EXTRAÇÃO DE DNA COM TRIZOL
1. Para cada 250 ml de amostra, adicionar 750 ml de Trizol;
2. Lise as células na amostra pipetando várias vezes. Use no mínimo 750 ul de
Trizol para 5-10 x 106 células. A proporção de Trizol e amostra deve ser
sempre de 8:1;
3. Incube a amostra homogeneizada por 5´ entre 15 e 30 ºC para ocorrer a
dissociação de complexos de nucleoproteínas;
4. Adicione 200 ul de Clorofórmio para 750 ul de Trizol. Feche os tubos, agite
vigorosamente com a mão por 15 seg. e incube entre 15 e 30 ºC durante 2 a 15
min.;
5. Centrifugue as amostras no máximo a 12.000 g ( rpm) por 15´ em centrífuga
refrigerada (2-8 ºC). A mistura irá se separar em uma fase fenólica abaixo
(avermelhada/DNA), uma interfase (DNA) e uma fase superior aquosa (RNA);
6. Precipitação do DNA: remova toda a fase aquosa e adicione 300 ul de Etanol
puro para cada 750 ul de Trizol utilizado inicialmente, misturando por inversão.
Guarde as amostras entre 15 e 30 ºC por 2-3 min. E sedimente o DNA por
centrifugação não superior a 2.000 g durante 5´ em centrífuga refrigerada;
7. Remova o fenol-etanol (SN = proteínas), lavando o pellet 2x com a solução
0,1 M de Citrato de Na com 10% de Etanol. Use 1 ml da solução por 750 ul do
Trizol inicial. A cada lavagem estoque o DNA por 30´ entre 15 e 30 ºC, fazendo
agitações periódicas. Centrifugue a 2.000 g por 5´ em cent. refr.;
8. Suspenda o pellet com 1,5-2 ml de Etanol 75% para cada 750 ul de Trizol e
estoque por 10 a 20´ entre 15 e 30 ºC fazendo agitações periódicas.
Centrifugue a 2.000 g por 5´ em cent. refr.;
9. Seque o DNA sob vácuo por 5-10´ e dissolva (pipetando) em 8 mM NaOH,
adicionando NaOH suficiente para obter 0,2-3 ug/ml de DNA (0,3-0,6 ml de
NaOH para cada 50-70 ng de tecido ou 1x107 células).