PRÊMIO MERCOSUL DE CIÊNCIA E TECNOLOGIA
Obtenção de biodiesel
através da transesterificação enzimática:
energia alternativa para auto-desenvolvimento
Projeto de pesquisa a ser desenvolvido
Laboratório de Energia (LEN)
Departamento de Engenharia Química (DEQ)
Escola Politécnica (EP)
Universidade Federal da Bahia (UFBA)
Brasil
Apresentação: Dra. Celina Luízar Obregón.
outubro de 2004
1
Resumo
No presente projeto propõe-se um processo de transesterificação do
óleo de dendê, Elaeis guineensis, bruto e in natura, com etanol, mediante
microorganismos produtores de lipase. Serão definidas as condições para os
melhores rendimentos da catálise, assim como também a qualidade dos
produtos obtidos em cada reação, em nível de bancada.
Para a determinação da composição do produto da catálise, a técnica
analítica será a cromatografia gasosa acoplada com espectrometria de
massas. Os espectros serão obtidos durante o monitoramento do processo de
transesterificação microbiana e os cromatogramas decorrentes serão objeto de
uma
análise
multivariada,
comparando
com
aqueles
obtidos
na
transesterificação com enzima comercial, usada como controle, permitindo a
avaliação da qualidade do processo proposto.
2
Conteúdo
I. Introdução .........................................................
4
1.1.- Transesterificação enzimática ...........................................
5
1.2.- O óleo de dendê ..............................................................
6
1.3.- Metodologias analíticas ....................................................
8
II. Justificativa ........................................................................
11
III. Objetivos ...........................................................................
13
IV. Materiais e Métodos ...........................................................
13
V. Resultados Esperados ..........................................................
17
VI. Cronograma .......................................................................
17
VII. Bibliografia .......................................................................
18
3
Obtenção de biodiesel
através da transesterificação enzimática:
energia alternativa para auto-desenvolvimento
I. Introdução
Os produtos da conversão de óleos vegetais em ésteres metílicos ou
etílicos de ácidos graxos, são comumente chamados de biodiesel, porque suas
propriedades combustíveis são comparáveis às do combustível diesel No. 2. [1]
Diversos estudos demonstraram que a obtenção destes ésteres a partir
de óleo de colza (canola), girassol, soja e palma (dendê) é ecologicamente
recomendável, sobre tudo porque apresenta menor combustão incompleta do
que os hidrocarbonetos, e menor emissão de monóxido de carbono, materiais
particulados, óxidos de enxofre, óxidos de nitrogênio e fuligem. Por outro lado,
ele pode ser produzido domesticamente, diminuindo assim os prejuízos sócioeconômicos da importação do petróleo. Ele é biodegradável e, se comparado
com o combustível diesel, sua armazenagem e transporte apresentam menos
riscos. Também é uma vantagem muito relevante o fato da sua produção ser
feita a partir de fontes renováveis.[2-8] O biodiesel tem sido produzido a partir
de uma variedade de fontes, incluindo óleos vegetais crus e refinados, resíduos
da extração de óleos vegetais, óleos usados em cozinha e gorduras animais.[1]
A metodologia comercial de obtenção utiliza freqüentemente meios
alcalinos para a transeterificação do óleo ou gordura, na presença de um
álcool, produzindo ésteres metílicos de ácidos graxos e glicerol.
[9]
Entretanto,
esta metodologia apresenta alguns inconvenientes, como a dificuldade na
recuperação do glicerol, o uso de catalisador alcalino que permanece no meio,
4
o tratamento posterior dos efluentes alcalinos, a natureza fortemente
energética do processo, a interferência dos ácidos graxos livres e a presença
de água na reação.[2,10]
Recentemente, foi observado que, a catálise enzimática sintetiza
especificamente ésteres alquílicos, permite a recuperação simples do glicerol, a
transesterificação de glicerídeos com alto conteúdo de ácidos graxos, a
transesterificação total dos ácidos graxos livres, e o uso de condições brandas
no processo, com rendimentos de no mínimo 90%, tornando-se uma alternativa
comercialmente muito mais rentável.[2,9,11-18]
1.1 Transesterificação enzimática
As lipases (glicerol éster hidrolase EC 3.1.1.3) são as enzimas que
catalisam a hidrólise de acilgliceróis em ácidos graxos, diacil gliceróis, monoacil
gliceróis e glicerol (transesterificação ou alcoólise).[19] Estas enzimas são
produzidas intra- e extracelularmente em diversos microrganismos, por
exemplo, nos fungos Candida rugosa, Candida antarctica, Thermomyces
lanuginosus, Rhizomucor miehei e nas bactérias Bukholdeira cepacia,
Pseudomonas
alcaligenes,
Pseudomonas
mendocina,
Chromobacterium
viscosum.
As inúmeras pesquisas ao seu respeito direcionam-se principalmente às
suas aplicações práticas na indústria, na hidrólise de gorduras, à produção de
ácidos graxos, aditivos alimentares, síntese de ésteres e peptídeos, definição
de misturas racêmicas, detergentes, entre outros. Na literatura há interessantes
revisões,
[4,7,8,13,17-20]
que incluem a sua produção, purificação, separação e
caracterização.
5
A maior parte das pesquisas sobre a transesterificação de óleos
vegetais, para a obtenção de biodiesel, utilizam a enzima comercial pura, em
diversos meios reacionais (solventes[1], presença de aditivos,[21] soluções
polares-íons,[22,23] fluídos supercríticos[24] ou fazendo uso da imobilização
enzimática em suportes (celite e polímeros principalmente)[10,25,19,26,27] Também
há estudos sobre novos aceitores do grupo acila, na presença de lipase de
Candida antarctica imobilizada,[28] e inibição da lipase pelo glicerol. [29]
Shiamada e col. (2002)[30] apresentaram uma revisão apontando para a
dificuldade de reuso de enzimas na transesterificação e expuseram que o
metanol insolúvel é o agente que inativa irreversivelmente a lipase, ainda que
imobilizada. Avaliaram um sistema de metanólise com lipase de Candida
antarctica imobilizada, e óleos residuais em bateladas de duas etapas, com
variação das proporções de enzima e metanol, obtendo rendimentos maiores
ao 90% de biodiesel.
Watanabe e col. (2001)[31] utilizaram óleo residual e lipase de Candida
antarctica imobilizada numa coluna junto a proporções variadas de metanol,
observando que a atividade da enzima permanece durante 100 dias de reação
sem diminuir sua atividade.
Entretanto, há poucos estudos que procurem a diminuição dos custos de
enzimas puras e sobre as aplicações diretas de microorganismos em reações
de transesterificação.[32-34]
1.2. O óleo de dendê
No Sudeste da Ásia, na Malásia, a indústria opera com produção
excedente de óleo de palma (dendê) e tem-se tornado um dos quatro maiores
mercados de óleo vegetal no mundo. O custo baixo do óleo tem motivado
6
diversos estudos, sobre tudo no “Palm Oil Research Institue of Malásia” e no
“National Automobile Industry of Malásia”, para seu uso como biocombustível.
Na atualidade a tecnologia está muito adiantada, embora os estudos
publicados a esse respeito são poucos.
Assim, Kalam e Masjuki[35] compararam os requerimentos do biodiesel
de óleo palma (BOP) para motores diesel, obtendo em automóveis de 1.8
cilindradas um consumo médio de BOP de 12 km/L, comparado com 13 km/L
de diesel de petróleo (com um número de cetanos na faixa de 50-52), sendo
que, ainda, a velocidades maiores que 80 km/h o BOP apresentou maior
economia que o combustível convencional.[1,35]
No Brasil, mais especificamente na Região Norte e Nordeste, existe uma
ampla produção de óleo de palma em baixo custo, em localidades carentes de
fontes de energia, o que estimula a realização de pesquisas nesta área,
visando a diminuição dos custos de produção do biodiesel de óleo de palma
(BOP) e procurando benefícios ambientais, energéticos e econômicos.
Pelo dito, a alternativa interessante de utilização de catálise enzimática
para a produção de BOP, utilizando cepas superprodutoras que atuem
diretamente no óleo de palma, surge com uma idéia muito promissora.
Há alguns estudos para o uso direto de células inteiras (biocatalíticas) de
microorganismos.[4] Segundo esta metodologia, as células podem ser
imobilizadas em semelhança aos suportes catalíticos em fase-sólida usados
tradicionalmente em reações de química orgânica. Há diversas formas de
imobilização, entre elas as técnicas usando partículas de suporte de biomassa
(biomass support particles BSPs) que têm várias vantagens:
7
i.- fácil aplicação industrial,
ii.- não têm a necessidade de reprodução celular
iii.- não é necessária a assepsia das partículas,
iv.- grão proporção de transferência de massa de substrato e produção,
v.- as partículas são reutilizáveis,
vi.- as partículas suportam agitação mecânica,
vii.- simplicidade no escalonamento do biorreator,
viii.- baixos custos quando comparados com outros métodos.[4]
Bana e col. (2002)[36] encontraram as condições adequadas para o uso
de células de Rhizopus oryzae, imobilizadas dentro de partículas de suporte de
biomassa (BSPs), como catalizador de células intactas para a produção de
biodiesel. Avaliando os efeitos da presença de 0,1% do glutaraldeído (GA) na
estabilidade da atividade lipásica, encontraram que, a ausência de GA leva à
diminuição da atividade em cada ciclo dos testes contínuos realizados e
formação do éster metílico em 50% no sexto ciclo.
1.3 Metodologias Analíticas
Outro aspecto é o relacionado com a necessidade de estudar os
produtos formados durante e após a transesterificação. Assim, Yunus e col.
(2002)
óleo
[37]
de
conseguiram identificar a composição do produto de esterificação de
palma,
através
de
CG
após
a
derivatização
com
N,
o-
bis(trimetilsilil)trifluoroacetamida em acetato de etila, conseguindo a separação
dos mono-ésteres metílicos, diésteres e triésteres. Também Brondz (2002)[5]
publicou uma revisão ao respeito da análise de ácidos graxos em
microorganismos, usando técnicas cromatográficas de HPLC e CG, com
inovações que evitem os pré-processamentos necessários para a análise.
8
Furukawa e col. (2002) monitoraram a transesterificação on-line, do vinilacetato
ao vinilalcool usando uma sonda de fibra óptica e espectroscopia NIR, desde a
adição do octanol e do catalisador (metóxido de sódio) até a formação do
produto.[38].
Uosukainen e col (1999)[39] realizaram um estudo estatístico combinado
com análise de componentes principais para avaliar a interdependência das
variáveis do processo enzimático de transesterificação. Os autores estudaram
a alcoólise com óleo de colza e trimetilolpropano, encontrando que, alguns dos
fatores que afetam a reação são a atividade de água e a eliminação do metanol
produzido durante a reação. Os ésteres mono- di- e tri-substituidos foram
produzidos em ótimas condições.[39]
Ainda em 1994 Keller e col.[40] demonstraram que é possível usar a
análise de Reconhecimento de Origem (Pattern Recognition - PR) para
monitorar processos de fermentação, com o objetivo de distinguir fermentações
microbiais normais das anormais, quando comparados com um sistema
modelo. Os dados foram coletados usando HPLC e os cromatogramas
comparados usando análise de clusters (HCA) e componentes principais
(PCA).
Os dados químicos, biológicos, individuais ou relacionados podem ser
analisados matematicamente através da Quimiometria. A complexidade real
dos dados não permite que avaliações univariadas forneçam toda a informação
possível, que neles existe. A quimiometria pode ser utilizada especificamente
quando são realizadas múltiplas medições num conjunto amplo de amostras.
Os algoritmos multivariados mais importantes em Quimiometria são: Análise
de Componentes Principais – PCA, Análise de Agrupamentos Hierárquicos –
9
HCA, Regressão Multivariada (PLS, PCR e CLS), Reconhecimento de Origem
– PR e Classificação: KNN e SIMCA.[41]
A análise exploratória de dados (EDA) é freqüentemente usada para
simplificar e entender melhor os conjuntos imensos de dados e para determinar
quantas propriedades fundamentais estão representadas no conjunto de dados
e,
para
entender,
quais
destas
propriedades
são
redundantes.
O
Reconhecimento de Origem (Pattern Recognition, PR) pode ser usado para
identificar a área de cultivo ou origem de uma matéria-prima ou sua qualidade,
ou a produção da fábrica na qual um produto é elaborado. Procedimentos
avançados de PR podem ser usados para detectar a adulteração, segurança
da qualidade ou controle de qualidade.[42] Os modelos empíricos têm muitas
aplicações, incluindo o desenvolvimento de métodos analíticos, diferenciação
de relações entre composição de produtos e propriedades sensoriais,
desenvolvimento de conhecimento de relações entre estrutura molecular e
propriedades químicas, e desenvolvimento de algoritmos de controle para
operações unitárias ou processos.[42]
A maior parte dos estudos ao respeito da análise multivariada empírica e
as diversas variáveis que influenciam a qualidade e rendimento de biodiesel
envolveram o uso de catalisadores inorgânicos ou enzimas puras, devido à
facilidade de controle dos parâmetros, como as proporções entre catalisador,
álcool e substrato.
Wu e col.
[43]
também otimizaram a produção de ésteres etílicos de
gordura com etanol (95%) e lipase PS-30 e SP-435, através da metodologia de
resposta de superfície. Segundo o modelo era possível obter 85,4% do éster
etílico, o qual não foi atingido, ainda que o rendimento tivesse aumentado após
10
uma segunda adição da enzima no meio reacional. Chowdary e col. (2000)
[44]
usaram lipase de Rhizomucor miehei imobilizada, para sintetizar o éster isoamil
isovaleriato, com aroma de maçã. E, a seguir, investigaram vários parâmetros
da reação: concentração do substrato, concentração da enzima, proporção
molar do substrato, temperatura, incubação, tipo de solvente. A relação entre
estes parâmetros e os rendimentos obtidos, foi modelada usando análise de
dados multivariada. Shieh (2003)[10] utilizou a metodologia de resposta de
superfície para encontrar as melhores condições para a reação da Lipozina IM77, uma lipase obtida a partir de Rhizomucor miehei imobilizada em resina
catiônica macroporosa, para transesterificar óleo de soja
na presença de
metanol (95%). Após a análise, as melhores condições permitiriam a conversão
de 92% em peso. Estes parâmetros foram tempo reacional 6,3 h, temperatura
36,5º, proporção molar de substrato 3:4:1 e adição de 5,8% de água.
O presente projeto visa aplicar os diversos avanços ao respeito do uso
de microorganismos para reações de transesterificação direta
dendê,
e
avaliar
os
produtos
experimentais
através
no óleo de
das
técnicas
cromatográficas disponíveis e a análise multivariada dos dados obtidos,
permitindo assim identificar as cepas de microorganismos que catalisem nas
melhores condições e baixo custo.
II Justificativa
O Estado da Bahia em particular e as Regiões Nordeste e Norte em
geral possuem uma série de plantas produtoras de óleos vegetais adequadas
para a produção de biodiesel. O óleo de dendê e mamona têm surgido como
uma alternativa para a promoção do desenvolvimento regional, demonstrado
não só, pelos resultados dos grandes investimentos realizados em outros
11
países como do Sudeste da Ásia (especialmente na Malásia) onde a tecnologia
do biodiesel de palma está altamente desenvolvida, mas também pelos poucos
estudos realizados em outros países produtores da palma.
Os estudos realizados no Brasil ao respeito do biodiesel de óleo de
dendê são poucos e constituem uma área muito fértil para sua exploração.
Ainda que o óleo de dendê apresente a desvantagem ambiental de plantação,
por ser produzido unicamente em algumas regiões, e ser uma monocultura
com tempo de produção aproximado de sete anos, é necessário desenvolver
tecnologias descentralizadas para as regiões isoladas, carentes de fontes de
energia, tornado-las em geradoras auto-sustentáveis, sempre que, o óleo de
dendê seja a matéria-prima mais disponível. Por isso, o presente projeto visa
um caminho para diminuir os custos da produção de biodiesel a partir de óleo
de dendê e evitar a formação de rejeitos alcalinos. Não está totalmente fora do
escopo do presente projeto a utilização de outras oleaginosas (mamona,
cupuaçu, amendoim, algodão, girassol, cacau, babaçu, pupunha, açaí, entre
outras possíveis), mas o dendê estará no foco principal desta fase da pesquisa.
Sabe-se que, o processo inorgânico convencional da produção de
biodiesel está melhor desenvolvido, mas há outras alternativas plausíveis como
o da catálise enzimática. As vantagens desta última são a inexistência de
rejeito aquoso alcalino, menor produção de outros contaminantes, maior
seletividade e bons rendimentos, que motivam a realização de pesquisas que
visem diminuir a principal desvantagem da metodologia: alto custo das enzimas
puras.
O desenvolvimento atual das técnicas cromatográficas permite a análise
dos produtos formados durante as reações de transesterificação. Tanto a
12
cromatografia gasosa (CG) quanto a cromatografia líquida de alta pressão
(HPLC) têm inovadoras adaptações nos seus sistemas de detecção, que
permitem a análise direta das amostras sem derivatizações prévias. Ainda, o
uso da análise multivariada dos cromatogramas permite a avaliação da
qualidade do produto obtido através de sua correlação.
III Objetivos
O
presente
projeto
tem
como
objetivo
geral
contribuir
ao
desenvolvimento da tecnologia da produção enzimática de biodiesel a partir de
óleo de dendê, contribuindo também, à consolidação do núcleo de pesquisa na
área de biotecnologia do Departamento de Engenharia Química da Politécnica
- UFBA.
Os objetivos específicos do projeto são:
ƒ
Utilizar microorganismos para a transesterificação do óleo de dendê.
ƒ
Identificar as variáveis que influenciam na atividade enzimática com
cepas de microorganismos no óleo bruto filtrado.
ƒ
Selecionar cepas superprodutoras de biodiesel através de análise
multivariada dos cromatogramas dos produtos de transesterificação e
das variáveis identificadas.
IV. Materiais e Métodos
Matéria-prima: O óleo de dendê será adquirido de um único produtorfornecedor
a
fim
de
ter
homogeneidade
nas
suas
propriedades
e
características, que serão avaliadas prévio uso.
Cepas de pelo menos dois microorganismos (a ser escolhido(s) entre os
fungos C. Antarctica, C. Rugosa, T. lanuginosus, R. miehei, e entre as
13
bactérias Bukholdeira cepacia, P. alcaligenes, P. medocina, Ch. Viscosum)
serão obtidas a partir de um centro de pesquisas nacional (no UCP da
Universidade Católica de Pernambuco ou no Banco de Cepas da FioCruz no
Rio de Janeiro).
Meios de cultura específicos para o microorganismo selecionado.
Solução buffer e reagentes químicos freqüentes em laboratório de
microbiologia.
Enzima lipase imobilizada.
Agitador de plataforma com banho termostático
Biorreator
Câmara incubadora – estufa para cultura microbiológica
Capela de fluxo laminar
Autoclave
pH-metro
Freezer vertical
Cromatógrafo CG-MS,
Software Eingsith da Infometrix (free).
4.1 Imobilização do microorganismo
A imobilização do microrganismo selecionado será realizada segundo
adaptações da metodologia descrita por Bana e col. (2002),[36] para células
intactas de Rhizopus oryzae onde, o meio com BSPs fora inoculado com
esporas e incubado a 35 ºC por 90 h num agitador a 150 oscilações /min e
amplitude de 70 mm. A imobilização foi realizada com cubos de 6 mm de
14
poliuretano reticulado, cavidade acima de 97% e com tamanho do poro de 50
poros/polegada. As células imobilizadas de Rhizopus oryzae em BSPs foram
separadas, lavadas e secas a 25 ºC por aproximadamente 48 h e usadas como
catalisador na metanólisis, com possibilidade de reaproveitamento.
4.2 Atividade de transesterificação
A atividade de transesterificação será avaliada segundo adaptação dos
procedimentos descritos por Lozano (2003),[23] onde, alíquotas da mistura
reacional, foram colocados em hexano, e a bi-fase é separada, permitindo a
extração de substratos e produtos. Como referência interna, para a análise em
CG, o autor utiliza o acetato de propila. As análises foram realizadas utilizando
um CG Shimadzu GC-17A com detector FID e uma coluna NukolTM (15 m x
0,53 mm, Supelco) e nitrogênio gasoso na fase móvil.
4.3 Transesterificação do óleo
A etapa de transesterificação do óleo de palma também seguirá
adaptações ao trabalho de Bana e col. (2002),[36] onde 9,65 g de óleo de soja,
foram adicionados ao meio reacional contendo 1,5 ml buffer fosfato 0,1 M (pH
6,8), metanol (0,175-0,525 g), e 50 BSPs, e incubados num agitador de
plataforma a 35 ºC por até 72 h.
4.4 Análise dos produtos da transesterificação
As variáveis mais importantes, que influenciam o rendimento, e que já
foram
reconhecidas
em
diversas
pesquisas
são
a
proporção
molar
álcool/óleo/enzima, a temperatura de reação, o tempo reacional.[1,10] Também
serão consideradas a atividade de água, molaridade do buffer, pH, presença de
surfactante [45]
15
A formação de acilgliceróis será monitorada através de CG-MS segundo
a metodologia proposta por Shieh (2003)[10] que utilizou um cromatógrafo CG
Hewlett Packard 6890 (Avondale, PA, USA) equipado com um detector de
ionização de chama e coluna capilar de sílica fundida DB-5 ( 15m x 0,32 mm
i.d., J&W Scientific).
4.5 Análise Multivariada
Os cromatogramas de CG obtidos serão inseridos numa base de dados
Einsigth e “Pirouette”, o último na versão para Windows, da Infometrix. A
seguir, os dados serão submetidos a análise exploratória, calibração
multivariada, e classificação para a extração da informação. A otimização da
Análise de Componentes Principais considerará uma matriz de dados, onde
cada linha (i) corresponda a um cromatograma e cada coluna (k) a uma
variável (análise). Através do algoritmo adequado, o dado xik da matriz, está
representado pela equação:
A
xik = α k + ∑θ ia β ak
a =1
onde αk é a media da variável k, para todos os objetos i. βak são
denominados “loadings”, relacionados com a variável k, e θia são os “scores,”
relacionados com cada objeto i. As novas variáveis são combinações lineares
das originais, ortogonais entre sim, e construídas segundo a diminuição da
ordem de variância que as descreve. Isto é, a PCA agrupará as variáveis
antigas em uma nova variável denominada componente principal (PC).
16
V. Resultados Esperados
A partir do presente projeto, pretende-se obter resultados acadêmicos
que encorajem ao fortalecimento de estruturas que visem a formação e
consolidação de pequenas indústrias produtoras de biodiesel de óleo de dendê
e produtores de matéria-prima exclusiva para a produção de biodiesel, em
regiões onde, o combustível convencional é pouco disponível ou é muito caro,
promovendo também a consolidação do setor agrícola que produz o dendê.
Mais especificamente, será definida uma metodologia para a obtenção
de biodiesel a partir de óleo de dendê e etanol, na presença de
microorganismos, diminuindo os custos da rota que faz uso de enzimas puras.
VI. Cronograma
Quadro 1 – Cronograma de Atividades/Ações Proposto
2005
ATIVIDADE
AÇÕES/Trimestre
Instalação e acondicionamento do laboratório e
pesquisa bibliográfica
1
Imobilização de
microorganismos
Transesterificação do óleo
2 3 4
5 6
X X X
Instalação e fortalecimento Aquisição e acondicionamento de reagentes, meios
de cultura, bioreator e microorganismos
da infraestrutura
Aquisição e instalação de computador e
instrumentos analíticos
2006
2007
7 8 9 10 11 12
X X
X X X X
X
X X
X X X X X X
Ensaios preliminares de imobilização de
microorganismos e padronização da metodologia
X X X
Ensaios prévios de análise dos produtos da reação,
reagentes de referência e padronização da
metodologia analítica
X X X X X X
Ensaios preliminares e padronização da
metodologia de obtenção de biodiesel.
X X X X X X
X
Caracterização do biodiesel
X X X X X X
X
X X X X X X X
X
X X X X X X
X
X X X X X X
X
X X X X X X
X
Monitoração das variáveis
Aquisição e instalação do software e hardware.
X
X
X
Análise de Resultados
Análise Multivariada dos
Resultados
Coleta de dados, pré-processamento multivariado
Análise exploratória dos resultados e
cromatogramas: PCA e HCA
Difusão de resultados
Participação em eventos e intercambio de
experiências
Relatório
X
X
X
X
X
X
X
X
X
17
VIII. Bibliografia
1.
Crabbe, E., Nolasco-Hipolito, C., Kobayashi, G., Sonomoto, K.,
Ishizaki, A., Biodiesel Production From Crude Palm Oil And
Evaluation Of Butanol Extraction And Fuel Properties. Process
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2.
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6.
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Y.,
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7.
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