Quick-Zol – Trizol Reagente
Condição de estoque: 4°C
Apresentação: frasco de 100 ml
1.0 Introdução
Trizol Reagente é um reagente de fácil uso para o isolamento simultâneo
de DNA, RNA e proteínas de amostras de tecidos ou células de animais,
plantas, bactérias, vírus e leveduras.
Trizol é uma mistura de tiocianato de guanidina e fenol em uma solução
monofásica capaz de lisar e/ou homogeneizar amostras de tecidos,
dissolvendo todo o seu conteúdo: DNA, RNA e Proteínas. Com a adição de
clorofórmio e após uma centrifugação, três fases distintas são geradas na
mistura: Fase aquosa menos densa, contendo RNA; Fase Intermediária ou
interfase contendo DNA e Fase Orgânica mais densa contendo as
proteínas celulares. Cada
fase pode ser isolada, assim como o conteúdo de cada uma destas, com a
utilização de protocolos específicos.
Uma quantidade de 1 ml de Trizol é suficiente para isolar RNA, DNA e
proteínas de 100 mg de tecidos.
O método para o isolamento de RNA total é bastante simples e pode ser
realizado em menos de uma hora. Todo o procedimento é bastante
eficiente para o isolamento de moléculas de RNA total intactas, com baixa
ou nenhuma contaminação de DNA e proteínas. O RNA isolado por este
método pode ser utilizado em ensaios de Northern blots, isolamento de
mRNA, tradução in-vitro, Ensaios livre de RNase, clonagem e PCR.
O DNA isolado por este método pode ser utilizado em PCR, Southern
blotting e digeridos com enzimas de restrição.
2.0 Componentes
Trizol Reagente 100ml
Conteúdo: Tiocianato de Guanidina, Fenol e Reagentes não tóxicos
3.0 Procedimento de Uso
3.1 Preparação das Amostras (Etapa 1)
3.1.1 Lise e Homogeneização das amostras
Tecidos
Adicionar 1 ml de Trizol para cada 100 mg de tecido. Homogeneizar a
amostra em um homogeneizador adequado.
Células de camada única
Lisar as células diretamente na placa de cultura, adicionando 1ml de Trizol
para cada 3,5 cm de diâmetro (aproximadamente 1x106 células), utilizar
apenas placas de cultura de vidro, Trizol não é compatível com placas de
plástico. Homogeneizar a amostra ressuspendendo várias vezes com o
auxílio de uma pipeta. Recomenda-se lavar as células de camada única
com PBS ou meio sem soro antes de adicionar o Trizol.
Células em Suspensão
Centrifugar as células (aproximadamente 5x106 células). Lisar as células
adicionando diretamente 1 ml de Trizol para células animais, cogumelos,
plantas ou de bactérias. Recomenda-se lavar as células de camada única
com PBS ou meio sem soro antes de adicionar o Trizol.
3.1.2 Separação das Fases
Para assegurar uma completa dissociação do complexo proteína- ácido
nucléico, deixar a amostra por 5 minutos à temperatura ambiente.
Adicionar 200 µl de clorofórmio para cada 1 ml de Reagente Trizol
utilizado.
Misturar vigorosamente em vortex a solução por 15 segundos e deixar de
2-15 min em temperatura ambiente.
Centrifugar a 12.000 x g por 15 minutos à 4ºC.
Observa-se uma abundante interfase, repetir este passo de extração.
3.2 Separação do RNA (Etapa 2)
1 - Transferir a fase aquosa, adquirida na preparação das amostras, para
um tubo limpo e adicionar 500 µl de isopropanol (misturar por inversão).
2 - Deixar a amostra repousar por 10 minutos a temperatura ambiente e
centrifugar a 12.000 x g por 10 minutos à 4ºC
3 - Descartar o sobrenadante e lavar o RNA sedimentado com 1 ml de
etanol 75% (misturar por inversão).
4 - Centrifugar a 7.500 x g por 5 minutos à 4ºC
5 - Descartar o sobrenadante e dissolver o RNA em 25 µl de água livre de
RNAse.
Utilizar uma pipeta para facilitar a dissolução.
6-Quantificar o RNA por espectrofotometria a 260 nm. Considerar 1
unidade de OD= 40 µg/ml
A amostra pode ser estocada à 4ºC por no máximo 1 semana ou por 1
ano à -20ºC.
3.3 Separação do DNA / Proteínas (Etapa 3)
1 - Descartar cuidadosamente a fase aquosa da amostra lisada e
homogeneizada. Adicionar 1,5ml de Água livre de nuclease para cada 2 ml
de Trizol utilizado na preparação das amostras.
2 - Agitar a amostra em vortex e centrifugar a 3.000 x g por 5 minutos a
4ºC.
3 - Descartar a fase aquosa e adicionar 150 μl de solução de CsCl 4,5 M e
Citrato de Sódio 0,5 M e 1,5 ml de etanol para cada 2 ml de Reagente
Trizol utilizado.
4 - Misturar por inversão por 15 segundos e centrifugar a 3.000 x g por 5
minutos à 4ºC.
5 - Separar o sobrenadante (fase orgânica protéica impura) do precipitado
(DNA sedimentado impuro) e guardar a 4ºC até o início das etapas de
purificações do DNA / Proteínas.
Iniciar a etapa 4 utilizando o DNA sedimentado impuro obtido nesta etapa
para a purificação do DNA ou iniciar a etapa 5 utilizando o sobrenadante
obtido nesta etapa para o isolamento das proteínas.
3.4 Purificação do DNA (Etapa 4)
1 - Lavar o DNA sedimentado (adquirido na Etapa 3) com 3 ml de etanol
75% para cada 2 ml de Trizol Reagente utilizado na etapa de preparação
da amostra.
2 - Centrifugar a 3.000 x g por 3 minutos à 4ºC.
3 - Descartar o sobrenadante e suspender o DNA sedimentado com etanol
100%.
4 - Centrifugar a 3.000 x g por 3 minutos à 4ºC.
5 - Descartar o sobrenadante e ressuspender o DNA precipitado com Água
Livre de Nuclease. Estocar o DNA à -20ºC.
3.5 Separação de Proteínas (Etapa 5)
1 - Precipitar a proteína (adquirida na Etapa 3) com 6 ml de isopropanol
para cada 2 ml de Trizol Reagente utilizado na preparação da amostra.
Deixar a amostra em repouso por 5 minutos à temperatura ambiente.
2 - Centrifugar a amostra a 10.000 x g por 10 minutos à 4ºC.
3 - Descartar o sobrenadante e ressuspender o precipitado com 3 ml de
etanol para cada 2 ml de Trizol reagente utilizado na preparação da
amostra. Deixar a amostra em repouso por 5 minutos à temperatura
ambiente. Centrifugar a 10.000 x g por 10 minutos à 4ºC.
4 - Repetir o procedimento 3 por mais 2 vezes.
5 - Descartar o sobrenadante e deixar a proteína sedimentada secar por
10 minutos à temperatura ambiente. Dissolver em Água Destilada.
Utilizar a proteína imediatamente para Western blotting ou estocar à 20ºC.