela de contrastes ortogonais realizados para o modelo experimental
apresentado, onde, cada cor representa as variáveis que foram contrastadas
totalizando 6 contrastes possíveis com os sete tratamentos............................ 65
Figura 12 - A- Atividade da enzima ALT (U/L) e respectivos de desvios padrão; BTabela de contrastes ortogonais com valores de p. .........................................67
Figura 13 - A- Atividade da enzima ALT (U/L) e respectivos desvios padrão; BTabela de contrastes ortogonais com valores de p. .........................................68
Figura 14 - A- Valores médios de ORAC do plasma em equivalente de trolox e
respectivos desvios padrão; B- Tabela de contrastes ortogonais com valores de p.
..........................................................................................................................71
Figura 15 - A- Média dos valores de ORAC do extrato de fígado em equivalente de
trolox e desvio padrão; B- Tabela de contrastes ortogonais com valores de p. 72
Figura 16 - A- Valores médios de SOD em plasma, expresso como porcentagem de
inibição de NBT e desvios padrão; B- Tabela de contrastes ortogonais com valores
de p...................................................................................................................74
Figura 17 - Cromatogramas obtidos pela metodologia de atividade antioxidante online do plasma dos animais: A- Plasma de animal CTL-N; B- Plasma de animal CTLJ/APAP; C- Plasma de animal P300-J/APAP e D- Plasma de animal P600-J/APAP.
..........................................................................................................................76
Figura 18 - A: Western Blot da enzima Superóxido Dismutase I. Cada membrana
possui 1 animal de cada tratamento. Detecção da enzima sem sinais visíveis de
degradação. B: Western Blot da enzima Catalase. Cada membrana possui 1 animal
de cada tratamento. As falhas visíveis não são resultado de degradação. Foram
utilizadas amostras dos mesmos animais para ambos os filmes. 1-CTL/N; 2-CTLJ/APAP; 3-AA-J/APAP; 4-Q-J/APAP; 5-P150-J/APAP; 6-P300-J/APAP; 7-P600J/APAP; P-Padrão de SOD 800ng/ml...............................................................78
Figura 19 - Imagens de lâminas de histopatologia hepática, corada pelo processo
Hematoxilina e Eosina. CTL/N (a); CTL-J/APAP (b); P150-J/APAP (c); P300-J/APAP
(d); P600-J/APAP (e) ........................................................................................79
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Composição química do EEP da própolis vermelha analisada pela técnica
de CG-EM Esquema da instrumentação para a análise CLAE-FR-DPPH on line .
......................................................................................................................... 57
Tabela 2 - Compostos voláteis (em porcentagem) identificados na própolis vermelha
e seus respectivos índices e tempos de retenção............................................ 60
Tabela 3 - Valores de atividade antioxidante in vitro para as metodologias de FRAP e
ABTS................................................................................................................ 64
Tabela 4 - Valores das enzimas de função hepática Alanina amino transferase (ALT),
Aspartato amino Transferase (AST) e Gama Glutamil Transferase (γGT). Valores das
médias de cada tratamento +/- o erro padrão. Para letras iguais, valores sem
diferença significativa; para letras diferentes, valores com diferença significativa com
nível de p individual para cada contraste. ........................................................ 66
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ................................................................................................. 21
1.1. Objetivos ...................................................................................................... 22
1.1.1. Objetivo Geral........................................................................................... 22
1.1.2.Objetivos Específicos ............................................................................... 22
2.REVISÃO DE LITERATURA ............................................................................ 24
2.1. Mecanismos antioxidantes de defesa ....................................................... 24
2.2. Antioxidantes naturais................................................................................ 25
2.3. Estresse oxidativo....................................................................................... 26
2.4. Acetaminofen X Estresse Oxidativo Hepático .......................................... 29
2.5. Enzimas de Função Hepática ..................................................................... 31
2.6. A Própolis .................................................................................................... 32
2.7. Compostos Bioativos Identificados e Isolados De Própolis ................... 35
2.8. Mensuração do Radical Peroxila em Sistemas......................................... 37
2.9. Enzima Superóxido Dismutase X Capacidade Sequestrante de Radical
Superóxido.......................................................................................................... 39
2.10. Western Blotting de Enzimas ................................................................... 40
3. MATERIAL E MÉTODOS ................................................................................ 41
3.1. Ensaios In Vitro ........................................................................................... 41
3.1.1. Coleta de Material ...................................................................................... 41
3.1.2. Tratamento das amostras de própolis bruta ............................................... 41
3.1.3. Preparo do extrato etanólico da própolis (EEP) ......................................... 41
3.1.4. Caracterização química dos compostos não voláteis................................. 42
3.2. Atividade Antioxidante In Vitro .................................................................. 44
3.2.1. Atividade Antioxidante on-line por CLAE-FR.............................................. 44
3.2.2. Atividade antioxidante on-line por CLAE-FR modificada para amostras de
plasma.
.............................................................................................................................. Erro
! Indicador não definido.
3.2.3 Poder antioxidante de redução do ferro (Método FRAP) ............................. 45
3.2.4. Atividade antioxidante pelo método do ABTS •+.......................................... 46
3.2.5. Capacidade de absorbância de radicais de oxigênio (ORAC) .................... 46
3.3. Ensaios para Avaliação da Atividade Antioxidante In Vivo ..................... 47
3.3.1 Ensaios In Vivo ............................................................................................ 47
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO ....................................................................... 54
4.1. Ensaios In Vitro............................................................................................ 54
4.1.1. Caracterização química da própolis vermelha ............................................ 54
4.2. Ensaios In Vivo e Ex Vivo ........................................................................... 65
4.2.1. Função hepática e instalação do estresse.................................................. 65
4.2.2. Atividade antioxidante X Estresse Oxidativo Induzido por APAP ............... 70
4.2.3. Atividade antioxidante on-line do plasma por HPLC ................................... 75
4.2.3. Análises qualitativas ................................................................................... 77
5. CONCLUSÕES ................................................................................................ 80
REFERÊNCIAS ....................................................................................................
1. INTRODUÇÃO
A utilização de recursos naturais para uso terapêutico é muito antiga, e por
muito tempo, os produtos naturais como minerais e vegetais constituíram o arsenal
terapêutico de muitas civilizações. Muitas culturas utilizaram estes produtos por
serem os principais, ou mesmo a única matéria prima para elaboração de
medicamentos (PINTO et al., 2002).
Atualmente, tanto no âmbito científico como no comercial, há uma procura
cada vez mais crescente por produtos naturais, justamente pela grande diversidade
de atividades biológicas que podem apresentar. Aliado a isto, a população também
está mais atenta para os produtos naturais, principalmente os derivados de plantas
que, sabidamente, vários não possuem efeito tóxico ou possuem menos efeitos
colaterais do que as drogas sintéticas (MILNER, 1999; CHANDRASEKARAN et al.,
2010). A abordagem terapêutica para utilização de produtos naturais na medicina
convencional ainda é uma conduta alternativa, geralmente ignorada pela prática
médica, devido à falta de informação científica adequada e evidência clínica
(FONTANAROSA; LUNDBERG, 1988; YUAN; LIN, 2000). Assim, numerosos
estudos in vitro têm sido realizados, porém não têm sido suficientes para o uso e/ou
aplicação in vivo. Com isso, a utilização de modelos animais e humanos se torna
essencial para validar cientificamente a eficácia e a segurança do uso terapêutico
dos produtos naturais (PETRONILHO et al., 2012).
Os produtos naturais possuem uma grande variedade de compostos
secundários, os quais são responsáveis por várias atividades biológicas. Dentre
esses compostos estão os flavonoides e os isoflavonoides, responsáveis
principalmente pela atividade antioxidante, ou seja, do sequestro de radicais livres,
por exemplo. Esses compostos são também importantes constituintes de vários
vegetais consumidos pelo homem (KUHNAU, 1976; KEY et al., 1996). Os
isoflavonoides possuem diversos efeitos biológicos e farmacológicos, como
antioxidantes, antibacterianos, antivirais, anti-inflamatórios entre outros (COMWELL;
COHICK, 2004; DASTIDAR et al., 2004).
Entre os produtos naturais que contém esses compostos está a própolis, a
qual é uma resina coletada por abelhas de diversas partes das plantas como brotos,
botões florais e exudados resinosos, e tem sido utilizada há séculos na medicina
popular. A própolis tem atraído a atenção de pesquisadores nas últimas décadas por
apresentar várias atividades biológicas, como atividade antimicrobiana, antiinflamatória, cicatrizante, anestésica, antiviral e antioxidante (BURDOCK, 1998;
CHEN et al., 2003; NAGAI et al., 2003, 2004; ISHIKAWA et al., 2004; KUMAZAWA
et al., 2004; GHISALBERTI, 1979; BANKOVA et al., 1989; KHAYYAL et al., 1993;
KUJUMGIEV et al., 1999; MARCUCCI et al., 2001; MONTPIED et al., 2003; CUNHA
et al., 2004; ALENCAR et al., 2007; OLDONI et al., 2011), bem como aplicação nas
indústrias farmacêutica e alimentícia (ACKERMANN, 1991) apesar de nem toda
própolis possuir atividade biológica.
Um tipo diferente de própolis e com perfil químico bastante peculiar, quando
comparado aos outros tipos de própolis brasileiras, foi denominada de própolis
vermelha (SILVA et al., 2007). Nessa própolis foi encontrada uma coloração
vermelha intensa e um alto teor de compostos fenólicos, principalmente
isoflavonoides. Estudos preliminares in vitro demonstraram que este tipo de própolis
possui altas atividades antimicrobiana e principalmente antioxidante (OLDONI et al.,
2011), sugerindo que ensaios in vivo devem ser realizados para avaliar essas
propriedades em sistemas biológicos mais complexos, como por modelos de
experimentação animal, e principalmente para a atividade antioxidante.
1.1. Objetivos
1.1.1. Objetivo Geral
Avaliar a atividade antioxidante in vivo do extrato etanólico da própolis
vermelha brasileira por modelo de experimentação animal bem como verificar todos
os efeitos gerados pelas diferentes doses e pelo estresse gerado, já que não há
relatos de testes in vivo para essa própolis.
1.1.2. Objetivos Específicos
-Avaliar a composição química volátil e não volátil do extrato etanólico bruto
da própolis vermelha brasileira (EEP);
- Avaliar a atividade antioxidante in vitro do extrato etanólico da própolis
vermelha brasileira;
- Avaliar comparativamente o desempenho in vivo do EEP com antioxidantes
de alta atividade e efetividade em sistemas biológicos (Vitamina E e
Vitamina C);
- Avaliar o perfil cromatográfico do plasma dos animais tratados com as doses
de própolis e submetidos ao estresse por Acetaminofen por HPLC;
- Avaliar o potencial antioxidante de extratos de fígado e plasma de ratos por
ensaio de captura do radical peroxila (ORAC);
- Avaliar a capacidade sequestrante da enzima Superóxido Dismutase no
fígado e no plasma, dos animais tratados e não com própolis.
- Avaliara instalação do estresse pelo Acetaminofen e o modo de ação da
própolis no fígado através das enzimas de função hepática Gama Glutamil
Transferase (γGT), Aspartato Amino Transferase (AST) e Alanina Amino
Transferase (ALT) no plasma dos animais;
- Avaliar por meio de exames histopatológicos se a própolis vermelha causa
dano nos tecidos animais.
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1. Mecanismos antioxidantes de defesa
Compostos com atividade antioxidante têm recebido atenção especial por
apresentarem capacidade de sequestrarem e/ou reagirem quimicamente com
radicais livres. A oxidação é parte fundamental da vida aeróbica e do nosso
metabolismo e, assim, os radicais livres são produzidos naturalmente ou por alguma
disfunção biológica. Esses radicais livres cujo elétron desemparelhado encontra-se
centrado nos átomos de oxigênio ou nitrogênio são denominados Espécies Reativas
de Oxigênio (ERO) ou Espécies Reativas de Nitrogênio (ERN). No organismo,
encontram-se envolvidas na produção de energia, fagocitose, regulação do
crescimento celular, sinalização intercelular e síntese de substâncias biológicas
importantes. No entanto, seu excesso apresenta efeitos prejudiciais e causa
diversos danos à célula, como câncer, doenças neurodegenerativas, anemia,
isquemia, além da oxidação da LDL, o que pode levar a problemas cardiovasculares
(RICE-EVANS, 2004; KOTSINAS et al., 2012).
O excesso de radicais livres no organismo é combatido por antioxidantes
produzidos pelo corpo, endógenos, ou absorvidos da dieta. A primeira linha
endógena de defesa antioxidante são as enzimas antioxidantes. Sabe-se que no
fígado é onde se encontra o maior arsenal dessas enzimas que combatem os
radicais livres ou Espécies Reativas de Oxigênio (ERO). Por isso, para o estudo de
compostos antioxidantes se faz importante avaliar a sua ação no órgão em questão.
Cada enzima antioxidante é responsável por uma ação protetora específica contra
as ERO ou ERN, conforme descrito a seguir:
1. Linha de proteção que atua como detoxificadora dos agentes antes de
causar a lesão: enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationa
peroxidase (GPx), os metabólitos da glutationa reduzida (GSH) e Vitamina E;
2. Linha de defesa que tem a função de reparar a lesão ocorrida: enzimas
glutationa
redutase
(GR),
GPx,
os
metabólitos
ácido
ascórbico
e
GSH
(KODYDKOVÁ et al., 2009)
Em virtude de todos os danos trazidos pelo estresse oxidativo, há um grande
interesse por antioxidantes exógenos que revertam ou protejam esse processo,
principalmente se for componente de alimentos naturais como frutas e plantas
(CHUN et al., 2005). Como exemplo de compostos antioxidantes naturais
provenientes da dieta, podemos citar o
-tocoferol (vitamina E),
-caroteno (pro-
vitamina A), ácido ascórbico (vitamina C) e os compostos fenólicos. Além disto,
estudos epidemiológicos, clínicos e de intervenção, demonstram, cada vez mais,
evidências de que os antioxidantes podem prevenir ou diminuir o desenvolvimento
de muitas doenças (BARREIROS, 2007).
2.2. Antioxidantes naturais
Os sistemas antioxidantes também estão presentes nas plantas que, por meio
de metabolismo específico, produzem substâncias como taninos, fenóis, alcaloides,
lignanas, cafeína e aminas (SOUSA et al., 2013; COTELLE, 2005; OKADA; OKADA;
SAGESAKA, 2010). Assim, alguns desses compostos fenólicos de plantas, possuem
como propriedade antioxidante, eliminar radicais livres e quelar metais reativos
(CHUN et al., 2005).
A própolis é um produto natural que contém em sua composição, compostos
fenólicos e várias outras substâncias que conferem a esse produto atividade
antioxidante, pois removem radicais livres em excesso (PARK et al., 2000;
ALENCAR et al., 2007). Alguns pesquisadores atribuem ao CAPE (éster fenílico do
ácido caféico), um composto fenólico da própolis europeia, grande potencial
antioxidante. Porém, Russo, Longo e Vanella (2002) verificaram que mesmo com a
remoção da CAPE, os extratos de própolis continuaram a apresentar atividade
antioxidante, demonstrando que outros compostos, possivelmente flavonoides,
também possuem atividade antioxidante.
Os compostos fenólicos se encontram amplamente distribuídos no reino
vegetal e em microrganismos, fazendo parte também do metabolismo animal. São
multifuncionais como antioxidantes, pois atuam de várias formas: combatendo os
radicais livres, doando um átomo de hidrogênio de um grupo hidroxila (OH) da sua
estrutura aromática, quelando metais de transição, como o Fe2+ e o Cu+;
interrompendo a reação de propagação dos radicais livres na oxidação lipídica;
modificando o potencial redox do meio e reparando moléculas atacadas por radicais
livres (PODSEKEK, 2007; MIN; EBELER, 2008). Também bloqueiam a ação de
enzimas específicas que causam inflamação; modificam as rotas metabólicas das
prostaglandinas (VALCO et al., 2006); protegem a aglomeração plaquetária e inibem
a ativação de carcinógenos (LIU, 2005). Em outros estudos, também foi encontrado
que atuam contra alergias, inflamações, hepatotoxinas, alguns vírus, úlceras e
tumores; aumentam a resistência dos vasos sanguíneos e bloqueiam as enzimas
que produzem estrógeno (MILES et al., 2005; PUKASKAS et al., 2005).
Além da atividade antioxidante direta, vários estudos têm destacado as
múltiplas funções e mecanismos importantes relacionados à habilidade dos
compostos fenólicos de se ligarem a receptores celulares e a transportadores de
membranas, influenciarem a expressão gênica, a sinalização e a adesão celular
(MANACH et al., 2005; BEZERRA et al., 2012).
A proteção do DNA é outro mecanismo antioxidante relevante para prevenção
de mutações e da carcinogênese. Vários antioxidantes como o ascorbato, o tocoferol
e os compostos fenólicos podem proteger o material genético dos efeitos deletérios
provocados pelas ERO, ERN e metais (FERRARI, 2001). Um parâmetro bioquímico
utilizado para se observar essa proteção é a fragmentação de DNA. Mishima et al.
(2005), ao testarem o efeito citotóxico dos extratos aquoso (WEP) e etanólico (EEP)
da própolis vermelha, em células de leucemia mielóide HL-60, observaram
fragmentação de DNA dessas células, sugerindo a inibição do crescimento das
mesmas. Concluíram assim, que essa inibição de crescimento se dá não só pela
citotoxicidade direta, mas também por mediação de apoptose. Esses mesmos
autores também realizaram ensaios de expressão de genes das células HL-60 e
constataram que as culturas tratadas com EEP e com WEP expressaram dois genes
responsáveis pela diferenciação em células granulocíticas, inibindo a formação de
células de leucemia mielóide.
2.3. Estresse oxidativo
Constantemente, no organismo humano, são geradas ERO e ERN no próprio
metabolismo fisiológico, na presença de algum processo inflamatório, disfunção
biológica ou até mesmo provenientes de alimentos (BARREIROS et al., 2006)
(Figura 1).
Figura 1 - Fontes exógenas e endógenas de produção de ERO e ERN. Sistemas de defesa
antioxidante enzimático e não enzimático, quando eficientes mantendo a homeostase e quando
ineficientes, instalando estresse oxidativo causando danos às macromoléculas como DNA, proteínas,
lipídios, que se expressam como envelhecimento ou doença (VASCONCELOS et al., 2007)
Na figura acima, é possível observar as fontes e respostas celulares às ERO
e ERN, derivados de enxofre (ERS), de Cloro (ERCl), de Carbono (ERC) e metais de
transição [M
n+)
]. Essas espécies são geradas no metabolismo normal em organelas
como mitocôndrias, peroxissomas e em várias enzimas citosólicas assim como
também existem fontes exógenas de produção dessa ER. Porém, os sistemas de
defesa antioxidante enzimático e não enzimático, quando são eficientes, conseguem
manter a homeostase fisiológica ou, se ineficientes, permitem a instalação do
estresse oxidativo. Esse estresse é representado pelo dano celular em
macrmoléculas como DNA, proteínas e lipídios, com expressão clínica no
envelhecimento, ou vários tipos de doenças (VASCONCELOS et al., 2007)
Nesse sentido, qualquer estímulo que leve a produção excessiva de espécies
reativas e/ou à depleção de antioxidantes, conduz a uma alteração significativa do
balanço entre a produção e a remoção de espécies reativas, como os radicais livres
(DRÖGE, 2002; URSO; CLARKSON, 2003).
Entre as ERO, o mais potente oxidante em sistemas biológicos é o radical
hidroxil (OH•), com um tempo de vida extremamente curto (1x10-9 s) e alta
reatividade a uma grande variedade de moléculas orgânicas, pois necessita
somente de mais um elétron para se estabilizar (ROVER JÚNIOR; HÖ; VELLASCO
2001). Se o radical hidroxil for produzido próximo ao DNA, e a este DNA estiver
fixado um metal, poderão ocorrer modificações de bases purínicas e pirimidínicas
levando à inativação ou mutação desse DNA, pois esse radical se combina com
extrema rapidez ao metal ou até mesmo a outros radicais. O radical hidroxil pode
também iniciar a oxidação dos ácidos graxos poli-insaturados das membranas
celulares (lipoperoxidação) (DIAS; MOURA; D´ANGELIS, 2011).
Os metais de transição, como o ferro e o cobre, têm ação catalítica na
formação de lesões oxidativas decorrentes da produção de radical hidroxil
(GUTTERIDGE; HALLIWELL, 2000), sendo que o ferro é o metal mais abundante no
organismo, por atuar como cofator importante para várias enzimas.
As duas reações de oxirredução mais importantes, responsáveis pela
formação de radical hidroxil, com efetiva participação de ferro ou cobre, são as
reações de Fenton e a de Haber-Weiss (KEHRER, 2000; DUTTA et al., 2001):
Reação de Fenton/Haber-Weiss:
H2O2 + Fe2+(Cu+)
1) Fe3+(Cu2+) + O-.2
2) Fe2+(Cu+) + H2O2
HO• + HO- + Fe3+(Cu2+)
Fe2+(Cu+) + O2
Fe3+(Cu2+) + HO• + HO
SOMA:
O2-. + H2O2
HO• + O2 + HO-
Quando acontece o desbalanço da quantidade produzida de ERO e a
remoção destas pelos sistemas antioxidantes, se tem então um estresse oxidativo,
causador de danos moleculares às estruturas celulares com consequente alteração
funcional e prejuízo das funções vitais (DRÖGE, 2002). Esses danos podem ser
observados em diversos tecidos e órgãos, tais como fígado, músculo e tecido
adiposo (RAMESH et al., 2012), vascular e cerebral (MARNETT et al., 2000;
FENSTER et al., 2002; KEYNES; GARTHWAITE, 2004).
Por um lado as ERO oxidam importantes estruturas celulares como as
macromoléculas, por outro lado também participam do sistema de defesa contra
uma infecção em que os fagócitos são estimulados a produzirem ERO com a
finalidade de destruir microrganismos (POULSEN et al., 2000). De qualquer forma,
sabe-se que as ERO estão envolvidas em vários processos fisiológicos assim como
em vários eventos patológicos como a mutação de DNA, carcinogênese,
envelhecimento, atEROclEROe, danos por radiação, inflamação, diabetes mellitus,
doenças neurodegenerativas e injúrias tóxicas, incluindo toxicidade aguda e crônica
por álcool (DAS VASUDEVAN, 2007).
2.4. Acetaminofen X Estresse Oxidativo Hepático
Acetaminofen (APAP; N-acetil-p-aminofenol) é uma droga analgésica,
antipirética, muito utilizada e eficiente em doses terapêuticas. Porém o uso
excessivo de APAP pode causar uma superprodução de Espécies Reativas de
Oxigênio (ERO), durante a formação de N-acetil-p-benzoquinonemina (NAPQI) pelo
citocromo P450 (DAHLIN et al., 1984; YEN et al., 2007). Esse mecanismo foi
sugerido por James et al. (2003) para explicar o desenvolvimento de estresse
oxidativo e injúria de hepatotoxicidade induzida pelo APAP.
Em doses suficientemente altas, o APAP causa depleção de GSH, deixando o
NAPQI livre para ligar a proteínas hepáticas essenciais, como APAPcisteina, que por
fim desenvolve a necrose hepática. Os hepatócitos necrosados liberam para a
circulação as enzimas hepáticas resultando alterações na atividade de outras
enzimas metabólicas e integridade celular. A toxicidade do APAP é, portanto, em
função do montante de NAPQI formado e a capacidade de GSH hepático utilizada
para a desintoxicação desse metabólito tóxico. Porém, a toxicidade de APAP pode
ser reduzida pela prevenção da depleção da defesa de antioxidantes endógenos e
pela utilização de antioxidantes exógenos (NIRALA; BHADAURIA, 2008; SLIKKER
JUNIOR et al., 2004). Portanto, overdoses de APAP resultam na geração de radicais
livres, seguido de depleção do tripeptídeo glutationa (JAESCHKE; BAJT, 2006), que
participa ativamente do mecanismo antioxidante endógeno.
Para os compostos que assumidamente possuem efeito hepatoprotetor, o
modelo de overdose de APAP em roedores, especialmente ratos, é um modelo
experimental muito popular em sistemas in vivo utilizados atualmente (CAMPOS et
al., 1989; CHEN et al., 2009; GAO; ZHOU, 2005; HAU et al., 2009; HSU et al., 2008;
KUPELI et al., 2006; WANG et al., 2010; WU et al., 2008, 2010, YUAN et al., 2010).
Este modelo possui a vantagem de ter sua toxicidade associada à dose e, em geral
tornam o experimento fácil de ser realizado. No entanto, após mesmos vários anos
de pesquisa, ainda não há uma informação substancial na literatura sobre os
mecanismos de instalação da hepatoxicidade do APAP (HINSON et al., 2004;
JAESCHKE et al., 2003; JAESCHKE; BAJT, 2006, 2010; NELSON, 1990; NELSON;
BRUSCHI, 2001).
De todos os mecanismos conhecidos, alguns estão bem estabelecidos e
outros não; alguns estão corretos e outros distorcidos por condições experimentais,
tornando o processo um tanto quanto controverso. A hepatotoxicidade do APAP é
então de certa forma complexa e a interpretação dos dados gerados in vivo, torna-se
às vezes difícil (JAESCHKE et al., 2010).
Para o mecanismo de injúria hepática causada por APAP, geralmente é
utilizado o modelo in vivo para ratos ou hepatócitos primários de ratos. Dentro desse
modelo, os animais são utilizados em jejum ou alimentados, com injeção
intraperitoneal ou intragástrica, fatores que estão diretamente ligados à dose que
será utilizada e à resposta a injúria. Ratos são menos sensíveis ao APAP, portanto,
em administração intragástrica, a dose recomendada é de 1g/kg para gerar uma
injúria moderada (JAESCHKE et al., 2011).
Estudos prévios relataram a presença de 3-nitrotirosina em fígados de ratos
tratados com APAP. Sua ocorrência coincide nos hepatócitos centrolobulares com
aductos de APAP-proteína desenvolvendo necrose (HINSON et al., 1998). Foi
postulado que a espécie reativa de nitrogênio peroxinitrito, formada pela rápida
reação da superóxido com oxido nítrico, foi importante no que diz respeito à
toxicidade gerada. Peroxinitrito é tanto um agente de nitração como também um
agente oxidante e é detoxificado pela GSH, a qual está diminuída em intoxicação por
APAP (AGARWAL et al., 2010; SIES et al., 1997; MITCHEL et al., 1973). Seo et al.
(2003) investigaram o efeito protetor de extrato etanólico de própolis proveniente da
Coréia em hepatotoxicidade induzida por APAP em hepatócitos de ratos
ecamundongos. Foi explorado o potencial dessa própolis em inibir a fase I das
enzimas envolvidas na ativação metabólica do APAP, e também de induzir a fase II
de conjugação das enzimas que serviriam para desintoxicar o produto reativo
formado.
No que se diz respeito à solubilização do APAP em meio hidrofílico, testes
pilotos prévios realizados por nosso grupo de pesquisa verificaram que há uma
considerável dificuldade na solubilização do APAP em solução de propilenoglicol a
40%. Apesar disto, Yen et al. (2007) preconizam que doses de 835mg/kg são
consideradas como ideais para instalação de um estresse oxidativo hepático. Em
consulta na literatura, verificou-se que a melhor solubilidade para o acetaminofen é o
propilenoglicol (100%), na concentração máxima de 0,962 mol/L-1, o que equivale a
145,42g mol/L-1 à temperatura de 40ºC (JIMENEZ E MARTÍN, 2006).
Dessa forma, e também por não ser um agente carcinogênico, o APAP foi a
droga escolhida para a indução do estresse oxidativo no modelo animal para a
avaliação do potencial antioxidante in vivo da própolis vermelha brasileira.
2.5. Enzimas de função hepática
Ao ocorrer alguma lesão hepática, principalmente se essa lesão se tratar de
danos celulares, há a liberação de enzimas que, por esse motivo, aumentam seus
níveis séricos e fornecem informações importantes em relação ao grau da lesão.
As transaminases, como a Alanina amino transferase (ALT) e Aspartato
amino transferase (AST), são duas enzimas que geralmente são mensuradas em
casos de lesão hepática, sendo que a ALT possui uma especificidade maior que a
AST. Essas enzimas catalisam a transferência reversível dos grupos amino de um
aminoácido para o -cetoglutarato, e essas reações exercem papéis centrais tanto
na síntese como na degradação de aminoácidos, além de atuarem como ponte entre
metabolismo dos aminoácidos e carboidratos (BRUNS et al., 1981).
2.6. A própolis
A própolis é uma mistura de substâncias resinosas de diversas fontes
vegetais, recolhidas pelas abelhas (Apis mellifera) e utilizada para vedar os orifícios
nos favos de mel e proteger a colmeia da entrada de predadores. A própolis tem
sido usada popularmente na medicina tradicional desde cerca de 300 aC
(BURDOCK, 1998; OLDONI et al., 2011). Além de sua atividade biológica, tem sido
utilizada com frequência em fórmulas farmacêuticas (THOMSOM W.M., 1990).
Recentemente a própolis tem ganhado popularidade como um suplemento
alimentar saudável e por esse motivo, tem sido extensivamente utilizada em
alimentos e bebidas em diferentes partes do mundo, com o apelo de melhorar a
saúde e prevenir doenças como câncer, inflamação, doenças cardíacas e diabetes,
por exemplo (BANSKOTA; TEZUKA; KADOTA, 2001; BEZERRA et al., 2012).
A composição da própolis é muito variável, mas em geral é composta por 50%
de resina e bálsamo vegetal, 30% de cera, 10% de óleos essenciais e aromáticos,
5% de pólen e 5% de outras substâncias variadas, incluindo resíduos orgânicos.
Devido à grande complexidade química, é considerada uma das misturas mais
heterogêneas encontradas em fontes naturais, e hoje mais de 300 constituintes já
foram identificados e/ou caracterizados em diferentes amostras de própolis
(BURDOCK, 1998). O maior grupo de compostos já identificados na própolis foram
os flavonoides, largamente encontrados no reino vegetal, os quais junto com os
ácidos fenólicos são os componentes responsáveis pela atividade contra vários
micro-organismos patogênicos (ISLA et al., 2005). Os compostos fenólicos
presentes na própolis pode expandir a capacidade das células de neutralizar o
estresse oxidativo e prevenir a apoptose (NOEL et al., 2000). A própolis possui
atividade antioxidante no fígado, rins e trato gastrointestinal, onde provavelmente
seus compostos se acumulam, influenciando esses tecidos mesmo do lado de fora
da célula (MORENO et al., 2000).
As diferentes variedades de própolis brasileiras foram classificadas em 12
grupos e testadas quanto as suas atividades biológicas, sendo que as que
apresentaram as melhores atividade foram as dos grupos 3, (proveniente do Rio
Grande do Sul); 6 (proveniente da Bahia) e 12 (proveniente de Minas Gerais) (PARK
et al., 2000). As própolis dos tipos 3 e 12 foram as que apresentaram as maiores
atividades antioxidante (PARK et al., 2000; MENSOR et al., 2001; AHN et al., 2004).
Em acréscimo, Park et al. (2000) demonstraram que a própolis brasileira tipo 6 é
altamente citotóxica contra quatro diferentes células tumorais.
A própolis brasileira tem a sua composição química bastante diversificada,
devido principalmente ao fato da rica biodiversidade do país. Portanto é necessária a
investigação deste produto natural como uma importante fonte de novas substâncias
bioativas, tais como ácidos fenólicos e seus derivados (BANKOVA; POPOV;
MAREKOV; 1989; KIMOTO et al., 1998), flavonoides (BANKOVA; POPOV;
MAREKOV; 1982; OLDONI et al., 2011) e outros compostos com propriedades
farmacológicos e funcionais.
A cor da própolis é normalmente amarela escura ou marrom, porém um tipo
peculiar de própolis, com uma composição química rica em isoflavonoides e uma
coloração vermelha intensa, encontrada em Alagoas , foi denominada de própolis
vermelha (ALENCAR et al., 2007) (Figura 2). Silva et al. (2008) verificaram que as
abelhas recolhiam exudatos sobre a superfície da Dalbergia ecastophyllum (L) Taub
para elaboração desta própolis (Figura 2a). Após estudos desses autores, sobre o
perfil químico comparativo entre a própolis a resina vegetal, pela técnica de
Espectrometria de Massas, concluíram que a origem botânica da própolis vermelha
brasileira é a espécie D. ecastophyllum.
Figura 2 - Aspecto da exudação da resina vermelha pela leguminosa Dalbergia ecastophyllus (L) taub
(a); Elaboração da própolis vermelha pelas abelhas Apis mellifera com a resina coletada (b e c);
Aspecto do extrato etanólico da própolis vermelha (EEP) após extração e evaporação sob baixa
pressão (d)
Para a maioria das própolis, flavonoides e compostos fenólicos são os
principais constituintes (IVANOVSKA et al., 1995), os quais
possuem efeitos
benéficos como antioxidantes naturais (BASNET et al., 1997; OLDONI et al., 2011),
prevenindo o dano oxidativo do DNA ocasionado por espécies reativas de oxigênio.
Tais efeitos antioxidantes podem ser o resultado de uma combinação da inativação
dos radicais juntamente com uma interação das funções enzimáticas (BENKOVIC
et al., 2007). É suposto que alguns compostos presentes na própolis são absorvidos
e entram na circulação sanguínea onde se comportam como antioxidantes hidrófilos,
recuperando a vitamina C, por exemplo (SUN et al., 2000). Segundo Badhauria e
Nirala (2009), o extrato etanólico bruto da própolis reverte a lesão hepática
subcrônica induzida por tetracloreto de carbono, além da toxicidade aguda induzida
por Acetaminofen (APAP) (NIRALA; BHADAURIA, 2008).
Frente a esses resultados, e a outros estudos já realizados in vitro, verifica-se
a necessidade de estudos mais aprofundados para as atividades biológicas das
própolis brasileira em modelos de experimentação animal, com o objetivo de avaliar
as potencialidades biológicas não mais in vitro, mas in vivo.
2.7. Compostos bioativos identificados e isolados de própolis
Estudos já demonstraram a existência de pelo menos trezentas substâncias
em amostras de própolis, com a predominância de flavonoides, aldeídos aromáticos,
ácidos fenólicos e alguns oligoelementos (BURDOCK, 1998; BANKOVA et al., 2005;
ALENCAR et al., 2007; SILVA et al., 2005; OLDONI et al., 2011). Em consequência
disto, trabalhos sobre a utilização de própolis aumentaram substancialmente, e
devido aos resultados altamente promissores, ocorreu uma maior procura pelo
produto in natura, tornando-se um atrativo no incremento da exploração econômica
do setor apícola (INOUE et al., 2007).
Vários trabalhos de isolamento e identificação química têm demonstrado a
diversidade de compostos biologicamente ativos nas própolis das mais diversas
regiões do mundo. Dentre eles podemos citar, por exemplo, o estudo de
Schneidweind et al. (1975) que isolaram e identificaram 14 flavonoides de própolis
europeia: crisina, tectocrisina, 5-hidroxi-4',7-dimetoxiflavona, ramnocitrina, galangina,
isalpinina, pinostrobina, 5-hidroxi-4',7-dimetoxiflavanona e pinocembrina. Os outros
cinco
flavonoides
sacuranetina,
isolados
pinobanksina
(pectolinarigenina,
e
quercetina-3,3'-dimetil
pinobanksina-3-acetato),
nunca
foram
éter,
antes
encontrados em amostras de própolis.
Aga
et
al.
(1994)
isolaram
três
ácidos
aromáticos
com
atividade
antimicrobiana da própolis verde brasileira (tipo 12): ácido 3,5-diprenil-4hidroxicinâmico (artepilin C), ácido 3-prenil-4-dihidroxicinamoloxicinâmico e ácido
2,2-dimetil-6-carboxietenil-2H-1-benzopirano. Ácidos diterpênicos possuem atividade
antimicrobiana (SALOMÃO et al., 2004), antitumor (ORSOLIC et al., 2006) e
antioxidante (SIMÕES et al., 2004). Da mesma forma, os terpenoides, tais como os
tri, sesqui, di e pentacíclicos são frequentemente encontrados em própolis brasileira
(SALATINO et al., 2005).
O éster feniletil do ácido caféico (CAPE), isolado de amostras de própolis de
clima temperado, demonstrou possuir atividades biológicas importantes para o ser
humano, incluindo o aumento na sensibilidade à radiação das células cancerosas
(CHEN et al., 2005), atividade anti-inflamatória e diminuição da resistência a insulina
(BEZERRA et al., 2012).
Banskota et al. (1998) isolaram e identificaram 23 compostos em amostras de
própolis brasileira. Destes, um novo composto foi identificado como um derivado do
cromano prenilado (3-hidroxi-2,2 dimetil-8-fenilcromano-6-ácido propenóico) (1). Os
outros
compostos,
já
conhecidos,
foram
identificados
como:
2,2-dimetil-8-
fenilcromeno-6- ácido propenóico (2); 2,2-dimetilcromeno-6-ácido propenóico (3);
2,2-dimetilcromeno-6- ácido carboxílico (4); artepelin (5); 4-dihidrocinamoiloxi-3ácido fenilcinâmico (6); 4- hidroxi-3-ácido fenilcinâmico (7); vanilina (8); aldeído
coniferil (9); ácido isocupréssico (10); 15-acetoxiisocupressico ácido (11); ácido
agático (12); ácido agático 15-metil éster (13); ácido agatálico (14); ácido cupréssico
(15); tremetona (16); viscidona (17); 12- acetoxiviscidona (18); betuletol (19);
canferide (20); ermanina (21); 3,5,7-trihidroxi-4'- metoxiflavanol (22) e acetato
coniferil dimérico (23). Os compostos 4, 7, 12-19 e 22 foram isolados pela primeira
vez em própolis.
As benzofenonas polipreniladas são outro grupo de compostos bioativos que
tem sido encontrado em amostras de própolis da Venezuela e Cuba (HERNANDÉZ
et al., 2005) e Brasil (CASTRO et al., 2009). Castro et al. (2009) isolaram da própolis
brasileira do tipo 6 uma nova bezofenona prenilada com alta atividade
antibacteriana, demonstrando assim que os ácidos graxos não são os compostos
bioativos responsáveis pela atividade antimicrobiana desta própolis, conforme
sugerido anteriormente por Duarte et al. (2006).
Na própolis produzida no Nordeste brasileiro (Teresina – PI) foram
encontrados
seis
triterpenoides
inéditos
derivados
do
cicloartano
(ácido
mangiferólico, ácido isomangiferólico, ácido mangiferônico, 24-metileno-cicloartano3 ,26-diol, ácido ambólico e ácido ambônico) (SILVA et al., 2005). Triterpenoides
pentacíclicos também já foram identificados em extratos de própolis provenientes da
região sudeste do Brasil (TEIXEIRA et al., 2006).
Oldoni et al. (2011) isolaram duas isoflavonas bioativas (vestitol e neovestitol)
juntamente com uma chalcona (isoliquiritigenina) da própolis vermelha brasileira. Os
isoflavonoides, dentre eles as isoflavonas, apresentam diversas atividades
biológicas, como atividade antimicrobiana (CUSHINE; LAMB, 2005; OLDONI et al.,
2011), anticâncer (AWALE et al., 2008) e antioxidante (TRUSHEVA et al., 2006),
além de estarem associados a diversos benefícios para a saúde, como prevenção
de doenças cardiovasculares (PICCINELLI et al., 2005), redução do colesterol,
prevenção da osteoporose e alívio dos sintomas da menopausa (LEE et al., 2006).
Já a atividade antimicrobiana das chalconas parece está relacionada com a
presença das hidroxilas nas posições C-2’, C-4 e C-4’. A presença desses
compostos na própolis vermelha demonstra uma grande diversidade de compostos
bioativos e, sendo assim, estudos para avaliação do efeito biológico in vivo deste
tipo de própolis são extremamente necessários para uma futura aplicação
terapêutica.
2.8. Mensuração do radical peroxila em sistemas
Dentre as diversas técnicas utilizadas atualmente para a verificação de
atividade antioxidante está a Capacidade de Absorção de radicais de Oxigênio
(ORAC), principalmente para amostras de produtos naturais e alimentos, além de
amostras biológicas, sendo considerada nesse caso, como uma metodologia ex
vivo. O ORAC é um teste amplamente aplicado para se verificar o potencial
antioxidante em humanos, animais, plasma proteínas DNA, extratos de plantas,
produtos naturais e alimentos (DÁVALOS; GÓMEZ; BARTOLOMÉ, 2004).
Originalmente Cao et al. (1993) propuseram o ensaio ORAC utilizando
-
ficoeritrina (B-PE) como molécula alvo. Neste ensaio é mensurado a atividade
antioxidante sequestrante induzida perante o radical peroxil 2,2’-azobis(2-dicloridrato
amidinopropano)
(AAPH) a 37°C (CAO et al., 1995; CAO et al., 1996). Neste
modelo a B-PE foi a sonda fluorescente escolhida, pois a perda da fluorescência da
B-PE é o indicador da extensão do dano no radical peroxila, causado pela reação
contendo o antioxidante a ser testado.
Porém, esses mesmos autores constataram que a B-PE utilizada como sonda
de fluorescência, tinha como característica uma variabilidade em sua emissão de
fluorescência, provavelmente relacionada com o processo de isolamento dessa
proteína de sua matriz Porphyridium cruentum, que apresentava mudança de lote
para lote. Além disso, foi observado que havia uma B-PE com os flavonoides
presentes majoritariamente na maioria dos antioxidantes testados, ocasionando uma
falsa queda nos valores ORAC (TANAKA et al., 2001; KOJIMA et al., 1999)
Por esse motivo, a fluoresceína e seus derivados começaram a ser eleitos
como sondas fluorescentes para detecção de biomoléculas, por se contrastarem em
suas características da B-PE. A fluoresceína (FL) é um composto sintético com
elevado rendimento quântico de fluorescência a um pH>7,0 (φ=0,78) e longos
comprimentos de onda (492/515 nm, de excitação/emissão), além do que a FL não
apresenta interação com outros compostos. Possui alta estabilidade em leitora de
placas de 96 poços, o que torna o método mais acessível (OU; HAMPSCHWOODILL; PRIOR, 2001).
O efeito protetor do antioxidante contido na reação é medido pela avaliação
da área sobre a curva (AUC) de decaimento da fluorescência em comparação a um
controle ou branco, que não possui antioxidante presente no ensaio, como mostrado
na Figura 3. A sensibilidades na utilização do método ORAC-FL é bastante alta, o
que se faz necessário, muitas vezes, várias diluições para as amostras testadas
(OU; HAMPSCH-WOODILL; PRIOR, 2001).
Figura 3 - Curva de decaimento de diferentes concentrações de Trolox. Pontos de concentração
utilizados como curva de calibração para análise de ORAC (OU; HAMPSCH-WOODILL; PRIOR,
2001)
2.9. Enzima superóxido dismutase x capacidade sequestrante de radical
superóxido
Perante o desafio de um estresse oxidativo, os sistemas biológicos laçam
mão de alternativas endógenas para reverter esse processo. A primeira alternativa é
a ativação de enzimas antioxidantes que sequestram os radicais gerados pelo
estresse, na tentativa de recuperar os possíveis danos causados. A Superóxido
Dismutase (SOD) faz parte dessa primeira linha de defesa endógena contra a
toxicidade dos radicais superóxidos gerados no estresse, pois catalisa a
decomposição desses radicais.
O radical superóxido pode desencadear a geração de outros radicais como o
hidroxil e o peroxil. O superóxido em meio ácido forma rapidamente peróxido de
hidrogênio e, em meio neutro ou pH alto, a dismutação ocorre pela SOD. Alguns
autores relatam que o radical superóxido possui baixa reatividade molecular,
tornando duvidosa a sua capacidade de causar danos importantes nas estruturas
celulares (ANDRADE JUNIOR et al., 2005)
A SOD cataliza a conversão do radical superóxido (O2.-) em peróxido de
hidrogênio e oxigênio molecular, atuando juntamente com outras enzimas como a
catalase, glutationa peroxidase na prevenção dos danos causados pela ação de
radicais como superóxido, hidroxil e peróxido de hidrogênio (EWING; JANERO,
1995).
Sabe-se que existem 3 formas de SOD: SOD1, encontrada no citoplasma e
que tem em seu centro reativo cobre e zinco; SOD2, encontrada nas mitocôndrias e
tem em seu centro reativo manganês e SOD3, encontrada no líquido extracelular e
que, assim como a SOD2, também possui cobre e zinco em seu centro (LI et al.,
2005).
A alteração da atividade dessa enzima pode ser associada ao aparecimento
de várias patologias, por isso, tornou-se frequente a mensuração de sua atividade
celular. A maioria dos ensaios usa um sistema de geração de radicais superóxido
pelo fato do mesmo apresentar um decaimento espontâneo. Assim, no ensaio
observa-se a capacidade da solução de inibir a reação do radical superóxido
(PESKIN; WINTERBOURN, 1999).
2.10. Western blotting de enzimas
Western Blott é uma técnica utilizada para visualização e identificação de
proteínas onde as transferências de Western detectam proteínas em amostras
biológicas com alta sensibilidade. Alguns procedimentos são mais comuns para
Western como SDS-PAGE, onde a separação é realizada de acordo com o seu
tamanho, transferindo para uma membrana de imobilização e utilizando dois
anticorpos
para
a
detecção
propriamente
dita
(BERGENDAHL;
GLASER;
BURGESS, 2003). Por meio de um anticorpo primário, há o reconhecimento
específico da proteína de interesse sobre a membrana onde é aplicado o blot após
ter sido bloqueada com BSA (albumina bovina) ou leite desnatado seco, com o
intuito de saturar a membrana com proteína prevenindo a ligação inespecífica do
anticorpo com a membrana. Com o anticorpo secundário, faz-se o reconhecimento
do primário de acordo com a origem (anticorpo de cabra anti-IgG de rato com o de
origem mouse), já que se liga a todas as imunoglobulinas do organismo particular
que o anticorpo primário foi isolado (DENNIS-SYKES et al., 1985).
3.MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Ensaios in vitro
Para verificação do alto potencial antioxidante in vitro da própolis vermelha
utilizada neste estudo, conforme a literatura preconiza, após a obtenção do extrato
etanólico bruto (EEP) foram realizados ensaios de caracterização química e
atividade antioxidante.
3.1.1. Coleta de Material
As amostras de própolis foram obtidas de coletores colocados nas caixas de
abelhas Apis mellifera, em um apiário localizado na cidade de Marechal Deodoro,
próximo à região de mangue, Estado de Alagoas (SL 09.40 e WL 35.41).
3.1.2. Tratamento das amostras de própolis bruta
A amostra de própolis bruta, um total de 2Kg, foi limpa retirando-se a poeira,
pedaços de madeira, abelhas mortas, traças e qualquer outro tipo de material
estranho.
Em
seguida,
foi
triturada
com
auxílio
de
nitrogênio
líquido,
homogeneizada, pesada e armazenada a -18ºC.
3.1.3. Preparo do extrato etanólico da própolis (EEP)
Para o preparo do extrato etanólico de própolis (EEP) foram pesados 100g de
própolis triturada, obtidos conforme o item 3.1.2, e transferido para frasco de vidro
contendo 450 mL de etanol Puro para Análise (P.A). A extração foi realizada a 70ºC
em banho de água termostatizado, por 30 minutos, sob agitação constante. Os
frascos foram acondicionados em freezer a - 4ºC overnight para a separação da
cera. Em seguida foi realizada uma filtração e o filtrado, denominado Extrato
Etanólico de Própolis (EEP), foi transferido para um frasco de vidro com tampa de
rosca. Posteriormente, o EEP foi concentrado a baixa pressão.
3.1.4. Caracterização química dos compostos não voláteis
3.1.4.1. Espectrofotometria na região ultravioleta-visível
A determinação do espectro de absorção foi realizada baseando-se no
método descrito por Silva et al. (2007). Uma alíquota do EEP, na concentração de
90 ppm, foi utilizada para determinação do espectro na região UV-Visível, na faixa
de comprimento de onda de 200 a 600 nm, em um espectrofotômetro UV Mini 1240
(Shimadzu Co.).
3.1.4.2 Teor de compostos fenólicos totais
O teor de compostos fenólicos totais do EEP foi determinado pelo método
colorimétrico de Folin-Ciocalteau (SINGLETON et al., 1999). Este método tem como
princípio a oxidação de fenóis por um reagente amarelo heteropoliácido de
fosfomolibdato e fosfotungstênio (reagente de Folin-Ciocalteau). A medida
colorimétrica é realizada a partir de um complexo azul Mo-W que se forma na reação
em meio alcalino (SINGLETON; ROSSI, 1965). Para a determinação de fenólicos
totais, uma solução do EEP de 100ppm (0,5 mL) foi misturada com 2,5 mL do
reagente Folin-Ciocalteau diluído 1:10 e 2,0 mL de Na2CO3 4%. A absorbância foi
medida a 740 nm depois de duas horas de incubação no escuro a temperatura
ambiente. Os resultados do teor de compostos fenólicos totais foram expressos
como equivalentes de ácido gálico (mg AG/g).
3.1.4.3. Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE) em fase reversa
As análises por CLAE em fase reversa do EEP foram feitas de acordo com o
método descrito por Alencar (2007). Quinze microlitros do extrato na concentração
1% foram injetados em um cromatógrafo líquido acoplado a um detector de arranjo
de fotodiodos a 260 nm e detector de fluorescência em série com uma coluna de
fase reversa C18 (250 x 4,6 mm) com tamanho de partícula de 5 m. A fase móvel
utilizada foi água/ácido acético (19:1, v/v) (solvente A) e metanol (solvente B), com
vazão constante de 1 mL/min. O gradiente iniciou com 40% do solvente B até 60%
de B em 45 minutos, 90% em 60 minutos até 75 minutos, 40% de B em 85 minutos.
A coluna foi mantida a uma temperatura constante de 30° C e os cromatogramas
foram processados utilizando software Class Vp. Os compostos foram identificados
pelo espectro de absorção na região ultravioleta, utilizando os recursos do detector
de arranjo de fotodiodos, pela comparação do tempo de retenção e co-cromatografia
de padrões. Neste trabalho, foram utilizados os seguintes padrões autênticos de
flavonoides e ácidos fenólicos (Extrasynthese Co.): quercetina, canferol, apigenina,
crisina, acacetina, galangina, kanferide, isosacuranetina, sacuranetina, ácido pcumárico, ácido cafeico, ácido gálico, ácido cinâmico, ácido ferrúlico, formononetina,
isoliquiritigenina e liquiritigenina.
3.1.4.4. Caracterização química por Cromatografia Gasosa
Espectrometria de Massas (CG-EM) dos compostos não voláteis
acoplada
com
A analise por CG-EM do EEP foi realizada de acordo com o método
modificado descrito por Proestos et al. (2006). Uma massa de 10mg foi adicionado
de 100µL de N-metil-N-(trimetilsilil)-trifluoroacetamida (MSTFA) para derivatização.
Em seguida, as amostras silanizadas foram analisadas em um cromatógrafo gasoso
(Shimadzu GC 2010) acoplado a espectrômetro de massas (Shimadzu QP 2010
Plus) e equipado com uma coluna capilar (RTX5MS 30m x 0,25mm x 0,25µL). A
programação de temperatura iniciou em 80ºC (1 minuto), a uma taxa de
aquecimento de 20ºC/minuto alcançou 250ºC (1 minuto) passou a 300ºC (5 minutos)
a uma taxa de 6ºC/minuto, a 310ºC (5 minutos) a uma taxa de 15ºC/minuto e a
320ºC (10 minutos) a uma taxa de 20ºC/minuto, totalizando 40 minutos de analise.
Hélio foi utilizado como gás de arraste. A temperatura do injetor foi de 280ºC e o
volume de injeção foi de 0,5µL no modo “splitless”. A interface foi mantida a 280ºC e
o detector operou no modo “scanning” (m/z 40-800), com modificações. A integração
foi feita por meio do software Lab Solutions-GCMS. Flavonoides, ácidos fenólicos e
derivados foram identificados por comparação com os dados obtidos do CG-EM
(tempo de retenção e fragmentação iônica) de padrões autênticos da Extrasynthese
Co. silanizados (quercetina, kanferol, apigenina, crisina, acacetina, galangina,
canferide, isosacuranetina, sacuranetina, acido p-cumárico, ácido cafeico, ácido
gálico, ácido cinâmico, ácido ferrúlico, isoliquiritigenina e liquiritigenina) eluídos nas
mesmas condições e com a biblioteca Wiley ®8.
3.1.4.5. Caracterização química dos compostos aromáticos por CG/EM-Headspace
A extração em headspace foi realizada com 1g de própolis a 100°C por 15
minutos. A fase de vapor (1mL) foi injetada no cromatógrafo a gás acoplado a um
espectrômetro de massas modelo Shimadzu QP 2010 plus. A injeção foi realizada
em modo splitless e o hélio foi utilizado como gás de arraste a uma vazão de 1
mL/minuto. A temperatura do injetor foi de 220°C. Uma coluna capilar de sílica
fundida (5% fenil-95% polidimetilsiloxano, 30m x 0,25mm x 0,25µm) foi utilizada na
separação dos compostos. A temperatura da coluna foi programada de 40°C (2
minutos) a 200°C, a uma taxa de 4°C/minutos. O espectrômetro de massas foi
operado em um modo de ionização por impacto de elétrons a 70 eV e massa de
varredura 4-60 Da. As temperaturas da fonte de íons e da interface CG/EM foram de
200 e 230°C, respectivamente. Os compostos foram identificados por comparação
de seus espectros de massas com as bibliotecas do equipamento (Wiley® 8 e 1,2
FFNSC).
3.2. Atividade antioxidante in vitro
3.2.1. Atividade Antioxidante on-line por CLAE-FR
O método on-line para a análise de compostos que possuem a habilidade de
sequestro de radicais livres foi primeiramente proposto por Koleva et al. (2000).
Vinte microlitros do cada extrato, na concentração de 12,5%, foram injetados em um
cromatógrafo líquido acoplado a um detector de arranjo de fotodiodos e uma coluna
de fase reversa C18 (250x4,6 mm) com tamanho de partícula de 5 µm. A fase móvel
utilizada foi água:ácido acético (99,5/0,5 v/v) (solvente A) e metanol (solvente B)
com vazão constante de 0,8mL/min. O gradiente iniciou com 30% do solvente B até
40% de B em 15 minutos, 50% de B em 30 minutos, 60% de B em 45 minutos, 75%
de B em 65 minutos, 75% de B em 85 minutos, 90% de B em 95 minutos e 30% de
B em 105 minutos. A coluna foi mantida a temperatura constante de 30°C. A análise
do sequestro do radical livre DPPH, pós-coluna, por CLAE-FR-DPPH on line foi
realizada utilizando a solução metanólica do radical livre DPPH na concentração de
10-5M, como mostrado na Figura 4, que reagiu com os compostos separados da
amostra num coil de 15m, por aproximadamente 1 min. A vazão do reagente do
DPPH foi de 0,8 mL/min e a perda de cor foi detectada por meio de picos negativos
à 517nm.
Bomba CLAE
Extratos
Bomba CLAE
Coluna FR-C18
Solução DPPH
Detector PDA
Misturador
280 nm
Detector 517nm
Cromatograma geral dos
compostos presentes nos
extratos
Cromatograma dos compostos
com atividade antioxidante
presentes nos extratos
Figura 4- Esquema da instrumentação para a análise CLAE-FR-DPPH on line
3.2.2 Poder Antioxidante de Redução do Ferro (Método FRAP)
Por meio desta técnica foi avaliada a atividade antioxidante, por meio da
redução do ferro frente ao extrato da própolis vermelha. Foi utilizada para o ensaio,
uma diluição do extrato de 200ppm, determinada como ideal através de testes
realizados com diferentes diluições utilizando uma curva de calibração de sulfato
ferro (100-1000 µM). A técnica se baseia na redução do complexo Fe3+- 2,4,6-tris(2piridil)-s-triazina (TPTZ) sobre condições ácidas de reação. O Fe3+ reduzido a Fe2+
forma novamente um complexo com TPTZ e aumenta a absorbância da coloração
azul proveniente desse complexo que deve ser medida a 593nm. O reagente de
FRAP foi preparado no dia do ensaio misturando 25 ml de tampão acetato (300 mM,
pH 3,6), 2,5 ml de solução de TPTZ (10 mM TPTZ em 40mM HCL) e 2,5 ml de FeCl3
(20 mM) em solução aquosa. Foi utilizado 100µL do extrato o qual foi adicionado a
4,5 ml do reagente de FRAP, agitado e incubado por 30 minutos.
A absorbância foi medida em 593 nm, usando a solução FRAP de trabalho
como branco. Os resultados foram expressos em µM Fe2+/mg de peso seco do
extrato. A atividade relativa das amostras foi comparada ao ácido L-ascórbico
(KALOGEROPOULOS et al., 2009).
3.2.3. Atividade antioxidante pelo método do ABTS •+
O primeiro a sugerir o método indireto do sequestro do radical ABTS 2,2´-azinobis
(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico) em testes de amostras biológicas foi Miller et
al. (1993). O ABTS•+ apresenta alta estabilidade em condições de análise
específicas. Este radical é gerado por reações químicas (como o perssulfato de
potássio) ou enzimáticas, e, é solúvel tanto em água como em solventes orgânicos,
permitindo a análise tanto de amostras hidrofílicas como lipofílicas (ARNAO, 2000).
Por meio da adição do perssulfato de potássio, ocorre a formação do radical ABTS,
que apresenta cor esverdeada. Na medida em que o antioxidante é misturado com
esse radical, ocorre a redução do ABTS•+ a ABTS, fato que provoca a perda da
coloração do meio reacional. Os resultados são expressos em função do padrão
antioxidante Trolox, submetido às mesmas condições de análise. O ABTS•+
apresenta forte absorção no intervalo de 600-750nm e pode ser facilmente
determinado espectrofotometricamente, sendo um radical estável na ausência de
antioxidantes. Possui a vantagem de ser um método relativamente simples de ser
realizado, sendo por isso aplicado em várias análises de laboratório, além de
apresentar boa solubilidade (ROGINSKI; LISSI, 2005; KUSKOSKI et al., 2005). Foi
utilizada uma diluição de 200ppm do extrato, determinada como ideal após testes
utilizando uma curva de calibração.
3.2.4. Capacidade de absorbância de radicais de Oxigênio (ORAC)
A metodologia utilizada neste trabalho foi baseada na metodologia proposta
por Ou, Hmapsch-Woodill e Prior (2001), com algumas modificações. Nessa análise,
a fluoresceína foi utilizada como uma sonda de detecção aos danos causados pelos
radicais gerados pelo 2.2’-Azobis (2-amidinopropano) diidroclorírico (AAPH) no
decorrer da reação. A queda da fluorescência gera uma curva de decaimento que é
então analisada pela mensuração da área produzida em relação a curva de um
controle que não possui agentes antioxidantes que possam impedir o processo.
Todos os reagentes, diluições das amostras e curva de calibração, foram
preparados com tampão fosfato de potássio, 75mM, pH 7,4. Foram utilizados
Fluoresceína na concentração inicial de 4,066mM e concentração final de
508,25mM, e o AAPH na concentração final de 76mM. Utilizou-se uma curva de
calibração com Tolox nas concentrações de 12,5, 25, 50, 100, 200 e 400µM/mL. As
análises foram realizadas em placa de 96 poços onde cada poço possui um volume
de 300µL. No ensaio em microplaca, em cada poço foi adicionado 30 µL da amostra,
60µL da solução de fluoresceína a 508,28 mM e 110 µL da solução de AAPH 76
mM. No poço que correspondente ao controle, foram colocados todos os reagentes
e a amostra substiuída por tampão e o correspondente ao branco, somente 300 µL
de tampão. As análises foram realizadas em triplicata, com metodologia em modo
cinético, utilizando as absorbâncias de emissão 528nm e excitação 825nm com
duração de 2 horas a 37ºC.
As amostras de plasma foram submetidas ao mesmo tratamento já descrito
acima para análises de atividade antioxidante on-line por CLAE-FR, porém com a
diferença de que os resíduos foram reconstituídos com o tampão de análise de
ORAC (fosfato de potássio 75mM pH7,4), para que não houvessem alterações
casualmente causadas por solventes orgânicos nessa análise. Já para as amostras
de fígado, foram utilizados os extratos do órgão diluídos 100 vezes com o tampão de
análise do ORAC.
3.3. Ensaios para avaliação da atividade antioxidante in vivo
3.3.1 Ensaios in vivo
3.3.1.1 Delineamento experimental dos animais
Foram utilizados para o experimento 50 ratos Wistar machos, com 35 dias de
idade, pesando em média 100g, fornecidos pelo CEMIB/UNICAMP. Esses animais
foram alocados no biotério da Faculdade de Odontologia da UNICAMP/Campus
Piracicaba, em condições ideais de luz e temperatura seguindo as condutas de ética
e biossegurança exigidas pela Comissãp de Ética no Uso de Animais
CEUA/Unicamp de número 2304-1 em 12 de novembro de 2010. Os animais
chegaram ao biotério com 21 dias, desmamados e permaneceram por duas
semanas nesse local sem manejo experimental, para a adaptação dos mesmos ao
novo ambiente. Após esse período, o experimento propriamente dito foi iniciado. Os
animais foram numerados por caixa, separados em 7 caixas contendo 7 animais
cada uma, sendo que uma caixa alocou 8 animais. Cada caixa correspondeu a um
tratamento, sendo eles: Controle normal (CTL-N) onde os animais foram somente
manipulados, mas não receberam nenhum tratamento e nem Acetaminofen (APAP)
como indutor de estresse; Controle estressado (CTL-J/APAP) os quais foram
submetidos a jejum e receberam o indutor de estresse (APAP); Ácido Ascórbico (AAJ/APAP) os quais foram tratados com ácido ascórbico na dose de 600mg/kg, e
submetidos a jejum e APAP; Quercetina (Q-J/APAP) os quais foram tratados com
Quercetina na dose de 20mg/kg e submetidos a jejum e APAP; Própolis 150 (P150J/APAP) os quais foram tratados com própolis vermelha na dose de 150mg/kg e
submetidos a jejum e APAP; Própolis 300 (P300-J/APAP) os quais foram tratados
com própolis vermelha na dose de 300mg/kg e submetidos a jejum e APAP; Própolis
600 (P600-J/APAP) os quais foram tratados com própolis vermelha na dose de
600mg/kg e submetidos a jejum e APAP.
Todos os tratamentos foram administrados por via intragástrica, (gavagem),
uma vez ao dia durante 15 dias consecutivos. Foi utilizado propilenoglicol como
veículo para todos os tratamentos e também na forma pura para os animais do
grupo controle normal (CTL-N). Durante todo o experimento, os animais tiveram
alimentação e água ad libitum e somente foram submetidos a jejum de 12 horas
(overnight) no 15º dia de experimento após administração da dose de 800 mg/kg de
APAP, também por via intragástrica. Após as 12 horas de jejum, já no 16º dia de
experimento, os animais foram anestesiados com uma mistura de Xilazina e
Quetamina 1/1, variando de 0,2 a 0,8 ml por via intraperitoneal, e sacrificados
extraindo-se o fígado e aproximadamente 2 mL de sangue, o qual foi coletado pela
veia cava inferior.
3.3.1.2 Avaliação da função hepática: análise das enzimas ALT, AST e γGT
As análises das enzimas de função hepática ALT, AST e γGT foram
realizadas no laboratório de análises clínicas Previlab Laboratório, localizado na
cidade de Piracicaba sob responsabilidade técnica de Maria Angélica B. Sanches.
As amostras de sangue heparinizado, coletadas dos animais no momento do
sacrifício, foram armazenadas em gelo e em seguida centrifugadas para a
separação do plasma. O plasma foi acondicionado em tubo fornecido pelo
laboratório. As amostras de plasma foram levadas para o laboratório e submetidas a
um método automatizado.
3.3.1.3 Determinação da atividade de sequestro de radical superóxido (O2.) pela
enzima Superóxido dismutase
A determinação da atividade de sequestro de radical superóxido foi realizada
baseando-se na metodologia de Chisté et al. (2011). Nessa análise, foi gerado o
radical
superóxido
pelo
sistema
-nicotinamida
adenina
dinucleotídeo
(NADH)/Fenazina metosulfato (PMS), sistema este que reduz o nitroblue tetrazolium
(NBT) à um composto azul, o diformazan. A eliminação dos radicais gerados pela
ação da enzima Superóxido Dismutase contida na amostra de plasma e fígado foi
monitorada por meio da redução de NBT a 560nm, durante 10 minutos, a
temperatura ambiente (GOMES et al., 2007).
A metodologia foi realizada em microplaca de 96 poços, tendo cada poço uma
capacidade de volume de 300µl. Cada poço continha os seguintes reagentes em
concentrações finais: NADH (166µM), NBT (43µM) e PMS (2,7µM), todos dissolvidos
em tampão Fosfato de Potássio 19mM e pH 7,4, assim como todas as amostras de
plasma e fígado utilizadas no ensaio. Foi realizada uma curva de calibração com a
enzima Superóxido Dismutase (SIGMA) nas concentrações de 1,25; 2,5; 5; 10; 20 e
40 ng/µL, que foram dissolvidas no mesmo tampão de trabalho.
Os efeitos foram expressos como a inibição em porcentagem da redução do
NBT para diformazan.
3.3.1.4 Atividade antioxidante on-line por CLAE-FR modificada para amostras de
plasma
As análises de CLAE-FR em modo analítico para as amostras de plasma
foram baseadas na metodologia descrita por Talcott, Howard e Brenens (2000).
Vinte microlitros de plasma foram injetados em um cromatógrafo líquido acoplado a
um detector de arranjo de fotodiodos e uma coluna de fase reversa C18 (250 x
4,6 mm) com tamanho de partícula de 5 µm. A fase móvel utilizada foi água:ácido
acético (98:2, v/v) (solvente A) e água:acetonitrila:ácido acético (68:30:2) (solvente
B), com vazão constante de 0,8mL/min. O gradiente iniciou com 0% do solvente B
até 30% de B em 20 minutos, 50% em 30 minutos, 70% em 50 minutos até 100%
em 55 minutos permanecendo nessa proporção por 15 minutos, somando
70 minutos de programação e retornando para 0% em 80 minutos. A coluna foi
mantida a uma temperatura constante de 30ºC e os cromatogramas foram
processados utilizando o software Class Vp. Ainda foi realizado um preparo prévio
do plasma, para a análise de atividade antioxidante on line. Para 100µL de plasma
foram adicionados 300µL de metanol P.A. e misturados em vortex por 30s. A mistura
foi centrifugada à 9659 x g por 15 minutos e em seguida foi coletado 300 µL do
sobrenadante. O sobrenadante foi evaporado à 40ºC sobre leve corrente de gás
nitrogênio. O resíduo foi reconstituído em 100 µL de metanol e água (80:20, v/v) e
centrifugado à 9659 x g por 5 minutos. Foi utilizada uma alíquota de 20µL para
injeção no sistema CLAE.
3.3.1.5 Western blot para as enzimas superóxido Dismutase e Catalase
Para a análise de Western Blot do fígado dos animais foi realizada uma
extração do tecido na proporção de 1mg de tecido para 1 ml de tampão fosfato de
sódio 50mM pH 7,4 com EDTA 0,1 mM. Durante a extração, os tecidos foram
mantidos em nitrogênio líquido e durante a trituração no Polytron, o tampão se
mantinha gelado e o tubo colocado no gelo. Após a trituração, o volume foi
centrifugado a 18.500 x g por 20 minutos, para retirada do sobrenadante.
Para que as amostras fossem visualizadas no gel, as amostras foram
misturadas com um tampão que contém Azul de Bromofenol 0,1% chamado de
tampão LAEMMLI. Essa mistura foi feita com 400ul da amostra e 100 µL do tampão
e colocada em água fervente por 5 minutos. Após esse tempo, centrifugou-se em
eppeddorf por 1 minuto a 9659 x g e só após foi possível a aplicação no gel.
Os géis foram preparados com uma solução de acrilamida a 40% e foram
utilizados dois tampões: tampão para gel de resolução (Resolving) e tampão para
gel de empilhamento (Stacking). O Resolving possui uma concentração maior de
Trisma (750mM) e o Stacking uma concentração de 50mM de Trisma, o que faz com
que as amostras possam primeiramente se empilhar e depois correr no gel
lentamente de acordo com seu peso molecular. Com gel já pronto, as amostras
foram aplicadas sempre tendo como primeira posição o marcador de peso molecular
com suas cores específicas para cada peso (Bio-Kaleidoscope Prestained
Standards) (Figura 5).
-216 KDa
-132 KDa
-78 KDa
-45,7 KDa
-32,5 KDa
-18,4 KDa
-7,6 KDa
Figura 5 - Esquema de cores do marcador de peso molecular Bio-Kaleidoscope Prestained Standards
catalog #161-0324 para identificação e detecção de proteínas
As amostras foram submetidas à dosagem de proteínas totais pelo método de
Bradford (BRADFORD, 1976) para se padronizar a quantidade de 200µg de proteína
nas alíquotas aplicadas no gel. Os géis foram preparados na concentração de 12%
de Resolving, ideal para a corrida de proteínas com peso molecular de 20 a 70 KDa
como Superóxido Dismutase I e II (23 e 25 KDa respectivamente) e Catalase
(64 KDa). Após a aplicação das amostras nos géis, os mesmos foram colocados nas
cubas para a corrida com tampão de corrida (aproximadamente 900 ml para cada
cuba). Foi selecionado 80 volts até o front (azul) entrar no gel de separação e
100-120 volts para corrida das amostras. A corrida foi monitorada e teve seu final
entre 1,5 a 2 horas.
Após a corrida foi realizada a transferência para uma membrana de
nitrocelulose com um tampão apropriado, chamado tampão de transferência. As
membranas foram colocadas novamente na cuba e submetidas a uma nova corrida,
observando-se o valor de 46W que foi aumentando e no momento em que se
alcançou o dobro desse valor, a corrida foi interrompida. Esse processo teve
duração de aproximadamente 1 hora. Terminada a transferência, as membranas
foram retiradas e colocadas em solução para anticorpo, juntamente com 10 µL do
anticorpo primário específico para cada membrana (SOD I, SOD II e CATALASE),
sendo então acondicionadas em geladeira, sob agitação constante, overnight. No dia
seguinte, o anticorpo foi retirado e as membranas foram lavadas com uma solução
basal, uma vez por 15 minutos e duas vezes por 10 minutos, sob agitação
constante. As membranas então foram bloqueadas com uma solução contendo leite
em pó desnatando por uma hora e meia. Após esse tempo, foi retirada a solução
bloqueadora e as membranas foram lavadas com solução basal no mesmo esquema
descrito acima.
Após as membranas serem bloqueadas e lavadas, foi adicionado o anticorpo
secundário, sendo que, para cada membrana, foi adicionado 2 µL de anticorpo em
10ml de solução basal. As membranas foram mantidas nessa solução por 1 hora em
agitação constante à temperatura ambiente. Após esse tempo, as membranas foram
novamente
lavadas,
ligeiramente
secas
e
submetidas
à
reação
de
quimiluminescência com kit apropriado para revelação em filme em câmara escura.
O tempo de exposição adequado para a melhor visualização das bandas foi de
2 segundos.
3.3.1.6. Histopatologia
O tecido utilizado para a confecção das lâminas de histopatologia foi o fígado
extraído no momento do sacrifício dos animais. Aproximadamente um terço do órgão
de 4 animais de cada tratamento, foi separado e acondicionado em solução de
formaldeído 10%, para posterior confecção das lâminas.
As amostras foram alocadas e identificadas em cassetes específicos e
durante esse processo, foi realizada a análise macroscópica do tecido. Em seguida,
as amostras foram submetidas ao processo de fixação e inclusão com parafina,
formando então os blocos que foram cortados em micrótomo.
Depois de endurecida a parafina, os blocos foram aparados o máximo
possível e colocados no micrótomo que realizou cortes de 4 a 7 µm de espessura,
como mostra a Figura 6. Os cortes finos foram lavados, colocados em lâminas
desengorduradas e secos em estufa. Posteriormente foram desparafinados e
reidratados para serem submetidos à coloração de Hematoxilina e Eosina.
Figura 6 - Esquema representativo do funcionamento de um micrótomo tipo rotativo (ALBERTS et al.,
2004)
A hematoxilina é uma base que cora, preferencialmente, compostos ácidos
das células em tom roxo/azulado, por isso o núcleo é o que se torna mais corado
pela hematoxilina pela presença do DNA e RNA, pois são compostos basofílicos. A
Eosina, ao contrário, é um ácido que cora estruturas acidófilas em tons de rosa,
essas estruturas estão mais abundantes no citoplasma (GARTNER; HIATT, 1999).
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Ensaios in vitro
4.1.1. Caracterização química da própolis vermelha
4.1.1.1. Espectro na região UV-Visível
Na Figura 7, está ilustrado o espectro de absorção na região UV-visível do
EEP vermelha brasileira utilizada nesse trabalho. Observa-se que a absorbância
máxima se deu em 280 nm, resultado coerentes com a absorção absorção da
maioria dos compostos fenólicos, os quais estão na faixa de 250 a 350 nm
(MARKHAM; THOMAS, 1970). O resultado do comprimento de onda máxima
encontrado para o EEP da própolis vermelha deste trabalho (280 nm) (Figura 7) está
de acordo com o obtido por Oldoni et al. (2007), os quais também trabalharam com a
própolis vermelha de Alagoas e encontraram valores de absorbâncias que variaram
de 276 a 284 nm.
Figura 7 - Espectro de absorção UV-Visível do EEP da propolis vermelha brasileira
4.1.1.2. Teor de compostos fenólicos totais
A quantidade de compostos fenólicos encontrada para a amostra de própolis
vermelha utilizada nesse trabalho foi de 266,8 mg/g de própolis, teor elevado em
relação a outros tipos de própolis brasileiras. Oldoni et al. (2007) encontraram um
teor de 231,4 mg/g para a própolis vermelha brasileira, uma das maiores
concentrações já encontrados até então em própolis. Frozza et al. (2013) ao analisar
amostras de própolis vermelha provenientes do Estado de Sergipe encontraram
teores menores (151,55 mg/g). Estes autores justificam que esta baixa concentração
pode ser devido ao método de extração utilizado, bem como a localização
geográfica de coleta. Sarikaia et al. (2009), ao avaliar própolis com origem botânica
na espécie Castania Sativa Mill. também encontraram valores inferiores ao da
própolis vermelha brasileira. Isso corrobora com o fato de que a própolis utilizada
nesse trabalho possui as características peculiares da própolis vermelha brasileira
referenciada na literatura, como o alto teor de compostos fenólicos e alta atividade
antioxidante in vitro.
O teor de compostos fenólicos totais possui um significado diferente em
relação às outras análises de atividade antioxidante in vitro, pois expressa de outra
forma a capacidade redutora do extrato, porém não necessariamente relacionados
com a atividade antioxidante contra as ERO e ERN. Para isso, soluções de etanol ou
metanol são normalmente misturadas com água, haja vista serem mais eficientes
nas extrações dos compostos fenólicos do que esses mesmos solventes puros
(RICE-EVANS; MILLER; PAGANGA, 1997)
4.1.1.3. Composição química por Cromatografia líquida de Alta Eficiência (CLAE)
O EEP quando analisado pela técnica de CLAE possibilitou a identificação de
compostos inerentes a esse tipo de própolis, ou seja, flavonoides, isoflavonoides e
chalconas, as quais também já foram identificadas por Oldoni et al. (2011) e Silva et
al. (2007), como por exemplo, liquiritigenina, quercetina, vestitol, neovestitol,
isoliquiritigenina, formononetina e biochanina (Figura 8). Portanto, pode-se constatar
que a própolis utilizada nos ensaios in vivo foi a mesma descrita por Silva et al.
(2007), a qual foi classificada como o 13º tipo de própolis brasileira, e que segundo
Alencar et al. (2007) e Oldoni et al. (2011) possui elevada atividade antioxidante in
1500
1500
1000
1000
500
500
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Volts
2000
Detector B-260 nm
Propolis vermelha (20mg por ml - Luciana) 20uL - 0,8mL DPPH 10-5M (10-02-12) ac acetico 0,1M
Propolis vermelha (20mg por ml - Luciana) 20uL - 0,8mL DPPH 10-5M (10-02-12) ac acetico 0,1M
0
Volts
2000
vitro.
110
Minutes
Figura 8 - Cromatograma obtido pela técnica de HPLC (CLAE) do EEP detectado a 280 nm;
Compostos identificados para EEP: 1-ácido ferúlico; 2-liquiritigenina; 3-quercetina; 4-vestitol; 5neovestitol; 6-isoliquiritigenina; 7-formononetina; 8-biochanina
4.1.1.4. Cromatografia Gasosa acoplada com Espectrometria de Massas (CG-EM)
da composição não volátil
Na análise do EEP por CG-EM foram identificados 19 compostos, incluindo os
isoflavonoides e pterocarpnaos característicos desse tipo de própolis como
medicarpina,
vestitol,
formononetina,
3,4-diidroxi-9-metoxipterocaroano
3,8-diidroxi-9-metoxipterocarpano (Tabela 1 e Figura 9).
e
Tabela 1 - Composição química do EEP da própolis vermelha analisada pela técnica de CG-EM
Pico
Compostos
íon (m/z abundancia em parenteses)
1
4,4'BIS[(TRIMETHYLSILYL)ETHYNYL]-2,2'-BITHIOPHENE-5,5' DICARBALDEHYDE
414(100), 73(95), 399(66), 342(64), 238(60), 208(41), 265(33)
2
SILANE, TRIMETHYL[5-METHYL-2-(1-METHYLETHYL)PHENOXY]-
222(100), 209(88), 207(81), 358(64), 73(46), 210(40)
3
MEDICARPINA
342(100), 327(34), 73(29), 148(15), 341(38)
4
BENZENEPROPANOIC ACID, 3,4-BIS[(TRIMETHYLSILYL)OXY]-, TRIMETHYLSILYL ESTER
73(100), 400(95), 401(36), 385(24), 369(22), 204(22)
5
ISOFLAVONA DESCONHECIDA
267(100), 280(90), 265(60), 73(88), 416(51), 268(40)
6
VESTITOL
222(100), 207(57), 209(55), 416(51), 73(48)
7
4,4'-BIS[(TRIMETHYLSILYL)ETHYNYL]-2,2'-BITHIOPHENE-5,5'-DICARBALDEHYDE
414(100), 73(54), 413(54), 415(35), 341(8), 383(10), 219(7)
8
HYDROCINNAMIC ACID, P-(TRIMETHYLSILOXY)-, TRIMETHYLSILYL ESTER
179(100), 192(67), 399(44), 400(61), 73(60), 177(40)
9
3,4-DIHYDROXY-9-METHOXYPTEROCARPAN
73(100), 430(95), 399(46), 267(29), 415(23), 161(16)
10
3,8-DIHYDROXY-9-METHOXYPTEROCARPAN (3-HYDROXY-8,9-DIMETHOXYPTEROCARPAN)
372(100), 357(25), 371(12), 219(5), 206(13), 178(10), 73(43)
11
1,3,5-CYCLOHEPTATRIEN, 7-METHYL-7-PHENYL-2,4-BIS(TRIMETHYLSILYL)-
252(100), 73(57), 222(48), 237(40), 240(38), 446(45), 179(15)
12
FORMONONETIN
340(100), 325(38), 132(26), 73(18), 208(9)
13
SILANE, 9H-FLUOREN-9-YLIDENEBIS[TRIMETHYL-
222(100), 73(53), 369(52),296(38),207(34),413(29), 503(16)
14
BENZENEACETIC ACID, 2,4,5-TRIS[(TRIMETHYLSILYL)OXY]-, TRIMETHYLSILYL ESTER
473(100), 268(91), 296(34), 269(26),179(16), 73(78)
15
ISOLIQUIRITIGENIN
457(100), 73(52), 458(35), 472(9), 307(7)
16
2-PROPENOIC ACID, 3-(3,4,5-TRIMETHOXYPHENYL)-, METHYL ESTER
252(100), 73(51), 460(35), 237(25), 206(7)
17
BENZENEACETIC ACID, 4-[(TRIMETHYLSILYL)OXY]-, TRIMETHYLSILYL ESTER
556(100), 73(96), 296(62), 297(39), 281(19), 69(42)
18
PROPANEDIOIC ACID, BIS[(TRIMETHYLSILYL)OXY]-, BIS(TRIMETHYLSILYL) ESTER
307(100),73(59), 308(25), 696(9), 219(11)
19
SILANE, TRIMETHYL[[(3.BETA.)-OLEAN-12-EN-3-YL]OXY]- $$ 3-[(TRIMETHYLSILYL)OXY]OLEAN-12-
218(100), 203(45), 69(25), 73(24), 498(3)
22
LUP-20(29)-EN-3-YL ACETATE
43(100), 218(91), 95(61), 109(55), 189(75), 135(45)
5
6
(x10,000,000)
2.00 TIC
1.75
3
1.50
1.25
7
1.00
17
0.00
32.5
35 .0
37.5
40.0
42.5
45.0
18
16
10
1
9
0.25
13
4
14
8
0.50
12
2
15
11
0.75
47.5
50.0
52.5
5 5.0
Figura 9 - Cromatograma obtido por CG-EM do EEP da própolis vermelha. O nome do composto
referente a cada pico está descrito na Tabela 1
De acordo com os dados da Tabela 1, os principais compostos do EEP são
da classe dos fenólicos, subclasse das isoflavonas, como medicarpina (pico 3),
Isoflavona desconhecida (pico 5) e vestitol (pico 6). Além desses, outros
isoflavonoides como a formononetina e a chalcona isoliquiritigenina também
apresentaram uma porcentagem relativa significativa. Os isoflavonoides medicarpina
e homopterocarpina também já foram identificados em altas concentrações pela
técnica de CG/MS na própolis vermelha de Alagoas (ALENCAR et al., 2007).
Os isoflavonoides são uma subclasse dos flavonoides e que possuem uma
distribuição limitada na natureza. São compostos intrínsecos das plantas, cuja
quantidade depende de fatores como crescimento e base genética. Embora várias
plantas sintetizem isoflavonoides, a forma bioativa para o consumo humano está
presente em poucos vegetais, que são espécies tipicamente da família das
leguminosas (DEWICK, 1996; PETERSON; DWYER, 1998). Desta forma, estes
compostos podem ser úteis como marcadores químicos deste tipo de própolis
brasileira.
De acordo com estudos epidemiológicos recentes, isoflavonoides são mais
benéficos para a saúde humana do que os flavonoides. Dietas contendo
isoflavonoides têm sido associadas com diversos benefícios para a saúde humana,
como doenças cardíacas, osteoporose, redução dos sintomas da menopausa e
prevenção de vários tipos de cânceres, vários associados com radicais livres
(KOBLOVSKÁ et al., 2008; LOF et al., 2006).
4.1.1.5. Cromatografia Gasosa acoplada com Espectrometria de Massas (CG-EM)
da composição volátil
De acordo com a Tabela 2, observa-se que a própolis vermelha de Alagoas
apresentou um perfil bastante heterogêneo em relação aos voláteis. Um total de 43
compostos foram encontrados, sendo os mais representativos o
(12,95%), germacreno D (10,04%), anetol (9,65%)
-cubebeno
-cariofileno (7,58%), metil
eugenol (6,03%), alfa pineno (5,72%), delta cadineno (4,95%), -asarona (3,71%),
biciclogermacreno (3,47%) e cariofileno <9-epi-(E)> (3,39%). Também foi possível
notar que o aroma da própolis vermelha consiste numa mistura de odores
característicos, dentre os quais se podem citar o de ervas, cera, madeira,
especiarias, pinho, cravo-da-índia, frescor, anis, entre outros. Dentre os compostos
encontrados estão presentes alcoóis, éteres, aldeídos, cetonas e fenilpropanóides
em menor proporção. Os compostos voláteis predominantes na própolis vermelha
foram os monoterpenos e sesquiterpenos. Terpenos são metabólitos secundários de
plantas formados pela condensação de unidades de isopreno (C5) através da via do
acetato-mevalonato e os mais comumente encontrados são os monoterpenos (10C),
sesquiterpenos (15C) e diterpenos (20C). Esses compostos estão também
associados com a defesa do vegetal (BAKKALI et al., 2008).
Tabela 2 - Compostos voláteis (em porcentagem) identificados na própolis vermelha e seus
respectivos índices e tempos de retenção
Compostos voláteis
TR
(%)
I K*
IK**
Metil-D3 1dideuterio-2propenil eter
Crotonaldeído, 3metil
Hexanal
5-metil-2-hexanol
Alfa pineno
Beta-pineno
Sabineno
Metilheptenona
Beta mirceno
1-octanal
Delta 3 careno
4-cimeno
Alfa-limoneno
1,8-cineol
Beta-cis-ocimeno
Beta-transocimeno
Beta linalool
Nonanal
Estragol
Decanal
Anetol (Z)
Delta elemeno
Alfa cubebeno
Alfa amorfeno
Beta elemeno
Metil eugenol
4,337
2,17
787
-
Fórmula
molecul
ar
C4H3D5O
5,779
0,30
823
-
C5H8O
6,123
9,450
10,670
12,189
12,338
12,654
12,753
13,226
13,464
14,016
14,172
14,291
14,531
14,921
1,35
0,25
5,72
1,57
0,22
0,09
0,14
0,30
0,18
0,24
0,34
0,11
0,06
1,00
831
913
943
981
985
993
995
1007
1014
1029
1032
1035
1042
819
911
939
981
976
986
994
1006
1013
1028
1031
1030
1043
1050
C6H12O
C7H16O
C9H12
C10H16
C10H16
C8H14O
C10H16
C8H16O
C10H16
C10H14
C10H16
C10H18O
C10H16
C10H16
16,885
17,058
20,544
20,759
23,618
25,351
25,756
26,355
27,154
27,525
1,05
0,66
1,74
0,15
9,65
0,15
14,90
1,48
3,60
6,03
1107
1108
1196
1211
1283
1340
1351
1393
1401
C10H18O
C9H18O
C10H12O
C10H20O
C10H12O
C15H24
C15H24
C15H24
C15H24
C11H14O2
27,768
27,879
0,69
2,90
1412
1431
C15H24
C15H24
28,092
28,384
28,710
29,030
29,163
29,406
9,09
1,42
0,30
0,48
0,99
3,39
1428
1461
1454
1476
C15H24
C15H24
C15H24
C15H24
C15H24
C15H24
29,843
30,018
30,191
30,494
31,000
31,257
32,172
32,332
32,936
1,23
10,04
0,88
3,47
0,73
4,95
3,71
0,74
1,09
1485
1499
1485
1517
1513
1530
1559
1560
1576
C15H24
C15H24
C15H24
C15H24
C15H24
C15H24
C12H16O3
C15H24
C15H24O
Alfa gurjuneno
Alfa-cisbergamoteno
Beta cariofileno
Beta cubebeno
Alloaromadendren
Beta maalieno
Alfa-cariofileno
Cariofileno <9-epi(E)
Alfa amorfeno
Germacreno D
Beta selineno
Biciclogermacreno
Gama cadineno
Delta cadineno
Beta-asarona
Germacreno B
Espatulenol
1052
1106
1110
1204
1211
1294
1346
1358
1376
1399
1410
1419
1423
1430
1440
1451
1462
1465
1474
1488
1494
1500
1510
1527
1534
1566
1570
1590
TR: Tempo de retenção
IK*: Índice de Kovats encontrado no voláteis da própolis vermelha de Alagoas
IK**: Índice de Kovats encontrado na literatura
- : Compostos cujos índices de Kovats não foram encontrados ou divergiram muito da literatura
Ainda não existem estudos sobre a composição de voláteis da planta
Dalbergia ecastophyllum (L) Taub., origem botânica da própolis vermelha de
Alagoas. Alguns trabalhos já foram conduzidos em outras espécies de Dalbergia,
como, por exemplo, nas folhas de Dalbergia frutescens coletadas em Santa
Catarina. Comparando a folha com os resultados encontrados para a própolis
vermelha, verificou-se que os compostos com maior concentração nas folhas foram
os norisoprenóides (produzidos pela degradação de carotenoides), e os mais
abundantes foram a -damascenona e -ionona (MENDES et al., 2012). Nunes et al.
(2009) analisaram os compostos voláteis de uma própolis vermelha produzida em
Pernambuco e observaram que grande parte dos compostos identificados foram
sesquiterpenos, fato que também ocorreu com a própolis de Alagoas. Houve
semelhança entre alguns compostos como o
-cubebeno,
-cariofileno e nonanal,
porém o composto majoritário encontrado na própolis de Pernambuco foi o transanetol, que variou de 25,58% a 52,58%, dependendo do mês de coleta. O anetol
apareceu na própolis vermelha de Alagoas também, porém em concentração bem
inferior (9,65%). De acordo com esses dados, é possível supor que as própolis
podem apresentar semelhança na aparência, porém podem ou não ser oriundas da
mesma fonte. Além disso, existem outros fatores, como temperatura, nutrientes do
solo, disponibilidade de água, tipo de vegetação, entre outros, que interferem na
produção de compostos secundários pelas plantas.
Ultimamente diversos estudos in vivo têm demonstrando as propriedades
biológicas de compostos voláteis, inclusive de substâncias encontradas em
quantidades consideráveis na própolis vermelha de Alagoas. Choi et al. (2009)
encontraram atividade do sesquiterpeno
-iso-cubebeno como agente anti-
inflamatório, sendo considerado pelos autores como possível composto capaz de
prevenir e tratar doenças artEROcleróticas em seres humanos. Os compostos
voláteis também podem agir em sistemas tritróficos, atraindo inimigos de herbívoros,
como vespas parasitas e moscas ou ácaros predadores, o que pode proteger a
planta de novos danos. Há pesquisas demonstrando que o germacreno D funciona
como sinalizador fundamental na relação entre plantas e insetos (ARIMURA et al.,
2004; PETRAKIS et al., 2005).
Em estudo realizado por Geng et al. (2010), foram encontradas evidências da
ação da
-asarona contra a doença de Alzheimer, uma vez que, quando
administrado por via oral, pode tanto suprimir a apoptose celular neuronal quanto a
disfunção do sistema de memória. Estudos conduzidos por Manikandan e Devi
(2005) mostraram o efeito da -asarona na restauração da atividade antioxidante no
cérebro de ratos, após a indução do estresse pelo ruído.
Rather et al. (2012) analisaram as atividades antioxidante e antimicrobiana do
óleo de Juglans regia L. e seus principais constituintes, dentre os quais estão
e
-pinenos,
-cariofileno e germacreno D. Nas análises microbiológicas
(concentração inibitória mínima), observou-se que o
-cariofileno e germacreno D
apresentaram melhores resultados contra alguns microrganismos como B. subtillis,
S. aureus, S. typhi, e K. pneumonia em relação aos pinenos. Para a atividade
antioxidante, expressa em termos de IC50 (método DPPH), foi encontrada a
concentração de 34,5 µg/mL para o óleo de Juglans regia L. e 78,1 µg/mL,
73,2
µg/mL
e
80 µg/mL
para
-pineno,
-cariofileno
e germacreno
D,
respectivamente. De acordo com Tamble et al. (1996), o sesquiterpeno antiinflamatório
-cariofileno apresentou, ainda, efeito gastro citoprotetor por meio da
ingestão oral, inibindo as injúrias induzidas por agentes que causam lesões
necróticas no estômago, como o etanol e o ácido clorídrico.
Para o composto anetol, componente encontrado na própolis vermelha e
majoritário em óleo de anis, óleo de erva-doce e cânfora, foi comprovada ação antiinflamatória e anticâncer, por meio da resposta celular induzida por TNF (CHAINY et
al., 2000).
Visando a aplicabilidade, os compostos voláteis podem ser utilizados em
diferentes contextos. O uso na indústria alimentícia propicia a caracterização,
reconstituição e formulação de aroma com maior fidelidade ao aroma natural de um
alimento. Há, ainda a possibilidade de utilização em perfumarias e na química de
aromatizantes. Dezenas de milhares de compostos já foram identificados e estudos
se estendem desde a olfatometria simples até avaliações de propriedades
medicinais e efeitos fisiológicos e psicológicos (NOGUEIRA, 2002).
4.1.1.6. Atividade antioxidante on-line por CLAE-FR do EEP
O método de atividade antioxidante on-line é um método que visa à
separação de compostos e sua atividade antioxidante simultaneamente. Como o
detector que analisa a atividade antioxidante on-line é zerado com a solução de
DPPH, e, após a reação com os compostos fenólicos a absorbância do respectivo
radical decresce, os picos obtidos são negativos. Assim, quanto mais negativo,
maior é a atividade antioxidante do pico. Portanto, dentre os compostos identificados
por esta técnica, a isoliquiritigenina foi claramente a que apresentou a maior
contribuição para a atividade antioxidante no sistema EEP. Já a formononetina,
apesar de também estar em alta concentração (Figura 10), não contribuiu
significativamente com o sequestro do radical livre DPPH. Oldoni et al. (2007)
analisando o potencial antioxidante da própolis vermelha brasileira, tanto do EEP
quanto de suas frações clorofórmicas e hexânicas, também verificaram uma
contribuição significativa da atividade antioxidante dos compostos isoliquiritigenina,
vestitol e o neovestitol, sendo que alguns compostos quando isolados apresentaram
1500
1000
1500
6
7
1000
45
500
Volts
2000
Detector B-260 nm
Propolis vermelha (20mg por ml - Luciana) 20uL - 0,8mL DPPH 10-5M (10-02-12) ac acetico 0,1M
Propolis vermelha (20mg por ml - Luciana) 20uL - 0,8mL DPPH 10-5M (10-02-12) ac acetico 0,1M
2
1
3
Volts
2000
atividade maior do que o EEP.
500
8
0
0
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Minutes
0.00
Detector A (517nm)
Propolis vermelha (20mg por ml - Luciana) 20uL - 0,8mL DPPH 10-5M (10-02-12) ac acetico 0,1M
Propolis vermelha (20mg por ml - Luciana) 20uL - 0,8mL DPPH 10-5M (10-02-12) ac acetico 0,1M
3
7 8
-0.01
-0.02
mAU
4
mAU
-0.01
1
0. 00
-0.03
-0.02
6
0
10
20
30
40
-0.03
50
60
70
80
90
100
110
Minutes
Figura 10 - Cromatogramas obtidos pela técnica HPLC. A:Comatograma do EEP detectado a 280
nm; B: Cromatograma da atividade antioxidante on-line, após reação com DPPH. Compostos
identificados para EEP: 1-ácido ferúlico; 2-liquiritigenina; 3-quercetina; 4-vestitol; 5-neovestitol; 6isoliquiritigenina; 7-formononetina; 8-biochanina A. Para os picos da atividade antioxidante on-line,
númERO iguais correspondem ao mesmo composto
5.1.1.7. Atividade antioxidante pelos métodos FRAP, ABTS e ORAC
As análises de atividade antioxidante in vitro pelos métodos FRAP, ABTS e
ORAC, estão apresentados na Tabela 3:
Tabela 3 - Valores de atividade antioxidante in vitro para as metodologias de FRAP e ABTS
Amostra
FRAP
(mmol/g)1,2
ABTS
(mmol/g)1,3
ORAC
(µmol/g)1,3
EEP
4,26±0,23
4,84±0,26
19.779±1,8
1-Valores são a média ± desvio pádrão
2-equivalentes de Sulfato ferroso
3-equilvalentes de Trolox
O valor encontrado para o FRAP para a própolis vermelha utilizada nesse
trabalho foi de 4,26 mmol/g em equivalente de sulfato ferroso. Valores inferiores já
foram encontrados para outros tipos de própolis provenientes de 6 regiões da
Colômbia, sendo a maior atividade de 0,50 mmol/g (PALOMINO et al., 2009).
Mohammadzadeh et al. (2007) encontraram teores de FRAP maiores do que os
encontrados para a própolis da Colômbia: 1,65 mmol/g para a própolis Iraniana,
porém esse valor é ainda significativamente inferior aos encontrados para a própolis
vermelha brasileira utilizada neste trabalho.
Em relação ao valor encontrado para a atividade antioxidante frente ao radical
ABTS, de 4,84 mmol/g, foi possível observar que essa própolis apresenta um
potencial antioxidante importante ao ser comparada com outras. No trabalho
realizado com amostras de própolis de 19 locais do país de Basque, no Nordeste da
Espanha, Bonvehí e Gutiérrez (2011) encontraram valores de ABTS que variaram de
0,56 a 1,46 mmol/g de equivalente de Trolox, demonstrando assim que, das 19
amostras, nenhuma apresentou atividade próxima à própolis vermelha de Alagoas.
Para a análise de ORAC foi encontrado um valor de 19.779,7 µmol/g em
equivalente de Trolox. Ninfali et al. (2009), em estudo sobre atividade antioxidante
de vários extratos liofilizados de plantas, inclusive extrato de multifrações de
própolis, encontraram um valor de ORAC de 13.800±1339 µmol/g, sugerindo que a
própolis vermelha brasileira demonstra uma atividade antioxidante ainda superior
para o sequestro do radical peroxila que é gerado nessa análise. Outros autores
(SHI et al., 2012), ao analisar 15 amostras de própolis de 15 locais da China,
encontraram uma variação de 2560 a 7630 µmol/g nos valores ORAC, atividades
estas muito aquém do que o encontrado para a própolis vermelha do presente
trabalho.
4.2. Ensaios in vivo e ex vivo
4.2.1. Função hepática e instalação do estresse
Foram realizadas as análises de função hepática por meio da mensuração
quantitativa das enzimas Alanina Amino Trasnferase (ALT), Aspartato Amino
Transferase (AST) e Gama Glutamil Transferase (γGT) no intuito de se verificar a
instalação do estresse oxidativo hepático induzido pelo Acetaminofen (APAP),
800mg/kg, intragástrico.
Na análise dos resultados foi utilizada a ferramenta estatística de Contrastes
Ortogonais (Figura 11), onde a ortogonalidade indica que a variação de um contraste
é inteiramente independente da variação de outro qualquer que lhe seja ortogonal.
(GARCIA; GOMES, 2002). Assim pode-se detectar as diferenças significativas com
maior eficiência em experimentos que possuem mais de 4 tratamentos. Cada
contraste possui um grau de liberdade, o que assegura assim ao teste maior
confiabilidade.
1
CTL /N
2
CTL –
J/APAP
3
AAJ/APAP
4
Q-J/APAP
5
P150J/APAP
6
P300J/APAP
7
P600J/APAP
1
2
3
4
5
6
Figura 11 - Tabela de contrastes ortogonais realizados para o modelo experimental apresentado,
onde, cada cor representa as variáveis que foram contrastadas totalizando 6 contrastes possíveis
com os sete tratamentos
De acordo com os dados mostrados na Tabela 4, observa-se que não houve
diferença entre os tratamentos para a enzima γGT, o que leva a crer que não foi
gerada uma lesão hepática importante pelo indutor de estresse (APAP), já que essa
enzima se apresenta alterada em processos de injúria hepática severa, por ter
especificidade com este órgão.
Tabela 4 - Valores das enzimas de função hepática Alanina amino transferase (ALT), Aspartato amino
Transferase (AST) e Gama Glutamil Transferase (γGT). Valores das médias de cada tratamento +/- o
erro padrão. Para letras iguais, valores sem diferença significativa; para letras diferentes, valores com
diferença significativa com nível de p individual para cada contraste
Tratamentos
γGT (U/L)
ALT (U/L)
AST (U/L)
CTL -N
3,37±0,30a
38,5±1,75a
69,7±3,07a
CTL-J/APAP
2,85±0,27a
33,7±1,64b
78,8±3,72b
AA-J/APAP
3,28±0,31a
32,3±1,57a
84,4±3,98a
Q-J/APAP
3,42±0,33a
29,3±1,42a
88,1±4,16a
P150-J/APAP
2,80±0,32a
29,0±1,66a
78,0±4,35a
P300-J/APAP
3,16±0,33a
31,8±1,67a
70,6±3,60a
P600-J/APAP
2,85±0,27a
42,4±2,06b
88,4±4,17b
CTL-N (Controle normal) os animais foram somente manipulados, mas não receberam nenhum tratamento e nem APAP; CTLJ/APAP (Controle estressado) os animais foram submetidos a jejum e receberam o indutor de estresse (APAP); AA-J/APAP
(Ácido Ascórbico) os animais foram tratados com ácido ascórbico na dose de 600mg/kg e submetidos a jejum e APAP; QJ/APAP (Quercetina) os animais foram tratados com quercetina na dose de 20mg/kg e submetidos a jejum e APAP; P150J/APAP (Própolis 150) os animais foram tratados com própolis na dose de 150mg/kg e submetidos a jejum e APAP; P300J/APAP (Própolis 300) os animais foram tratados com própolis na dose de 300mg/kg e submetidos a jejum e APAP; P600J/APAP (Própolis 600) os animais tratados com própolis na dose de 600mg/kg e submetidos a jejum e APAP.
Chaves e colchetes se referem aos contrates, conforme descritos na figura 11.
Com relação à enzima ALT, com importante especificidade para fígado, houve
diferença entre os dois grupos controles, normal e estressado, podendo então
verificar que houve uma alteração na função hepática dos animais estressados com
APAP (Tabela 4 e Figura 12 B). Observa-se também que a própolis na dose de
150mg/kg apresentou efeito estatisticamente diferente das demais doses (300 e 600
mg/kg) e um comportamento de proteção em relação aos animais estressados. A
dose de 150 mg/kg ainda se igualou ao antioxidante quercetina utilizado como
controle positivo e que sabidamente é considerado um potente antioxidante de
origem natural (Tabela 4 e Figura 12 A). Merece ainda destacar que os antioxidantes
utilizados como controle positivo (quercetina e ácido ascórbico) não apresentam
diferença estatística (Tabela 4 e Figura 12A). Ainda para a enzima ALT, merece
destacar que todos os antioxidantes utilizados, com exceção da própolis 600mg/kg,
apresentaram um efeito positivo na redução da ALT. Portanto, fica evidente que a
própolis em concentrações superiores a 300 mg/kg tendem a ter um comportamento
pro-oxidante, deixando assim de ser benéfica neste aspecto e passando então a
modificar a função hepática. Apesar do controle estressado ter apresentado uma
pequena redução nos níveis da ALT, proporcionado pela ativação do sistema
antioxidante endógeno, o efeito foi sinérgico quando um antioxidante esteve
presente (Figura 12 A e B).
)
1
CTL /N
2
CTL –
J/APAP
3
AAJ/APAP
4
5
P150Q-J/APAP J/APAP
6
P300J/APAP
7
P600J/APAP
1
2
3
4
5
6
!
"# $
%& '
%& '
%( '
%( '
Figura 12: A- Atividade da enzima ALT (U/L) e respectivos de desvios padrão; B- Tabela de
contrastes ortogonais com valores de p.
Para a enzima AST, por ser uma enzima que está também presente em
outros órgãos (músculo e coração, por exemplo), demonstra lesão desses órgãos
além do fígado. Porém, novamente há diferença entre os controles normal e
estressado (p=0,06) (Figura 13B), além de uma evidente ação pro-oxidante da
própolis 600mg/kg em relação às outras doses, mostrado por uma tendência ao
aumento desta enzima em relação aos grupos controles, tanto normal como
estressado (Figura 12A). Além disto, o efeito da dose 300 mg/kg foi estatisticamente
diferente da dose 600 mg/kg, a nível de p<0,01 (Figura 12B).
)
1
CTL /N
2
CTL –
J/APAP
3
AAJ/APAP
4
5
P150Q-J/APAP J/APAP
6
P300J/APAP
7
P600J/APAP
1
2
3
4
5
6
!
#$
%& '
%& '
%( '
Figura 13 - A- Atividade da enzima ALT (U/L) e respectivos desvios padrão; B- Tabela de contrastes
ortogonais com valores de p.
Lee et al. (2011), quando induziram estresse hepático com APAP na dose de
200mg/kg por via intraperitoneal em camundongos, obtiveram efeitos mais
pronunciados aos apresentados nesse trabalho, pois foi encontrado um aumento
significativo das enzimas ALT e AST nos animais induzidos com APAP em
comparação aos animais sem indução. Isso pode ser explicado pela via de
administração utilizada, pois a via intragástrica torna o processo de absorção mais
lento. Já na via intraperitoneal o APAP é absorvido quase que imediatamente após a
aplicação, pelo fato do peritônio se tratar de um local altamente vascularizado.
Manimaran et al. (2010), utilizaram APAP na dose de 420mg/kg e 1000mg/kg em
ratos machos, por via intragástrica e obtiveram diferença significativa em relação aos
grupos controle sem APAP para as duas doses, porém foi utilizado como veículo,
carboximetilcelulose sal de Sódio, diferentemente do trabalho aqui apresentado,
onde foi utilizado Propilenoglicol P.A. como veículo, tanto para APAP quanto para os
tratamentos com os antioxidantes.
Nirala e Bhadauria (2008) também obtiveram diferentes resultados ao utilizar
própolis para reverter danos hepáticos causados por APAP. Foi utilizada própolis
nas doses de 100mg/kg e 200mg/kg, também por via oral após 24h da
administração do APAP na dose de 2g/kg em uma única vez (gavagem). Foram
observadas diferenças significativas para as enzimas ALT e AST, entre o grupo
controle e o grupo induzido por APAP, porém somente na dose de 200mg/kg a
própolis reverteu os valores dessas enzimas significativamente. Há que se
considerar que foi utilizado outro tipo de própolis naquele estudo e usado o extrato
aquoso da própolis e água quente como veículo para o APAP. No presente trabalho
foi utilizado o extrato etanólico da própolis, pelo fato do etanol extrair com alta
eficiência os compostos com propriedades antioxidantes da própolis vermelha bruta
(EEP). Porém, após evaporação o EEP foi ressolubilizado no veículo propilenoglicol,
tanto para as doses de própolis como para o APAP. Este procedimento foi realizado
devido ao fato de ser encontrada dificuldade de solubilização, tanto da própolis
quanto do APAP em solventes aquosos, o que seria adequado para a administração
aos animais
Por tudo isso, foi necessário escolher um veículo que pudesse manter solúvel
todos os compostos da própolis e ainda assegurar a solubilização de toda a dose do
APAP administrada aos animais, sendo eleito o propilenoglicol. O propilenoglicol
(1,2 propanediol) possui característica de fluido viscoso, incolor, higroscópico e
inodoro, e comumente utilizado em várias aplicações: 1) veiculo em medicamentos
diversos; 2) solvente e emulsificante e 3) precursor químico de outras substâncias
(WARSHAW et al., 2009) e ainda é considerada uma substância de baixa a média
irritabilidade, sendo que em algumas concentrações, tem ação queratolítica e
antimicrobiana (LESSMANN et al., 2005)
4.2.2. Atividade antioxidante X Estresse Oxidativo Induzido por APAP
4.2.2.1. Capacidade de Absorbância de Radicais de Oxigênio (ORAC)
Para avaliar a capacidade antioxidante do plasma e extrato do fígado, dos
animais tratados e não tratados com os antioxidantes acido ascórbico, quercetina e
as 3 doses de Própolis (150, 300 e 600mg/kg), foi realizada a análise de ORAC.
Essa análise foi feita com o intuito de se observar uma possível diferença no
potencial antioxidante endógeno, tanto no órgão alvo quanto na circulação
sanguínea.
Foi observado então, como mostrado na Figura 14 B, que há uma diferença
significativa entre o grupo dos animais controle normal em relação aos animais do
grupo controle estressado, sugerindo que o indutor de estresse causou a
mobilização do sistema antioxidante endógeno, e isso fez aumentar a capacidade de
sequestro de radicais nos animais estressados, tanto no plasma como no fígado.
Para o ORAC no plasma, foi possível observar que há diminuição da atividade
antioxidante nos animais estressados e tratados com os antioxidantes em relação
aos animais somente estressados (Figura 14 A e B). Isto demonstra que apesar de
terem sido submetidos ao mesmo estresse, não foi necessário a mesma mobilização
do sistema antioxidante endógeno que o grupo controle estressado com APAP, pois
os antioxidantes atuaram inibindo os radicais gerados pelo estresse. É possível
ainda observar que, entre as doses de própolis, a de 150mg/kg teve uma tendência
a preservar mais o sistema antioxidante dos animais, de forma semelhante ao ácido
ascórbico e a quercetina, que sabidamente são potentes antioxidantes de produtos
naturais (Figura 14 A e B). Essa observação pode novamente sugerir que doses
muito altas de própolis podem se tornar pró-oxidantes.
)
1
2
CTL –
J/APAP
CTL /N
3
AAJ/APAP
4
5
P150Q-J/APAP J/APAP
6
P300J/APAP
7
P600J/APAP
1
2
3
4
5
6
Contrastes
ORAC
Plas
1
2
3
4
5
6
p<0,01
p=0,06
ns
ns
ns
ns
Figura 14 - A- Valores médios de ORAC do plasma em equivalente de trolox e respectivos desvios
padrão; B- Tabela de contrastes ortogonais com valores de p
Leite et al. (2011) utilizaram porcentagens diferentes de casca de jabuticaba
em pó (0%,1%, 2% e 4%), introduzidos na alimentação comercial para ratos Wistar
machos, e constataram que a atividade antioxidante máxima no plasma pela análise
de ORAC foi encontrada no grupo de animais que receberam a concentração de 2%
de jabuticaba e que o grupo dos animais que receberam 4%, não apresentou
qualquer efeito antioxidante, quando comparado ao grupo controle. Assim,
concluíram que os compostos fenólicos podem inibir o processo de oxidação em
determinados sistemas, mas a dosagem pode ter limites superiores e inferiores e
que alguns compostos antioxidantes podem apresentar uma atividade pró-oxidante
sob algumas condições e concentrações.
Em relação às análises de ORAC para o fígado, foi possível observar que o
APAP gerou um estresse pelo aumento da atividade antioxidante dos animais
somente estressados em comparação com os animais controle normal (Figura 15 A
e B). Houve novamente, assim com no plasma, uma mobilização do sistema
antioxidante endógeno dos animais induzido pelo estresse causado pelo APAP.
Porém desta vez a quercetina teve uma tendência a apresentar atividade
antioxidante semelhante aos animais do grupo controle estressado (Figura 15 A), o
qual estatisticamente difere do grupo controle normal, sugerindo assim pouca ou
nenhuma proteção desse antioxidante para este órgão na dose utilizada. Com
relação às doses de própolis, a de 150mg/kg continuou apresentar uma tendência
de ser mais protetora em relação as doses mais altas quando comparada ao grupo
controle estressado. Também o efeito do controle positivo (ácido ascórbico) não
diferiu significativamente das doses própolis (Figura 15 A e B).
)
1
2
CTL –
J/APAP
CTL /N
3
AAJ/APAP
4
5
P150Q-J/APAP J/APAP
6
P300J/APAP
7
P600J/APAP
1
2
3
4
5
6
Contrastes
1
2
3
4
5
6
ORAC Fíg
p<0,01
ns
ns
ns
ns
ns
Figura 15 - A- Média dos valores de ORAC do extrato de fígado em equivalente de trolox e desvio
padrão; B- Tabela de contrastes ortogonais com valores de p
Behling et al. (2004) verificaram que a quercetina administrada por via
intragástrica tem potencial hepatoprotetor em injúria por isquemia-reperfusão e
antifibrinogênico.
Miltersteiner
et
al.
(2003)
também
relataram
a
ação
hepatoprotetora da quercetina intraperitoneal em ratos cirróticos. Diferentemente do
trabalho aqui apresentado, esses estudos demonstram a ação benéfica da
quercetina no fígado, porém aqueles autores não verificaram outras injúrias mais
graves e/ou lesões importantes. O estresse induzido no presente trabalho pela dose
de APAP de 600mg/kg, por via intragástrica, produziu um estresse oxidativo, porém
não uma lesão hepática de grande ordem.
4.2.2.2. Sequestro do radical Superóxido pela enzima Superóxido Dismutase
As análises de sequestro de radical Superóxido pela enzima Superóxido
Dismutase (SOD) foram também realizadas no extrato do fígado e plasma. Os
resultados para o extrato de fígado, não apresentaram diferenças significativas para
nenhum dos tratamentos, controles com ou sem estresse, o que pode sugerir que o
estresse moderado gerado não foi suficiente para que houvesse uma indução da
ação antioxidante por parte desta enzima. Porém, os antioxidantes utilizados, podem
ter estimulado a liberação da enzima SOD. Esse fato pode ser observado nos
resultados da análise no plasma dos animais, onde os animais tratados com os
antioxidantes apresentaram uma porcentagem de inibição de redução de NBT maior
do que os não tratados, apresentando este contraste diferença significativa do ponto
de vista estatístico (Figura 16 B).
Para esta análise, ao contrário das análises de ORAC, a maior dose de
própolis (600mg/kg) mostrou uma tendência positiva em relação a dose 300 mg/kg,
apesar de não apresentar nenhuma diferença significativa. Pode-se verificar ainda
que a dose de 150 mg/kg foi a que apresentou o comportamento na atividade da
SOD mais próximo dos controles positivos (ácido ascórbico e quercetina) (Figura 16
A e B).
)
1
2
CTL –
J/APAP
CTL /N
3
AAJ/APAP
4
5
P150Q-J/APAP J/APAP
6
P300J/APAP
7
P600J/APAP
1
2
3
4
5
6
Contrastes
SOD
Plasma
1
2
3
4
5
6
ns
p<0,01
ns
ns
ns
ns
Figura 16 - A- Valores médios de SOD em plasma, expresso como porcentagem de inibição de NBT e
desvios padrão; B- Tabela de contrastes ortogonais com valores de p
Kanbul, Eraslan e Silici, (2009) ao avaliarem o efeito da propolis na reversão
dos danos causados pelo pesticida propetamphos em ratas Wistar, por meio da
expressão da atividade da enzima SOD no plasma dos animais, também obtiveram
resultado semelhante ao encontrado nesse trabalho. Observaram o aumento da
atividade dessa enzima nos grupos que receberam o pesticida juntamente com a
dose de própolis, diferindo significativamente do grupo que recebeu somente o
pesticida.
Hosmuter et al. (2004) verificaram que o consumo da SOD ativada no plasma
de ratos submetidos á queimadura de pele aumenta pela necessidade de sua
utilização, na forma ativa, para regenerar a injúria tecidual. Porém, os autores
também verificaram que animais submetidos à injúria térmica e tratados
intraperitonealmente com CAPE, um composto antioxidante da própolis temperada,
fez com que houvesse uma diminuição do consumo dessa enzima, já que o próprio
CAPE pode atuar na regeneração do tecido atingido.
4.2.3 Atividade antioxidante on-line do plasma por HPLC
O plasma dos animais dos grupos controle normal, controle estressado e
tratados com própolis foram submetidos à análise da atividade antioxidante on-line
por HPLC, no intuito de se verificar se o estresse aliado ao tratamento com os
antioxidantes, apresenta alguma alteração nos compostos do plasma em relação à
atividade antioxidante. Foi possível observar que alguns compostos que aparecem
no início do cromatograma foram inerentes a todos os animais, tais como o pico
1, 2 e 3, como mostrado na Figura 17. Isso provavelmente se deve ao fato de que
existem compostos com atividade antioxidante circulante no plasma mesmo em
condições de homeostase. Em relação ao pico 4, não foi possível detectá-lo nos
animais do grupo controle normal, o que sugere que pode estar relacionado com a
defesa antioxidante endógena do animal que foi mobilizada pelo estresse, fato que
corrobora com os resultados das análises de ORAC no plasma. Os picos 5, 6 e 7
somente foram detectados nos animais estressados com APAP e tratados com as
doses de própolis 300mg/kg e 600mg/kg. Essas substâncias podem significar os
compostos fenólicos ou derivados da própolis vermelha que conseguiram ser
absorvidos pela microvilosidades intestinais.
)
3: 280 nm, 8 nm
CTL sem jejum R5 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (19-07-12)
CTL sem jejum R5 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + ág ua ac (19-07-12)
3: 280 nm, 8 nm
CTL com jejum R6 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + ág ua ac (13-07-12)
CTL com jejum R6 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + ág ua ac (13-07-12)
40
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150
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Detector A (517nm)
CTL com jejum R6 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (13-07-12)
CTL com jejum R6 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (13-07-12)
0.04
0.04
Detector A (517nm)
CTL sem jejum R5 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (19-07-12)
CTL sem jejum R5 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + ág ua ac (19-07-12)
0.00
-0.02
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Minutes
0.02
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mAU
Detector A (517nm)
P300 R4 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (12-07-12)
P300 R4 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (12-07-12)
10
Detector A (517nm)
P 600 R5 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (17-07-12)
P 600 R5 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (17-07-12)
0.04
0.04
mAU
3: 280 nm, 8 nm
P 600 R5 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (17-07-12)
P 600 R5 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (17-07-12)
80
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Volts
40
3: 280 nm, 8 nm
P300 R4 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (12-07-12)
P300 R4 - 30uL - DPPH 0,45M acetonitrila + água ac (12-07-12)
80
-0.06
0
10
20
30
Minutes
40
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60
Figura 17 - Cromatogramas obtidos pela metodologia de atividade antioxidante on-line do plasma dos
animais: A- Plasma de animal CTL-N; B- Plasma de animal CTL-J/APAP; C- Plasma de animal P300J/APAP e D- Plasma de animal P600-J/APAP
4.2.3. Análises qualitativas
4.2.3.1. Western Blot
As imagens apresentadas na Figura 18 demonstram a presença das enzimas
Superoxido Dismutase e Catalase sem nenhum sinal de degradação. Por se tratar
de uma análise qualitativa, não é possível observar diferença na expressão das
enzimas entre os tratamentos, somente a detecção e a identificação das enzimas,
pois suas bandas se localizaram na altura compatível de seus pesos moleculares,
comparados com o marcador molecular, e também pela utilização de anticorpos
específicos que se ligam somente a essas enzimas.
$
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)
Figura 18 - A: Western Blot da enzima Superóxido Dismutase I. Cada membrana possui 1 animal de
cada tratamento. Detecção da enzima sem sinais visíveis de degradação. B: Western Blot da enzima
Catalase. Cada membrana possui 1 animal de cada tratamento. As falhas visíveis não são resultado
de degradação. Foram utilizadas amostras dos mesmos animais para ambos os filmes. 1-CTL/N; 2CTL-J/APAP; 3-AA-J/APAP; 4-Q-J/APAP; 5-P150-J/APAP; 6-P300-J/APAP; 7-P600-J/APAP; PPadrão de SOD 800ng/ml
4.2.3.2 Histopatologia hepática
Para todos os tratamentos, excluindo o grupo Controle Normal (CTL/N),
ocorreu o seguinte: presença de fragmentos de parênquima hepático com
arquitetura lobular preservada. Tríade portal presente e sem alterações dignas de
nota. Os hepatócitos se distribuem em trabéculas radiadas e, em áreas, algumas
destas células mostram-se com núcleos picnóticos e citoplasmas eosinofílicos
(corpúsculos de Councilman).
Para os grupos, controle com jejum e APAP (CTL-J/APAP) e própolis
600mg/kg (P600/APAP) aconteceu o mesmo que descrito acima, porém com uma
informação a mais: na zona 3 acinar (peri-venular), foi observado hepatócitos
balonizados (aumento do volume celular com citoplasma claro), para todos os
animais avaliados. Também não foi observado depósitos no material examinado e
não foi encontrado a dilatação e congestão dos sinusóides como foi encontrado em
todos os outros grupos. Isso remete ao fato dessa dilatação e congestão serem
consequência do estresse induzido por APAP (Figura 19 A, B, C, D e E). As
alterações encontradas nos grupos CTL-J/APAP e P600/APAP (Figura 17B e E),
sugerem que as doses mais baixas protegeram melhor o órgão da lesão causada
pelo APAP em relação a dose de 600mg/kg, fato que também corrobora com outras
análises realizadas nesse estudo.
Figura 19 - Imagens de lâminas de histopatologia hepática, corada pelo processo Hematoxilina e
Eosina. CTL/N (a); CTL-J/APAP (b); P150-J/APAP (c); P300-J/APAP (d); P600-J/APAP (e)
5. CONCLUSÕES
Diante dos resultados obtidos, foi possível concluir:
A própolis utilizada nesse trabalho apresentou uma grande diversidade de
flavonoides, isoflavonoides e pterocarpanos, típicos da própolis vermelha
brasileira. Além disto, foram encontradas altas concentrações das substâncias
voláteis
-cubebeno e germacreno D, as quais não são as substâncias
majoritárias na própolis vermelha de outras regiões do Nordeste do Brasil.
O indutor de estresse oxidativo hepático Acetaminofen (APAP), na dose de
800mg/kg em administração oral, não gerou um estresse oxidativo intenso.
Porém houve alteração hepática importante, mas não o suficiente que
pudesse detectar diferenças significativas em algumas variáveis de resposta
ao estresse oxidante.
Pode-se concluir também que a via de administração da droga e a espécie de
animal utilizado contribuem para que o estresse excessivo seja gerado.
Dentre as análises realizadas, a análise de ORAC foi eficiente e adequada
parta a avaliação da atividade antioxidante, tanto em amostras biológicas
(plasma e fígado) quanto no próprio EEP.
Em relação às doses de própolis utilizadas, foi possível concluir que a
concentração para uso como antioxidante contra o estresse oxidativo é de
150 a 300mg/kg. Acima desse limite, a própolis deixa de ser antioxidante e
passa a ter uma ação de menor proteção.
As doses mais baixas, de acordo com as análises histopatológicas,
protegeram melhor o fígado da lesão causada pelo APAP em relação à dose
de 600mg/kg.
A própolis vermelha brasileira possui alto potencial antioxidante in vitro, e
também potencial benéfico in vivo.
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