Resumo de Tese de Doutorado apresentada ao Programa de Ciências Morfológicas
da UFRJ em 2012 – Sayonara Maria de Carvalho Gonzalez
Estudo da regulação da expressão do gene galanina e do seu
envolvimento no crescimento e na sobrevivência de células-tronco
embrionárias de camundongo
RESUMO
A galanina é um neuropeptídio que apresenta funções neuromodulatórias e endócrinas
além de desempenhar um importante papel trófico no cérebro adulto e também
durante o desenvolvimento embrionário. Este peptídeo também pode atuar induzindo
a apoptose e a proliferação, dependendo do tipo celular envolvido. Através de estudos
de transcriptoma e proteoma a galanina foi identificada em células tronco embrionárias
(ES) indiferenciadas, entretanto, o seu papel nestas células, assim como as proteínas
que regulam a sua expressão ainda não foram determinados. Através de análises in
silico, identificamos a presença de sítios de transcrição conservados entre sequências
regulatórias do gene galanina de camundongo e humano. Os sítios HOX-F e PAX 4/6
localizam-se a -2408bp/-2186bp e os sítios SP1 e CRE localizam-se a -146bp /+69 bp, no
gene do camundongo. A combinação de ensaios de EMSA, transfecção e ensaios de
luciferase revelou que CREB ativa a expressão de galanina e deve trabalhar com SP1 de
forma cooperativa, enquanto que HOX-F e PAX 4/6 devem atuar como inibidores da
expressão da galanina. Provavelmente, a utilização diferencial destes elementos
regulatórios dirige a expressão apropriada da galanina in vivo.
Ao investigar o papel da galanina no crescimento e na diferenciação de células ES por
citometria de fluxo, utilizando os anticorpos anti-nestina, alfa-feto proteína e alfaactina, específicos para os três folhetos embrionários e os anticorpos anti-Oct 3/4,
Nanog e SSEA-1, marcadores de pluripotencialidade e anti-Ki-67 marcador de
proliferação não observamos alteração na diferenciação e nem na proliferação destas
células. Como a galanina sabidamente apresenta um papel protetor de morte em
diversos tipos celulares, combinamos o tratamento com galanina e anisomicina, para
avaliar a morte celular por apoptose, utilizando o ensaio de Anexina-V e iodeto de
propídeo e análise por citometria de fluxo. Após o duplo tratamento foi observado que
a galanina foi capaz de reduzir a morte induzida por anisomicina. Tem sido descrito que
este efeito protetor da galanina é mediado pelo receptor GALR2 através da via de
PI3/AKT. Como neste trabalho observamos que as células ES expressam somente o
receptor GalR2, nós postulamos que esta via de sinalização seja utilizada para a
sobrevivência das células ES.
A análise por espectrometria de massa do perfil proteico das células ES tratadas com
galanina mostrou um aumento da expressão de 286 proteínas e diminuição da
expressão de 174 proteínas. Dentre as proteínas com expressão aumentada, APi5 nos
chamou atenção por ser um potente inibidor de apoptose induzida por E2F1.
Interessantemente, este efeito de E2F1 na apoptose também pode ser inibido pela via
PI3K/AKT. Estes dados nos levam a propor que APi5 e PI3K medeiam a sobrevivência das
células ES induzida por galanina.