Desenvolvimento e validação de método analítico para determinação de
rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada
Iara Maíra de Oliveira Viana1
Paula Rocha Chellini2
1
Farmacêutica Industrial. Aluna da Pós-Graduação em Biociências Forenses, pela Universidade Católica de
Goiás/IFAR
2
Mestre em Estatística pela Universidade Federal de Minas Gerais. Farmacêutica Bioquímica pela Universidade
Federal de Juiz de Fora.
Resumo
A tuberculose é um problema de saúde prioritário no Brasil, que juntamente com outros 21 países em
desenvolvimento, concentram 80% dos casos da doença no mundo. Devido a frequentes recidivas e a
multirresistência a fármacos, seu tratamento representa uma grande preocupação mundial. No intuito de
aumentar a adesão do paciente ao tratamento e reduzir a resistência bacteriana, têm sido propostas formas
farmacêuticas contendo associações de fármacos. Entretanto, ainda não existem métodos analíticos descritos em
compêndios oficiais para análise de algumas dessas associações. Dessa forma, foi desenvolvido método analítico
para determinação concomitante dos tuberculostáticos rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa
combinada. As análises foram realizadas em cromatógrafo Agilent® 1200 provido de detector ultravioleta (DAD)
a 238 nm e coluna Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4.6 mm; 5 µm), mantida a 30 ºC; eluição em gradiente,
sendo que na primeira etapa utilizou-se tampão fosfato pH 6,8: acetonitrila (95:5 v/v), e na segunda fase do
gradiente utilizou-se a proporção de (1:1 v/v); fluxo de 1,2 mL/min e volume de injeção de 20 µL. O método
desenvolvido foi validado em relação à linearidade, precisão, exatidão, seletividade e robustez, conforme
procedimentos recomendados pela Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA. A linearidade do
método foi confirmada para rifampicina e para isoniazida na faixa de 80 a 120%, resultando em coeficiente de
correlação superiores a 0,99. Além disso, os valores obtidos com os testes de precisão e exatidão foram
satisfatórios.
Palavras-chaves: Tuberculostáticos. Rifampicina. Isoniazida. Cromatografia a líquido de alta eficiência.
Validação.
Abstract
Tuberculosis is a priority health problem in Brazil, which along with 21 other developing countries concentrate
80% of cases of the disease worldwide. Due to frequent relapses and multidrug resistance, its treatment is a
major global concern. In order to increase patient adherence to treatment and reduce bacterial resistance, have
been proposed dosage forms containing drug associations. However, there are no analytical methods described in
official compendia for the analysis of some of these associations. Thus, was developed an analytical method for
simultaneous determination of rifampicin and isoniazid in antituberculosis combined fixed dose tablets. Analyses
were performed in chromatograph Agilent® 1200 equipped with an ultraviolet detector (DAD) at 238 nm and
column Zorbax Eclipse XDB-C18 (150 x 4.6 mm, 5 mm), maintained at 30 °C; gradient elution, where in the
first step was used phosphate buffer pH 6.8: acetonitrile (95:5 v/v), and in the second step was used the ratio of
(1:1 v/v); flow of 1.2 mL/min and injection volume of 20 µL. The method was validated with respect to linearity,
precision, accuracy, selectivity and robustness according to procedures recommended by Resolution RE Nº 899
of May 29, 2003 of ANVISA. The linearity of the method was confirmed to isoniazid and rifampicin in the range
of 80 to 120%, resulting in a correlation coefficient greater than 0.99. Furthermore, the values obtained with the
precision and accuracy tests were satisfactory.
Keywords: Tuberculostatic. Rifampicin. Isoniazid. High performance liquid chromatography. Validation.
1 INTRODUÇÃO
A tuberculose é uma doença infecciosa evitável e curável, causada pela bactéria
Mycobacterium tuberculosis. É transmitida de pessoa a pessoa através de perdigotos de
pacientes com doença respiratória ativa e sua forma mais comum é a pulmonar, podendo
também ocorrer em outros órgãos ou tecidos [1].
Segundo a Organização Mundial de Saúde, cerca de um terço da população mundial é
infectado pela bactéria causadora da doença, entretanto, somente uma parcela desenvolve a
tuberculose. Em 2010, a estimativa para a incidência global da doença foi de 128 casos por
100.000 habitantes. No Brasil, a incidência de tuberculose no mesmo ano foi de cerca de 43
casos por 100.000 habitantes. Pessoas com deficiência no sistema imunológico possuem
maior risco de desenvolvê-la, o que explica sua alta incidência em portadores do vírus da
imunodeficiência humana (HIV, do inglês Human Immunodeficiency Virus). A tuberculose é
a principal causa de morte nesse grupo, correspondendo a aproximadamente um em cada
quatro mortes de pessoas HIV positivas [1].
Por muito tempo, o tratamento da tuberculose no Brasil consistiu na associação de
rifampicina, isoniazida e pirazinamida. Porém, após o segundo Inquérito Nacional, que
aconteceu em 2009, notou-se um aumento da resistência à isoniazida. O Ministério da Saúde
então propôs um novo sistema de tratamento da doença. As dosagens de pirazinamida e
isoniazida foram reduzidas, introduziu-se um quarto fármaco (o cloridrato de etambutol) na
etapa inicial do tratamento e formulou-se um comprimido com quatro fármacos de dose fixa
combinada [2,3].
Atualmente o esquema básico para adultos e adolescentes consiste em dois meses de
tratamento com rifampicina, isoniazida, pirazinamida e cloridrato de etambutol, seguidos de
quatro meses de tratamento com rifampicina e isoniazida [2]. O tratamento preconizado para
crianças (menores de dez anos) continua sendo com três fármacos [3].
A mudança no esquema de tratamento contra a tuberculose agregou benefícios como
redução do número de comprimidos a ser ingerido pelo paciente, impossibilidade da
utilização isolada dos fármacos e simplificação da gestão farmacêutica em todos os níveis [2].
O acréscimo de um fármaco aumenta a proteção contra a expressão fenotípica de possíveis
mutações genéticas da bactéria Mycobacterium tuberculosis [3]. Além disso, a administração
conjunta de medicamentos nos pacientes sensíveis, por meio de medicamentos dose fixa
combinada ou formulação conjunta, assegura melhores picos séricos e facilita a sua
supervisão [4].
A execução de ensaios analíticos garante que os medicamentos tenham qualidade
assegurada [5]. Sem essa avaliação da qualidade, todo o tratamento pode ser comprometido.
Entretanto, não existem métodos analíticos descritos na literatura para quantificação
simultânea de rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada. A
Farmacopeia Brasileira 5ª edição e a Farmacopeia Britânica 2011 descrevem métodos
analíticos para determinação da qualidade de comprimidos contendo apenas um dos fármacos,
rifampicina ou isoniazida [6,7]. Já a Farmacopeia Americana 2012 descreve método para
análise simultânea dos fármacos, porém para a forma farmacêutica cápsula [8].
Conforme Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA, o método
analítico para quantificação do princípio ativo em produtos farmacêuticos, não descrito em
farmacopeias ou formulários oficiais, deve ser validado [9]. Esse processo comprova, pelo
fornecimento de evidência objetiva, de que os requisitos para a aplicação ou uso específico
pretendido do método analítico foram atendidos [10]. É importante que todo método analítico
tenha seu desempenho confirmado por meio de procedimentos de validação intralaboratoriais.
Considerando que a validação por procedimentos interlaboratorias tem limitações, já que
envolvem um alto custo e determinam principalmente a exatidão e a precisão dos métodos, a
validação intralaboratorial é essencial para determinação de parâmetros de desempenho como
linearidade, faixa de trabalho, seletividade, limite de detecção e limite de quantificação [11].
Segundo Resolução RE Nº 899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA devem ser
avaliados os parâmetros especificidade, linearidade, intervalo, repetibilidade, precisão
intermediária, exatidão e robustez durante a validação de método analítico para quantificação
do princípio ativo em produtos farmacêuticos [9].
Considerando o exposto, o presente trabalho apresenta o desenvolvimento e validação
de método analítico para a quantificação simultânea de rifampicina e isoniazida em
comprimidos de dose fixa combinada, associação utilizada na segunda etapa do tratamento
preconizado pelo Ministério da Saúde.
2 METODOLOGIA
2.1 Amostra
Foram utilizados comprimidos de dose fixa combinada de rifampicina e isoniazida
(contendo 150 mg e 75 mg por comprimido de fármaco respectivamente) produzidos pela
Lupin LTD e doados pela Secretaria de Estado da Saúde de Minas Gerais/Brasil.
2.2 Soluções
2.2.1 Solução tampão fosfato pH 6,8
No preparo da solução tampão pH 6,8 dissolveu-se de 1,4019 g de fosfato de sódio
dibásico anidro em aproximadamente 600 mL de água ultrapura e em seguida transferiu-se
para balão volumétrico de 1 L. Adicionou-se 1 mL de trietilamina e completou-se volume
com água ultrapura. Ajustou-se o pH para 6,8 utilizando solução de ácido fosfórico diluído.
Obteve-se, portanto, tampão fosfato de sódio dibásico 10 mM com trietilamina 0,1%.
2.2.2 Solução diluente
A solução diluente foi preparada pela mistura de solução tampão pH 6,8 e acetonitrila
na proporção (95:5 v/v).
2.2.3 Solução amostra
Inicialmente determinou-se o peso médio dos comprimidos contendo rifampicina e
isoniazida, utilizando 20 unidades, e os pulverizou. Em seguida, pesou-se quantitativamente o
equivalente a 1/10 do peso médio e transferiu-se para balão volumétrico de 100 mL.
Adicionou-se cerca de 10 mL de solução diluente e manteve-se a solução em banho ultrassom
por 10 minutos. Em seguida, completou-se o volume do balão volumétrico com solução
diluente.
2.2.4 Solução padrão 100%
Pesou-se quantitativamente 30 mg de rifampicina substância química de referência
(SQR) e 15 mg de isoniazida SQR e transferiu-se para balão volumétrico de 200 mL.
Adicionou-se cerca de 20 mL de solução diluente e manteve-se a solução em banho ultrassom
por 10 minutos. Em seguida, completou-se o volume do balão volumétrico com solução
diluente. Obteve-se solução contendo 150 µg/mL de rifampicina e 75 µg/mL de isoniazida.
2.2.5 Solução padrão 200%
Pesou-se quantitativamente 30 mg de rifampicina SQR e 15 mg de isoniazida SQR e
transferiu-se para balão volumétrico de 100 mL. Adicionou-se, utilizando pipeta volumétrica,
5 mL de acetonitrila e cerca de 10 mL de solução tampão fosfato pH 6,8 e manteve-se a
solução em banho ultrassom por 10 minutos. Completou-se o volume do balão volumétrico
com solução tampão fosfato pH 6,8. Obteve-se solução contendo 300 µg/mL de rifampicina e
150 µg/mL de isoniazida. Essa solução padrão 200% foi utilizada na construção da curva
analítica.
2.3 Método de ensaio
No desenvolvimento e otimização do método analítico foram testados diversos
tampões e proporções dos solventes da fase móvel, e a melhor condição de análise (Tabela 1)
foi definida com base nos valores de fator de retenção, da resolução e do fator de cauda dos
picos [12]. Os parâmetros cromatográficos otimizados foram: eficiência (número de pratos
teóricos), tempo de corrida, composição e vazão de fase móvel, temperatura, volume de
injeção e condições de detecção por espectrofotometria no ultravioleta (comprimento de
onda). As análises foram realizadas em cromatógrafo a líquido Agilent ® 1200 provido de
detector de arranjos diodos (DAD).
Tabela 1 – Condições cromatográficas do método analítico para determinação de rifampicina
e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada
Parâmetro
Comprimento de onda
Volume de injeção
Coluna
Temperatura
Fluxo
Fase móvel
Condições Cromatográficas
238 nm
20 µL
Zorbax Eclipse XDB – C18 (150 x 4,6 mm; 5µm)
30 °C
1,2 mL/min
Tampão Na2HPO4 10 mM e 0,1% trietilamina (pH 6,8)
Acetonitrila
A eluição foi realizada em gradiente de acordo com as informações contidas na tabela
2, sendo o solvente A uma mistura de tampão e acetonitrila (95:5 v/v) e o solvente B
acetonitrila.
Tabela 2 – Gradiente utilizado para possibilitar determinação simultânea de rifampicina e
isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada
Tempo (min)
0–2
2–4
4–7
7–8
8 – 10
Solvente A
100%
100% → 52%
52%
52% → 100%
100%
Solvente B
0%
0% → 48%
48%
48% → 0%
0%
Eluição
Isocrática
Gradiente linear
Isocrática
Gradiente linear
Reequilíbrio
2.4 Validação
Os parâmetros linearidade, precisão, exatidão, seletividade e robustez foram
estabelecidos em ensaios com soluções padrão e amostra. A adequação do método foi
avaliada em função dos parâmetros de desempenho estabelecidos na Resolução RE Nº 899 de
29 de maio de 2003 da ANVISA e respectivos critérios de aceitabilidade [9].
2.4.1 Linearidade
Preparou-se uma curva de calibração a partir de três soluções padrão 200% (contendo
300 µg/mL de rifampicina e 150 µg/mL de isoniazida), cujos níveis de concentração foram
80, 90, 100, 110 e 120%. Foram preparadas triplicatas independentes de cada nível por meio
da transferência quantitativa de alíquotas dessas soluções padrão 200%, utilizando bureta de
10 mL, para balões volumétricos de 10 mL. Foram transferidos 4,0, 4,5, 5,0, 5,5 e 6,0 mL da
solução padrão 200% para o preparo dos níveis de concentração 80, 90, 100, 110 e 120%
respectivamente. Completaram-se os balões volumétricos com solução diluente. As soluções
foram preparadas e analisadas em ordem aleatória.
A linearidade foi avaliada conforme descrito por SOUZA e JUNQUEIRA. Primeiro
avaliou-se se o método dos mínimos quadrados ordinários era adequado. Foram testadas as
premissas da regressão linear simples pelos testes de distribuição normal dos resíduos (teste
de Ryan & Joiner), de homocedasticidade dos resíduos (teste de Brown & Forsythe) e
independência dos resíduos (teste de Durbin-Watson). O gráfico dos resíduos da regressão
foram
construídos
e
examinados
para
investigação
de
perfis
que
indicassem
heterocedasticidade ou desvio da linearidade [13, 14]. Os outliers foram verificados pelo teste
de resíduos padronizados Jacknife. O teste de Jacknife foi aplicado sucessivamente até que
novos outliers não fossem encontrados ou até exclusão de, no máximo, 22,2% dos resultados
em relação ao original [15]. Em seguida, a análise da variância (ANOVA) foi aplicada para
avaliar o desvio da linearidade e significância da regressão. Quando não há desvio da
linearidade e a regressão é significativa, conclui-se que o modelo linear é adequado [13, 14].
2.4.2 Seletividade
Seletividade foi avaliada em ensaios com soluções padrão 100%, amostra e branco. A
solução padrão 100% e a solução amostra foram preparadas conforme item 2.2.4 e item 2.2.3
respectivamente. Já o branco consistiu apenas no preparo da solução diluente, conforme item
2.2.2, pois não foi possível identificar os excipientes presentes nos comprimidos de dose fixa
combinada de rifampicina e isoniazida produzidos pela Lupin LTD. Após preparo, as três
soluções foram injetadas em cromatógrafo a líquido conforme descrito no item 2.3. Os perfis
cromatográficos obtidos com a solução padrão 100% e solução amostra foram comparados,
verificando se os tempos de retenção dos fármacos rifampicina e isoniazida eram semelhantes.
O perfil cromatográfico do branco foi utilizado para identificar possíveis interferentes
provenientes do diluente utilizado. Para isso o perfil cromatográfico do branco foi comparado
com os perfis cromatográficos da solução padrão 100% e da solução amostra. Além disso,
avaliou-se a pureza dos picos dos fármacos rifampicina e isoniazida com auxílio de detector
de arranjo de diodos.
2.4.3 Exatidão e precisão
A exatidão e precisão do método analítico foram avaliados conforme Resolução RE Nº
899 de 29 de maio de 2003 da ANVISA.
Devido à indisponibilidade dos constituintes da matriz do comprimido doado, optou-se
por estudar a exatidão pelo método da adição de padrão. Assim, quantidades conhecidas de
rifampicina SQR e isoniazida SQR foram adicionados ao medicamento, sendo preparadas
soluções em três níveis de concentração 90, 100 e 110% com três réplicas de cada. Para o
preparo dessas soluções, inicialmente determinou-se o peso médio dos comprimidos contendo
rifampicina e isoniazida, utilizando 20 unidades, e os pulverizou. Em seguida, pesou-se
quantitativamente o equivalente a 1/25 do peso médio e transferiu-se para balão volumétrico
de 50 mL. Adicionou-se 5, 10 e 15 mL de solução de padrão 100% recém preparada a cada
balão volumétrico de 50 mL. Completou-se o volume dos balões volumétricos com solução
diluente. Preparou-se também duas soluções amostra 80%. A partir das leituras das soluções
amostra 90, 100 e 110%, soluções amostra 80% e da solução padrão 100% foi estimada a
recuperação aparente. A recuperação deve ser entre 98 e 102% [16].
A precisão do método foi verificada através da precisão intracorrida e da precisão
intercorrida. Em um primeiro dia foram realizadas seis determinações a 100% sob mesmas
condições de análise (em um curto período de tempo e com o mesmo analista e
equipamentos). Já em um segundo dia foram preparadas outras seis soluções amostra
utilizando balança diferente e por outro analista. As precisões sob as duas condições (precisão
intracorrida e precisão intercorrida) foram expressas em termos de desvios padrão relativos,
sendo o critério de aceitação desvio padrão relativo menor que 5% [9].
2.4.4 Robustez
A robustez de um método analítico é a medida de sua capacidade em resistir a
pequenas e deliberadas variações dos parâmetros analíticos [9]. Para avaliação da robustez do
método variou-se três parâmetros: temperatura, fluxo e coluna cromatográfica. Os ensaios
foram realizados de forma univariada conforme tabela 3 e os resultados foram comparados
por meio de análise de variância (ANOVA). Foram necessários 3 dias de análise, sendo que
em cada dia foram preparadas 3 soluções amostra e 1 solução padrão 100%. No primeiro dia
as soluções foram injetadas nas condições dos ensaios de 1 a 3. No segundo dia foram
preparadas novas soluções, que foram utilizadas nos ensaios de 4 a 6 e, em um terceiro dia,
preparou-se soluções para realizar os ensaios 7 e 8. Os ensaios 2, 5 e 7 correspondem às
análises nominais realizadas para servir de comparação para os demais ensaios. Os teores de
rifampicina e isoniazida obtidos nos ensaios de 1 a 3 foram comparados entre si, bem como os
ensaios 4 a 6, e os ensaios 7 e 8.
Tabela 3 – Ensaios realizados para análise da robustez do método analítico para determinação de
rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada
Parâmetro
Temperatura
(ºC)
Fluxo (mL/min)
Lote da coluna
Ensaio
1
2
3
4
5
6
7
8
25
30
35
30
30
30
30
30
1,2
1,2
1,2
1,1
1,2
1,3
1,2
1,2
799511 799511 799511 799511 799511 799511 799511 993967
8-595
8-595
8-595
8-595
8-595
8-595
8-595
-902
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
No desenvolvimento do método foram avaliados vários comprimentos de onda,
utilizando o modo varredura (200 – 400 nm) do equipamento. Foi observado que o máximo
de absorção da rifampicina ocorre no comprimento de onda de 238 nm e 338 nm, e o máximo
da isoniazida em 265 nm. Como em 238 nm foram observados valores adequados de sinais
para ambos os fármacos, esse foi o comprimento de onda selecionado.
Para escolha do pH foram testados diferentes tampões e avaliados os resultados de
tempo de retenção, resolução ente os picos e o fator de cauda.
Os perfis dos gráficos de resíduos (Figura 1) demonstraram que não houve tendências
óbvias, indicando que há bom ajuste ao modelo linear escolhido. Os intervalos de confiança
dos resíduos sugeriram a presença de outlier apenas no gráfico do analito rifampicina, que
foram confirmados pelo teste de resíduos padronizados Jacknife, portanto não houve
indicação de um número maior que 22,2% de outliers para cada curva.
Figura 1 – Gráficos de resíduos obtidos pelas curvas de cada fármaco,
rifampicina e isoniazida.
Gráfico de resíduos - Rifampicina
200
ei
100
0
-100
-200
75
80
85
90
95
100
105
110
115
120
125
115
120
125
Concentração (%)
Gráfico de resíduos - Isoniazida
100
ei
50
0
-50
-100
75
80
85
90
95
100
105
110
Concentração (%)
A tabela 4, a seguir, contem os dados obtidos nos experimentos para avaliação da
linearidade. Foi confirmado que os resíduos da regressão seguem a distribuição normal, são
homocedásticos e independentes, que são as premissas da regressão linear. Dessa forma, o
teste de F pode ser aplicado para avaliação da regressão e do desvio da linearidade. Além
disso, obteve-se coeficiente de correlação (r) satisfatório na faixa de linearidade definida,
0,9979 para rifampicina e 0,9957 para isoniazida. Os resultados indicam que há bom ajuste ao
modelo linear. A significância da regressão (p < 0,001) e desvios de linearidade não
significativos (p > 0,05) determinaram linearidade na faixa de 80 a 120% para ambos os
fármacos (Figura 2).
Tabela 4 - Estatísticas para avaliação da linearidade para as curvas da rifampicina e da isoniazida.
Estatística
Rifampicina
Isoniazida
Faixa de Linearidade
80% a 120%
120 a 180 µg/mL
60 a 90 µg/mL
15
15
n
14
15
R
0,9780
0,9620
p
p > 0,10
p > 0,10
tL
0,235
- 0,434
p
p > 0,05
p > 0,05
d
2,036
2,667
p
p>0,01
p>0,01
r
0,9979
0,9957
F
2843,104
1505,811
p
p < 0,001
p < 0,001
F
0,117
0,188
p
p > 0,05
p > 0,05
Número de observações total
ninicial
Número de observações, após exclusão de
outliers
Normalidade
Homocedasticidade
Independência
Coeficiente de correlação da curva final
Regressão
Desvio da linearidade
ninicial = número de observações antes da avaliação de outliers; n = número de observações,
após exclusão de outliers pelo teste Jacknife; R = coeficiente de correlação de Ryan-Joiner; p
= significância; tL = estatística t de Levene; d = estatística de Durbin-Watson; r = coeficiente
de correlação da curva linear final obtida para cada fármaco e F = razão entre as variâncias
(teste ANOVA).
Figura 2 – Gráficos finais da linearidade obtidos para cada fármaco,
rifampicina e isoniazida.
Gráfico Final da Linearidade - Rifampicina
7000
Resposta
6400
5800
5200
y = 58,989x - 94,613
R² = 0,9958
r = 0,9979
4600
4000
75
80
85
90
95
100 105 110 115 120 125
Concentração (%)
Gráfico Final da Linearidade - Isoniazida
2400
Resposta
2200
2000
1800
y = 18,98x - 5,5163
R² = 0,9914
r = 0,9957
1600
1400
75
80
85
90
95 100 105 110 115 120 125
Concentração (%)
O método analítico é seletivo e possui adequada resolução entre os picos (Figura 3).
Nenhum pico é observado quando injetada a solução branco, indicando que não existem
interferentes provenientes dos solventes utilizados na análise. Além disso, os perfis
cromatográficos da solução padrão e da solução amostra, preparadas na mesma concentração,
são semelhantes. Os tempos de retenção médios observados foram de 9,838 ± 0,373 minutos
para rifampicina e de 3,041 ± 0,461 minutos para isoniazida obtidos pela injeção da solução
padrão. Para a solução amostra, os tempos de retenção médios foram 9,810 ± 0,389 de
minutos para rifampicina e de 3,034 ± 0,480 minutos para isoniazida. O ruído observado na
linha de base dos cromatogramas obtidos para as soluções amostra, padrão e branco é devido
ao uso da eluição em gradiente (Figura 4).
Figura 3 – Cromatogramas obtidos para as soluções amostra, padrão e branco no teste seletividade
1200
1000
mAu
800
600
400
Padrão
Amostra
Branco
200
0
0
1
2
3
4
5
Tempo (min)
6
7
8
9
Figura 4 – Linha de base dos cromatogramas obtidos para as soluções amostra, padrão e branco
no teste seletividade
100
mAu
75
50
Padrão
Amostra
Branco
25
0
0
1
2
3
4
5
Tempo (min)
6
7
8
9
Tabela 5 – Desvios padrões relativos obtidos nas análises de soluções amostras
preparados para avaliação do teste precisão
Parâmetro
Rifampicina
Isoniazida
Precisão intracorrida 1º dia
0,56 %
2,01 %
Precisão intracorrida 2º dia
2,29 %
1,61 %
Precisão intercorrida
1,63 %
3,23 %
As concentrações médias esperadas e observadas, bem como as porcentagens de
recuperação de cada fármaco, encontram-se na tabela 5. As porcentagens de recuperação dos
fármacos rifampicina e isoniazida foram superiores a 98% e inferiores a 102% (Tabela 6) e os
valores de DPR foram menores que 5%, portanto o método para análise simultânea dos dois
fármacos não é inexato.
Tabela 6 – Concentrações médias esperadas e observadas e porcentagens de recuperação de cada fármaco
obtidas no teste exatidão
Fármaco
Rifampicina
Isoniazida
Nível de
Concentração
Concentração
concentração esperada (mg/mL) observada (mg/mL)
Recuperação (%)
90 %
0,1417
0,1404
99,1
100 %
0,1563
0,1535
98,2
110 %
0,1713
0,1699
99,1
90 %
0,0653
0,0656
100,5
100 %
0,0727
0,0731
100,5
110 %
0,0804
0,0815
101,4
Na verificação da robustez do método analítico, constatou-se que pequenas variações
de temperatura, no fluxo e no lote da coluna cromatográfica não impactam significativamente
o método. Não houve diferenças estatisticamente significativas a 95% de confiança (p > 0,05).
A tabela 7 apresenta o teor de cada fármaco obtido em cada ensaio. Além disso, ela apresenta
os valores de F obtidos, valor de p e o F crítico correspondente a cada grupo de ensaios. Os
ensaios foram realizados conforme descrito no item 2.4.4 e tabela 3: nos ensaios de 1 a 3
variou-se a temperatura, nos ensaios 4 a 6 variou-se o fluxo e no ensaio 8 utilizou-se coluna
com lote diferente da coluna da validação. O resultado do ensaio 8 foi comparado com o
resultado obtido com o ensaio 7. A partir dos resultados obtidos, conclui-se que, quando
aplicado o método analítico para determinação de rifampicina e isoniazida em comprimidos
de dose fixa combinada, a temperatura do método pode variar entre 30 ºC ± 5 ºC, o fluxo
entre 1,2 mL/min ± 0,1 mL/min e que pode-se utilizar coluna cromatográfica de outro lote
sem causar grandes variações no resultado analítico.
Tabela 7 – Resultados obtidos nos experimentos realizados para análise da robustez do método para
determinação de rifampicina e isoniazida em comprimidos de dose fixa combinada
Ensaio
Estatística
1
2
3
4
5
6
7
8
Teor de Rifampicina 102,4% 102,0% 102,6% 102,6% 102,0% 102,0% 101,4% 101,4%
F
6,457 x 10-1
5,272 x 10-2
1,485 x 10-2
p
0,557
0,949
0,909
Fcrítico
5,143
5,143
7,709
Teor de Isoniazida
99,7% 99,6% 99,7% 94,2%
94,2% 94,2% 92,4%
92,1%
F
2,506 x 10-3
7,760 x 10-4
1,914 x 10-1
p
0,997
0,999
0,684
Fcrítico
5,143
5,143
7,709
4 CONCLUSÕES
O método analítico desenvolvido para quantificação simultânea de rifampicina e
isoniazida em comprimidos dose fixa combinada, associação utilizada na segunda etapa do
tratamento preconizado pelo Ministério da Saúde, é seletivo e específico e cumpriu com os
requisitos de linearidade, precisão, exatidão e robustez. Esse método permitirá a verificação
da qualidade dos comprimidos disponibilizados pelo Sistema Único de Saúde. Além disso, o
novo método poderá ser útil no trabalho de verificação da qualidade dos produtos
farmacêuticos realizado pelos Laboratórios Centrais de Saúde Pública (LACENs) juntamente
com a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA).
5 AGRADECIMENTOS
Ao Laboratório de Controle de Qualidade de Medicamentos e Cosméticos da
Faculdade de Farmácia da UFMG e ao Grupo de Revisão da Farmacopeia Brasileira 5ª edição
pela colaboração no trabalho.
REFERÊNCIAS
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Coordenadoria de Controle de Doenças. Secretaria de Estado da Saúde. São Paulo, SP, Brasil.
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[3] SVS/MS. Informe Técnico de Tuberculose. Julho, 2010. Disponível em: <
http://portal.saude.gov.br/portal/arquivos/pdf/informe_tb_julho10_certo_22_07_2010.pdf>.
Acesso em: 25 de julho de 2012.
[4] DALCOLMO, M.P.; NORONHA, M.K.; PICON, P.D.P.. Tuberculose multirresistente no
Brasil: histórico e medidas de controle. Rev. Saúde Pública, v.41, p.34-42, 2007.
[5] BRASIL. Resolução RDC N° 17, de 16 de abril de 2010. Dispõe sobre as Boas Práticas de
Fabricação de Medicamentos. Diário Oficial da União, Brasília, 19 de abril de 2010.
[6] FARMACOPEIA BRASILEIRA. 5ª edição, v.2, Brasília, 2010. Disponível em:
<http://www.anvisa.gov.br/hotsite/cd_farmacopeia/pdf/volume1.pdf>. Acesso em: 24 de julho
de 2012.
[7] BRITISH PHARMACOPOEIA 2011 (BP 2011). The Stationary Office on behalf of the
Medicines and Healthcare products Regulatory Agency (MHRA), London (GB), UK, 2011.
[8] UNITED STATES PHARMACOPEIA AND NATIONAL FORMULARY (USP 35 - NF
30). The United States Pharmacopeial Convention, Rockville (MD), USA, 2012.
[9] BRASIL. Resolução RE N° 899, de 29 de maio de 2003. Guia para validação de métodos
analíticos e bioanalíticos. Diário Oficial da União, Brasília, 02 de junho de 2003.
[10] BRASIL. Resolução RDC N° 11, de 16 de fevereiro de 2012. Dispõe sobre o
funcionamento de laboratórios analíticos que realizam análises em produtos sujeitos à
Vigilância Sanitária e dá outras providências. Diário Oficial da União, Brasília, 22 de
fevereiro de 2012.
[11] SOUZA, Scheilla Vitorino Carvalho de. Procedimento para validação intralaboratorial
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