IMPLANTAÇÃO DA TÉCNICA DE MIRU (MYCOBACTERIAL
INTERSPERSED REPETITIVE UNITS) PARA CARACTERIZAR
MOLECULARMENTE Mycobacterium tuberculosis
Natália Sanches Xavier (PIBIC/CNPq-FA-UEM), Rosilene Fressatti Cardoso
(Orientador), e-mail: [email protected]
Universidade Estadual de Maringá/Departamento de Análises Clínicas e
Biomedicina/Maringá, PR.
Ciências da Saúde
Palavras-chave: Mycobacterium tuberculosis, MIRU, Epidemiologia.
Resumo:
Mycobacterial Interspersed Repetitive Units (MIRU) é uma técnica específica
para caracterização molecular do Complexo Mycobacterium tuberculosis.
Neste sentido, o objetivo do presente projeto foi implantar o método de
MIRU para caracterizar molecularmente M. tuberculosis isolados de culturas
de escarros de pacientes com tuberculose pulmonar atendidos no
Laboratório de Ensino e Pesquisa em Análises Clínicas (LEPAC), referência
da 15ª Regional de Saúde de Maringá, Paraná. MIRU-VNTR foi realizado em
84 isolados clínicos de M. tuberculosis e um total de 67 perfis distintos de
MIRU foram obtidos, com 58 (69.0%) isolados que eram órfãos e os 26
(31.0%) remanescentes foram incluídos em nove clusters compostos de dois
a seis isolados cada um. Os dados indicam que a tuberculose desenvolve
predominantemente por reativação de infecções latentes nesta população
estudada.
Introdução
Mycobacterium tuberculosis é o principal agente causador da tuberculose
(TB), uma doença responsável por 26% dos óbitos possivelmente evitáveis
no mundo (1, 2). IS6110 Restriction Fragment Lenght Polymorphism (RFLP)
foi adotado como método padrão para tipagem molecular de M. tuberculosis,
por ser altamente discriminatório. Entretanto, apesar de ser 100%
reprodutível, apresentar alto grau de discriminação e especificidade, a
mesma é trabalhosa, necessitando de pessoal altamente qualificado para a
realização do ensaio (3). Tendo em vista essa problemática, métodos
baseados em mini-satélites que contém números variáveis de repetições em
sequências (“Variable Numbers of Tandem Repeats” – VNTRs) foram
demonstrados ser efetivos para tipagem de M. tuberculosis (4). A técnica
denominada MIRU (“Mycobacterial Interspersed Repetitive Units”), baseada
na análise de sequências homólogas de 46-100pb de DNA se repetem
sequencialmente (tandem repeats) e estão dispersas em regiões
intergênicas no genoma de M. tuberculosis (5). MIRU consiste em um
sistema altamente reprodutível e rápido, e possibilita uma comparação entre
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
linhagens de diferentes áreas geográficas e permite o rastreamento da
movimentação de linhagens individuais (5) de forma semelhante à técnica
de RFLP sendo, no entanto, de execução mais fácil. Este tipo de abordagem
torna possível maior número de análises e identificação de mais focos de
contágio na população.
O presente estudo teve como objetivo implantar a técnica MIRU para
caracterizar molecularmente M. tuberculosis isolados de cultura de escarros
de pacientes com tuberculose pulmonar atendidos no laboratório de Ensino
e Pesquisa em Análises Clínicas (LEPAC).
Materiais e métodos
Amostras bacterianas
Os isolados de M. tuberculosis utilizados no presente estudo foram
provenientes da micobacterioteca do setor de Bacteriologia Clínica do
Laboratório de Ensino e Pesquisa em Análises Clínicas (LEPAC)/DAC/UEM.
Extração do DNA micobacteriano
Os DNAs cromossômicos dos isolados de M. tuberculosis em LowensteinJensen foram extraídos utilizando a técnica descrita por GONZALEZMERCHAND et al. (1996). Foi empregada solução de lise Cloridrato de
Guanidina 6M e purificação fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25:24:1), e
em seguida com clorofórmio/álcool isoamílico (24:1). Os DNAs foram
precipitados com etanol absoluto, lavados com etanol 70%, secos ao ar e
reconstituído em 100µl de tampão TE (Tris-HCl 10mM; EDTA 1mM, pH 8,0).
A integridade das amostras de DNAs foi avaliada por eletroforese em gel de
agarose a 0,8% em tampão TBE (Tris-HCl 90mM, ácido bórico 90mM e
EDTA 2mM) a 100 Volts, por 30 minutos.
MIRU-VNTR
Os isolados foram genotipados pela amplificação utilizando os 12 MIRUVNTR loci (2, 4, 10, 16, 20, 23, 24, 26, 27, 31, 39, e 40) (5) em
termocicladora TC-512 (Techne, UK). Cada locus foi amplificado com 2 µl de
DNA micobacteriano em 23 µl mistura contendo 0.4 µM de cada respectivo
primer e PCR Master Mix (Promega Corporation, Madison, Wisconsin, USA).
As condições de amplificações para cada par de primers foram descritas por
Supply et al. (2000) (Quadro). O produto da PCR foi submetido à
eletroforese em agarose (Invitrogen Life Technologies, São Paulo, Brasil)
2.0%. Marcadores de peso moleculares de 50 e 100-bp (Invitrogen Life
Technologies, São Paulo, Brasil) foram usados para determinação do
tamanho do produto da PCR. Os géis foram corados com brometo de etídio
e fotodocumentados em câmera Digital Power Shot S215 (Cannon, NY,
USA). O tamanho dos produtos da PCR foi determinado por comparação
visual com os marcadores moleculares. Resultados de cada um dos 12 loci
foram combinados para criar um perfil de 12 dígitos para cada isolado
micobacteriano. O software BioNumerics (versão 4.45; Applied Maths, SintMartens-Latem, Belgium) foi usado para análise dos padrões de MIRU-
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
VNTR. O Dendrograma e a distância genética foram construídos
empregando algorítimo UPGMA (Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean; Sneath and Sokal 1973).
Quadro. Sequências de oligonucleotídeos iniciadores dos 12 loci de MIRU.
Locus
de MIRU
02
04
10
16
20
23
24
26
27
31
39
40
Identificação
2F
2R
4F
4R
10F
10R
16F
16R
20F
20R
23F
23R
24F
24R
26F
26R
27F
27R
31F
31R
39F
39R
40F
40R
Sequência de oligonucleotídeos
TGGAACTTGCAGCAATGGACCAACT
TACTCGGACGCCGGCTCAAAAT
GCGCGAGAGCCCGAACTGGC
GCGCAGCAGAAACGTCAGC
GTTCTTGACCAACTGCAGTCGTCC
GCCACCTTGGTGATCAGCTACCT
TCGGTGATCGGGTCCAGTCCAAGTA
TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG
TCGGAGAGATGCCCTTCGAGTTAG
GGAGACCGCGACCAGGTACTTGTA
CTGTCGATGGCCGCAACAAAACG
AGCTCAACGGGTTCGCCCTTTTGTC
CGACCAAGATGTGCAGGAATACAT
GGGCGAGTTGAGCTCACAGAA
CATAGGCGACCAGGCGAATAG
TAGGTCTACCGTCGAAATCTGTGAC
TCGAAAGCCTCTGCGTGCCAGTAA
GCGATGTGAGCGTGCCACTCAA
ACTGATTGGCTTCATACGGCTTTA
GTGCCGACGTGGTCTTAGT
CGCATCGACAAACTGGAGCCAAAC
CGGAAACGTCTACGCCCCACACAT
GGGTTGCTGGATGACAACGTGT
GGGTGATCTCGGCGAAATCAGATA
Temperatura
de
hibridização
60ºC
55 ºC
55 ºC
55 ºC
55 ºC
55 ºC
50 ºC
50 ºC
55 ºC
55 ºC
55 ºC
55 ºC
Resultados e Discussão
MIRU-VNTR foi realizado em 84 isolados clínicos de M. tuberculosis e um
total de 67 perfis distintos de MIRU foram obtidos, com 58 (69.0%) isolados
que eram órfãos e os 26 (31.0%) remanescentes foram incluídos em nove
clusters compostos de dois a seis isolados cada um (Fig.).
Análise do polimorfismo usando os 12 loci de MIRU revelou que o
locus 40 foi o mais discriminatório com oito alelos, seguido pelos loci 23, 10
e 16. No locus 40 a presença de três alelos foi o mais frequente seguido de
cópia única. Os loci 20, 26 e 31 foram moderadamente discriminantes.
Outros loci foram menos polimórficos com dois alelos nos loci 4, 20 e 39 e
somente um alelo no locus 24, onde uma única cópia estava presente em
todos os 84 isolados de M. tuberculosis analisados.
O presente estudo oferece os primeiros dados sobre a diversidade
genética de isolados clínicos de M. tuberculosis isolados de pacientes com
TB em cidades da região Noroeste do Estado do Paraná.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
Pearson correlation
100
95
90
85
80
75
70
65
60
55
50
45
40
35
30
25
20
15
10
MIRU
28
31
49
56
57
60
59
66
73
54
05
09
22
80
43
45
58
02
37
64
72
21
77
15
41
75
04
06
13
01
84
16
17
34
39
27
19
35
40
42
03
11
68
52
67
63
74
14
51
69
61
83
53
44
46
24
10
78
76
36
62
29
55
33
65
18
20
23
47
30
79
70
50
81
82
25
48
26
38
12
08
07
71
32
Figura. Análise de 84 isolados clínicos de M. tuberculosis de Maringá e outras cidades do
Noroeste do Estado do Paraná, Brasil, utilizando MIRU-VNTR.
Conclusões
A técnica foi implantada com sucesso e os dados indicam que a
tuberculose desenvolve predominantemente por reativação de infecções
latentes nesta população estudada. Nossos resultados encorajam que
estudos adicionais em nossa região sejam realizados.
Referências
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killer. Science. 1992, 257: 1055-1064.
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Journal of the American Medical Association. 1995, 273: 220-226.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.
3. Pandolfi, J.R.C. Otimização da técnica de MIRU (Mycobacterial
Interspersed Repetitive Units) para o estudo epidemiológico de paciente com
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Araraquara, 2006.
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Mycobacterium tuberculosis strain typing: a users guide. J. Appl. Microbiol.
2003, 94: 781-791.
5. Supply, P.; Mazars, E.; Lesjean, S.; Vincent, V.; Gicquel, B.; Locht, C.
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6. Gonzalez-Merchand, J.A.; Estrada-Garcia, I.; Colston, M.J.; Cox, R.A. A
novel method for the isolation of mycobacterial DNA. FEMS Microbiol. Lett.
1996, 135: 71-77.
Anais do XIX EAIC – 28 a 30 de outubro de 2010, UNICENTRO, Guarapuava –PR.