RENATA PINHEIRO BARRETO
IMPLEMENTAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA A
DETERMINAÇÃO DE HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS
AROMÁTICOS NITRADOS (NHPAs) EM FULIGEM DE DIESEL
Dissertação apresentada ao Curso de
Pós-Graduação em Química da
Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial para a obtenção
do Grau de Mestre. Área de
Concentração: Química Analítica
Orientador
Prof. Dr. Annibal Duarte Pereira Netto
Niterói
Junho de 2006
B 273
Barreto, Renata Pinheiro
Implementação da metodologia analítica para a determinação
de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos nitrados (NHPAs)
em fuligem de diesel/ Renata Pinheiro Barreto. – Niterói: [s. n.],
2006.
112f.
Dissertação – (Mestrado em Química) – Universidade Federal Fluminense, 2006.
1. Hidrocarboneto. 2. Hidrocarboneto policíclico aromático
nitrado. 3. Cromatografia líquida. 4. Química analítica. 5.
Diesel. I. Título.
CDD.: 547.01046
ii
RENATA PINHEIRO BARRETO
IMPLEMENTAÇÃO DE METODOLOGIA ANALÍTICA PARA A
DETERMINAÇÃO DE HIDROCARBONETOS POLICÍCLICOS
AROMÁTICOS NITRADOS (NHPAs) EM FULIGEM DE DIESEL
Dissertação apresentada ao Curso de Pós-Graduação
em Química da Universidade Federal Fluminense,
como requisito parcial para a obtenção do Grau de
Mestre. Área de Concentração: Química Analítica
Aprovada em Junho de 2006
Prof. Dr. Annibal Duarte Pereira Netto - orientador
Universidade Federal Fluminense
Prof. Dr. Ricardo J. Cassela
Universidade Federal Fluminense
Prof. Dr. Thomas Krauss
Fundação Oswaldo Cruz
Dr. Celso Blatt
Agilent Technologies
Niterói
2006
Dedico este trabalho à minha avó,
Heloísa Bello Barreto
(In Memorian)
Pelo Kossen Rufo,
NAM MYOHO RENGUÊ KYO
iv
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS
vii
RESUMO
viii
ABSTRACT
ix
LISTA DE FIGURAS
x
LISTA DE TABELAS
xii
LISTA DE ABREVIATURAS
xiv
CAPÍTULO 1: Introdução
p.16
CAPÍTULO 2: Fundamentação Teórica
p.20
2.1)
HPAs e NHPAs: Aspectos Gerais
p.20
2.2)
Determinação de HPAs e NHPAs
p.26
2.3)
Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência acoplada a espectrometria de massas
(CLAE-EM)
p.31
2.4)
Ionização Química à Pressão Atmosférica (APCI)
p.36
2.5)
Comparação das Interfaces APCI e ESI
p.41
2.6)
Espectrometria de massas acoplada à espectrometria de massas (EM-EM)
p.44
2.7)
Determinação de NHPAs por CLAE-EM-EM
p.46
CAPÍTULO 3: Objetivos
p.50
3.1)
Objetivo Geral
p.50
3.2)
Objetivos Específicos
p.50
CAPÍTULO 4: Materiais & Métodos
p.51
4.1)
p.51
Solventes
v
4.2)
Padrões
p.52
4.3)
Outros Materiais
p.52
4.4)
Instrumentação
p.53
4.5)
Limpeza e descontaminação de vidraria
p.55
CAPÍTULO 5: Resultados & Discussão
p.56
5.1)
p.56
Estudos de ionização de NHPAs em interface APCI-EM
5.1.1)
Avaliação dos padrões de fragmentação de 1-NPi com detecção por
varredura
5.1.2)
p.56
Avaliação dos padrões de fragmentação de outros NHPAs com detecção
por varredura
5.1.3)
p.61
Avaliação da detecção de NHPAs por monitoramento de reações múltiplas
(MRM)
5.2)
p.65
Otimização do sistema de eluição para determinação de NHPAs por
CLAE-EM
5.3)
p.66
Comparação dos fatores de resposta de soluções-padrão de 1-NPi preparadas
em diferentes solventes, por injeção direta (sem coluna)
p.68
5.4)
Otimização da vazão do sistema de eluição
p.69
5.5)
Otimização de parâmetros eletrônicos do espectrômetro de massas para
determinação de 1-NPi
p.69
5.6)
Otimização de parâmetros da interface APCI para determinação de 1-NPi
p.71
5.7)
Estudos de Extração (I): Avaliação da extração de 1-NPi com detecção por
injeção direta
p.75
5.7.1)
p.76
Extração de SRM 2975 com ultra-som e diclorometano
5.8)
Avaliação do efeito do DCM na detecção de 1NPi por CLAE-EM-EM
p.78
5.9)
Figuras de Mérito do método desenvolvido
p.82
5.10)
Estudos de Extração (II): Avaliação da extração de 1-NPi por CLAE-EM
p.83
5.11)
Avaliação da recuperação de 1-NPi em papel de filtro
p.87
5.12)
Determinação de 1-nitropireno em amostras reais de FD
p.88
5.12.1) Análise de FD depositada nos filtros BR1 e BR2
p.88
5.12.2) Extração de Fuligem de Diesel de automóvel
p.92
5.13)
Avaliação de outros NHPAs em FD
p.94
5.13.1) Otimização da separação de 1-nitropireno e outros NHPAs
p.94
5.13.2) Avaliação preliminar de outros NHPAs no material certificado SRM 2975
p.96
CAPÍTULO 6: Conclusões
p.98
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
p.100
vi
AGRADECIMENTOS
À minha mãe, sem a qual eu jamais teria chegado aqui, pelo seu amor e pelo apoio
incondicional em todos os momentos de minha vida.
À minha família, pelo enorme carinho e pelo exemplo constante de união e força.
Aos amigos mais próximos (Raq, Walli, Dri, Suy, Bruno, Tigra, Cau, Fabs e Ti), em
especial à Raq, pela força de sempre, amizade verdadeira e por me aturarem em
casa durante a execução deste trabalho.
Ao Annibal, por tantos anos de orientação e amizade, por sua paciência comigo, por
ter me ensinado muita química e principalmente por ter me ensinado a lidar com os
números.
Aos amigos do laboratório, especialmente ao Daniel e à Soraia (meus fiéis
escudeiros), pela ajuda de sempre e paciência comigo.
Aos professores da UFF que sempre me ajudaram em diversos momentos do meu
trabalho.
Ao Budismo, por ter entrado em minha vida. Nam Myoho Renguê Kyo!
vii
RESUMO
Metodologia analítica por Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (CLAE)
acoplada a um Espectrômetro de Massas do tipo Ion Trap (EM-IT) e interface de
Ionização Química a Pressão Atmosférica (APCI), com detecção por monitoramento
de reações múltiplas (MRM), em modo de ionização negativo foi desenvolvida e
empregada na determinação de hidrocarbonetos policíclicos aromáticos nitrados
(NHPAs) em fuligem de diesel. Na etapa inicial do trabalho, os padrões de
fragmentação destas substâncias foram avaliados. Ionização negativa predomina em
relação a ionização positiva e o íon [M-30]- foi o fragmento predominante na maior
parte dos espectros de NHPAs. A identificação foi feita através da comparação com
tempos de retenção de soluções padrão e pela análise dos respectivos espectros de
massas. A eficiência da metodologia desenvolvida (75-100%) foi avaliada pela
análise do padrão de fuligem de diesel certificado para 1-nitropireno (NIST- SRM
2975). Limites de detecção (1,5 mg/Kg) e de quantificação (5,0 mg/Kg) foram
determinados. Amostras de fuligem de diesel geradas em motores de bancada
analisadas através da metodologia desenvolvida, apresentaram concentrações de 1nitropireno abaixo dos limites de detecção. Amostras de fuligem de cano de
descarga de veículo diesel também apresentaram concentrações de 1-nitropireno
comparáveis ao LD do método. O único NHPA detectado nas amostras estudadas
foi o 1-nitropireno. O método desenvolvido tem potencial para aplicação em
amostras de fuligem de diesel.
viii
ABSTRACT
An analytical procedure using High Performance Liquid Chromatography (HPLC)
coupled with an Ion Trap Mass Spectrometer (IT-MS) and Atmospheric Pressure
Chemical Ionization (APCI) interface with multiple reactions monitoring (MRM)
detection and negative ionization was developed and applied in the determination of
nitrated
polcycyclic
aromatic
hydrocarbons
(NPAHs)
in
diesel
soot.
The
fragmentation patterns were evaluated. Negative ionization predominates over
positive ionization and [M-30]- ion was shown to the predominating fragment of most
NPAHs. NPAHs identification was performed retention time comparison and mass
spectra. A high recevery efficiency (75-100%) was obtained for 1-nitropyrene in the
NIST- SRM 2975. Detection limits of 1,5 mg/Kg and quantification limits of 5,0 mg/Kg
were found. Diesel soot samples from bench motors were analyzed and 1nitropyrene levels were bellow the detection limits. A sample taken from a diesel
vehicle showed levels of 1-nitropyrene comparable to the detection limit of the
method. The only NPAH detected in the samples detected in the samples was 1nitropyrene. The method showed potential for further application in the study of
NPAHs in diesel soot samples.
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Estruturas dos NHPAs estudados
p.23
Figura 2: Principais componentes de um sistema de CLAE-EM-IT com interface de
ionização à pressão atmosférica
p.34
Figura 3: Comparação das principais interfaces comerciais de CLAE-EM em função
de sua aplicação (polaridade e peso molecular)
p.36
Figura 4: Esquema típico de interface APCI
p.37
Figura 5: detector de massas do tipo Ion Trap
p.45
Figura 6: Comparação dos espectros de 1NPi por CLAE-EM-APCI, com
detecção por varredura, em modo de ionização negativa (a) e positiva (b)
p.59
Figura 7: estrutura de ressonância eletrônica do grupo nitro (NO2) na molécula de
1NPi
p.61
Figura 8: diferença de intensidades dos íons de m/z 211 e 210 no espectro de
varredura de 2NFl adquirido por CLAE-EM-APCI em modo de ionização negativo
p.64
Figura 9: Cromatograma e espectro de massas de 1NPi (15 ppb) obtido por
CLAE-EM-APCI, com detecção por MRM em modo de ionização negativo
x
p.68
Figura 10: Variação do sinal de soluções de 1-NPi em função da vazão do sistema de
Eluição
p.69
Figura 11: Variação da área de sinal de soluções de 1-NPi em função da
temperatura de vaporização: (a) 1-NPi 5 ppb; (b) 1-NPi 100 ppb
p.73
Figura 12: Variação da área de sinal de soluções de 1-NPi em função da temperatura de
secagem. (a) 1-NPi 5 µg/L; (b) 1-NPi 100 µg/L
p.74
Figura 13: Avaliação da detecção de 1-NPi após procedimento de extração de material certificado
(NIST, SRM 2975) com ultra-som e DCM
p.77
Figura 14: Variação do sinal de 1-NPi em função da concentração de DCM na solução p.80
Figura 15: Procedimento de extração de cerca de 20 mg SRM 2975 em condições
otimizadas
p.84
Figura 16: Procedimento de extração de cerca de 2 mg SRM 2975 em condições
otimizadas, após 4 etapas de extração
p.85
Figura 17: Procedimento de extração de cerca de 2 mg SRM 2975 em condições otimizadas,
após 6 etapas de extração
p.86
Figura 18: Procedimento de extração e tratamento das amostras de Fuligem de
Diesel da BR
p.90
Figura 19: Cromatogramas de 1NPi obtidos por CLAE-EM-APCI, com detecção por
MRM em modo de ionização negativo. a) extrato de fuligem de diesel depositada no
filtro BR1 após reconcentração e com injeção de 100 uL; b) padrão 1µg/L (20 uL)
p.91
Figura 20: Procedimento de extração alternativo empregado no tratamento da
amostra de fuligem de cano de descarga de automóvel movido a diesel
p.93
Figura 21: Cromatogramas em CLAE-EM-APCI-MRM de 9-NA e 1-NPi em extrato de
SRM 2975
p.96
xi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Especificação de solventes orgânicos utilizados
p.51
Tabela 2: Especificação de outros materiais utilizados
p.53
Tabela 3: Especificação da Instrumentação utilizada
p.54
Tabela 4: Principais íons observados nos espectros de varredura de 1NPi,
obtidos por CLAE-EM-APCI, em modo de ionização positivo e negativo
p.58
Tabela 5: Caracterização da fragmentação de NHPAs selecionados por
CLAE-EM-APCI, em modo negativo, com detecção por varredura
p.63
Tabela 6: detecção de 1NPi por MRM em modo de ionização positivo e negativo;
sistema de eluição MeOH/H2O (20:80)
p.66
Tabela 7: Valores dos parâmetros do espectrômetro de massas otimizados para a
detecção de 1NPi
p.70
Tabela 8: Colunas cromatográficas estudadas na separação de DCM e 1-NPi
p.78
Tabela 9: Parâmetros analíticos otimizados para a determinação de 1-NPi
em FD
p.81
Tabela 10: Figuras de mérito do método para detecção de 1NPi em FD
p.82
xii
Tabela 11: Avaliação da recuperação de 1-NPi em SRM 2975
p.86
Tabela 12: Avaliação da recuperação de 1-NPi em solução
p.88
Tabela 13: Tempos de retenção (tr) de 1-NPi, 9-NA e 2-NFl em coluna Vydac
p.95
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS
ABREVIATURA
DESCRIÇÃO
1-NPi
1-nitropireno
1,3-DNP
1,3-dinitropireno
1,6-DNP
1,6-dinitropireno
1,8-DNP
1,8-dinitropireno
1,8-NN
1,8-dinitronaftaleno
2-NFl
2-nitrofluoreno
9-NA
9-nitroantraceno
AHPAs
Hidrocarbonetos Amino-Policíclicos Aromáticos
APCI
Ionização Química em Pressão Atmosférica
API
Ionização a Pressão Atmosférica
APPI
Ionização Fotoquímica a Pressão Atmosférica
CCF
Cromatografia em Camada Fina
CGAR
Cromatografia a Gás de Alta Resolução
CI
Ionização Química
CID
Dissociação Induzida por Colisão
CLAE
Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência
DCM
Diclorometano
EFS
Extração em Fase Sólida
EI
Ionização por Impacto de Elétrons
EM
Espectrometria de Massas
ESI
Interface Eletrospray
FLUO
Detector de Fluorescência
xiv
FD
Fuligem de Diesel
FM
Fase Móvel
HPAs
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos
IT
Ion Trap
MB
Interface Moving Belt
MeOH
Metanol
MPA
Material Particulado Atmosférico
MRM
Monitoramento de Reações Múltiplas
NHPAs
Hidrocarbonetos Policíclicos Nitro-Aromáticos
NOx
Óxidos de Nitrogênio
NO2
Grupamento Nitro
PB
Interface Particle Beam
PCBs
Bifenilas Policloradas
PPB
Partes por Bilhão
PPM
Partes por Milhão
SCAN
Detecção por varredura
SIM
Monitoramento Seletivo de Íons
SiO2
Sílica
SPAs
Substâncias Policíclicas Aromáticas
TSP
Interface Termospray
UV
Detector de Ultra Violeta
xv
CAPÍTULO 1
Introdução
Durante muitos séculos a humanidade utilizou da ajuda de animais para
realizar trabalhos pesados e como forma de transportar cargas e pessoas.
Porém, com o advento da revolução industrial no século XVIII, a força animal
tornou-se em grande parte obsoleta devido à introdução de máquinas a vapor,
cujo combustível era o carvão.
No final do século XIX, as máquinas a vapor foram gradativamente
substituídas por outras movidas a combustíveis fósseis e derivados de
petróleo. Desde então, devido aos preços acessíveis e à robustez de motores
movidos a diesel, o emprego deste combustível foi favorecido e amplamente
disseminado, caracterizando o início do uso de diesel como principal fonte de
energia para o setor industrial, na agricultura e nos transportes urbanos.
Entretanto, ao serem queimados, óleo diesel e outros combustíveis
fósseis liberam na atmosfera partículas de fuligem às quais estão associadas
substâncias genotóxicas, notadamente substâncias policíclicas aromáticas
(SPAs), que se distribuem entre a fase gasosa e o material particulado
atmosférico (MPA) e tendem a contaminar os compartimentos ambientais em
proporções que dependem das características de cada substância e também
das características de cada compartimento ambiental. Ademais, outras
substâncias que podem ser nocivas à saúde e ao meio ambiente também são
16
emitidas em fase gasosa devido ao processo de combustão incompleta,
contribuindo de forma significativa ao incremento dos níveis de poluição
ambiental.
A fuligem de diesel é composta por partículas de carbono e matéria
orgânica geralmente pequenas (com diâmetros < 1 µm), que podem penetrar
até às porções mais inferiores dos pulmões e a presença de SPAs no material
particulado atmosférico (MPA) e nas fuligens é particularmente importante
devido ao seu impacto biológico e atividade mutagênica, que podem ser
associados à ocorrência de câncer (IARC, 1989).
Substâncias Policíclicas Aromáticas (SPAs), são encontradas em grande
variedade na natureza e constituem uma grande classe de substâncias
orgânicas cuja estrutura molecular central é mantida por estáveis sistemas de
ligações π. Compreendem tanto sistemas orgânicos heterocíclicos quanto
homocíclicos. O estudo destas substâncias é de grande interesse, pois apesar
de algumas delas serem pigmentos animais e vegetais de notável importância
biológica e intensa coloração, outras são importantes poluentes ambientais
que, em alguns casos, induzem o desenvolvimento de neoplasias e/ou
provocam mutações (Pereira Netto et al., 2000; Blumer, 1976).
Fontes antropogênicas encontram-se intimamente ligadas à questão da
poluição
e
contaminação
ambiental
em
grandes
centros
urbanos,
principalmente devido à emissão por veículos automotores e por processos
industriais (Menzie et al., 1992). Neste caso, há formação de SPAs por síntese
de novo, através de mecanismos via radicais livres que são bem conhecidos
(Badger e Kimber, 1960; Badger et al., 1960).
A importância relativa de cada tipo de fonte depende das características
industriais e econômicas de cada região, mas as estimativas de contribuição
relativa de cada uma variam de autor para autor (Baek et al., 1991). Entretanto,
a combustão incompleta por fontes móveis ou estacionárias é uma das mais
importantes delas, tanto pela quantidade emitida quanto por sua ampla
distribuição.
Emissões veiculares são, portanto, consideradas uma das principais
fontes primárias de substâncias mutagênicas em atmosferas urbanas (Alfheim
et al., 1983), especialmente devido aos motores a diesel, que emitem alta
17
carga de partículas ao serem comparados, por exemplo, aos motores a
gasolina (Rappaport et al., 1980).
Devido ao crescente número de veículos que trafegam diariamente nos
grandes centros urbanos e da multiplicação de indústrias ao redor das
metrópoles e em áreas anteriormente rurais, a poluição ambiental decorrente
da queima de óleo diesel e de combustíveis fósseis tem aumentado
gradativamente e constitui importante fator de risco à saúde das populações
em geral. A inalação de ar poluído por indivíduos que trabalham em locais de
grande exposição ou que lidam diretamente com máquinas movidas a
combustíveis fósseis aumenta fortemente a exposição ocupacional.
Os efeitos da poluição atmosférica podem ser sentidos a curtos e longos
prazos e se apresentam de forma bastante variada e profunda. Chuva ácida,
aquecimento global, redução da visibilidade em áreas urbanas e/ou agrícolas e
degradação da camada de ozônio são apenas alguns dos mais conhecidos,
porém a poluição atmosférica também está associada a problemas de saúde
das populações expostas, gerando aumento na demanda por atendimento
médico e podendo contribuir para o congestionamento do sistema de saúde
público.
Além disso, o MPA (fuligens, sujeiras, fumaça, poeira e gotículas
líquidas) se deposita sobre a superfície de solos e corpos d’água,
proporcionando alterações bioquímicas nestes ecossistemas e seu depósito
sobre estruturas de importância histórica e cultural, causa erosão e deixa
mancha nas mesmas.
Diante deste cenário, uma das principais questões que se apresentam é:
em que extensão a queima de óleo diesel constitui uma fonte significativa de
exposição humana à SPAs e o quanto contribui à concentração atmosférica
total das mesmas, com interesse particular em relação à presença de
hidrocarbonetos policíclicos aromáticos (HPAs) e seus derivados nitrados
(NHPAs), duas das principais classes de SPAs de grande importância
ambiental.
Neste contexto, este trabalho apresenta o desenvolvimento e a
implementação de metodologia para a determinação de NHPAs em fuligem de
diesel por cromatografia a líquido de alta eficiência acoplada a espectrometria
18
de massas e os resultados obtidos com esta metodologia no estudo da
emissão destas substâncias por combustão de óleo diesel nacional.
19
CAPÍTULO 2
Fundamentação Teórica
2.1)
HPAs e NHPAs: Aspectos Gerais
Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos (HPAs) e seus derivados
nitrados (NHPAs) são substâncias tóxicas persistentes (STPs), formadas
durante processos de combustão incompleta envolvendo combustíveis fósseis
ou qualquer outro tipo de matéria orgânica e são consideradas umas das
principais famílias de SPAs.
Muitos HPAs e NHPAs representam risco à saúde por serem
potencialmente carcinogênicos, mutagênicos e/ou teratogênicos, mesmo em
baixas concentrações (Pereira Netto et al., 2000; Boffetta et al., 1997). Sabe-se
também que alguns NHPAs, como 1-nitropireno e dinitro-pirenos, estão entre
as substâncias mais potencialmente mutagênicas já testadas (Rosenkranz,
1982; Rosenkranz e Mermelstein, 1983).
Os HPAs possuem tempos de vida diferentes na atmosfera (Butler,
1981) pois estão susceptíveis a reações fotoquímicas que vêm sendo
estudadas há pelo menos quatro décadas (Grosjean, 1983). No entanto, o
interesse pelo estudo destas substâncias aumentou no final da década de 70,
quando Jager e Pitts Jr demonstraram, independentemente, que HPAs podem
reagir com óxidos de nitrogênio (NOx) na atmosfera, formando derivados
nitrados (NHPAs).
20
Jager (1978) reportou a presença de 3-nitrofluoranteno em MPA
coletado em Praga e Pitts Jr (1978, 1979) demonstrou que benzo(a)pireno,
perileno e pireno eram convertidos nos respectivos nitro-derivados após serem
expostos a atmosferas (simuladas) contendo NO2 e traços de HNO3 em fase
gasosa. A formação de NHPAs é catalisada por baixos valores de pH e como
os óxidos de nitrogênio (NOx) são responsáveis pela acidificação do meio,
catalisam sua própria reação com os HPAs precursores para sua formação
(Moller et al.; 1983).
NHPAs podem ser emitidos diretamente na atmosfera, após serem
formados em processos de combustão incompleta em motores movidos a
combustíveis fósseis, principalmente a óleo diesel (Shuetzle et al., 1982,
Librando et al., 1993), e também a partir de processos industriais (Nielsen et
al., 1984; Nielsen e Ramdahl, 1986; Pitts Jr et al., 1985a; Ramdahl et al., 1986).
Entretanto, as reações atmosféricas são as principais fontes dos NHPAs
presentes no MPA (Arey et al.; 1986; Atkinson et al.; 1990; Finlayson-Pitts &
Pitts Jr, 1986; Pitts Jr et al., 1985 b; Sweetman et al., 1986; Kamens et al.,
1994) pois a maioria dos NHPAs é formada na atmosfera a partir de reações de
HPAs da fase gasosa (Schuetzle et al., 1986; Atkinson, 1988; Nishioka et al.,
1988; Lewtas et al., 1990).
Diversos NHPAs foram detectados em MPA, em estudos conduzidos na
cidade de Barcelona, Espanha (Bayona et al.; 1994), nos quais a ocorrência de
2-nitrofluoranteno e de 2-nitropireno está relacionada a processos de nitração
de fluoranteno e pireno em fase gasosa, na presença de radicais OH ou N2O5.
Por outro lado, a ocorrência de 9-nitroantraceno e de 1-nitropireno está
relacionada a reações eletrofílicas com os HPAs precursores durante
processos de combustão, refletindo a contribuição de fontes móveis de
poluição.
Assim como acontece com os HPAs precurssores, NHPAs de baixo
peso molecular (por exemplo, nitrobifenilas e nitronaftalenos) predominam na
fase gasosa do ar enquanto os mais pesados (por exemplo, nitropirenos,
nitrofluorantenos, nitroantracenos e nitrocrisenos) encontram-se associados ao
MPA, de acordo com suas pressões de vapor.
NHPAs constituem um grupo de mais de 200 substâncias diferentes.
São encontrados no meio ambiente junto aos HPAs precursores e outras
21
centenas de substâncias orgânicas e inorgânicas, porém em concentrações
inferiores àquelas dos HPAs.
Os NHPAs encontrados em diferentes matrizes ambientais possuem de
2 a 5 anéis aromáticos que podem conter 1, 2 ou 3 grupamentos nitro (NO2).
No entanto, a genotoxicidade dos NHPAs depende tanto da estrutura do HPA
de origem como do número e da posição do grupamento nitro (NO2). NHPAs
também têm sido encontrados em diversos materiais como toners de
fotocopiadoras, produtos da combustão de carvão, sedimentos e fumaça de
cigarro (Moreira e Barek, 1995). As estruturas moleculares dos NHPAs
estudados neste trabalho encontram-se na Figura 1.
22
NO2
NO2
NO2
1-Nitropireno
(1-NPi)
9-Nitroantraceno
(9-NA)
2-Nitrofluoreno
(2-NFl)
NO2
NO2
1-Nitronaftaleno
2-Nitronaftaleno
(1-NN)
(2-NN)
NO2
O2 N
NO2
NO2
2,5-diNitrofluoreno
(2,5-diNFl)
2,7-diNitrofluoreno
(2,7-diNFl)
NO2
NO2
NO2 NO2
NO2
1,3-diNitronaftaleno
(1,3-diNN)
NO2
1,5-diNitronaftaleno
(1,5-diNN)
1,8-diNitronaftaleno
(1,8-diNN)
Figura 1: Estruturas moleculares dos NHPAs estudados neste trabalho.
23
HPAs e NHPAs podem ser absorvidos por inalação, ingestão ou por
contato dérmico e se distribuem amplamente em todo o organismo, sendo
encontrados principalmente em tecidos ricos em lipídios. O metabolismo de
ambos é complexo. No caso dos HPAs, epóxidos são os intermediários
metabólicos e precursores de intermediários como dihidrodiois e diol-epóxidos,
que
são
as
substâncias
responsáveis
pelos
processos
iniciais
de
carcinogênese. A formação destes intermediários reativos explica a atividade
biológica dos HPAs, que seriam naturalmente inativos (Josephy, 1997; Glusker,
1985).
NHPAs são metabolizados no fígado por NADPH-citocromo P-450
redutases, formando intermediários que são reduzidos às substâncias aminoaromáticas correspondentes, que são excretadas na urina sob a forma livre ou
após acetilação (Moreira e Barek, 1995).
Seus efeitos tóxicos estão relacionados à formação de intermediários
reativos, os quais podem reagir com macromoléculas endógenas, sobretudo
com proteínas (Pryor, 1982) e ácidos nucléicos (Varghese e Withmore, 1980).
No entanto, muitos NHPAs também apresentam atividade mutagênica mesmo
na ausência de ativação metabólica (Moreira e Barek, 1995) e muitos NHPAs
são mais mutagênicos de que os HPAs precursores em testes de
mutagenicidade do tipo Ames, com Salmonella typhimurium (Pitts Jr, 1987).
Muitos também demonstram ter potencial carcinogênico em animais (Ohgaki et
al., 1984; Rosenkranz, 1984; Salmeen et al., 1982; Tokiwa et al., 1986).
Concentrações de NHPAs normalmente encontradas na atmosfera são
da ordem de ng/m3 (OMS, 2003; Librando e Fazzino, 1993), enquanto
partículas de fuligem de diesel apresentam concentrações de NHPAs da ordem
de µg/kg a mg/kg (IARC, 1989; Moller et al.; 1993). As concentrações de
dinitro-HPAs são aproximadamente 10 vezes menores do que os NHPAs, tanto
em amostras ambientais como em amostras biológicas (Cvacka et al., 1998).
Até 1987, cerca de 100 diferentes mono e di-NHPAs já haviam sido
relatados em fuligem de diesel (Shuetzle et al., 1982, Shuetzle, 1983; PaputaPeck et al., 1983; Pitts Jr, 1987). Dentre os principais NHPAs encontrados em
fuligem de diesel destacam-se nitropirenos, nitroantracenos e nitrofenantrenos,
24
nitrofluorenos, metilnitropirenos, metilnitrofluorantenos e nitrofluorantenos
(Schuetzle, 1983).
No entanto, as concentrações de NHPAs em fuligem de diesel variam
substancialmente de amostra para amostra, sendo difícil comparar os
diferentes perfis. Geralmente, 1-nitropireno é o NHPA predominante, com
concentrações de 7-165 mg/Kg (Levsen, 1988), sendo comum encontrar
concentrações de 2-nitrofluoreno de cerca de 15% em relação ao 1-nitropireno
(Beije e Moller, 1988). Entretanto, nem sempre 1-nitropireno predomina,
especialmente em fuligens oriundas de veículos pesados, nas quais há
predomínio de 2-nitrofluoreno (IPCS, 2003).
Até o presente momento, não existem estudos epidemiológicos
detalhados sobre exposição humana às emissões de motores a diesel, que por
serem misturas complexas demandam substâncias marcadoras que sejam
específicas e sensíveis para a determinação de efeitos biológicos.
Neste contexto, 1-nitropireno é considerado o principal biomarcador da
queima de diesel para a classe dos NHPAs e pode fornecer informação acerca
da exposição a esta classe de substâncias tóxicas (Gallagher et al., 1994; Raat
et al., 1994), embora certos autores também atribuam este papel ao 2nitrofluoreno (Zwirner-Baier et al., 1999). Straube e colaboradores (2004),
consideraram que a única fonte relevante de exposição humana a dinitropirenos é a emissão por motores a diesel e devido a esta especificidade
sugerem a utilização dos mesmos como biomarcadores.
Extratos de fuligem de diesel produziram mutações em testes do tipo
Ames, com Salmonella typhimurium e segundo Schuetzle e colaboradores
(1981), 1-nitropireno está relacionado à cerca de 24% da atividade mutagênica
destes extratos.
Há estimativas de que nitro-arenos contribuem com cerca de 15-20% da
atividade mutagênica direta em atmosferas urbanas (Arey et al., 1988). Deve
ser considerado ainda que as concentrações de HPAs em combustíveis a base
de petróleo, diesel e em óleos são da ordem de partes por milhão (ppm) (IPCS,
1998), que podem, em parte, ser liberados diretamente para a atmosfera
durante a queima, bem como originar NHPAs em motores de veículos
automotivos, a partir da reação com óxidos de nitrogênio que são emitidos pela
25
conversão de nitrogênio e oxigênio em altas temperaturas nas câmaras de
combustão (Scheepers e Bos, 1992).
Neste contexto, muitos esforços têm sido feitos no intuito de avaliar
estas classes de substâncias em matrizes ambientais, sobretudo aqueles
NHPAs
de
maior
importância
carcinogênica,
como
1-nitropireno,
2-
nitrofluoreno, 1,3-, 1,6- e 1,8- dinitropirenos. Entretanto, há apenas dois
trabalhos sobre NHPAs no meio ambiente do Brasil (Vasconcellos et al., 1998;
Ciccioli et al. 1996) e não foram encontrados dados sobre NHPAs em fuligens
de combustível no Brasil.
2.2)
Determinação de HPAs e NHPAs
Devido à complexidade das misturas de HPAs e/ou de NHPAs
encontradas em amostras ambientais a determinação de HPAs e NHPAs
requer
métodos
que
permitam
alta
resolução
e
alta
seletividade
simultaneamente.
Portanto, não é possível realizar análise direta de HPAs e NHPAs em
amostras ambientais, uma vez que as mesmas contêm ampla variedade de
outros produtos de combustão (carbono elementar [fuligem], espécies
inorgânicas, aldeídos, cetonas e ácidos carboxílicos), que tendem a co-eluir
com as substâncias de interesse nas técnicas cromatográficas geralmente
empregadas.
Em amostras provenientes de combustão, hidrocarbonetos alifáticos
tendem a predominar com concentrações 100 a 1000 vezes maiores que as
dos HPAs e 10.000 a 100.000 vezes maiores que as dos NHPAs. Os extratos
de HPAs podem conter também isômeros destas substâncias e no caso de
NHPAs derivados contendo mais de um grupo nitro ou funções mistas. Muitas
destas famílias de substâncias apresentam comportamento físico-químico
semelhante ao dos analitos de interesse e por isso sua remoção completa
através de processos de extração e purificação se torna muito difícil, o que
aponta na direção do uso de técnicas de detecção altamente seletivas
(Niessen, 2000; Cvacka et al., 1998; Anacleto et al., 1995; Moreira e Barek,
1995, Castello e Gerbino, 1993; IPCS, 1998).
26
A extração das amostras de fuligem de diesel (FD), bem como de outras
amostras ambientais como MPA, solos, sedimentos e poeira de túnel, podem
ser realizadas através de diversos procedimentos. Os mais empregados são
extração ultra-sônica, soxhlet e agitação mecânica (Ryno et al., 2006).
A extração e o preparo de amostras constituem, na maioria dos casos,
as etapas mais laboriosas e lentas dos procedimentos analíticos e o consumo
de tempo é maior (12 a 24 horas) quando extração em Soxhlet é realizada, que
ademais, em algumas situações, pode demandar supervisão humana. Por
outro lado, a extração em banho de ultra-som é mais rápida e consome menor
tempo. Outra vantagem da extração em ultra-som é o fácil manuseio. De modo
geral, ambas permitem altas recuperações de NHPAs (> 90 %) (Cvacka et al.,
1998).
Os solventes orgânicos mais utilizados são diclorometano, acetonitrila,
metanol, acetona, benzeno, tolueno e hexano (Guillén, 1994). Muitos
procedimentos realizam a extração com um único solvente (Cvacka et al.,
1998) enquanto outros utilizam misturas dos mesmos (Moriwaki et al., 2000;
Schauer et al., 2004).
Devido à alta complexidade das matrizes ambientais, procedimentos de
limpeza e fracionamento das amostras são geralmente usados e permitem
obter extratos com menos interferentes provenientes da matriz e de outras
classes ou famílias de substâncias químicas. Estes procedimentos podem ser
realizados, por exemplo, por extração líquido–líquido, extração em fase sólida
(EFS), cromatografia em camada fina (CCF), cromatografia líquida em coluna
(CL) ou CLAE preparativa.
EFS é um procedimento de limpeza amplamente utilizado devido à
facilidade de operação e ao baixo consumo de tempo (Kootstra et al., 1995;
Barranco et al., 2003). O emprego de EFS com cartuchos descartáveis de sílica
é um procedimento usado na determinação de HPAs (Pereira Netto, 1999).
Estudos comparativos de procedimentos de fracionamento mostraram que
altas taxas de recuperação de NHPAs podem ser obtidas com EFS (87-91%)
ou CLAE preparativa (83-92%) contra menores taxas de recuperação obtidas
por CCF (55-60%) (Cvacka et al., 1998).
Devido à complexidade das amostras ambientais e também à
necessidade de identificação de diferentes isômeros, técnicas cromatográficas
27
têm sido amplamente usadas na determinação de HPAs e NHPAs.
Cromatografia a gás de alta resolução (CGAR) e cromatografia a líquido de alta
eficiência (CLAE) são empregadas freqüentemente e a principal vantagem das
técnicas cromatográficas sobre as demais é possibilitar a separação
(resolução) de misturas complexas.
O uso ou acoplamento a detectores de alta seletividade e alta
sensibilidade permite identificar e quantificar baixas concentrações de HPAs e
de NHPAs, mesmo em misturas ou frações contendo outras classes ou famílias
de substâncias químicas.
Neste contexto, a técnica ideal deve possibilitar boa resolução de todas
as substâncias de interesse entre si e em relação às interferentes, de forma a
permitir simultaneamente baixos limites de detecção e reprodutibilidade de
tempos de retenção para auxiliar a identificação.
Durante muito tempo CGAR foi utilizada para a análise de HPAs e
NHPAs, porém a principal desvantagem na utilização desta técnica na
separação de HPAs e NHPAs está relacionada com a baixa volatilidade dos
membros mais pesados das séries. A baixa estabilidade térmica de certos
NHPAs também pode ser uma desvantagem pois pode haver perda por
decomposição no injetor, na coluna e na interface CGAR-EM (Sweetman,
1982), o que pode ser problemático para amostras ambientais onde encontramse em níveis bastante baixos (ng-pg/g) destas substâncias.
Uma forma de evitar a perda por decomposição de NHPAs nas regiões
aquecidas do cromatógrafo à gás é reduzi-los à amino-HPAs (AHPAs) e, em
seguida, derivatizá-los (Scheepers et al., 1992). Como este processo envolve
duas etapas de reação, implica em maior consumo de tempo no preparo das
amostras e na possibilidade de perda parcial dos NHPAs nas duas etapas de
reação.
Algumas das limitações da análise de HPAs e NHPAs por CGAR podem
ser superadas pela utilização de CLAE, que, de modo geral, apresenta muitas
vantagens na determinação de compostos termolábeis, uma vez que as
análises são feitas em temperaturas próximas à ambiente, evitando
decomposição. Além disso, derivatização normalmente não é necessária e
como a volatilidade não é pré-requisito à determinação, substâncias de alto
peso molecular podem ser determinadas. Outro fator que pode ser considerado
28
é o fato de não haver volatilização da amostra nas análises por CLAE, o que
reduz as perdas na transferência para a coluna e a discriminação por peso
molecular.
HPAs e NHPAs presentes em diversos tipos de amostras (como MPA,
emissões de veículos, materiais biológicos, extratos de alimentos, águas,
plantas, óleos, poeira e fuligens) são habitualmente analisados por CLAE em
fase reversa, que é a técnica mais amplamente usada para a separação dos
mesmos (Wise et al, 1993; Furton et al., 1993) que, por serem substâncias de
baixa polaridade, são bem retidos em octadecilsílica (ODS).
Schauer e colaboradores (2004) apresentaram cromatogramas de
alguns NHPAs obtidos por CLAE em fase reversa, com boa resolução em
gradientes de eluição de MeOH/H2O contendo até 50% de cada solvente.
Entretanto o tempo total de análise foi de cerca de 40 minutos e os picos
cromatográficos obtidos apresentavam largura maior que 3 minutos.
Várias técnicas de detecção têm sido usadas para a determinação de
HPAs e NHPAs (Cvazka et al., 1998). Para a análise de amostras reais, a
sensibilidade do detector a ser utilizado é fator determinante à escolha do
mesmo, uma vez que as amostras normalmente estudadas contêm apenas
traços das substâncias de interesse.
Espectrofotometria de absorção no ultravioleta (UV) e fluorescência
(FLUO) são as técnicas de detecção mais utilizadas para a determinação de
HPAs. A detecção por UV é praticamente universal para HPAs. Entretanto, na
quantificação de amostras complexas, o detector de fluorescência oferece
maior sensibilidade e seletividade já que estas substâncias apresentam
fluorescência natural devido ao seu sistema de elétrons π (ver, por exemplo,
Wise et al., 1993).
A sensibilidade e a seletividade da técnica de detecção por FLUO
podem ser aumentadas utilizando-se uma programação de detecção na análise
cromatográfica que permita variar os comprimentos de onda de excitação e de
emissão dos compostos de interesse, de forma adequá-los aos valores
máximos para cada HPA ou grupos de HPAs. Dados de literatura apresentam
espectros de excitação e de emissão para vários HPAs ou tabelas de
comprimentos de onda máximos de excitação e de emissão, que podem ser
29
usados como base para a otimização dos comprimentos de onda analíticos
ideais (ver por exemplo, Wise et al., 1993 e Barranco et al., 2003).
No caso de NHPAs, além de detecção fluorimétrica, detecção
eletroquímica, detecção por quimioluminescência e por espectrometria de
massas têm sido empregadas (Cvacka et al; 1998).
Como NHPAs são pouco fluorescentes ou mesmo não-fluorescentes
devido ao efeito desativador do grupo nitro (NO2), para a determinação
fluorimétrica destas substâncias é necessário convertê-las previamente em
espécies fluorescentes, o que pode ser feito por redução do grupamento nitro
(NO2) em um grupo amino (NH2), gerando amino-HPAs (AHPAs), que são
extremamente fluorescentes.
A redução de NHPAs pode ser feita antes da introdução no sistema
cromatográfico (off line) ou após a separação, previamente à detecção ou
diretamente (on line) no sistema cromatográfico e ambas as metodologias tem
sido empregadas na determinação de NHPAs por CLAE (Cvacka et al., 1998).
Os métodos de redução on line requerem a utilização de uma coluna de
redução em linha com a coluna analítica. Os métodos off line tendem a ser
mais laboriosos e a consumir mais tempo de pré-tratamento das amostras.
Para fins quantitativos, a etapa de redução também pode levar a perdas na
determinação de traços de NHPAs. Os métodos quimioluminescentes
envolvem também redução e reação, enquanto a detecção eletroquímica pode
ser afetada por pequenas concentrações de O2 residual do ar (Cvacka et al.,
1998).
A detecção por espectrometria de massas (EM) é, possivelmente, a
principal ferramenta utilizada na determinação de HPAs e NHPAs. Este
detector apresenta como principal vantagem a possibilidade de elucidação de
estruturas moleculares por comparação dos espectros de massas com
bibliotecas de espectros e/ou através da interpretação destes espectros.
Outra vantagem que se apresenta na determinação de NHPAs por CLAE
com detecção por espectrometria de massas (CLAE-EM) é que não há
necessidade da etapa de redução (como acontece na detecção fluorimétrica) e
a determinação pode ser feita diretamente nos extratos das amostras, devido à
seletividade do detector.
30
2.3)
Cromatografia
a
Líquido
de
Alta
Eficiência
acoplada
a
Espectrometria de Massas (CLAE-EM)
O acoplamento de cromatografia a líquido de alta eficiência com
espectrometria de massas (CLAE-EM) vem sendo estudado há cerca de 30
anos, desde o início da década de 1970. Um histórico dos grupos pioneiros e
uma discussão sobre o tema pode ser encontrada na revisão de Niessen e
colaboradores (1995).
A combinação destas técnicas (CLAE - separação; EM - detecção e
informação estrutural) disponibiliza uma ferramenta analítica bastante versátil
para a análise de misturas complexas contendo compostos desconhecidos
e/ou analitos em baixa concentração. Dentre as áreas de aplicação, destacamse as ciências bioquímicas e biomédicas (Gelpi, 1995; Madl et al., 2006),
farmacêuticas (Smyth et al., 2006) e aplicações ambientais (Amorisco et al.,
2006).
Três maiores dificuldades podem ser citadas em relação ao acoplamento
CLAE-EM: (a) a necessidade de adaptar vazões de aproximadamente 1
mL/min do efluente oriundo do sistema cromatográfico na região de alto vácuo
do espectrômetro de massas; (b) a ionização de analitos termolábeis ou não
voláteis e (c) a incompatibilidade na composição dos eluentes, caso haja uso
de fases móveis não voláteis no desenvolvimento de metodologia de
separação cromatográfica.
A questão da ionização gerava maior problemática nos primeiros anos
de desenvolvimento da técnica, quando apenas tecnologias baseadas na
ionização por impacto de elétrons (EI) e ionização química (CI) (que requeriam
amostras no estado gasoso) eram consideradas, em contraste com as técnicas
de CLAE e CLAE-EM que lidavam com substâncias não voláteis. Entretanto,
considerável progresso foi alcançado no desenvolvimento de métodos de
ionização mais suaves e, atualmente, a ionização de analitos em CLAE-EM
não é mais considerada um problema.
Isto foi obtido considerando-se também o papel da fase móvel em CLAEEM. O paradigma anterior considerava que a fase móvel estava mais
relacionada ao processo cromatográfico e devia ser removida de forma mais
rápida e completa possível. Atualmente, com as atuais interfaces empregadas
31
em CLAE-EM, o processo de ionização da substância de interesse é
considerado na escolha da fase móvel a ser utilizada, o que por outro lado
pode levar a “conflitos de interesses”, uma vez que uma determinada
composição de fase móvel pode ser excelente do ponto de vista da
espectrometria de massas, mas pode não ser útil em relação ao processo
cromatográfico e vice-versa.
O uso rotineiro de fases móveis contendo tampões salinos (fosfato, por
exemplo) ou outros aditivos, não é indicado em interfaces de CLAE-EM, pois os
mesmos costumam ser geralmente não-voláteis e tendem a acumular-se nas
interfaces. Entretanto, sistemas que dispõem de fluxo de gás em contra
corrente podem empregar tais eluentes com maior tolerância. Para resolver a
questão das incompatibilidades relacionadas à fase móvel, muitas vezes o
mais indicado é a substituição de seus componentes.
Entretanto,
continua
havendo
restrições
na
instrumentação,
especialmente no que se refere ao fluxo de fase móvel e aos dispositivos de
vácuo, pois, por exemplo, uma vazão de 1 mL/min de água é convertida em
volumes muito maiores de vapor d’água (~1,2 L/min) à pressão atmosférica,
gerando um aporte excessivo de material aos sistemas de vácuo empregados
em espectrometria de massas. Visando resolver esta incompatibilidade, várias
técnicas de acoplamento e várias interfaces de CLAE-EM tornaram-se
disponíveis comercialmente, tendo em comum o fato de operarem em baixas
e/ou moderadas pressões (Niessen et al., 1995).
O acoplamento CLAE-EM é considerado um dos mais importantes
avanços na área de Química Analítica (Niessen, 2000) e foi viabilizado pelo
desenvolvimento de interfaces que permitem a introdução adequada do fluxo
oriundo do sistema cromatográfico (à pressão atmosférica) ao ambiente sob
alto vácuo exigido pelo detector de massas. Várias interfaces com estas
características foram introduzidas no mercado nos últimos anos (Niessen,
2000).
As primeiras interfaces comerciais de CLAE-EM apresentavam muitas
dificuldades em sua manipulação, sensibilidade limitada e falta de robustez.
Alguns exemplos podem ser citados: interfaces dos tipos moving belt (MB) e
particle beam (PB), que se baseiam na remoção da fase móvel antes da
entrada no sistema de espectrometria de massas; interfaces de introdução
32
direta de líquido e de fluxo contínuo, que diminuem a vazão de entrada com
dispositivos de divisão, porém geram perda de sensibilidade de acordo com a
razão de divisão e interface termospray (TSP), baseadas na vaporização do
efluente da coluna.
O grande aumento na aplicação de técnicas de CLAE-EM se deu em
função do desenvolvimento de técnicas de ionização à pressão atmosférica
(API), que apresentavam sensibilidade e robustez adequadas (Niessen, 2000).
Esta denominação - API - engloba todas as técnicas de ionização nas quais
íons são formados à pressão atmosférica. A aplicação destes processos de
ionização à espectrometria de massas vem sendo estudada há muitos anos
(Knewstubb et al., 1966; Shahin, 1966; Horning et al., 1974).
Recentemente, foram desenvolvidas interfaces de ionização à pressão
atmosférica (API), que diferem principalmente quanto ao princípio de
nebulização do efluente cromatográfico e quanto à faixa de aplicação que
cobrem.
Há variações de desenho nos modelos de espectrômetros de massas
disponíveis comercialmente, mas de modo geral, os íons formados na região
da API são transportados para a região sob alto vácuo no interior do
espectrômetro de massas por intermédio da aplicação de potenciais elétricos e
de um ou mais estágios de bombeamento consecutivos. Um esquema genérico
de instrumentação CLAE-EM com sistema de ionização à pressão atmosférica
é apresentado na Figura 2.
33
Ion Trap
Detector
Câmara
de
nebulização
Figura 2: Principais componentes de um sistema de CLAE-EM-IT com interface
de ionização à pressão atmosférica.
A câmara de ionização em pressão atmosférica termina em um capilar
de transferência, que atua como um “nariz” atraindo os íons formados nesta
região. Este capilar já se encontra na face de baixa pressão do espectrômetro
de massas e apenas um orifício encontra-se aberto para região em pressão
atmosférica.
No entanto, a passagem do gás da região de pressão atmosférica para a
região de vácuo é acompanhada por um processo de expansão, onde as
partículas com as menores massas tendem a se difundir mais, afastando-se
daquelas de maior massa, e o resultado deste fenômeno é o enriquecimento
das espécies de maior massa. Tanto em CGAR-EM quanto em CLAE-EM,
como as moléculas dos analitos têm massas moleculares consideravelmente
maiores do que os constituintes da fase móvel, a conseqüente separação que
ocorre durante o processo de expansão leva ao enriquecimento das espécies
do analito em fase gasosa (Niessen, 1995).
Após o processo de vaporização, o fluxo oriundo do sistema
cromatográfico, só pode ser introduzido na região de vácuo do EM por
intermédio da aplicação de potenciais elétricos e de estágios diferenciados de
bombeamento (vácuo).
34
Existem sistemas que dispõem de um único estágio de bombeamento ou
expansão, mas na prática há duas razões para que seja empregado um
segundo estágio: a evaporação incompleta de líquido e a transmissão das
espécies do analito até o analisador de massas. A evaporação das gotículas
geralmente é incompleta, resultando na entrada de uma grande fração de
líquido no espectrômetro de massas. Visando a prevenção destes problemas,
sistemas com dois estágios de bombeamento diferenciados são empregados.
Além disso, modelos com dois estágios permitem o uso de skimmers
(separadores de massas) mais largos, que favorecem a transmissão das
espécies do analito até a região de alto vácuo no interior do espectrômetro de
massas.
Os íons são focalizados e guiados até o analisador de massas através
dos skimmers e pela aplicação de campos elétricos apropriados em
dispositivos do tipo octapolo. A primeira região de vácuo é produzida por
intermédio de bombas turbo-moleculares e encontra-se entre o capilar de
transferência e o primeiro skimmer. Alguns sistemas empregam um segundo
skimmer, que conduz a um segundo estágio de vácuo. Geralmente, o vácuo a
partir desta região é produzido por bombas do tipo turbo-molecular. Em
equipamentos mais modernos, ao invés de sistemas convencionais de lentes,
são empregados quadrupolos, hexapolos ou octapolos como dispositivos de
focalização, através da aplicação de rádio-freqüência apenas, para préconcentrar os íons do analito e direcioná-los ao analisador de massas. Esta
aplicação produz melhora na relação sinal-ruído devido ao melhor efeito de
focalização alcançado.
Atualmente, as principais interfaces comerciais baseiam-se em ionização
à pressão atmosférica (API), compreendendo electrospray (ESI), ionização
química à pressão atmosférica (APCI) e ionização fotoquímica à pressão
atmosférica (APPI). Esta recente introdução de novas interfaces comerciais
abriu novas perspectivas e impulsionou a aplicação da técnica na análise de
misturas orgânicas complexas contendo substâncias instáveis e/ou de alto
peso molecular, proporcionando limites de detecção da ordem de pg ou sub-pg.
Entretanto, as interfaces não devem ser entendidas apenas como
dispositivos para introdução de amostras em sistemas de espectrometria de
massas. Uma interface é, além disto, o que determina ou permite a ionização
35
dos analitos de interesse e consequentemente, sua escolha influencia
fortemente os resultados obtidos.
O diagrama esquemático abaixo (Figura 3) indica as áreas de aplicação
das três principais interfaces comerciais de CLAE-EM.
Figura 3: Comparação das principais interfaces comerciais de CLAE-EM em
função de sua aplicação (polaridade e peso molecular).
2.4)
Ionização Química à Pressão Atmosférica (APCI)
O desenvolvimento de interfaces APCI para sistemas CLAE-EM reporta-
se ao trabalho de Horning e colaboradores (Horning et al., 1974), porém devido
à falta de instrumentação adequada, a implementação desta técnica em larga
escala se consolidou apenas no início da década de 1990. O processo de APCI
é iniciado a partir da descarga de elétrons proveniente de uma agulha do tipo
corona e os íons gerados na interface, em fase gasosa. Atualmente, o uso de
APCI para ionização de analitos é outra das estratégias mais utilizadas.
Em APCI, a ionização das moléculas do analito ocorre por descarga de
elétrons provenientes de uma agulha do tipo corona (Niessen, 1995). Esta
descarga ioniza não apenas as moléculas do analito, pois moléculas do eluente
também são ionizadas e reagem com as moléculas do analito, em fase gasosa.
36
Os mecanismos de ionização em APCI são os mesmos observados em
procedimentos de ionização química em pressões moderadas, porém quando
comparada aos mesmos verifica-se que a ionização é mais eficiente, uma vez
que a frequência de colisões é maior em pressão mais alta (atmosférica). A
formação de íons positivos ocorre por transferência de prótons, formação de
adutos ou reações de transferência de cargas, enquanto a formação de íons
negativos acontece devido à abstração de prótons, acoplamento de ânion ou
por reações de captura de elétrons (Lemière, 2001).
As interfaces APCI geralmente consistem dos seguintes componentes:
(a) um sistema de aporte do efluente do sistema cromatográfico, geralmente
em vazões na faixa de 0,5 a 2,0 mL/min.; (b) um dispositivo de nebulização e
vaporização deste efluente e (c) uma fonte de íons a pressão atmosférica,
contendo uma agulha do tipo corona. A Figura 4 apresenta um esquema de
interface APCI.
Nebulizer
Pressure
Corona
current
Heater
Vcap
Drying gas
Temperature
and Flow
Fragmentor
Figura 4: Esquema típico de interface APCI
Para o acoplamento do sistema de CLAE ao sistema APCI, o efluente
líquido da coluna cromatográfica é transferido por meio de tubos capilares, que
podem ser de metal ou sintéticos (tubos peek). A distância entre os dois
37
equipamentos e o diâmetro do tubo conector utilizados devem ser avaliados
para evitar a criação de volume morto excessivo no sistema. O emprego de
altas vazões é fundamental para a performance desta técnica e o uso de
colunas de CLAE com 4.6mm e grandes volumes de amostra são relatados
constantemente na literatura (Lemière, 2001).
Como o processo de APCI ocorre em fase gasosa após aquecimento do
efluente nebulizado, diversas montagens de nebulizadores e vaporizadores
estão disponíveis no mercado, fabricados por diferentes fornecedores.
Os
nebulizadores
mais
utilizados
são
do
tipo
pneumático
e
compreendem três tubos concêntricos. O primeiro deles é um tubo capilar
através do qual é carreado o eluente oriundo do sistema cromatográfico; o
segundo e o terceiro têm a função de carrear o gás de nebulização e o gás de
secagem auxiliar, respectivamente. O tubo através do qual passa o gás de
nebulização possui um dispositivo aquecedor em seu interior e o aerossol préaquecido chega à câmara de vaporização, localizada diretamente em frente ao
nebulizador, para completar o processo de vaporização. A agulha corona
localiza-se em posição axial, próxima ou até mesmo dentro da câmara de
vaporização.
A vazão empregada nos processos de nebulização-vaporizaçãosecagem varia de acordo com o fabricante de cada equipamento e com as
características químicas dos compostos de interesse e do sistema de eluição
empregado. O gás mais utilizado é o nitrogênio (N2) e sistemas APCI requerem
grande suprimento do mesmo, podendo até mesmo ser maior que 600 L/h em
alguns instrumentos. Consumos tão altos muitas vezes requerem aporte de N2
a partir de cilindros de N2 líquido ou até mesmo de unidades geradoras de N2 a
partir de ar comprimido.
Os produtos do processo de ionização em interface APCI são íons em
fase gasosa oriundos do eluente e do analito, além de íons e moléculas dos
gases envolvidos no processo de secagem. Além disto, ocorre formação de
agregados com água (cluster ions) e com íons provenientes do sistema de
eluição que não contenham íons do analito. Estes agregados devem ser
destruídos antes de passar à região de alto vácuo do espectrômetro de massas
a fim de reduzir o ruído na linha de base, que pode mascarar o sinal do analito.
O aumento na temperatura da interface, bem como do fluxo do gás de
38
secagem podem reduzir a formação destes agregados, porém se o fluxo de
gás for aumentado excessivamente, poderá causar atenuação no sinal do
analito, por perda na interface.
Os íons dos analitos formados estão solvatados por moléculas de água,
misturados aos íons do sistema de eluição e por moléculas dos gases
utilizados no processo de vaporização. A desagregação destes clusters pode
ser conseguida com o auxílio de um fluxo de gás em contra corrente, localizado
no mesmo patamar onde se encontra o orifício do capilar de transferência ou
pelo uso de um capilar de transferência aquecido ou pela combinação de
ambos. Outro artifício que pode ser empregado é a aplicação de um suave
deslocamento potencial entre o capilar de transferência e o skimmer, visando
promover colisões entre os agregados e as moléculas de gás que estiverem
presentes. Este artifício é conhecido como dissociação induzida por colisão –
CID. As colisões dos clusters com superfícies aquecidas dentro do
espectrômetro
de
massas
provocam
transferência
de
calor
e,
consequentemente, evaporação. Sendo assim, o fluxo de gás efetivo dentro do
espectrômetro de massas aumenta e pode exceder a capacidade da bomba de
vácuo. Por esta razão, também são empregados sistemas com dois estágios
de bombeamento diferenciados.
As reações de ionização química são iniciadas após descarga de
elétrons emitidos a partir de uma agulha do tipo corona (5-10kV) e os elétrons
emitidos deflagram uma série de reações. O processo de ionização em
interfaces do tipo APCI pode ocorrer de diferentes maneiras. Em modo positivo,
ocorre por transferência de prótons ou por reações de transferência de cargas.
A transferência de cargas entre íons positivos ocorre entre um íon-reagente
(gerado a partir de uma molécula com alto potencial de ionização) e uma
molécula em fase gasosa com baixo potencial de ionização. Em modo
negativo, reações de captura de elétrons ocorrem quando moléculas
susceptíveis a tais processos são ionizadas pela fonte de API, produzindo
ânions de peso molecular ou por captura de elétrons após dissociação,
produzindo fragmentos de ânions negativos.
Nas
interfaces
APCI,
o
efluente
da
coluna
é
nebulizado
pneumaticamente em um tubo aquecido (geralmente de quartzo ou aço
inoxidável), impulsionado por um fluxo de gás adicional, que circunda o
39
nebulizador. Uma vez vaporizado, o aerossol formado pela mistura de vapor e
solvente é transferido para a interface, onde uma descarga de elétrons
proveniente da agulha corona inicia o processo de ionização. As moléculas do
eluente estão em excesso em relação às moléculas do analito, sendo ionizadas
preferencialmente. Em um segundo momento, as moléculas do analito são
ionizadas (preferencialmente) a partir das moléculas do eluente.
Altas temperaturas de vaporização e secagem na interface APCI podem
levar à degradação de alguns analitos, mas não há sérios relatos de
decomposição térmica na literatura (Niessen, 1995), uma vez que as altas
vazões empregadas e o fluxo de N2 auxiliar previnem a quebra das moléculas
(Lemière, 2001).
A interface APCI é fácil de ser operada e não requer complexos
procedimentos de otimização de temperatura. Nos sistemas que dispõem de
gás de secagem em contra corrente, podem ser usados tanto tampões voláteis
quanto não-voláteis, pois qualquer material ou contaminação não volátil
depositada na câmara de ionização pode ser facilmente removida com
procedimentos de limpeza que não requerem o desligamento do sistema de
vácuo do espectrômetro de massas.
A interface APCI é, de modo geral, menos sensível a interferências
químicas do que a interface ESI, pois o processo de ionização na APCI é muito
eficiente, sendo o método de escolha para muitas drogas e metabólitos e
utilizada em larga escala na indústria farmacêutica. Triglicerídios, PCBs, HPAs,
ftalatos e ácidos graxos são alguns exemplos de analitos típicos para análise
em APCI (Niessen, 1995). Amostras que contém hetero-átomos como
benzodiazepinas e carbamatos também são passíveis de análise nesta
interface.
Amostras termolábeis e/ou fotossensíveis que possam se decompor
durante o processo de nebulização, que ocorre sob aquecimento, devem ser
evitadas assim como analitos que se encontrem carregados em solução, como
peptídeos, proteínas, aminoácidos e nucleotídeos, pois a sensibilidade na
detecção será reduzida. Ademais estas espécies tendem a ser termolábeis e,
devido ao alto peso molecular, são menos voláteis. A aplicação de CLAE-EMAPCI para a análise de NHPAs foi relatada inicialmente na década de 80
(Henderson et al.; 1983), mas devido à limitada sensibilidade deste método
40
naquela época, poucas aplicações são reportadas na literatura, como a
determinação de nitropirenos (Moriwaki et al.; 2000).
Substâncias
contendo
grupos
funcionais
eletronegativos
(NO2,
halogênios) ou que contenham carbonilas conjugadas, são passíveis de
ionização em APCI negativo, uma vez que a descarga de elétrons em APCI é
feita por agulha corona. A maioria das reações íon-molécula em APCI é do tipo
ácido-base em fase gasosa. Para operação em modo positivo, os íonsreagentes são ácidos e para operação em modo negativo, os íons reagentes
são bases. No entanto, o mecanismo de ionização predominante depende das
características químicas da fase móvel e da substância considerada.
O maior benefício da ionização a pressão atmosférica é que todos os
íons em fase gasosa sofrem colisões com as demais moléculas, resultando em
interações com todos os gases que se encontram nesta região no momento da
ionização. Os principais íons formados são N2+, O2+, H2O+e NO+ e na presença
de traços de água uma série de reações em cascata se inicia, resultando
principalmente na formação de íons agregados com água (clusters). Uma vez
que estes agregados com água são a principal fonte de íons reagentes, a
afinidade protônica dos mesmos em relação à afinidade protônica dos íons do
analito e dos íons do eluente possui grande efeito na sensibilidade do sistema
de detecção.
2.5) Comparação das Interfaces APCI e ESI
Nas aplicações de CLAE-EM, podem ser destacadas principalmente
duas técnicas de ionização, APCI e ESI.
ESI é o método de ionização à pressão atmosférica mais usado em
espectrometria de massas atualmente, embora seja um processo conhecido há
muitos anos. O primeiro relato sobre esta técnica de ionização foi feito por
Zeleny (1917) que descreveu como a aplicação de um potencial elétrico sobre
um capilar contendo solvente produzira a quebra do mesmo em finas gotículas.
Este processo é ainda hoje a base de funcionamento da maioria dos modelos
de interface ESI disponíveis.
Posteriormente, o primeiro relato do uso de electrospray em uma
interface foi feito por Dole e colaboradores (Dole et al., 1968) no final da
41
década de 1960. Eles investigaram a possibilidade de produzir íons em fase
gasosa a partir de macromoléculas em solução utilizando um spray
eletrostático à pressão atmosférica e demonstraram que a técnica proposta era
capaz de produzir íons em fase gasosa. Após este primeiro trabalho de
sucesso, apenas no final da década de 1970, deu-se continuidade às
pesquisas sobre o tema com os trabalhos de Thomson e Iribarne (Thomson,
1979; Iribarne, 1976). O acoplamento CLAE-EM-ESI foi reportado em seguida,
quase simultaneamente, por Yamashita e Whitehouse (Yamashita et al., 1984;
Whitehouse et al., 1985) e desde então, encontram-se na literatura inúmeras
aplicações sobre o tema.
Devido à grande semelhança entre as interfaces APCI e ESI, os
sistemas de CLAE-EM-API de última geração geralmente são equipados para
ambos os processos de ionização, requerendo um mínimo de interação do
operador ou modificação no equipamento.
As interfaces APCI diferem das interfaces ESI em dois aspectos
principais. O primeiro deles refere-se à inclusão de uma região aquecida que
vai além da extremidade do capilar de nebulização, através do qual passa um
fluxo de gás para vaporizar eluente(s) e analito(s).
O segundo aspecto refere-se à inclusão da agulha corona, para produzir
a descarga de elétrons que deflagra o processo de ionização. Portanto, em
contraste com a interface ESI, os processos de evaporação do solvente e de
formação de íons ocorrem separadamente e, desta forma, a ionização em
APCI ocorre na fase gasosa resultante do aquecimento do efluente nebulizado.
Por outro lado, na interface ESI, o efluente da coluna é nebulizado em uma
câmara de ionização a pressão atmosférica e a ionização ocorre como
resultado da ação de um campo elétrico. Em alguns sistemas a nebulização em
ESI é feita por um nebulizador pneumático (ES-pneumaticamente assistida),
que difere principalmente no processo de formação do spray.
Outra diferença muito importante entre as duas técnicas refere-se às
vazões de fase móvel empregadas. A interface ESI opera em vazões baixas,
na faixa de até nL/min., enquanto a interface APCI tem melhor performance em
vazões mais altas (mL/min). Vazões mais baixas até podem ser usadas em
APCI, mas neste caso a estabilidade da descarga da agulha corona pode
apresentar problemas. Enquanto ESI é uma técnica que favorece a
42
miniaturização, a redução das dimensões em APCI seria muito trabalhosa e
pouco proveitosa (Lemière, 2001).
Pelo fato do processo de ionização ocorrer em solução, de modo geral a
interface ESI é mais sensível aos efeitos de matriz e à composição de fase
móvel que a interface APCI. Em ESI, o pH dos solventes afeta diretamente o
processo de ionização uma vez que os analitos são íons em solução e pode
haver formação de adutos com cátions (Na+, K+) e ânions (Cl-, CF3 e COO-).
Logo, a otimização do pH pode afetar positiva ou negativamente a performance
desta interface. Em APCI, a escolha do solvente afeta diretamente o processo
de ionização, porém o efeito de pH é pouco pronunciado.
Outra forma de se comparar interfaces CLAE-EM é a avaliação de suas
figuras de mérito, ou seja, comparar seus limites de detecção e de
quantificação e/ou ainda, comparar o conteúdo de informação estrutural
fornecida. É importante ressaltar que o tipo de informação que se deseja
adquirir depende da finalidade da aplicação: Em uma análise qualitativa, por
exemplo, deve-se adquirir consistente informação acerca da estrutura química
dos íons e substâncias, enquanto em análise quantitativa, a presença de 1-3
picos distintos no espectro de massas é suficiente. Em relação às figuras de
mérito, torna-se difícil fazer uma comparação das interfaces CLAE-EM, uma
vez que é complicado extrair dados comparáveis da literatura e isto só seria
possível caso uma mesma substância fosse analisada por diferentes interfaces
(Niessen, 1995). Ademais, as diferenças em sistemas de detecção têm papel
importante nos valores obtidos.
Uma característica marcante da técnica de ESI é que a geração de íons
em fase gasosa é um processo suave, que permite a análise de substâncias
lábeis sem que haja comprometimento estrutural das mesmas. Incluem-se
entre as amostras mais indicadas para ESI aquelas carregadas em solução,
como proteínas, peptídeos, oligonucleotídeos e aminas quaternárias (em geral
macro moléculas), por exemplo, enquanto devem ser evitados compostos de
baixa polaridade, como HPAs e PCBs.
Já em APCI, são indicados compostos de menor peso molecular
(geralmente abaixo de 1000 Da) e de polaridade baixa a intermediária. Em
geral, substâncias não-voláteis devem ser evitadas, pois os analitos precisam
ter
certa
volatilidade,
devido
aos
43
mecanismos
envolvidos.
Espécies
previamente carregadas em solução e substâncias termolábeis devem ser
evitadas. Analitos típicos para APCI são HPAs, NHPAs, PCBs, ácidos graxos,
ftalatos e esteróides (Perez e Barceló, 2001; Ingelse et al., 2001).
Uma comparação sistemática de três diferentes técnicas de ionização
(ESI, APCI e APPI) foi feita por Straube e colaboradores (2004), que utilizaram
interfaces comerciais para a análise de aminas poliaromáticas e de substâncias
nitroaromáticas por CLAE-EM-EM.
2.6)
Espectrometria de Massas acoplada à Espectrometria de Massas
(EM-EM)
Técnicas de detecção que empregam múltiplas etapas de espectometria
de massas (EMn) oferecem grande especificidade para análises qualitativas.
Do ponto de vista quantitativo, a detecção por EMn apresenta sensibilidade e
precisão adequadas para muitas das determinações de interesse em análise
ambiental, pois permitem detectar as substâncias de interesse em misturas
complexas, com alta seletividade e com eficiente redução nos níveis de ruído
(background).
Além disto, a seletividade e especificidade de duas ou mais etapas de
EM (CLAE-EM-EM) tende a reduzir a complexidade dos procedimentos de
preparo de amostras, com baixos limites de detecção e com exatidão e
precisão adequadas.
Há sistemas de detecção que permitem várias etapas de isolamento e
fragmentação, dando origem a uma determinação extremamente seletiva e de
um modo geral, qualquer um dos íons gerados pode ser usado em análise
quantitativa, embora o sinal gerado caia com o aumento do número de etapas
de fragmentação e isolamento consecutivas. Atualmente, espectrômetros de
massas do tipo triplo quadrupolo (QqQ), Ion Trap (IT) e quadrupolo associado a
detecção por tempo de vôo (Q-TOF) são exemplos de sistemas disponíveis
comercialmente que podem empregar a detecção por EMn.
Além do alto custo e de serem mais complicados no que se refere a sua
operação e manutenção do que os sistemas IT, os sistemas de QqQ e Q-TOF
são limitados a apenas duas etapas de espectrometria de massas (EM-EM).
44
Além de possibilitar a realização de EMn, que oferece vantagens em
relação à obtenção de informação qualitativa adicional, sistemas IT permitem
adquirir espectros de varredura em alta velocidade, com boa resolução e com
maior sensibilidade do que sistemas QqQ. Ademais, os espectros de massas
gerados por IT no modo EM-EM são fáceis de ser interpretados, pois os
mecanismos de fragmentação são bem definidos, além de haver menor
fragmentação do que nos sistemas QqQ (Agilent Technologies, sem data).
As desvantagens dos sitemas IT estão relacionadas à menor precisão
na informação das massas (m/z) adquiridas (em relação ao Q-TOF), bem como
à menor sensibilidade para análises quantitativas do que os sistemas QqQ
devido ao mecanismo de funcionamento do IT, que será explicado
detalhadamente a seguir. Entretanto, levando-se em consideração o custo dos
equipamentos, a vantagem de um sistema IT está relacionada à flexibilidade de
análises que o mesmo oferece.
Um detector de massas do tipo IT (Figura 5) é composto por dois
eletrodos em forma de anel, ,que estão relacionados com a análise das massas
e por dois eletrodos do tipo “end caps”, que estão relacionados com o
isolamento das massas adquiridas, com o processo de dissociação induzida
por colisões (CID) e com o processo de ejeção por ressonância não linear. Há
também um sistema de aporte de gás (He), o qual está relacionado à
mobilidade dos íons (m/z) dentro do detector, bem como ao processo de CID e
à resolução de massas.
Figura 5: Detector de massas do tipo Ion Trap.
45
Inicialmente, ocorre acumulação dos íons que são formados na câmara
de ionização em pressão atmosférica. Em seguida, o Trap opera em
ressonância não linear, de forma a ejetar os íons de modo seqüencial, de
acordo com os interesses de cada análise. Desta forma, é possível empregar a
técnica de detecção por monitoramento de reações múltiplas (MRM), que
permite isolar um ou mais íons e fragmentá-los seletivamente, gerando vários
“íons filhos”, dos quais pode-se novamente isolar aqueles de interesse,
reiniciando assim o processo de fragmentação seletiva.
2.7)
Determinação de NHPAs por CLAE-EM-EM
Há relativamente poucos dados disponíveis na literatura
sobre o
comportamento de NHPAs por CLAE-EM-EM (Bonfanti et al., 1996; Moriwaki et
al., 2000; Williams e Perreault, 2000; Schauer et al., 2004; Straube et al.,
2004). Entretanto, nos últimos anos, o aumento no número de publicações
sobre aplicações desta técnica na determinação de substâncias poliaromáticas
é indicativo de sua viabilidade na determinação de NHPAs.
No trabalho de Bonfanti e colaboradores (1996), o estudo de NHPAs por
CLAE com interface do tipo Particle Beam (PB) gerou espectros de massas de
baixa qualidade tanto em modo de ionização negativo quanto positivo quando
foi empregada ionização por impacto de elétrons. Quando ionização química
com detecção em modo negativo foi empregada, melhores respostas em
termos foram obtidas e íons [M]- foram detectados predominantemente para a
maioria dos NHPAs estudados.
Moriwaki e colaboradores (2000) realizaram estudos com 1-nitropireno e
dinitro-pirenos. A formação de picos correspondentes aos íons de peso
molecular não foi observada por CLAE-EM-ESI, em modo negativo e em modo
positivo. Com interface APCI, em modo de ionização negativo, apenas íons [M]foram observados.
Straube e colaboradores (2004) compararam diferentes interfaces de
CLAE-EM (ESI e APCI) para a análise de 1,6-dinitropireno e observaram que
não houve ionização consistente em interface ESI. Por outro lado, observaram
46
a formação de íons negativamente carregados ([M]-) em interface APCI e
atribuíram este fato à capacidade aceptora de elétrons dos nitroaromáticos.
Schauer e colaboradores (2004) investigaram o comportamento de
alguns NHPAs (1- e 2-nitronaftalenos; 2-nitrofluoreno; 9-nitroantraceno e 1nitropireno, dentre outros) através de CLAE-EM-APCI com detecção por TOF.
Em modo de ionização positivo observaram predominantemente a formação de
íons do tipo [M+H]+, exceto no caso dos nitronaftalenos, onde observaram
predomínio dos íons do tipo [M+H-30]+. Em modo de ionização negativo,
observaram predominância do íon [M]- e do fragmento correspondente à perda
de 30 unidades de massa [M-30]-.
No estudo de NHPAs por CLAE-EM-ESI realizado por Williams e
Perreault (2000), não foram obtidas condições consistentes para gerar íons
positivos estáveis que permitissem o desenvolvimento de metodologia
sistemática para a detecção de NHPAs em modo de ionização positivo. No
entanto, em modo de ionização negativo foi observado que apenas os
compostos contendo grupos “puxadores” de elétrons foram prontamente
ionizados em modo negativo e também que, dentre os compostos estudados,
apenas
os
NHPAs
(1-nitronaftaleno,
9-nitroantraceno
e
1-nitropireno)
produziram fragmentação significativa, gerando íons do tipo [M]-, [M-H]- e [MH+16]-, que posteriormente sofreram perda de 30 u.m.a., gerando fragmentos
do tipo [M-30]-, [M-H-30]- e [M-H+16-30]-.
A perda de 30 unidades de massa a partir a partir do íon precursor de
NHPAs já foi observada anteriormente com outras técnicas de ionização, como
por exemplo impacto de elétrons com detecção de íons positivos, ionização
química em modo negativo e por MALDI em modo positivo e tem sido
interpretada por alguns autores como decorrente da perda de NO ([M-NO]- ou
[M-NO+H]+) (Korfmacher et al., 1987; Schauer et al., 2004).
No entanto, a redução na fonte de ionização que leva à formação de
uma amina ([M - 2O + 2H]- ou [M - 2O + 3H]+) também tem sido considerada
como hipótese à formação do fragmento correspondente à perda de 30
unidades de massa (Straube et al., 2004; Williams e Perreault, 2000; Bonfanti
et al., 1996). Esta hipótese é corroborada por estudo realizado em interface
APCI com substâncias nitradas e solventes deuterados, onde a perda de 28
unidades de massa foi observada e considerada conseqüência da formação de
47
amina contendo dois átomos de deutério (Karancsi e Slegel, 1999). Bonfanti e
colaboradores (1996) observaram a perda de 30 u.m.a. nos espectros da
maioria dos compostos nitrados estudados em modo de ionização negativo,
exceto no espectro do 1NPi, no qual o produto de redução não foi identificado.
Eles atribuem este fato à hipótese de que a reação de redução seja isômeroespecífica.
No trabalho de Moriwaki e colaboradores (2000), também não foi
observada a formação de produtos de redução ou de eliminação do grupo nitro
(NO2) nos espectros de massas obtidos em interface APCI dos nitropirenos
estudados (1-nitropireno; 1,3-, 1,6- e 1,8-dinitropirenos) em modo de ionização
positiva. No entanto, como aminopirenos (1-aminopireno; 1,3; 1,6 e 1,8diaminopirenos) formaram íons do tipo [M+H]+, foi sugerido que nitropirenos
não formam amino-derivados, ou seja, não sofrem redução em interfaces
CLAE-EM-APCI.
Por exemplo, Bezabeh e colaboradores (2003) observaram que a
técnica de ionização química em modo negativo apresenta maior seletividade
na ionização de substâncias contendo grupos eletronegativos, inclusive
NHPAs, em matrizes ambientais complexas.
Outra abordagem feita em relação à ionização de substâncias
policíclicas aromáticas considerando a afinidade protônica das espécies
(Takáts e Vékey, 1998). Eles sugerem que a ionização positiva em sistemas
APCI ou ESI não ocorre de forma satisfatória devido à afinidade protônica de
NHPAs ser geralmente menor do que a dos eluentes comumente usados em
CLAE em fase reversa, como acetonitrila e metanol. Isto é explicado devido ao
efeito de supressão provocado na presença destes eluentes, pois compostos
aromáticos de baixa polaridade possuem afinidade protônica menor ou igual do
que metanol ou acetonitrila e não são protonados na presença dos mesmos.
A presença destes íons em espectros de NHPAs obtidos por CLAE-EMESI em modo de ionização negativo, foi descrita por Williams e Perreault
(2000), que sugeriram que a natureza deste fragmento está relacionada à
perda de um próton e ao ganho de um átomo de oxigênio ([M-H+O]-) num
mecanismo de captura de elétrons via oxidação. Entretanto, esta oxidação ou
adição de 16 u.m.a. não foi observada em MALDI em modos positivo e
48
negativo, nem por ionização química em modo negativo. (Williams e Perreault,
2000).
49
CAPÍTULO 3
Objetivos
3.1) Objetivo Geral
Desenvolvimento e implementação de metodologia para a determinação
de Hidrocarbonetos Policíclicos Aromáticos Nitrados (NHPAs) em fuligem de
diesel.
3.2) Objetivos Específicos
ƒ
Otimização de metodologia para a detecção de NHPAs por EM-EM;
ƒ
Desenvolvimento de sistema de eluição para a separação de NHPAs
Cromatografia a Líquido de Alta Eficiência (CLAE);
ƒ
Validação da metodologia desenvolvida (CLAE-EM-EM);
ƒ
Determinação de HPAs e NHPAs em amostras de fuligem de diesel
fornecidas pela Petrobrás-BR, através da metodologia validada.
50
CAPÍTULO 4
Materiais & Métodos
4.1) Solventes
Metanol,
acetonitrila,
diclorometano
e
tolueno
grau
HPLC
ou
espectrocópico (Tedia Brazil) foram usados (Tabela 1).
Tabela 1: Especificação de solventes orgânicos utilizados
SOLVENTE
ESPECIFICAÇÃO
FABRICANTE
Metanol (CH3OH)
CLAE-ESPECTRO
Tedia Company, EUA
Acetonitrila (CH3CN)
CLAE-ESPECTRO
Tedia Company, EUA
Diclorometano (CH2Cl2)
UV/CLAE
Tedia Company, EUA
Tolueno (C6H5CH3)
UV-Análise de Resíduos
EM Science, EUA
51
4.2) Padrões
NHPAs sólidos com purezas maiores que 98% (Sigma; Aldrich - EUA)
foram adquiridos e utilizados sem purificação adicional.
As soluções de todos os NHPAs utilizados neste trabalho foram
preparadas a partir da dissolução dos respectivos sólidos. As pesagens foram
feitas em balança analítica com precisão de 0,01 mg.
4.3) Outros materiais
O material certificado de referência Fuligem de Diesel, SRM 2975 (NIST,
EUA) foi empregado para validação de metodologia analítica.
Nitrogênio líquido e hélio de alta pureza (PRAXAIR-White Martins, Brasil)
foram empregados no sistema de espectrometria de massas.
Colunas e pré-colunas (Vydac 201TP54 e Zorbax Eclipse XDB) de fase
reversa (C8, C18) foram empregadas no sistema CLAE.
Micropipetas de volume fixo e/ou variável e ponteiras descartáveis foram
utilizadas no preparo de soluções padrão e na manipulação dos extratos de
fuligem.
Filtros descartáveis de seringa foram empregados na filtração dos
extratos antes de análise por CLAE-EM (Tabela 2).
52
Tabela 2: Especificação de outros materiais utilizados
MATERIAL
ESPECIFICAÇÃO
FABRICANTE
Material certificado
Fuligem de Diesel
NIST, EUA
de referência
(SRM 2975)
Gases
N2 líquido He (Pureza >
White Martins
99,995%)
PRAXAIR,
Brasil
Colunas e pré-colunas
Zorbax Eclipse XDB
para CLAE
C8 (2.1 x 5 x 50)
201TP54
Agilent, EUA
Vydac, EUA
C18 (4.6 x 5 x 250)
Micropipetas e ponteiras de
(50, 100, 250, 500
volume fixo e/ou variável
e 1000 µL)
Filtros descartáveis de
(PTFE; 0,45 µm; 13 mm)
Gilson, França
Agilent, EUA
seringa
4.4)
Instrumentação
Balança analítica (Série GR, modelo GR-202 – AND, Japão), com
precisão de 0,01 mg, foi utilizada para pesagem de NHPAs sólidos e das
amostras de fuligem.
Com base nas altas taxas de recuperação relatadas na literatura
(Schauer et al., 2004; Cvacka et al., 1998) e visando diminuir o tempo total
gasto no procedimento analítico, o procedimento de extração de fuligem de
diesel desenvolvido neste trabalho foi realizado por banho de ultra-som (USC1800, Unique, Brasil).
Uma centrífuga (Excelsa II 206 BL – Fanem, Brasil) e um agitador Vortex
(AP 56 – Phoenix, Brasil) também foram usados no procedimento de extração
de amostras de fuligem.
53
Para separação e detecção das substâncias de interesse foram
empregados, um sistema de cromatografia a líquido de alta eficiência acoplado
a um sistema de espectrometria de massas (CLAE-EM) Agilent série 1100,
dotado de bomba quaternária, degaseificador, injetor automático, forno de
coluna e detector por espectrometria de massas (Agilent SL), com analisador
do tipo Ion Trap e interface por ionização a pressão atmosférica por ionização
química (APCI).
Uma estação de trabalho Agilent foi usada para aquisição de dados e
controle do sistema CLAE-EM.
Água ultrapura foi obtida por destilação seguida de tratamento em
sistema Simplicty (Millipore, EUA). Estufa (Icamo, modelo 3; Brasil) foi utilizada
para secagem da vidraria utilizada.
Todos os instrumentos utilizados neste trabalho são apresentados na Tabela 3.
Tabela 3: Especificação da Instrumentação utilizada
INSTRUMENTO
ESPECIFICAÇÃO
FABRICANTE
Série 1100
Agilent, EUA
Série 1100
Agilent, EUA
Ionização Química à Pressão
Agilent, EUA
Cromatógrafo a Líquido de Alta
Eficiência
Espectrômetro de Massas por captura
de íons (Ion Trap)
Interface CLAE-EM
Atmosférica (APCI)
Programa de tratamento e aquisição de
Versão 4.2
Agilent, EUA
Simplicity 185
Millipore, EUA
USC-1800
Unique, Brasil
AP 56
Phoenix, Brasil
Excelsa II 206 BL
Fanem, Brasil
Série GR, modelo GR-202
AND, Japão
Modelo 3
Icamo, Brasil
dados (ChemStation)
Sistema de purificação de água
Banho de ultra-som
Agitador Vortex
Centrífuga
Balança analítica
Estufa
54
4.5)
Limpeza e descontaminação de vidraria
Toda a vidraria empregada no trabalho foi descontaminada através de
várias etapas de limpeza. Recipientes e frascos usados na extração e
manipulação de amostras eram previamente rinsados com solvente orgânicos
(PA) para retirada de resíduos visíveis. Após esta etapa, a vidraria era imersa
por 12 horas em banho contendo detergente neutro, específico para limpeza de
vidraria (Extran Merck-Brasil ou Detertec, Vetec-Brasil). A vidraria era lavada
com água potável, depois com água ultra-pura e em seguida aquecida por 6 a
8 horas na temperatura de 250oC.
55
CAPÍTULO 5
Resultados & Discussão
5.1) Estudos de ionização de NHPAs em interface APCI-EM
Nos estudos de ionização, exceto quando mencionado no texto, 20 uL
de soluções contendo diferentes NHPAs foram injetados diretamente na
interface de ionização química à pressão atmosférica (APCI), sem uso de
coluna cromatográfica, na vazão de 0,3 mL/min.
Os estudos de ionização realizados neste trabalho utilizaram interface de
ionização química à pressão atmosférica (APCI), que foi escolhida por
apresentar melhor resposta para substâncias não-iônicas, como no caso das
substâncias de interesse. As características de interesse deste tipo de interface
foram discutidas no item 2.4.
5.1.1)
Avaliação dos padrões de fragmentação de 1-NPi com detecção
por varredura
Espectros de massas foram adquiridos, em ionização positiva e
negativa, por varredura, na faixa de m/z = 100-500 para soluções de 1-NPi
1000, 500 e 100 µg/L, preparadas em ACN. O sistema de eluição utilizado foi
MeOH/H2O (20:80). O padrão de fragmentação de 1-NPi foi avaliado
56
comparando-se as massas dos fragmentos e as áreas de cada um deles nos
dois modos de ionização. O programa de integração do EM foi utilizado com
esta finalidade.
Em modo de ionização negativo foi observada principalmente a
formação do íon de peso molecular m/z 247 ([M]-), que corresponde ao ganho
de 1 elétron.
O principal fragmento observado em modo negativo foi o íon de m/z 217
([M-30]-) que corresponde à perda de 30 unidades de massa. Outros
fragmentos observados em menor intensidade foram os íons de m/z 262 e 231.
O íon de m/z 262 corresponde a um mecanismo de oxidação e desprotonação
([M-H+16]-) (Williams e Perrault, 2000), enquanto o íon de m/z 231 corresponde
à perda de um átomo de oxigênio ([M-16]-) (Bonfanti et al., 1996). Traços do
fragmento de m/z 201, correspondente à perda de NO2 ([M-46]-) também foram
observados.
Em modo de ionização positivo, o principal íon observado foi o
fragmento correspondente à protonação da molécula original seguida de perda
de um átomo de oxigênio de (m/z 232; [M+H-O]+).
Nos espectros adquiridos em modo positivo, foi observada em menor
intensidade a formação do íon de pseudo-peso molecular (m/z 248; [M+H]+),
que corresponde à protonação da molécula original. Também foram
observados os fragmentos de m/z 218 ([M-30+H]+), que corresponde à perda
de 30 unidades de massa em decorrência da fragmentação do íon de m/z 248
([M+H]+) e traços do fragmento de m/z 202, que corresponde à protonação da
molécula original seguida de perda de NO2 ([M+H-46]+). Os resultados obtidos
em ambos os modos de ionização estão apresentados na Tabela 4 e na Figura
6.
57
Tabela 4: Principais íons observados nos espectros de varredura de 1NPi,
obtidos por CLAE-EM-APCI, em modo de ionização positivo e negativo.
Modo de
Íons Observados
Fragmentos
Possível
Ionização
(m/z)
observados
Explicação
APCI
247
[M]-
Captura de 1 elétron
Negativo
217
[M-30]-
Redução e/ou perda de NO
262
[M-H+16]-
Oxidação e desprotonação
231
[M-16]-
Perda de um átomo de oxigênio
201
[M-46]-
Perda de NO2
232
[M+H-O]+
Protonação seguida de perda
APCI
Positivo
de oxigênio
248
[M+H]+
Protonação
218
[M+H-30]-
Redução e/ou perda de NO
202
[M+H-46]-
Protonação seguida de perda
de NO2
Em nossos experimentos, as melhores condições de ionização foram
obtidas com fase móvel contendo os solventes próticos MeOH e H2O, o que de
acordo com a hipótese de Karancsi e Slegel (1999) favorece a ionização de
NHPAs, indicando que a redução dos mesmos é uma hipótese plausível. Os
espectros de massa da Figura 6 ilustram a diferença de intensidade de sinal
em ionização positiva e em ionização negativa, bem como os principais íons
observados em cada situação. Em modo negativo, os sinais obtidos para o íon
de m/z 247 [M]- foram sempre maiores do que os obtidos em modo positivo
para o íon de m/z 248 ([M+H]+).
58
a)
b)
Figura 6: Comparação dos espectros de 1NPi por CLAE-EM-APCI, com
detecção por varredura, em modo de ionização negativa (a) e positiva (b).
59
Como é possível observar na comparação das Figuras 6a e 6b, o sinal
em modo positivo tem intensidade que é, pelo menos, uma ordem de grandeza
inferior a obtida em modo positivo. Ademais, o espectro obtido em modo
positivo apresenta maior contribuição do background do sistema, com vários
íons inespecíficos.
A maior sensibilidade observada em modo de ionização negativo está
certamente relacionada com o caráter eletrofílico dos NHPAs, que podem
estabilizar uma carga negativa adicional obtida por um mecanismo de captura
de elétrons, fato também observado por outros autores (Bonfanti et al., 1996;
Moriwaki et al., 2000; Williams & Perreault, 2000; Bezabeh et al., 2003;
Schauer et al., 2004; Straube et al., 2004).
Este fato pode ser interpretado considerando-se, nas moléculas
estudadas, as estruturas de ressonância eletrônica do grupo nitro (NO2), que,
por ser eletronegativo, é considerado é um forte retirador de elétrons do
sistema aromático. Independente do posicionamento dos elétrons nas
estruturas de Lewis (Figura 7), o átomo de nitrogênio sempre possui uma carga
formal positiva e por efeito de indução diminui a densidade eletrônica do anel
aromático e aumenta seu caráter eletrofílico, favorecendo a captura de elétrons
disponíveis no sistema de ionização.
Em modo de ionização negativo, a conseqüência da descarga de
elétrons emitida pela agulha corona sobre as moléculas dos NHPAs na
interface APCI é a captura de um elétron, formando predominantemente um
ânion que tem o peso molecular da molécula original. A aromaticidade do anel
é mantida e por este motivo a carga negativa é bem estabilizada nos sistemas
aromáticos dos NHPAs.
60
O
N
+
_
O
Figura 7: estrutura de ressonância eletrônica do grupo nitro (NO2) na molécula
de 1NPi.
Em modo de ionização positivo, a formação de íons positivamente
carregados pode ocorrer por um mecanismo de captura de um próton ou
protonação, decorrente de um ataque eletrofílico. A conseqüência da entrada
de um eletrófilo no sistema aromático (neste caso, de um próton oriundo do
sistema de eluição) é a quebra da aromaticidade do sistema, gerando espécies
iônicas altamente instáveis. No sentido de reaver a aromaticidade e
conseqüentemente diminuir a energia potencial do sistema, pode ocorrer uma
reação de substituição eletrofílica aromática, pela abstração de um próton ou
pode haver a reversão da reação. Por este motivo, a ionização de NHPAs em
modo positivo não é favorecida, uma vez que os sistemas aromáticos dos
NHPAs não são capazes de estabilizar a carga positiva gerada pela captura de
um próton tão bem quanto são capazes de estabilizar a adição de uma carga
negativa. Deste modo, a ionização negativa é favorecida em detrimento da
positiva.
5.1.2) Avaliação dos padrões de fragmentação de outros NHPAs com
detecção por varredura
O interesse no estudo dos padrões de fragmentação de outros NHPAs
visou o posterior desenvolvimento de metodologia para sua determinação em
fuligem de diesel e devido aos resultados obtidos anteriormente com 1-NPi (ver
ítem 5.1.1), apenas o modo de ionização negativo foi considerado.
61
Espectros de massas com detecção por varredura (SCAN) foram
adquiridos na faixa de 100-500 (m/z) para estudo dos padrões de fragmentação
dos seguintes NHPAs selecionados: 9-nitroantraceno (9-NA), 2-nitrofluoreno (2NFl), 1- e 2-nitronaftalenos (1-NN e 2-NN) e para os seguintes di-NHPAs: 1,3-,
1,5- e 1,8-dinitronaftalenos (1,3-, 1,5- e 1,8-diNN), 2,5- e 2,7-dinitrofluorenos
(2,5- e 2,7-diNFLs). O sistema de eluição utilizado foi MeOH/H2O (20:80).
Os íons predominantes na fragmentação de cada NHPA estudado estão
descritos na Tabela 5. A aquisição de dados em varredura mostrou que os
principais íons gerados, para a maioria dos NHPAs, foram os respectivos íons
de peso molecular ([M]-), correspondentes à captura de elétron. Exceto no caso
do 2NFl e dos isômeros 2,5 e 2,7-diNFL, foi observada principalmente
formação de íons do tipo [M-H]-, correspondendo à captura de elétron e
desprotonação, em detrimento dos íons do tipo [M]-. No caso do 2-NFl, a
intensidade do íon de m/z 210 ([M-H]-) foi sempre maior do que a do íon de
peso molecular de m/z = 211 ([M]-) (Figura 8). A perda de um próton permite
que o carbono 9 do 2-nitrofluoreno participe do sistema aromático aumentando
a estabilidade do ânion obtido. Resultado análogo é obtido na ionização de
fluoreno, onde o íon de peso molecular e o íon de [M-H]- tem intensidades
comparáveis. O mesmo padrão de fragmentação foi observado no caso do 2,5diNFL, onde o íon de m/z 255 ([M-H]-) predominou em relação ao íon de m/z =
256 ([M]-). A presença de íons [M-H]- foi também observada nos espectros de
1-NPi, 9-NA e 1-NN obtidos por ionização em interface ESI (Williams e
Perreault, 2000), mas a razão entre as intensidades dos mesmos não foi
discutida por ela.
62
Tabela 5: Caracterização da fragmentação de NHPAs selecionados por CLAEEM-APCI, em modo negativo, com detecção por varredura.
NHPA
9-NA
PM
Íons (m/z)
Fragmentos
Possível
(g/mol)
Observados
observados
Explicação
223
223
[M]-
captura de elétron
193
[M-30]-
perda de NO ou redução na
fonte
2-NFl
211
238
[M-H+16]-
Oxidação e desprotonação
210 (>)
[M-H]-
Desprotonação
211 (<)
[M]-
captura de elétron
180
[M-H-30]-
perda de NO ou redução na
fonte e desprotonação
181
-
[M-30]
perda de NO ou redução na
fonte
1-NN
225
[M-H+16]-
Oxidação e desprotonação
173
173
[M]-
captura de elétron
218
218
[M]-
captura de elétron
172
[M-46]-
perda de NO2
188
[M-30]-
perda de NO ou redução na
2-NN
1,3diNN
1,5diNN
fonte
1,8diNN
233
[M-H+16]-
Oxidação e desprotonação
158
[M-60]-
Perda e/ou redução de 1 e/ou
2 grupos NO
255 (>)
[M-H]-
Desprotonação
e
256 (<)
[M]-
captura de elétron
2,7-
225 (>)
[M-H-30]-
perda de NO ou redução na
2,5-
256
diNFl
diNFl
fonte e desprotonação
226 (<)
-
[M-30]
perda de NO ou redução na
fonte
63
Figura 8: diferença de intensidades dos íons de m/z 211 e 210 no espectro de
varredura de 2NFl adquirido por CLAE-EM-APCI em modo de ionização
negativo.
Assim como observado para 1-NPi, nos espectros de varredura dos
demais NHPAs também foi identificada a perda de 30 unidades de massa ([M30]-) a partir do íon de peso molecular, que indica a perda de NO (Kormacher et
al., 1987; Schauer et al., 2004) ou um processo de redução na fonte (Bonfanti
et al., 1996; Williams & Perreault, 2000; Straube et al., 2004), conforme
discutido anteriormente.
No caso do 2NFl e dos isômeros 2,5 e 2,7-diNFL, os fragmentos de m/z 180 e
225 ([M-H-30]-) predominaram em relação aos fragmentos de m/z 181 e 226
([M-30]-), respectivamente, embora estes últimos também tenham sido
identificados em menor intensidade.
No caso do 1,8-diNN, houve predominância do fragmento de m/z 172
([M-46]-) em relação ao fragmento de m/z 188 ([M-30]-). Este fato sugere que a
perda de um dos grupos nitro (NO2) pode ser um processo importante para diNHPAs. Na investigação espectral não foi observada formação de nenhum
outro fragmento que indicasse a perda do segundo grupo NO2. Ainda no
64
espectro do 1,8-diNN, foi observada pequeno sinal do íon 158, que
correspondente ao íon [M-60]- e que poderia indicar a redução de um dos
grupos NO, a redução de ambos ou a perda de um deles e a redução de outro,
ou mesmo uma mistura destes mecanismos. Traços do fragmento de m/z 172
([M-NO2]-) também foram observados por Bonfanti e colaboradores (1996), em
espectros de massa obtidos por ionização química em modo negativo de 1,8diNN. Na fragmentação de alguns NHPAs selecionados (9-NA; 1,3-; 1,5- e 1,8diNN; 2-NFl), foi identificada a presença de íons do tipo [M-H+16]- (Tabela 5),
que correspondem à perda de um próton e ao ganho de um átomo de oxigênio
([M-H+O]-) num mecanismo de captura de elétrons via oxidação (Williams e
Perreault, 2000).
5.1.3) Avaliação da detecção de NHPAs por monitoramento de reações
múltiplas (MRM)
Foi realizada a comparação dos sinais e da seletividade da detecção de
NHPAs por monitoramento de reações múltiplas (MRM). O sistema de eluição
utilizado foi MeOH/H2O (20:80) e a aquisição de dados foi feita em modo de
ionização negativo, pelo monitoramento de duas etapas consecutivas de
fragmentação, considerando-se os principais íons de cada substância.
O modo de MRM foi escolhido para a detecção do 1-NPi devido a
seletividade
que
esta
forma
de
detecção
permite.
A
detecção
por
monitoramento de reações múltiplas (MRM) pressupõe o isolamento de um íon
e sua fragmentação após isolamento pelo sistema Ion Trap, o que torna a
detecção extremamente seletiva. Algumas das características desta técnica de
detecção foram discutidas anteriormente (ítem 2.6).
Com base nos resultados anteriores, foi avaliado que a melhor forma de
detecção de NHPAs seria o uso de MRM em modo negativo, isolando-se os
íons de peso molecular e monitorando-se o íon [M-30]- na etapa seguinte de
fragmentação. Exceto no caso do 2-NFl e dos isômeros 2,5 e 2,7-diNFL, foram
detectados os íons de m/z 180 e 225 ([M-H-30]-) a partir do isolamento e
fragmentação dos íons precurssores 210 e 255 do tipo [M-H]-, conforme
discussão anterior.
65
Uma limitação desta técnica de detecção é quando o sinal gerado pelo
íon proveniente do 2º estágio de fragmentação apresenta baixa intensidade. No
caso dos NHPAs estudados e especificamente no caso do 1-NPi, esta relação
é suficientemente elevada em modo de ionização negativo para a detecção
com baixos limites de detecção, como será discutido adiante. O modo de
ionização positivo foi também avaliado nestas condições, embora os próprios
estudos de varredura já apontassem para menor sensibilidade de detecção
neste modo.
Resultados típicos são apresentados na Tabela 6, onde é possível
verificar que a intensidade em MRM em modo negativo é cerca de 400 vezes
maior. Tal fato é certamente decorrente da ionização menos eficiente em modo
positivo.
Tabela 6: detecção de 1NPi por MRM em modo de ionização positivo e
negativo; sistema de eluição MeOH/H2O (20:80)
Modo de
EM1
EM2
Ionização
(m/z)
(m/z)
Negativo
247
217
[M]-
[M-30]-
248
218
[M+H]+
[M-30+H]+
Positivo
Intensidade de sinal (u.a)
1,9. 106
4,5. 103
Como o 1-NPi é o principal NHPA de interesse em fuligem de diesel e é
o único certificado em fuligem de diesel (SRM 2975 – NIST-EUA), grande parte
do trabalho subseqüente foi baseado na otimização de condições para a
detecção desta substância nesta matriz.
5.2) Otimização do sistema de eluição para determinação de NHPAs por
CLAE-EM
A resposta de 1-NPi com detecção por MRM, utilizando-se os íons
descritos acima (Tabela 6), foi comparada nos dois modos de ionização
(positivo e negativo) em função de três sistemas de solventes de eluição:
66
ACN/H2O, ACN/MeOH e MeOH/H2O, em proporções variáveis entre 20 a 80%
de cada solvente.
A ionização das moléculas do analito em interfaces APCI ocorre por
descarga de elétrons provenientes de uma agulha do tipo corona. Neste
momento, as moléculas do eluente encontram-se em excesso em relação às
moléculas do analito e são ionizadas preferencialmente. Conseqüentemente,
as moléculas do analito são ionizadas a partir das moléculas do eluente em
fase gasosa e, portanto, dependem da composição do meio (Niessen, 1995).
Foi observado que, em modo de ionização positivo, o íon de m/z 218
([M-30+H]+) gerou sinais comparáveis ao ruído eletrônico nos três sistemas de
eluição testados, o que, mais uma vez confirmava a inviabilidade de detecção
deste NHPA por MRM neste modo. Em modo negativo (Figura 6), os sinais
obtidos para o íon de m/z 217 ([M-30]-) foram sempre cerca de três ordens de
grandeza maiores do que os resultados obtidos em modo positivo para o íon de
m/z 218 ([M-30+H]+) (Tabela 6).
A fase móvel MeOH/H2O (80:20) apresentou os sinais de maiores
intensidades e melhores relações sinal/ruído em modo de ionização negativo
(Figura 9). Esta composição de fase móvel foi adotada nas etapas posteriores
do trabalho. O aumento de sinal com metanol está relacionado às reações de
transferência de carga em CLAE-EM-APCI, pois o uso de ACN leva à redução
da sensibilidade na medida. A redução da detecção de 1-NPi em sistemas de
eluição contendo ACN foi anteriormente observada em interface ESI (Williams
e Perreault, 2000).
67
Figura 9: Cromatograma e espectro de massas de 1NPi (15 µg/L) obtido por
CLAE-EM-APCI, com detecção por MRM em modo de ionização negativo.
5.3) Comparação dos fatores de resposta de soluções-padrão de 1-NPi
preparadas em diferentes solventes, por injeção direta (sem coluna)
Foram preparadas soluções de 1-NPi com concentrações de 1, 10, 50,
100 e 500 µg/L em ACN, MeOH e DCM e foram injetados 20 µL de cada uma
das soluções, diretamente no espectrômetro de massas, sem uso de coluna
cromatográfica, na vazão de 0,3 mL/min. O sistema de eluição utilizado foi
MeOH/H2O (80:20). A aquisição de dados foi feita por MRM, em interface APCI
com ionização negativa.
DCM, MeOH e ACN foram selecionados por serem alguns dos principais
solventes orgânicos usados em extrações de substâncias orgânicas ou como
fase móvel em CLAE. DCM é particularmente importante por ser um solvente
de escolha na extração de HPAs e NHPAs de amostras sólidas (Guillén, 1994).
A ionização em modo negativo apresentou maiores sinais em soluções
preparadas em metanol, que foi, portanto, usado na preparação das soluções
de NHPAs estudadas neste trabalho.
No desenvolvimento do trabalho foi observada forte redução do sinal na
injeção direta de soluções preparadas apenas em DCM, onde não era possível
detectar 1-NPi. Este fato afetou de forma drástica o desenvolvimento do
trabalho conforme será discutido adiante, já que inicialmente era pretendido
68
fazer injeção direta no sistema de CLAE-EM e tirar proveito da seletividade do
sistema de detecção.
5.4)
Otimização da vazão do sistema de eluição
A influência da vazão do sistema de eluição de CLAE no sinal de
espectrometria de massas foi avaliada utilizando-se detecção por MRM e
injeção direta no espectrômetro de massas. Duas concentrações diferentes de
1-NPi (100 e 500 µg/L; MeOH) foram avaliadas em vazões de de 0,3 a 0,5
mL/min do sistema de eluição MeOH/H2O (20:80). As respostas relativas para
injeção de 20 uL de soluções de 1-NPi nas diferentes vazões são apresentadas
na Figura 10. Na menor vazão há a maior resposta relativa, como seria de se
esperar, pois há menor diluição do 1-NPi.
4,00E+07
3,50E+07
3,00E+07
2,50E+07
área (EIC m/z = 217) 2,00E+07
1NPi 500 ppb
1NPi 100 ppb
1,50E+07
1,00E+07
5,00E+06
0,00E+00
0,3
0,4
0,5
vazão de fase móvel (mL/min)
Figura 10: Variação do sinal de soluções de 1-NPi em função da vazão do
sistema de eluição
5.5)
Otimização de parâmetros eletrônicos do espectrômetro de massas
para determinação de 1-NPi
A otimização de parâmetros eletrônicos do espectrômetro de massas foi
realizada com infusão de solução de 1-NPi (100 µg/L; MeOH) diretamente no
69
espectrômetro de massas, em vazão constante de 300 µL/min e monitoramento
do íon de m/z = 247. Foram otimizadas (automaticamente através da estação
de trabalho do equipamento) as voltagens para os seguintes parâmetros do
espectrômetro de massas: capilar, skimmer, saída do capilar, octapolos, trap
drive e lentes (Tabela 7).
Tabela 7: Valores dos parâmetros do espectrômetro de massas
otimizados para a detecção de 1-NPi
PARÂMETRO
VALOR OTIMIZADO
CAPILAR
1000 V
SKIMMER
-33,1 V
SAÍDA DO CAPILAR
-107,4 V
OCTAPOLO 1 DC
-4,4 V
OCTAPOLO 2 DC
-1,37 V
TRAP DRIVE
40,03 V
OCTAPOLO RF
136 V
LENTE 1
0,82 V
LENTE 2
33,6 V
TARGET MASS
30.000
TEMPO DE ACUMULAÇÃO MÁXIMO
50 ms
70
5.6)
Otimização de parâmetros da interface APCI para determinação de
1-NPi
A ionização em APCI acontece em fase vapor, logo é influenciada
diretamente pela temperatura de vaporização (Tvap) no nebulizador e pela
temperatura de secagem (Tsec) do spray na interface e a formação do aerossol
é um parâmetro crítico no processo de ionização nesse tipo de interface.
Para auxiliar o processo de secagem do aerossol na interface APCI, o
equipamento utilizado neste trabalho dispõe de um mecanismo auxiliar que
fornece um aporte de gás (N2) em sentido contrário ao orifício de entrada do
capilar do espectrômetro de massas.
Condições de CLAE-EM iguais às descritas no item 5.5 foram usadas neste
experimento. Além destas, foi usada a vazão de gás de secagem de 5 L/min
recomendada (Agilent Technologies, sem data) para a interface APCI na vazão
de eluente empregada (0,300 mL/min) e embora a pressão do gás de
nebulização também possa ser otimizada, foi usado o valor de 60 PSI.
Para a otimização da temperatura de vaporização e da temperatura de
secagem, foram usadas soluções de 1-NPi de diferentes concentrações (5 e
100 µg/L; MeOH) e dois experimentos foram realizados. No primeiro, variou-se
a temperatura de vaporização em função da temperatura de secagem fixada
em 350°C. Os melhores resultados foram obtidos na faixa de 350-400°C, para
ambas as concentrações estudadas (Figura 11a-b).
Em função dos resultados obtidos na avaliação da temperatura de
vaporização, a temperatura de secagem foi avaliada em duas temperaturas de
vaporização (350°C e em 400°C). Soluções de 1-NPi 5 e 100 µg/L foram
estudadas e os resultados obtidos estão apresentados na Figura 12a-b.
Para as duas concentrações estudadas, os melhores resultados, isto é
os sinais de maiores intensidades, foram obtidos em temperatura de
vaporização de 350°C. A melhor temperatura de secagem para a solução de 5
µg/L foi de 350°C e para a solução de 100 µg/L foi de 300°C. Certamente esta
diferença está relacionada às concentrações avaliadas em cada caso, pois as
respostas não são proporcionais para as duas soluções em cada temperatura.
71
Como a análise de amostras contendo baixas concentrações de NHPAs,
era de interesse do método, tanto a temperatura de vaporização quanto a
temperatura de secagem foram mantidas em 350°C.
72
Otimização da Temperatura de Vaporização; 1NPi 5 ug/L (MeOH)
1,80E+06
1,60E+06
1,40E+06
área EIC 217 (MRM)
1,20E+06
1,00E+06
8,00E+05
6,00E+05
4,00E+05
2,00E+05
0,00E+00
220
250
280
320
350
380
400
450
Temperatura de Vaporização (°C)
Otimização da Temperatura de Vaporização; 1NPi 100 ug/L (MeOH)
3,50E+07
3,00E+07
área EIC 217 (MRM)
2,50E+07
2,00E+07
1,50E+07
1,00E+07
5,00E+06
0,00E+00
220
250
280
320
350
380
400
450
Temperatura de Vaporização (°C)
Figura 11: Variação da área de sinal de soluções de 1-NPi em função da
temperatura de vaporização: (a) 1-NPi 5 µg/L; (b) 1-NPi 100 µg/L
73
Otimização da Temperatura de Secagem; 1NPi 5 ug/L (MeOH)
2,00E+06
1,80E+06
1,60E+06
área EIC 217 (MRM)
1,40E+06
1,20E+06
VAP TEMP = 350°C
VAP TEMP = 400°C
1,00E+06
8,00E+05
6,00E+05
4,00E+05
2,00E+05
0,00E+00
300
335
350
Temperatura de Secagem (°C)
Otimização da Temperatura de Secagem; 1NPi 100 ug/L (MeOH)
3,50E+07
3,00E+07
área EIC 217 (MRM)
2,50E+07
2,00E+07
VAP TEMP = 350°C
VAP TEMP = 400°C
1,50E+07
1,00E+07
5,00E+06
0,00E+00
300
335
350
Temperatura de Secagem (°C)
Figura 12: Variação da área de sinal de soluções de 1-NPi em função da
temperatura de secagem. (a) 1-NPi 5 µg/L; (b) 1-NPi 100 µg/L
74
5.7) Estudos de Extração (I): Avaliação da extração de 1-NPi com
detecção por injeção direta
Extração ultra-sônica foi escolhida para realizar a extração de NHPAs de
fuligem de diesel. Esta técnica de tem sido rotineiramente utilizada em nosso
laboratório para a determinação de HPAs (Pereira Netto et al., 2000, 2001,
2002a,b) e mais recentemente para a extração de metais (Soriano et al., 2006).
Ela apresenta vantagens como rapidez, custo relativamente baixo e tanto
reprodutibilidade quanto robustez adequadas.
Substâncias policíclicas aromáticas com substituintes polares (nitro,
amino e hidroxi derivados) têm sido caracterizadas em materiais certificados de
referência para material particulado de diesel, tanto por CGAR-EM quanto por
CLAE-EM (Bayona et al, 1988).
O material de referência certificado SRM 2975 (National Institute of
Standards & Technology - NIST) é um padrão de referência internacional para
a avaliação de metodologias analíticas empregadas na determinação de HPAs
em material particulado de diesel e matrizes similares. Dentre os NHPAs,
fornece informação acerca da concentração de 1-NPi (36 mg/Kg).
O material de referência (fuligem de diesel; SRM 2975; NIST, EUA), foi
armazenado em geladeira, dentro de dessecador de vidro, destinado
exclusivamente a esta finalidade, no qual a sílica era periodicamente seca. O
dessecador e o frasco contendo tal padrão eram retirados da geladeira pelo
menos 20 minutos antes da pesagem, até estabilização da temperatura. Em
seguida, a fuligem era retirada do frasco com o auxílio de espátula de vidro e a
pesagem do material realizada em balança analítica com precisão de 0,01 mg.
O material era pesado diretamente no recipiente onde era realizada a extração.
Imediatamente após a pesagem, o mesmo era coberto com papel alumínio e
levado à capela de exaustão, onde o solvente de extração era adicionado.
Nesta primeira parte dos estudos de extração, foram extraídas
inicialmente massas de cerca de 20 mg (cerca de 720 ng de 1-NPi). As
condições de extração foram avaliadas e otimizadas considerando-se a
eficiência e a recuperação obtida em cada conjunto de situações avaliada.
Os extratos obtidos na primeira parte dos estudos de extração foram
analisados por injeção direta (sem coluna cromatográfica) e, exceto quando
75
mencionado no texto, foram injetados 20 µL de cada extrato diretamente no
espectrômetro de massas, na vazão de 0,3 mL/min.
É importante ressaltar que até esta etapa, o trabalho foi realizado por
injeção direta das soluções de NHPAs no espectrômetro de massas, ou seja,
até este momento o sistema de CLAE era utilizado apenas como sistema de
injeção automático, sem coluna cromatográfica.
5.7.1) Extração de SRM 2975 com ultra-som e diclorometano
Para a realização dos experimentos de extração, o solvente de escolha
foi DCM, pois este é um dos solventes mais eficientes para a extração de
NHPAs de amostras sólidas (Guillén, 1994).
Alíquotas de cerca de 20 mg de SRM 2975 foram pesadas em tubo de
ensaio e submetidas a três etapas de extração em banho de ultra-som (15 mL
de DCM; 20min cada). Ao término de cada etapa de sonicação, o extrato
parcial era submetido à centrifugação (5 min, 3500 RPM). Após centrifugação,
o sobrenadante de cada etapa, foi retirado e transferido para balão volumétrico,
cujo volume era completado com DCM.
Considerando-se a concentração de 1-NPi na amostra certificada (36
mg/kg) e a massa de amostra certificada pesada, a concentração do extrato
bruto resultante era da ordem de 14,4 µg/L. Uma alíquota de 10 mL deste
extrato foi concentrada sob fluxo de N2 até 1mL, ([1-NPi] ~144 µg/L), filtrada e
analisada. A Figura 13 representa o procedimento de extração realizado.
76
20 mg
SRM 2975
15 mL DCM;
U.S.; 20 min.
Centrifugar
(5min, 3500 RPM)
Repetir 3 vezes
Retirar
sobrenadante e
transferir
Extrato bruto
(DCM; 50 mL);
[1-NPi]~14,4 µg/L
1)
2)
alíquota 10 mL
N2 (g)
3) filtração
Extrato
concentrado (DCM;
1 mL);
[1-NPi]~ 144 µg/L
CLAE-EMEM
Figura 13: Avaliação da detecção de 1-NPi após procedimento de extração de
material certificado (NIST, SRM 2975) com ultra-som e DCM.
Os extratos obtidos em DCM não apresentaram sinal de resposta de 1NPi. Na tentativa de solucionar a questão que se apresentava, vários
procedimentos foram realizados e a resposta de 1-NPi era avaliada após cada
um deles: 1) troca de solvente para ACN e para MeOH após a extração com
DCM; 2) extração ultra-sônica com metanol e com tolueno; 3) extração com
agitação mecânica; 5) adição de solução padrão de 1-NPi aos extratos obtidos
com DCM.
Nenhuma destas intervenções resultou na detecção de 1-NPi e foi
verificado que a interferência do DCM na ionização daquele NHPA era crítica.
Desta forma, foi decidido usar uma coluna cromatográfica para a separação
prévia do DCM e do 1-NPi nos extratos, antes da transferência para a interface
de ionização.
77
5.8) Avaliação do efeito do DCM na detecção de 1NPi por CLAE-EM-EM
Os experimentos anteriores (nos quais a detecção de 1-NPi foi realizada
por injeção direta) demonstraram que há influência direta na determinação de
1NPi por CLAE-EM/APCI, em modo negativo, de acordo com a presença de
DCM em solução.
Diante da impossibilidade em detectar 1-NPi em soluções preparadas
apenas em DCM, através de injeção direta no sistema de espectrometria de
massas,
foi
introduzida
uma
etapa
cromatográfica
na
metodologia
desenvolvida, a fim de avaliar se a separação do solvente (DCM) e da
substância de interesse (1-NPi) produziria resultado positivo em sua detecção
por APCI em modo negativo.
Dada a ampla e consagrada utilização de colunas de fase reversa para a
separação de HPAs e NHPAs (Wise et al, 1993; Furton et al., 1993) e dadas as
características físico-químicas dos mesmos, foram avaliadas duas colunas
cromatográficas de fase reversa do tipo octadecilsílica (Tabela 8).
Tabela 8: Colunas cromatográficas estudadas na separação de DCM e 1-NPi
Nome comercial
Diâmetro
Tamanho de
Comprimento
Interno (mm)
Partícula (um)
(mm)
Zorbax Eclipse XDB
2.1
5
50
Vydac 201TP54
4.6
5
250
Nos experimentos com a coluna Zorbax Eclipse XDB, foram utilizadas
soluções individuais de 1-NPi, com concentração 1000 µg/L em DCM e em
MeOH e suas respostas foram avaliadas em função de fases móveis contendo
ACN (100%) e de composição MeOH/H2O (20:80), com vazão de 0,3 mL/min e
detecção por CLAE-EM-APCI, em modo negativo (MRM, m/z 247/217).
Nos experimentos com a coluna Vydac 201TP54, foram preparadas
soluções individuais de 1-NPi de concentração 100 e 1000 µg/L em diferentes
composições de DCM e em MeOH (0 a 100%) e suas respostas foram
78
avaliadas utilizando como fase móvel apenas MeOH, com vazão de 1 mL/min e
detecção por CLAE-EM-EM-APCI, em modo negativo (MRM, m/z 247/217).
Os resultados obtidos com o uso da coluna Zorbax Eclipse XDB não
foram satisfatórios e seu o uso foi descartado. Dadas as características
estruturais desta coluna, a mesma opera em baixas vazões, o que por sua vez
prejudica a ionização dos analitos na interface APCI, vide o mecanismo de
ionização que ocorre neste tipo de interface, descrito anteriormente (ver item
2.4).
Por outro lado, os resultados obtidos com a coluna Vydac 201TP54 foram
promissores e satisfatórios e sendo assim, todas as etapas subseqüentes
deste trabalho foram realizadas com a coluna Vydac 201TP54, a qual
apresenta performance otimizada em vazões mais altas do que a coluna
Zorbax Eclipse XDB, favorecendo o processo de ionização na interface APCI.
A fim de obter uma avaliação mais detalhada da influência de DCM na
ionização de 1-NPi por APCI em modo de ionização negativo (MRM m/z
247/217) e de avaliar se havia uma condição analítica que permitisse a
presença de DCM em solução sem que isto prejudicasse sua detecção por este
modo de ionização, foram analisadas soluções de 1-NPi de concentração 100 e
1000 µg/L, preparadas em diferentes composições de DCM e MeOH.
Ao comparar as soluções preparadas em 100% de cada solvente, foi
verificado que a solução preparada apenas em DCM apresentava sinal
reduzido em cerca de três ordens de grandeza em relação à solução preparada
em MeOH. A Figura 14 apresenta a variação do sinal de 1-NPi em função da
porcentagem de DCM em solução.
79
3,20E+07
3,10E+07
área EIC 217 (MRM)
3,00E+07
2,90E+07
2,80E+07
2,70E+07
2,60E+07
2,50E+07
0
20
30
40
50
60
% DCM
Figura 14: Variação do sinal de 1-NPi em função da concentração de DCM na
solução.
Em virtude do demasiado efeito de solvatação exercido pelo DCM sobre
as moléculas de 1-NPi (diminuindo a interação das mesmas com a coluna), foi
observado alargamento dos picos cromatográficos de acordo com o aumento
da % de DCM nas soluções, que ademais apresentaram aspecto “serrilhado”.
Tão pouco foi possível realizar integração automática dos picos, sendo
necessário proceder de forma manual. Assim, para tornar o procedimento de
integração manual mais consistente, foi necessário utilizar a ferramenta de
suavização de picos cromatográficos (smooth chromatogram) disponível no
software de tratamento e análises de dados do equipamento, tornando possível
realizar a integração de forma mais uniforme.
A composição DCM/MeOH (30:70) apresentou sinal ligeiramente maior
que as demais, indicando que o DCM pode, de alguma forma, facilitar o
processo de transferência de cargas em interface APCI. A partir da composição
de DCM/MeOH (40:60) foi observado alargamento significativo dos picos
cromatográficos, resultando em diminuição de aproximadamente 10% das
áreas medidas.
80
Estes resultados são importantes, pois viabilizam o uso de DCM para a
extração dos NHPAs de interesse, sem que haja necessidade de eliminá-lo
totalmente do extrato, visto que este solvente sempre foi nossa primeira opção
para o processo de extração.
A composição DCM/MeOH (30:70) foi escolhida e fixada para a
composição final dos extratos de 1NPi em fuligem de diesel a serem estudados
posteriormente. Com esta condição, não foi necessário introduzir uma etapa
adicional de eliminação do DCM por evaporação, que poderia acarretar na
perda por volatilização dos compostos de interesse (sobretudo dos mais leves),
diminuição da eficiência e aumento do tempo total de análise da metodologia
desenvolvida.
A Tabela 9 apresenta as condições otimizadas para a determinação de
NHPAs em fuligem de diesel (FD) por CLAE-EM-APCI. Os parâmetros
eletrônicos do espectrômetro de massas utilizados foram aqueles apresentados
na Tabela 7.
Tabela 9: Parâmetros analíticos otimizados para a determinação de 1-NPi em
FD
PARÂMETRO
OTIMIZAÇÃO
Método de extração
Ultra-som
Solvente de extração
DCM
Composição do extrato de FD
DCM/MeOH (30:70)
Coluna cromatográfica (sistema CLAE)
Vydac 201TP54 (ODS; 4.6mm; 5um; 250mm)
Fase Móvel
MeOH (100%)
Volume de injeção
20 uL; injeção automática
Vazão de fase móvel
1 mL/min
Interface CLAE-EM
APCI
Modo de ionização
Negativo
Temperatura de vaporização
350°C
Temperatura de secagem
350°C
Vazão do gás de secagem
5 L/min
Pressão de nebulização
60 PSI
Modo de detecção (EM/ION TRAP)*
MRM
81
5.9) Figuras de Mérito do método desenvolvido
De modo geral, as calibrações foram realizadas nas faixas de 0,5 a 15
µg/L ou de 5 a 50 µg/L, em função da massa de amostra extraída e, portanto,
da concentração de 1-NPi esperada. Padrões e extratos foram analisados em
triplicata nas condições das Tabelas 7 e 9 para a quantificação de 1-NPi nos
diferentes experimentos de extração realizados. Valores experimentais dos
coeficientes de correlação e dos limites de detecção (3*S/N) e de quantificação
(10*S/N) são apresentados na Tabela 10.
Tabela 10: Figuras de mérito do método para detecção de 1NPi em FD
Região da curva
Coeficiente de
Em solução
Massa injetada*
Em amostra**
de calibração
correlação
(µg/L)
(pg)
(mg/Kg)
(µg/L)
LD
LQ
LD
LQ
LD
LQ
0,5 a 15
> 0,999
0,2
0,5
3
10
1,5
5,0
5 a 50
> 0,999
1,2
4,2
24
84
3,0
10,0
LD = limite de detecção; LQ = limite de quantificação.
*calculado considerando-se 20 µL
**calculados em relação às massas de SRM extraídas em diferentes experimentos
O limite de detecção calculado para o método desenvolvido (0,2 µg/L) é
melhor do que o obtido por Moriwaki (2000) (25 pg em termos de massa
injetada) por CLAE-EM-APCI foram calculados, embora tenham sido piores que
os obtidos por Bonfanti (1996) (5 pg em termos de massa injetada) através de
CLAE-EM-PB. O limite de detecção calculado também é melhor que o valor
apresentado por Schauer (2004) (0,8 µg/L em solução) em análises conduzidas
por CLAE-EM-APCI-TOF. Entretanto deve ser considerado que os diferentes
arranjos experimentais utilizados (fontes, interfaces, sistema de espectrometria
de massas etc) não permitem uma comparação direta destes resultados.
Valores dos coeficientes de correlação e dos limites de detecção (LD) e
de quantificação (LQ) expressos em termos do método desenvolvido e das
massas estudadas (~2 mg de FD) são também apresentados na Tabela 10.
Estes resultados indicam que é possível detectar até cerca de 1,5 mg de 1-NPi
por Kg de FD.
82
5.10) Estudos de Extração (II): Avaliação da extração de 1-NPi por CLAEEM
Após a introdução da etapa cromatográfica e da definição dos demais
parâmetros analíticos do método, foi realizada nova etapa de otimização da
extração, na qual todos os procedimentos avaliados foram realizados por
extração em banho de ultra-som e todos os extratos obtidos tinham
composição final de DCM/MeOH (30:70). Nesta etapa, também foi utilizado o
material de referência certificado.
Nos experimentos descritos abaixo, sempre foi utilizada coluna Vydac
201TP54 (ODS; 4.6mm; 5um; 250mm). A aquisição de dados foi feita sempre
por CLAE-EM-APCI, em modo de ionização negativo e com detecção por MRM
(m/z, 247/217). O volume de solução injetada foi sempre 20 µL. Exceto quando
mencionado no texto, a fase móvel empregada foi sempre MeOH (100%), em
vazão de 1,0 mL/min. As demais condições utilizadas foram aquelas descritas
nas tabelas 8 e 9.
As massas de material certificado empregadas inicialmente foram de
cerca de 20 mg e posteriormente as condições foram otimizadas para a
extração de cerca de 2 mg, visando atender às massas de amostras de fuligem
disponíveis.
Foram pesados cerca de 20 mg de SRM 2975 em tubo de centrífuga e
foram realizadas quatro etapas de extração em banho de ultra-som (4 mL de
DCM, 3 min cada). Ao término de cada etapa de sonicação, o extrato parcial foi
submetido à centrifugação (5 min, 3500 RPM) e após cada etapa de
centrifugação o sobrenadante foi retirado e transferido para um balão
volumétrico de 50 mL. Ao término das quatro etapas de extração, o extrato
bruto foi avolumado para 50 mL com MeOH e a concentração de 1-NPi
resultante era de cerca de 15 µg/L em composição final de DCM/MeOH
(30:70). A Figura 15 representa o procedimento empregado.
83
20 mg
SRM 2975
4 mL DCM
U.S.; 3 min.
Centrifugar
(5min; 3500 RPM)
1) Repetir 4 vezes;
2) Adicionar MeOH qsp...50 mL
Retirar sobrenadante
e transferir
Extrato bruto
(DCM/MeOH; 30:70)
(50 mL; [1-NPi]~15 µg/L)
1) Alíquota 1mL
CLAE-EM-EM
2)Filtração
Figura 15: Procedimento de extração de cerca de 20 mg SRM 2975 em
condições otimizadas
Em seguida, foram avaliados dois procedimentos de extração de cerca
de 2 mg de material certificado SRM 2975:
Com o primeiro procedimento (Figura 16), foram realizados diversos
experimentos nos quais foram pesados cerca de 2 mg de SRM 2975 em tubo
de centrífuga, e foram realizadas quatro etapas de extração em banho de ultrasom (1 mL de DCM; 5 min cada). Ao término de cada etapa de sonicação, o
extrato parcial foi submetido à centrifugação (5 min, 3500 RPM) e após cada
etapa de centrifugação o sobrenadante foi retirado e transferido para uma
proveta. Ao término das quatro etapas de extração, o extrato bruto foi
avolumado para 13 mL com MeOH e a concentração de 1-NPi resultante era
de cerca de 6 µg/L em composição final de DCM/MeOH (30:70).
No segundo experimento (Figura 17), foram realizados diversos
experimentos pesados cerca de 2 mg de SRM 2975 em tubo de centrífuga, o
qual foi submetido a seis etapas de extração em banho de ultra-som (1 mL de
DCM; 5 min cada). Ao término de cada etapa de sonicação, o extrato parcial foi
84
submetido à centrifugação (5 min; 3500 RPM) e após cada etapa de
centrifugação o sobrenadante foi retirado e transferido para uma proveta. Ao
término das seis etapas de extração, o extrato bruto foi avolumado para 20 mL
com MeOH e a concentração de 1-NPi resultante era de cerca de 4 µg/L em
composição final de DCM/MeOH (30:70). As Figuras 16 e 17 representam os
dois procedimentos avaliados.
2 mg
SRM 2975
1 mL DCM
U.S.; 5 min.
Centrifugar
(5min; 3500 RPM)
1)Repetir 4 vezes
2) Adicionar MeOH qsp...13 mL
Retirar sobrenadante
e transferir
Extrato bruto
(DCM/MeOH; 30:70)
(13 mL; [1-NPi]~ 6 µg/L)
1) Alíquota 1mL
CLAE-EM-EM
2)Filtração
Figura 16: Procedimento de extração de cerca de 2 mg SRM 2975 em
condições otimizadas, após 4 etapas de extração
85
2 mg
SRM 2975
1 mL DCM;
U.S.; 5 min.
Centrifugar
(5min; 3500 RPM)
Repetir 6 vezes;
adicionar MeOH qsp...20 mL
Retirar sobrenadante
e transferir
Extrato bruto
1) Alíquota 1mL
(DCM/MeOH; 30:70)
(20 mL; [1-NPi]~4 µg/L)
CLAE-EM-EM
2)Filtração
Figura 17: Procedimento de extração de cerca de 2 mg SRM 2975 em
condições otimizadas, após 6 etapas de extração
Em todas as condições avaliadas (Figuras 15, 16 e 17) eram adicionados ao
extrato volumes suficientes de metanol para se obter uma composição
semelhante a dos padrões. A recuperação de 1-NPi calculada em ambos os
casos é apresentada na Tabela 11.
Tabela 11: Avaliação da recuperação de 1-NPi em SRM 2975
Massa de SRM 2975
Etapas de extração
Recuperação (%)
20 mg
4
102%
2 mg
4
80 a 100%.
2 mg
6
76 a 91%.
Como se pode verificar, a recuperação do método usando 2 ou 20 mg do
material certificado apresentou resultados comparáveis. O mesmo foi
observado com relação ao número de etapas para a massa de 2 mg. A
importância da otimização do método para massas muito pequenas estava
relacionada às massas de fuligem de diesel disponíveis para a análise, que
encontravam-se na faixa de 2 mg.
86
5.11) Avaliação da recuperação de 1-NPi em papel de filtro
Além dos estudos de extração em condições otimizadas, também foram
realizados outros estudos para avaliar a recuperação da metodologia
desenvolvida.
Nos experimentos que envolveram avaliação da recuperação em papel
de filtro, foram utilizados papéis de filtro fornecidos pelo CENPES. Estes
experimentos foram realizados nas mesmas condições analíticas de CLAE-EM
descritas no ítem 5.10.
Foram realizados dois experimentos individuais para avaliação da
recuperação de 1-NPi em solução. No primeiro deles foram adicionados 50 µL
de solução de 1-NPi 150 µg/L (7,5 ng de 1-NPi) e no segundo foram
adicionados 250 uL de solução de 1-NPi 150 µg/L (37,5 ng de 1-NPi) a ¼ de
papel de filtro previamente recortado e condicionado com 1mL de MeOH.
Em ambos os casos, o papel foi processado segundo o procedimento
ilustrado na Figura 16. A concentração de 1-NPi nos extratos resultantes era de
cerca de 0,6 µg/L e de 3 µg/L, respectivamente e ambos os extratos foram
obtidos em composição final de (DCM/MeOH; 30:70).
Também foram realizados dois experimentos individuais para avaliação
da recuperação de 1-NPi proveniente do material certificado SRM 2975 (36
mg/Kg). Em ambos, foram adicionados cerca de 2 mg de SRM 2975 (72 ng de
1NPi) a ¼ de papel de filtro previamente recortado e condicionado com 1mL de
MeOH.
No primeiro experimento, o papel foi processado e analisado conforme
procedimento ilustrado na Figura 16. A concentração de 1-NPi no extrato
resultante era de cerca de 6 µg/L em composição final de DCM/MeOH (30/70).
No segundo experimento realizado, o papel foi processado e analisado
conforme procedimento ilustrado na Figura 17. A concentração de 1-NPi no
extrato resultante era de 4 µg/L em composição final de DCM/MeOH (30/70).
A recuperação da extração de 1-NPi foi avaliada também fortificando-se
filtro em branco com solução deste NHPA em dois níveis: 7,50 ng e 37,50 ng.
Os resultados obtidos encontram-se na Tabela 12.
87
Tabela 12: Avaliação da recuperação de 1-NPi em solução
Nível de fortificação
Recuperação (%)
7,5 ng
102
37,5 ng
114
A recuperação obtida nos dois experimentos indicou que havia
recuperação adequada para a determinação de 1-NPi, independente da
presença do filtro.
Na avaliação da recuperação de 1-NPi de 2 mg da amostra certificada
(SRM 2975) na presença do filtro, recuperações um pouco menores (73 a 74%)
foram obtidas indicando que neste caso pode haver alguma interferência da
matriz na extração do NHPA de interesse, embora estes valores sejam ainda
aceitáveis nos níveis de concentração deste estudo.
Outros experimentos de controle foram realizados. Uma solução
contendo 1-NPi foi submetida ao ultra som durante 1 hora e não foi observada
degradação desta substância. Brancos de solventes e de filtro também
demonstraram não haver contaminação detectável por 1-NPi.
5.12) Determinação de 1-NPi em amostras reais de FD
5.12.1) Análise de FD depositada nos filtros BR1 e BR2
Foram fornecidos pelo CENPES BR as seguintes amostras de fuligem de
diesel:
•
Filtro BR1 (4,56 + 0,12,00 mg): Euro III: ETC, European transient cycle;
oscila rotação e carga; coleta é feita durante todo o ensaio (cerca de 30
minutos).
•
Filtro BR2 (2,09 + 0,08 mg): Euro II – R49 (ensaio “13 pontos”); Euro III –
ESC, European steady cycle; estabiliza rotação e a carga e faz a coleta
88
Foi realizada a extração de cerca de ½ do filtro BR1 (2,35 mg de fuligem)
e de cerca de ½ do filtro BR2 (1,08 mg de fuligem), segundo o procedimento
apresentado na Figura 18. A análise dos extratos foi realizada nas condições
otimizadas das Tabelas 7 e 9. A quantificação dos experimentos foi feita
através de curva de calibração com figuras de mérito semelhantes às da
Tabela 10.
Após a pesagem, os filtros foram recortados em pequenos pedaços e
processados separadamente em tubos de centrífuga, que foram submetidos a
seis etapas de extração em banho de ultra-som. Entre cada etapa de
sonicação, os extratos parciais eram submetidos à centrifugação (5 min; 3500
RPM) e após a retirada do sobrenadante eram transferidos para uma proveta
de 25 mL. Ao término de todo o processo, os extratos brutos totais foram
avolumados para 20 mL com MeOH e foram analisados (Figura 18).
Em cada caso, uma alíquota de 5 mL do extrato bruto original (20 mL;
DCM/MeOH, 30:70) foi concentrada (N2) até o volume final de 0,5 mL. Após
filtração, foram realizadas análises nas mesmas condições de CLAE-EM
apresentadas no item 5.10 e também com volume de injeção igual a 100 µL. A
Figura 18 representa o procedimento descrito para ambas as amostras:
89
Fuligem de Diesel
BR
1 mL DCM;
U.S.; 5 min.
Centrifugar
(5min; 3500 RPM)
Repetir 6 vezes;
adicionar MeOH qsp...20 mL
Retirar sobrenadante
e transferir
1) Alíquota 5mL
2) N2 (g); Vf=0,5mL
3) Filtração
Vinj = 20 µL
Extrato bruto original
Vf = 20 mL
(DCM/MeOH; 30:70)
1) Alíquota 1mL
2)Filtração
CLAE-EM-EM
Vinj = 100 µL
Figura 18: Procedimento de extração e tratamento das amostras de Fuligem de
Diesel da BR
A quantificação dos experimentos foi feita através de curva de calibração
com figuras de mérito semelhantes às da Tabela 10. O tratamento das
amostras seguiu o procedimento otimizado com material certificado, apesar da
pequena massa de fuligem de diesel que apresentavam (cerca de 2 a 4 mg). O
filtro BR1 foi o primeiro a ser analisado por ser aquele que apresentava a maior
massa de fuligem.
A concentração de 1NPi calculada tanto para o filtro BR1, quanto para o
filtro BR2, no extrato original e nas alíquotas de 20 e de 100 µL (Figura 18)
injetadas após concentração por um fator de dez vezes, estava abaixo dos
limites de detecção e quantificação determinados.
90
Figura 19: Cromatogramas de 1NPi obtidos por CLAE-EM-APCI, com detecção
por MRM em modo de ionização negativo. a) extrato de fuligem de diesel
depositada no filtro BR1 após reconcentração (10x) e com injeção de 100 µL; b)
padrão 1µg/L (20 µL)
O sinal do 1-NPi esteve abaixo do LD (1,5 mg/Kg) na injeção de 20 µL
de ambos os extratos. A reconcentração de ambos os extratos (10x), embora
sujeita a perdas, também não permitiu a detecção de 1-NPi, indicando que as
concentrações de 1-NPi estavam abaixo de 1,5 mg/Kg. Para avaliar de modo
aproximado a concentração de 1-NPi nas amostras de FD fornecidas pela
Petrobrás, o extrato foi reconcentrado 10 vezes com nitrogênio gasoso e foram
injetados 100 µL desta solução nas condições habituais. Os resultados obtidos
permitem estimar uma concentração de 0,080 mg de 1NPi/kg de fuligem de
diesel no extrato BR1 e 0,2 mg de 1NPi/kg de fuligem de diesel no extrato BR2.
Do ponto de vista toxicológico e de Saúde Pública, este resultado é de
interesse, pois indica que há pequena contaminação do ar pela emissão desta
fuligem. Este resultado é conseqüência das características também das
amostras de óleo diesel estudadas (Euro II e Euro III), que têm processos de
fabricação muito controlados e restritivos.
91
5.12.2) Extração de Fuligem de Diesel de automóvel
Foi realizada a análise de uma amostra de fuligem de diesel de um
automóvel Jeep Land Rover, movido à diesel, coletada no estacionamento do
Campus do Valonguinho, da Universidade Federal Fluminense, na cidade de
Niterói, RJ.
A coleta foi realizada durante o dia, por volta de 13hs, com o auxílio de
uma espátula de metal. A parte superior do interior do cano de escapamento do
veículo foi raspada de forma a soltar a camada de fuligem aderida às paredes
internas sobre um pedaço de papel alumínio, inserido na parte inferior do cano.
A raspagem da fuligem foi realizada na posição mais distante da abertura do
cano de descarga para o exterior quanto possível, considerando–se as
dimensões do cano e da espátula usada. A fuligem coletada foi imediatamente
transportada ao laboratório e armazenada em geladeira, em frasco recoberto
com alumínio, ao abrigo da luz.
Foram realizados dois procedimentos de extração de cerca de 2
mg desta fuligem. O primeiro deles foi realizado segundo o procedimento
descrito na Figura 17, no qual foram extraídos 2,90 mg da fuligem coletada. A
concentração de 1NPi calculada estava abaixo do limite de detecção do
método.
Um segundo experimento de extração foi realizado pela extração de
2,20 mg de fuligem, pelo procedimento envolvendo reconcentração sob fluxo
de nitrogênio (Figura 20). Foram pesados cerca de 2 mg da fuligem do
automóvel em tubo de centrífuga, o qual foi submetido a seis etapas de
extração em banho de ultra-som (1 mL de DCM; 5 min cada). Ao término de
cada etapa de sonicação, o extrato parcial foi submetido à centrifugação (5
min; 3500 RPM) e após cada etapa de centrifugação, o sobrenadante foi
retirado e transferido para uma proveta de 10 mL. Ao término das seis etapas
de extração, foram adicionados 1,5 mL de MeOH ao extrato bruto e a solução
resultante foi concentrada sob fluxo de N2 até o volume final de 1 (um) mL, que
foi filtrado e analisado.
Na injeção de 20 µL deste extrato, obteve-se área de 1-NPi comparável
à área desta substância no padrão de concentração 1 µg/L. A partir destes
92
resultados, foi estimado que a concentração de 1-NPi nesta amostra era da
ordem de 0,5 mg/Kg.
Fuligem de
automóvel
1 mL DCM;
U.S.; 5 min.
Centrifugar
(5min; 3500 RPM)
1) Repetir 6 vezes;
2) adicionar 1,5 mL de MeOH
Retirar sobrenadante
e transferir
1) N2 (g); Vf= 1 mL
2) Filtração
Extrato Final
(Vf= 1 mL)
CLAE-EM-EM
Figura 20: Procedimento de extração alternativo empregado no tratamento da
amostra de fuligem de cano de descarga de automóvel movido a diesel.
Estes resultados devem ser tomados com cautela já que se trata de
apenas uma amostra e, portanto, sem representatividade estatística. Ademais,
a temperatura do cano de descarga é alta, o que deve levar a perda
considerável de substâncias relativamente voláteis com HPAs, hidrocarbonetos
e o 1-NPi.
Entretanto nossos resultados indicam que a metodologia tem potencial
para ser aplicada a amostras de campo, já que neste caso a restrição para a
quantidade de amostra é menor, pois podem ser coletadas maiores massas
e/ou avaliadas amostras combinadas de fuligem de diesel.
93
5.13) Avaliação de outros NHPAs em FD
5.13.1) Otimização da separação de 1-nitropireno e outros NHPAs
Foram estudados parâmetros de separação cromatográfica para alguns
NHPAs selecionados (1-NPi, 9-NA, 2-NFl), em coluna Vydac 201TP54 (ODS;
4.6mm x 5um x 250mm). Os tempos de retenção das substâncias estudadas
foram determinados em diferentes composições de fase móvel do sistema
MeOH:H2O, em diferentes vazões.
A aquisição de dados foi feita segundo as condições de CLAE-EM descritas no
item 5.10.
A separação de NHPAs selecionados (1-NPi, 9-NA e 2-NFl) foi otimizada
na coluna Vydac 201TP54 (ODS; 4,6mm x 5mm x 250mm), usada na
determinação de 1-NPi. O tempo de retenção de cada substância foi
determinado em vazão de 1,0, 0,8 e 0,6 mL/min e foram testadas diferentes
composições de fase móvel do sistema MeOH:H2O. A Tabela 13 apresenta os
tempos de retenção obtidos.
Os resultados obtidos demonstram que há aumento na retenção dos
NHPAs conforme a proporção de água é aumentada na fase móvel. Este fato
provocou aumento na largura dos picos cromatográficos, redução da relação
sinal/ruído e, conseqüentemente, piora do limite de detecção e do limite de
quantificação. Entretanto, foi verificado que até uma proporção MeOH/H2O
(80:20), ainda era possível obter uma boa quantificação dos NHPAs.
Na fase móvel MeOH/H2O (70:30), os picos cromatográficos foram
largos, com perda de resolução e redução de sinal significativa, o que indica
ser apropriado trabalhar em sistema que contenha no máximo 20% de H2O.
Além disso, na proporção MeOH/H2O (70:30), o tempo de total de análise seria
alto e maior do que o desejado, uma vez que o 1-NPi apresentou tr = 21,5 min.
Em vazão de 0,8 mL/min também não houve melhora na resolução de 9NA e 2-NFl em relação à vazão de 1,0 mL/min. A composição MeOH/H2O
(70:30) não foi testada com esta vazão pois já havia apresentado resultados
insatisfatórios na vazão anteriormente testada.
94
A vazão de 0,6 mL/min, empregada apenas com fase móvel de 100%
MeOH, também não melhorou a resolução do par 9-NA e 2-NFl (Tabela 13).
Vazões maiores que 1,0 mL/min não foram avaliadas sistematicamente pois
impediam a resolução do DCM e do 1-NPi.
A partir destes resultados a composição de MeOH/H2O (80:20) foi
utilizada para a separação dos NHPAs de interesse. No caso em que o objetivo
da análise foi apenas a determinação de 1-NPi, MeOH 100% foi empregado na
fase, reduzindo assim o tempo total de análise dos extratos.
Tabela 13: Tempos de retenção (tr) de 1-NPi, 9-NA e 2-NFl em coluna
Vydac
tr (min.)
NHPA
MeOH
V=1,0 mL/min
MeOH/H2O
MeOH/H2O
MeOH/H2O
(90/10)
(80/20)
(70/30)
1NPi
3,5
5,0
9,0
21,5
9NA
3,0
3,5
5,0
9,5
2NFl
3,2
3,7
5,3
9,2
NHPA
MeOH
MeOH/H2O
MeOH/H2O
MeOH/H2O
(90/10)
(80/20)
(70/30)
V=0,8 mL/min
1NPi
4,4
6,2
12,2
-
9NA
3,8
4,5
6,7
-
2NFl
3,9
4,6
7,0
-
NHPA
Tr (min)
-
-
-
V=0,6 mL/min
MeOH
1NPi
5,9
-
-
-
9NA
5,0
-
-
-
2NFl
5,2
-
-
-
95
5.13.2) Avaliação preliminar de outros NHPAs no material certificado SRM
2975
Os extratos obtidos em condições otimizadas (Figuras 16 e 17) foram
guardados em geladeira (8°C) após troca das tampas usadas dos vials por
tampas novas e alguns deles foram analisados posteriormente visando a
identificação de outros NHPAs além do 1-NPi.
Para a análise de outros NHPAs, foi empregada detecção em modo de
varredura. As demais condições de CLAE-EM descritas no ítem 5.10 foram
empregadas, exceto a composição e a vazão da fase móvel, tendo sido
empregada fase composta por MeOH:H2O (80/20) em vazão de 0,8 mL/min.
Os extratos de SRM 2975 estudados anteriormente foram analisados em
modo de varredura para avaliação de outros NHPAs. A fase móvel MeOH/H2O
(80:20) foi utilizada uma vazão de 0,8 ml/min, nas condições instrumentais
(Tabelas 7 e 9 ) descritas para a determinação de 1-NPi.
Além do 1-NPi (tr = 12,2 min), o único NHPA identificado foi o 9-NA (tr =
6,7 min) (Figura 21).
1-NPi
9-NA
Figura 21: Cromatogramas em CLAE-EM-APCI-MRM de 9-NA e 1-NPi em
extrato de SRM 2975
A quantificação do 9-NA foi realizada com uma curva de calibração na
faixa de 5 a 25 µg/L deste NHPA (70%MeOH:30%DCM). A aquisição de dados
foi feita a partir do sistema CLAE (20 µL; FM= 80%MeOH:20% H2O; 1,0
mL/min.) e a detecção feita por MRM (m/z 193) em modo de ionização APCI
negativo.
96
As áreas em cada ponto tiveram desvios relativos menores que 5%.
Bom coeficiente de correlação foi obtido (0,9955). O limite de detecção
estimado a partir desta curva para o 9NA foi de 1,92 µg/L.
A concentração deste NHPA não foi estimada no padrão, pois foi
considerado que deve haver pré-concentração do extrato, o que não foi
estudado com mais detalhes neste trabalho. Ademais não há valor certificado
ou valor de referência para o 9-NA no material SRM 2975. A comparação das
áreas de 1-NPi e 9-NA calculadas nestes extratos indicou que a concentração
deste NHPA era cerca de 10 vezes menor do que a do 1-NPi no SRM 2975 e
comparável ao limite de detecção para o 9-NA. Estimativas preliminares,
usando a área do menor padrão, indicam que este valor situa-se numa faixa
inferior a 1 mg/kg.
97
CAPÍTULO 6
Conclusões
Os padrões de fragmentação de NHPAs foram estudados neste
trabalho. A ionização negativa e a formação dos íons [M-30]- parecem ser dois
processos comuns a todos os NHPAs estudados. O uso de MRM considerando
o íon de peso molecular [M-] e o [M-30]- possibilitaram a detecção de NHPAs,
em particular o 1-NPi em níveis muito baixos (LD = 1,5 mg/kg) e compatível
com a determinação deste NHPA em fuligem de diesel.
As amostras avaliadas apresentaram concentrações de 1-NPi abaixo do
limite de detecção, o que do ponto de vista de toxicologia e da saúde pública
tem alta importância devido às características mutagênicas desta substância.
As características de tratamento do óleo diesel empregado nos testes para a
obtenção de fuligem parecem influenciar este baixo teor de 1-NPi já que o
tratamento deste combustível, neste caso, é bastante restritivo.
Outros NHPAs não foram quantificados no material certificado e nas
amostras de diesel estudadas. Na amostra certificada 9-nitroantraceno foi
detectado com concentrações (estimadas) de 1 ordem de grandeza menores
que as do 1-nitropireno.
O método desenvolvido apresenta potencial para aplicação em amostras
de fuligem de diesel e em amostras de outras origens e características, que
98
contenham NHPAs e onde a massa de amostra não seja a principal limitação,
como foi o caso das amostras estudadas neste trabalho.
O prosseguimento deste trabalho será focado na determinação de
NHPAs em fuligem de diesel coletada em veículos automotores onde a
limitação de massa de amostra não é um impeditivo para o trabalho analítico. A
avaliação das figuras de mérito na determinação de outros NHPAs pela
metodologia desenvolvida também está em curso neste momento. Outro
aspecto de interesse a ser mais avaliado é a perda de NHPAs na etapa de
reconcentração com nitrogênio, o que permitirá a análise de massas de
fuligens menores.
99
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Alfheim, I.; Lofroth, G.; Moller, M.; Bioassay of extracts of ambient particulate
matter, Environmental Health Perspectives 47: 227-238 (1983)
Amorisco, A.; Losito, I.; Carbonara, T. et al.; Photocatalytic degradation of
phenyl-urea herbicides chlortoluron and chloroxuron: characterization of the byproducts by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem
mass spectrometry, Rapid Communications in Mass Spectrometry 20 (10):
1569-1576 (2006)
Anacleto, J.F.; Ramaley, L.; Benoit, F.M.; Boyd, R.K.; Quilliam, M.; Comparison
of liquid-chromatography mass-spectrometry interfaces for the analysis of
polycyclic aromatic-compounds, Analytical Chemistry 67:4145-4154 (1995)
Arey, J.; Zielinska, B.; Atkinson, R.; Winter, A.M.; Ramdahl, T.; Pitts, J.N.Jr.;
The formation of nitro-PAH from the gas-phase reactions of fluoranthene and
pyrene with the OH radical in the presence of NOx, Atmospheric Environment
20, 2339-2345, (1986)
Arey, J.; Zielinska, B.; Warger, W.P.; Atkinson, R.; Winter, A.M.; The
contribution of nitrofluoranthenes and nitropyrenes to the mutagenic activity of
100
ambient particulate organic-matter collected in southern-california, Mutation
Research 207: 45-51, (1988)
Atkinson, R.; Atmospheric transformations of automotive emissions. In: Air
Pollution, the Automobile, and Public Health (Watson, A.Y.; Bates, R.R.;
Kennedy, D.; eds.) Washington: National Academy Press, 99-132 (1988)
Atkinson, R.; Arey, J.; Zielinska, B.; Aschmann, S.M.; Kinetics and nitroproducts of the gas-phase OH and NO3 radical-initiated reactions of
naphthalene-D8, fluoranthene-D10, and pyrene, International Journal of
Chemical Kinetics. 22, 999-1014, (1990)
Badger, G.M., Lewis, G.E.; Napier, I.M.; The formation of aromatic
hydrocarbons at high temperatures .8. The pyrolysis of acetylene, Journal of the
Chemical Society: 2825-2827 (1960)
Baek, S.O.; Field, R. A.; Goldstone, M.E.; Kirk, P.W.; Lester, J.N.; Perry, R.; A
review of atmospheric polycyclic aromatic-hydrocarbons - sources, fate and
behavior, Water, Air and Soil Pollution 60 (3-4): 279-300 (1991)
Barranco, A.; Alonso-Salces, R.M.; Bakkali, A.; Berrueta, L.A.; Gallo, B.;
Vicente, F.; Sarobe, M.; Solid-phase clean-up in the liquid chromatographic
determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in edible oils, Journal of
Chromatography A 988: 33-40 (2003)
Bayona, J.M.; Casellas, M.; Fernández, P.; Solanas, A.M.; Albaigés, J.;
Sources and seasonal variability of mutagenic-agents in the Barcelona city
aerosol, Chemosphere 29 (3): 441-450 (1994)
Beije, B.; Moller, L.; 2-nitrofluorene and related-compounds - prevalence and
biological effects, Mutation Research 196: 177-209 (1988)
Bezabeh, D.Z.; Bamford, H.A.; Schantz, M.M.; Wise, S.A.; Determination of
nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons in diesel particulate-related standard
101
reference materials by using gas chromatography/mass spectrometry with
negative ion chemical ionization, Analytical and Bioanalytical Chemistry 375 (5):
381-388 (2003)
Blumer, M.; Polycyclic aromatic-compounds in nature, Scientific American, 234
(3), 34-45 (1976)
Boffetta, P.; Jourenkova, N.; Gustavsson, P.; Cancer risk from occupational and
environmental exposure to polycyclic aromatic hydrocarbons, Cancer Causes &
Control 8 (3): 444-472 (1997)
Bonfanti, L.; Careri, M.; Mangia, A.; Manini, P.; Maspero, M.; Simultaneous
identification of different classes of hydrocarbons and determination of nitropolycyclic
aromatic
hydrocarbons
by
means
of
particle
beam
liquid
chromatography mass spectrometry, Journal of Chromatography A, 728: 359369 (1996)
Butler, J.D.; Crossley, P.; Reactivity of polycyclic aromatic-hydrocarbons
adsorbed on soot particles, Atmospheric Environment 15 (1): 91-94 (1981)
Castello, G.; Gerbino, T.C.; Analysis of polycyclic aromatic-hydrocarbons with
an ion-trap mass detector and comparison with other gas-chromatographic and
high-performance
liquid-chromatographic
techniques,
Journal
of
Chromatography, 642 (1-2): 351-357 (1993)
Ciccioli, P.; Cecinato, A. Brancaleone, E.; Frattoni, M.; Zacchei, P.; Miguel,
A.H.; Vasconcellos, P.D.; Formation and transport of 2-nitrofluoranthene and 2nitropyrene of photochemical origin in the troposphere, Journal of Geophysical
Research-Atmospheres, 101(D14): 19567-19581 (1996)
Cvacka, J.; Barek, J.; Fogg, A.G.; Moreira, J.C.; Zima, J.; High-performance
liquid chromatography of nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons, Analyst 123
(2): 9R-18R (1998)
102
Dole, M.; Hines, R.L.; Mack, L.L.; Mobley, R.C.; Ferguson, L.D.; Alice, M.B.;
Molecular beams of macro ions, Journal of Chemical Physics 49: 2240 (1968).
Finlayson-Pitts, B.J.; Pitts, J.N.Jr.; Atmospheric Chemistry: Fundamental and
Experimental Techniques. Wiley, New York. (1986)
Furton, K.G.; Jolly, E.; Pentzke, G.; Recent advances in the analysis of
polycyclic aromatic-hydrocarbons and fullerenes, Journal of Chromatography
642 (1-2): 33-45 (1993)
Gallagher, J.; Heinrich, U.; George, M.; Hendee, L.; Phillips, D.H.; Lewtas, J.;
Formation of DNA-adducts in rat lung following chronic inhalation of diesel
emissions, carbon-black and titanium-dioxide particles, Carcinogenesis, 15 (7):
1291-1299 (1994)
Glusker, J.P. X-Ray analyses of polycyclic hydrocarbon metabolite structures,
Chapter 7 in: Polycyclic Hydrocarbons and Carcinogenesis, Harvey, R.G.;
American Chemical Society, Washington, DC, USA, p.125-185, (1985)
Grosjean, D.; Fung, K.; Harrison, J.; Interactions of polycyclic aromatichydrocarbons
with
atmospheric
pollutants,
Environmental
Science
&
Technology 17: 673-679, (1983)
Guillén, M.D.; Polycyclic aromatic-compounds - extraction and determination in
food,
Food Additives and Contaminants 11 (6): 669-684 (1994)
Henderson, T.R.; Sun, J.D.; Royer, R.E.; Clark, C.R.; Li, A.P.; Harvey, T.M.;
Hunt, D.H.; Fulford, J.E.; Lovette, A.M.; Davidson, W.R.; Triple-quadrupole
mass-spectrometry studies of nitroaromatic emissions from different dieselengines, Environmental Science & Technology 17: 443-449 (1983)
Horning, E.C. et al., Atmospheric-pressure ionization (API) mass-spectrometry solvent-mediated ionization of samples introduced in solution and in a liquid
103
chromatograph effluent stream, Journal of Chromatographic Science 12: 725
(1974)
IARC: Diesel and Gasoline Engine Exhausts and Some Nitroarenes, Lyon,
International Agency for Research on Cancer, 322 pp; IARC Monographs on
the Evaluation of Carcinogenic Risk of Chemicals to Humans, Volume 46,
(1989)
Ingelse, B.A. Van Dam, RCJ, Vreeken, RJ.; Determination of polar
organophosphorus pesticides in aqueous samples by direct injection using
liquid chromatography-tandem mass spectrometry, Journal of Chromatography
A, 918 (1): 67–78 (2001)
International Programme on Chemical safety (IPCS). Environmental Health
Criteria 202: Selected non-heterocyclic polycyclic aromatic hydrocarbons,
W.H.O.; Genebra, (1998)
International Programme on Chemical safety (IPCS), Environmental Health
Criteria 229: Selected Nitro- and Nitro-Oxy-Polycyclic Aromatic Hydrocarbons,
W.H.O.;Genebra (2003)
Iribarne, J.V.; Thomson, B.A.; Evaporation of small ions from charged droplets,
Journal of Chemical Physics 64 (6): 2287-2294 (1976)
Jager, J.; Detection and characterization of nitro-derivatives of some polycyclic
aromatic-hydrocarbons
chromatography
-
by
fluorescence
application
to
quenching
air-pollution
after
analysis,
thin-layer
Journal
of
Chromatography 152 (2): 575-578 (1978)
Josephy, P.D.; Molecular Toxicology, Chapter 18 in: Polycyclic Aromatic
Hydrocarbons Carcinogenesis, Oxford University Press, NY, USA, p.315-351.
1997.
104
Kamens, R.M.; Fan, Z.; Yao, Y.; Chen, D.; Chen, S.; Vartiainen, M.; A
methodology for modeling the formation and decay of nitro-PAH in the
atmosphere, Chemosphere 28 (9), 1623-1632 (1994)
Karancsi, T.; Slegel, ,P.J.; Reliable molecular mass determination of aromatic
nitro compounds: elimination of gas-phase reduction occurring during
atmospheric pressure chemical ionization, Journal of Mass Spectrometry 34 (9):
975 (1999)
Knewstubb, P.F.; Sugden, S.B.; Mass-spectrometric studies of ionization in
flames .1. The spectrometer and its application to ionization in hydrogen flames,
Proceedings of the Royal Society of London series a-mathematical and physical
sciences A, 255: 520 (1966)
Kootstra, P.R.; Straub, M.H.C.; Stil, G.H.; van der Velde, E.G.; Hesselink, W.;
Land, C.C.J., Solid-phase extraction of polycyclic aromatic-hydrocarbons from
soil samples, Journal of Chromatography A 697 (1-2): 123-129 (1995)
Korfmacher W.A, Rushing L.G., Arey J., Zielinska B., Pitts Jr J.N.; Identification
of mononitropyrenes and mononitrofluoranthenes in air particulate matter via
fused-silica gas-chromatography combined with negative-ion atmosphericpressure
ionization
mass-spectrometry,
Journal
of
High
Resolution
Chromatography & Chromatography Communications 10 (12): 641-646 (1987)
Lemière, F.; Guide to LC-MS, Dezembro, (2001)
Lewtas, J.; Chuang, J.; Nishioka, M.; Petersen, B.; Bioassay-directed
fractionation of the organic extract of SRM-1649 urban air particulate matter,
International Journal of Environmental Analytical Chemistry 39 (3): 245-256
(1990)
Levsen, K., The analysis of diesel particulate, Fresenius Zeitschrift fur
Analytische Chemie 331 (5): 467-478 (1988)
105
Librando, V.; Fazzino, S.D.; Quantification of polycyclic aromatic-hydrocarbons
and their nitro-derivatives in atmospheric particulate matter of Augusta city,
Chemosphere, 27 (9): 1649-1656 (1993)
Madl, T.; Sterk, H.; Mittelbach, M.; Tandem mass spectrometric analysis of a
complex triterpene saponin mixture of chenopodium quinoa, Journal of The
American Society for Mass Spectrometry 17 (6): 795-806 (2006)
Menzie, C.A.; Potoki B.B.; Santodonato, J.; Exposure to carcinogenic PAHs in
the environment, Environmental Science & Technology 26: 1278-1284 (1992)
Moller, L.; Lax, I.; Lennart, C.; Nitrated polycyclic aromatic-hydrocarbons - a risk
assessment for the urban citizen, Environmental Health Perspectives 101: 309313 (1993)
Moreira, J.C.; Barek, J.; Analysis of carcinogenic nitrated polycyclic aromatichydrocarbons - a review Química Nova, 18: 362-367 (1995)
Moriwaki, H.; Funakasa, K.; Uebori, M.; Direct determination of NO2-substituted
pyrenes by liquid chromatography-atmospheric pressure chemical ionizationmass spectrometry, Analytical Sciences 16: 1247-1249 (2000)
Nielsen, T.; Seitz, B.; Ramdahl, T.; Occurrence of nitro-PAH in the atmosphere
in a rural area, Atmospheric Environment 18, 2159-2165 (1984)
Nielsen, T.; Ramdahl, T.; Determination of 2-nitrofluoranthene and 2nitropyrene in ambient particulate matter - evidence for atmospheric reactions,
Atmospheric Environment 20, 1507-1509 (1986)
Niessen W.M.A.; Tinke, ,A.P., Liquid-chromatography mass-spectrometry general-principles and instrumentation, Journal of Chromatography A, 703 (12): 37-57 (1995)
106
Niessen, W.M.A.; Lc-MS in quantitative analysis, Reviews in Analytical
Chemistry, 19 (3-4): 289-301 (2000)
Nishioka, M.G.; Howard, C.C.; Contos, D.A.; Ball, L.M.; Lewtas, J.; Detection of
hydroxylated nitro aromatic and hydroxylated nitro polycyclic aromaticcompounds in an ambient air particulate extract using bioassay-directed
fractionation, Environmental Science & Technology 22: 908-915 (1988)
Ohgaki, H.; Negishi, C.; Wakabayashi, K.; kusama, K.; Sato, S.; Sugimura, T.;
Induction of sarcomas in rats by subcutaneous injection of dinitropyrenes,
Carcinogenisis 5: 583-585 (1984)
Paputa-Peck, M.C.; Marano, R.S.; Schuetzle, D.; Riley, T.L.; Hampton, C.V.;
Prater, T.I.; Skewes, L.M.; Jensen, T.E.; Ruehle, P.H.; Bosch, L.C.; Duncan,
W.P.;
Determination
of
nitrated
polynuclear
aromatic-hydrocarbons
in
particulate extracts by capillary column gas-chromatography with nitrogen
selective detection, Analytical Chemistry 55: 1946-1954 (1983)
Pereira Netto, A.D.; Tese de Doutorado; Depto de Físico Química, IQ, UFRJ,
Rio de Janeiro, RJ, 1999
Pereira Netto, A.D.; Moreira, J.C. Arbilla, G.; Ferreira, L.F.V.; Oliveira, A.S.;
Barek, J.; Evaluation of human contamination with polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAHs) and their nitrated derivatives (NHPAs): a review of
methodology, Química Nova 23: 765-773 (2000)
Pereira Netto, A.D.; Barreto, R.P.; Moreira, J.C.; Arbilla, G.; Preliminary
comparison of PAH in total suspended particulate samples taken at Niteroi and
Rio de Janeiro cities, Brazil, Bulletin of Environmental Contamination and
Toxicology, 66:36 (2001)
Pereira Netto, A.D.; Muniz , F.C.; Laurentino, Rego, E.C.P.; Identification of
polycyclic aromatic hydrocarbons in street dust of niteroi city, RJ, Brazil, Bulletin
of Environmental Contamination and Toxicology, 68 (6): 831-838 (2002a)
107
Pereira Netto, A.D.; Barreto, R.P.; Moreira, J.C.; Arbilla, G.; Polycyclic aromatic
hydrocarbons in total suspended particulate of Niteroi, RJ, Brazil: a comparison
of summer and winter samples, Bulletin of Environmental Contamination and
Toxicology, 69 (2):173-180 (2002b)
Perez, S.; Barcelo, D.; Determination of polycyclic aromatic hydrocarbons in
sewage reference sludge by liquid chromatography-atmospheric-pressure
chemical-ionization mass spectrometry, Chromatographia, 53 (9-10): 475–480
(2001)
Pitts, J.N. Jr.; Van Cauwenberghe, K.; Grosjean, D.; Schimid, J.P.; Fitz, D.R.;
Belser, W.L.; Knudson, G.B.; Hynds, P.M.; Atmospheric reactions of polycyclic
aromatic-hydrocarbons - facile formation of mutagenic nitro-derivatives Science
202 :515 (1978)
Pitts, J.N. Jr.; Photo-chemical and biological implications of the atmospheric
reactions of amines and benzo(a)pyrene. Phil. Trans. R. Soc. Lond A290
(1376): 551-576 (1979)
Pitts, J.N. Jr.; Atkinson R.; Sweetman, J. A.; Zielinska, B.; Determination of 2nitrofluoranthene and 2-nitropyrene in ambient particulate organic-matter evidence for atmospheric reactions, Atmospheric Environment 19 (10), 16011608, (1985a)
Pitts, J.N.Jr.; Zielinska, B.; Sweetman, J.A.; Atkinson, R.; Winter, A.M.;
Reactions of adsorbed pyrene and perylene with gaseous N2O5 under simulated
atmospheric conditions, Atmospheric Environment 19 (6): 911-915, (1985b)
Pitts, J.N. Jr.; Nitration of gaseous polycyclic aromatic-hydrocarbons in
simulated and ambient urban atmospheres - a source of mutagenic nitroarenes,
Atmospheric Environment 21 (12): 2531-2547, (1987)
108
Pryor, A.W. (Ed.): Free Radicals in Biology, vol. 5, p.161. Academic Press, New
York. 1982
Raat, W.K. de.; Boers, J.P.; Bakker, G.L.; Meijere, F.A. de.; Hooimeijer, A.;
Lohman, P.H.M.; Mohn, G.R.; Contribution of PAH and some of their nitrated
derivatives to the mutagenicity of ambient airborne particles and coal fly-ash,
Science of the Total Environment, 153 (1-2): 7-28 (1994)
Ramdahl, T.;. Zielinska, B.; Arey, A.; Atkinson, R.; Winter, A.M.; Pitts, J.N.Jr.;
Ubiquitous occurrence of 2-nitrofluoranthene and 2-nitropyrene in air, Nature
321: 425-427 (1986)
Rappaport, S.M.; Wang, Y.Y.; Wei, E.T.; Sawyer, R.; Watkins, B.E.; Rappaport,
H.; Isolation and identification of a direct-acting mutagen in diesel-exhaust
particulates Environmental Science & Technology 14 (12): 1505-1509 (1980)
Rosenkranz, H.S.; Mutagenicity of chloroalkene epoxides in bacterial systems
Mutation Research 101(2): 115-125 (1982)
Rosenkranz,
H.S.;
Mermelstein,
R.,
Mutagenicity
and
genotoxicity
of
nitroarenes - all nitro-containing chemicals were not created equal, Mutation
Research 114 (3): 217-267 (1983)
Rosenkranz, H.S.; Mutagenic and carcinogenic nitroarenes in diesel emissions risk identification, Mutation Research, 140 (1): 1-6 (1984)
Ryno, M.; Rantanen, L.; Papaioannou, E.; et al.; Comparison of pressurized
fluid extraction, soxhlet extraction and sonication for the determination of
polycyclic aromatic hydrocarbons in urban air and diesel exhaust particulate
matter, Journal of Environmental Monitoring 8 (4): 488-493 (2006)
Salmeen, I.T.; Durisin, A.M.; Prater, T.J.; Riley, T.; Shuetzle, D.; Contribution of
1-nitropyrene to direct-acting ames assay mutagenicities of diesel particulate
extracts
109
Mutation Research 104 (1-3): 17-23 (1982)
Schauer, C.; Niessner, R.; Poschl, U.; Analysis of nitrated polycyclic aromatic
hydrocarbons
by
liquid
chromatography
with
fluorescence
and
mass
spectrometry detection: air particulate matter, soot, and reaction product
studies, Analytical and Bioanalytical Chemistry, 378 (3): 725-736 (2004)
Scheepers, P.T.J.; Bos, R.P.; Combustion of diesel fuel from a toxicological
perspective .1. Origin of incomplete combustion products, International Archives
of Occupational and Environmental Health 64 (3): 149-161 (1992)
Schuetzle, D.; S-C Lee, F.; Prater, T.J.; The identification of polynuclear
aromatic hydrocarbon (PAH) derivatives in mutagenic fractions of diesel
particulate extracts, International Journal of Environmental Analytical Chemistry
9 (2) 93-144 (1981)
Schuetzle, D.; Riley, T.L.; Prater, T.J.; Harvey, T.M.; Hunt, D.F., Analysis of
nitrated polycyclic aromatic hydrocarbons in diesel particulates, Analytical
Chemistry 54 (2): 265-271 (1982)
Schuetzle, D.; Sampling of vehicle emissions for chemical-analysis and
biological testing, Environmental Health Perspectives 47: 65-80 (1983)
Schuetzle,
D.;
Lewtas,
J.;
Bioassay-directed
chemical-analysis
in
environmental-research, Analytical Chemistry 58 (11): 1060 (1986)
Shahin, M.M.; Mass-spectrometric studies of corona discharges in air at
atmospheric pressures, Journal of Chemical Physics 45 (7): 2600 (1966)
Smyth, W.F.; Leslie, J.C.; McClean, S. Hannigan, B.; McKenna, H.P.; Doherty,
B.; Joyce, C.; O’Kane, E.; The characterisation of selected antidepressant drugs
using electrospray ionisation with ion trap mass spectrometry and with
quadrupole time-of-flight mass spectrometry and their determination by highperformance liquid chromatography/electrospray ionisation tandem mass
110
spectrometry, Rapid Communications In Mass Spectrometry 20 (11): 16371642 (2006)
Soriano, S.; Pereira-Netto, A.D.; Cassela, R.J.; Determination of Cu, Fe, Mn
and Zn by flame atomic absorption spectrometry in multivitamin/multimineral
dosage forms or tablets after an acidic extraction, Journal of Pharmaceutical
and Biomedical Analysis (2006), in press
Straube, E.A.; Dekant, W.; Volkel, W.; Comparison of electrospray ionization,
atmospheric
pressure
chemical
ionization,
and
atmospheric
pressure
photoionization for the analysis of dinitropyrene and aminonitropyrene LCMS/MS, Journal of the American Society for Mass Spectrometry, 15 (12): 18531862 (2004)
Sweetman, J. A.; Karasek, F.W.; Schuetzle, D.; Decomposition of nitropyrene
during gas-chromatographic mass-spectrometric analysis of air particulate and
fly-ash samples, Journal of Chromatography 247 (2): 245-254 (1982)
Sweetman, J. A.; Zielinska, B.; Atkinson, R.; Ramdahl, T.; Winter,A .M.; Pitts,
J.N.Jr.; A possible formation pathway for the 2-nitrofluoranthene observed in
ambient particulate organic-matter, Atmospheric Environment 20 (1): 235-238,
(1986)
Tákats, Z.; Vékey, K.; Electrospray and atmospheric pressure chemical
ionisation of aromatic compounds in dichloromethane solvent, European Mass
Spectrometry 4 (5): 365-370 (1998)
Thomson, B.A.; Iribarne, J.V.; Field-induced ion evaporation from liquid
surfaces at atmospheric-pressure, Journal of Chemical Physics 71 (11): 4451–
4463 (1979)
Tokiwa, H.; Morita, H.; Ohnish, Y.; Mutagenicity and carcinogenicity of
nitroarenes and their sources in the environment, Crc Critical Reviews in
Toxicology 17 (1): 23-60 (1986)
111
Varghese, A.J.; Withmore, G.T.; Binding of nitroreduction products of
misonidazole to nucleic-acids and protein, Cancer Clinical Trials 3 (1): 43-46
(1980)
Vasconcellos, P.C.; et al.; Chemical composition of aerosol collected in the
amazon forest, Química Nova 21 (4): 385-393 (1998)
Williams, T.T.J.; Perreault, H.; Selective detection of nitrated polycyclic aromatic
hydrocarbons by electrospray ionization mass spectrometry and constant
neutral loss scanning, Rapid Communications in Mass Spectrometry 14 (16):
1474-1481 (2000)
Wise, S.A.; Sander, L.C.; May, W.E.; Determination of polycyclic aromatichydrocarbons by liquid-chromatography, Journal of Chromatography, 642 (1-2):
329-349 (1993)
Whitehouse, C.N.; Dreyer, R.N.; Yamashita, M.; Fenn, J.B.; Electrospray
interface for liquid chromatographs and mass spectrometers, Analytical
Chemistry 57 (3): 675-679 (1985)
Yamashita, M.; Fenn, J.B.; Negative-ion production with the electrospray ionsource, Journal of Physical Chemistry 88 (20): 4671–4675 (1984)
Zeleny, J.; Industry application of electrospray technology, Physical Review.,
10: 1–6 (1917)
Zwirner-Baier, I.; Neumann, H.G.; Polycyclic nitroarenes (nitro-pahs) as
biomarkers of exposure to diesel exhaust, Mutation Research-Genetic
Toxicology and Environmental Mutagenesis 441 (1): 135-144 (1999)
112