SuperPicTure™ Kits
Zymed 2.a Geração
Sistema de detecção de polímero
CAT. N.º
PARA ANTICORPOS
ENZIMA
BOM PARA
PRIMÁRIOS
87-8963
Espectro amplo*
HRP POLYMER**
1000 lâminas
*Reagirá com anticorpos primários de ratos, coelhos, porquinhos da Índia e ratazanas.
**Este kit não contém um cromogénio. AEC solução simples (Cat. N.º 00-1111) ou kit DAB (Cat. N.º 00-2014) são recomendados
para serem usados com este kit.
UTILIZAÇÃO PREVISTA
Para utilizar em diagnóstico in vitro. A interpretação deve ser feita dentro do contexto do historial clínico do paciente e de outros testes de
diagnóstico por um patologista qualificado.
Os Kits SuperPicTure™ são concebidos para revelar antígenos que reagiram com um anticorpo primário fornecido pelo utilizador em tecido
humano ou em amostras de células. Podem ser utilizados tecidos congelados ou embebidos em parafina, linfócitos preparados recentemente e
células de cultura fixa.
PRAZO DE ARMAZENAGEM E DE VALIDADE
Armazene o kit a 2-8 °C. Todas as reclamações de execução são anuladas após a expiração da data de validade do kit.
REAGENTES FORNECIDOS
Reagente A. Um frasco conta-gotas (110 mL) de conjugado de polímero HRP pronto a usar.
REAGENTE E MATERIAIS NECESSÁRIOS MAS NÃO FORNECIDOS
– Xileno, etanol e metanol absoluto
– Água destilada ou desionizada
– Água oxigenada a 30%
– 10 mM de soro fisiológico com tampão de fosfato (PBS)
(Opcional: Tween 20 a 0,05%)
– Mini PAP Pen (Zymed Cat. n.º 00-8877)
– Anticorpo primário
– reagentes de substrato/cromogénio HRP:
AEC solução simples (Cat. Zymed N.º 00-1111)
Kit DAB (Zymed Cat. N.º 00-2014)
Kit DAB-Black™ (Zymed Cat. N.º 00-2013)
– Hematoxilina (Cat. Zymed N.º 00-8001)
– Meios de montagem
Clearmount™ (Cat. Zymed N.º 00-8110) ou
HistomountTM (Cat. Zymed n.º 00-8030)
4/6/2005
Copyright 2005, Zymed Laboratories
PIN: 30756
PROTOCOLO DE COLORAÇÃO SUGERIDO
A. PREPARAÇÃO PRELIMINAR DE LÂMINAS
1. PREPARAÇÃO DA AMOSTRA
2. PREPARAÇÃO DE LÂMINAS
3. DESPARAFINIZAÇÃO E
REIDRATAÇÃO
4. LÂMINAS DE CONTROLO
B.
- São necessários tecidos apropriados e a fixação de antígenos para obter uma execução reprodutível e
interpretações seguras. Os fixadores adequados incluem: formol tamponado neutro a 10%, B5, Bouin’s,
formol de zinco ou fixadores à base de álcool.
- Formol tamponado neutro a 10%, B5, Bouin’s, formol de zinco ou fixadores à base de álcool são aceites
como fixadores adequados para a maior parte dos antígenos de importância clínica.
- Os tecidos fixados a formol fixados posteriormente em B5 e anteriormente embebidos em parafina podem
mostrar coloração melhorada. Exames citológicos de células preparados a partir de fluidos corporais
deverão ser feitos para garantir uma camada monomolecular de células. Muitas camadas de células podem
capturar os reagentes de coloração e interferirem com a interpretação dos resultados. Os esfregaços
citológicos devem ser fixados imediatamente após a preparação. Dependendo das propriedades do antígeno,
os esfregaços citológicos de células são normalmente estáveis durante uma ou duas semanas quando
armazenados a 4 °C.
- A fixação de citospina ou secções congeladas pode ser efectuada com acetona (100%) a 4 °C durante um
período de 10 minutos.
-Revista primeiro as lâminas com HistoGrip™ (Cat. Zymed N.º 00-8050). Como alternativa, revista
primeiro com poli-L-lisina a 0,1% em água, depois seque ao ar.
As secções de parafina são desparafinizadas com xileno e reidratadas numa série graduada de etanol. Lave
os esfregaços citológicos ou o tecido num banho de PBS durante 10 minutos antes de iniciar o
procedimento de coloração. Nota: Não permita que a amostra ou as secções de tecido sequem a partir
deste ponto.
São necessárias três lâminas de controlo para a interpretação de resultados.
• Controlo de tecido positivo: Uma amostra, processada da mesma maneira da desconhecida, contém o
antígeno a ser colorido.
• Controlo de reagentes/controlo negativo 1: Uma lâmina adicional que será tratada com um soro não
imune em substituição da mesma concentração de anticorpo primário. Qualquer coloração observada na
amostra é provavelmente devida a ligação de proteínas não específicas ou a ligação não específica de outros
reagentes.
• Controlo negativo 2: Uma amostra, processada da mesma maneira da desconhecida, não contém o
antígeno a ser colorido [opcional].
PROTOCOLO DE COLORAÇÃO
Reagentes
Procedimentos de coloração
1. SOLUÇÃO DE
ARREFECIMENTO RÁPIDO DE
PEROXIDASE
(Não fornecido)
Este passo é opcional. Efectue o passo 1 se a eliminação da actividade de peroxidase
endógena for necessária.
Período de
incubação
(Min.)
10
(opcional)
- Para tecidos embebidos de parafina,
a. Acrescente 1 parte de água oxigenada a 30% a 9 partes de metanol absoluto. Misture bem.
b. Mergulhe as lâminas em SOLUÇÃO DE ARREFECIMENTO RÁPIDO DE
PEROXIDASE durante 10 minutos.
c. Lave com PBS 2 min., 3 vezes. Prossiga para o passo 2.
Para tecido congelado, trate com Peroxo-Block (cat. n.º 00-2015) durante 45 seg. Lave
imediatamente. Peroxo-BlockTM pode também ser usado com tecidos de parafina.
2. ANTICORPO PRIMÁRIO
(Não fornecido)
3. CONJUGADO DE POLÍMERO
HRP
Pronto a usar. Reagente A
4. CROMOGÉNIO
(Não incluído)
4/6/2005
30-60
Os períodos óptimos de diluição e de incubação deverão ser determinados pelo investigador. Os
anticorpos primários 2ndGen são optimizados para uso com os kits de detecção SuperPicTure™. (Os
períodos de diluição e de incubação estão dependentes da preparação da amostra, afinidade de
anticorpos, quantidade do antígeno presente e acessibilidade do antígeno).
a. Aplique 2 gotas (100 µL), ou o suficiente para cobrir o tecido completamente, de
ANTICORPO PRIMÁRIO para cada secção.
b. Incube na câmara de humidade durante 30-60 min.
c. Enxagúe com PBS durante 2 min., 3 vezes.
a. Aplique 2 gotas (100 µL), ou o suficiente para cobrir o tecido completamente, de
CONJUGADO DE POLÍMERO HRP para cada secção. Incube durante 30 min. Para
primários de ratazana, incube durante 10 min.
b. Enxagúe com PBS durante 2 min., 3 vezes.
a. Prepare e acrescente cromogénio seguindo as instruções do fabricante. Nós recomendamos
a utilização de AEC solução simples (Cat. N.º 00-1111) ou kit DAB (Cat. N.º 00-2014).
Copyright 2005, Zymed Laboratories
10
DAB 5
AEC 10
PIN: 30756
A partir deste ponto, o investigador deverá prosseguir com os seus próprios protocolos laboratoriais estabelecidos para contracoloração e
montagem. Zymed recomenda a utilização de hematoxilina (Cat. N.º 00-8001) como uma contracoloração e HistomountTM (Cat. N.º 00-8030) ou
ClearmountTM (Cat. N.º 00-8010) como solução de montagem para DAB.
INTERPRETAÇÃO DE RESULTADOS
A tabela seguinte interpreta os resultados que podem ser conseguidos utilizando vários controlos de coloração.
Caso N.º
controlo +
1
2
_
3
4
5
6
controlo de
reagente
controlo (-)
Amostra
_
_
_
Procedimento efectuado incorrectamente.
+
+
+
+
+
_
_
_
+
+
+
_
_
+/+
Coloração não específica devido a ligação de proteína
ou a actividade de peroxidase endógena.
O controlo negativo contém o antígeno.
_
_
_
Análise
O controlo positivo não contém o antígeno.
_
A amostra não contém o antígeno.
+
A amostra contém o antígeno.
RESOLUÇÃO DE PROBLEMAS
Causas possíveis para coloração negativa em lâminas positivas:
1. Os passos no protocolo de coloração foram efectuados na sequência incorrecta.
2. Alguns passos de incubação de anticorpos primários ou secundários foram omitidos.
3. Os antígenos lábeis foram destruídos.
4. As amostras foram incorrectamente fixadas e/ou processadas.
5. As amostras desidrataram durante a coloração.
Causas possíveis para fraca coloração em todas as lâminas:
1. As amostras retiveram líquido em excesso após os passos de enxaguamento.
2. Os tempos de incubação foram insuficientes.
3. O substrato foi preparado incorrectamente.
4. As desparafinização ficou incompleta (a coloração pode ser acompanhada por um fundo elevado).
Causas possíveis para coloração de fundo elevada:
1. A actividade endógena de peroxidase foi incompletamente bloqueada.
2. A desparafinização ficou incompleta.
3. Aplicação excessiva de adesivo para tecidos.
4. Enxaguamento de lâminas inadequado.
5. Sobredesenvolvimento de substrato.
6. Desidratação da amostra durante a coloração.
MARCAS
SuperPicTure™, CAS-Block™, Clearmount™, HistoGrip™, Histomount™ e Peroxo-Block™ são marcas comerciais da Zymed Laboratories, Inc. Zymed® e
Histostain® são marcas registadas da Zymed Laboratories, Inc.
SE TIVER QUAISQUER PERGUNTAS ACERCA DESTE PRODUTO, POR FAVOR CONTACTE O SEU DISTRIBUIDOR LOCAL.
Representante autorizado de IVDD 98/79/CE:
4/6/2005
MDSS
Burckhardstr.1
D-30163 Hannover
Alemanha
Copyright 2005, Zymed Laboratories
PIN: 30756