Novos Equipamentos
ao Serviço do Controlo de
Produtos Enológicos
A. César Silva Ferreira – [email protected]
Escola Superior de Biotecnologia - Universidade Católica Portuguesa
- Portugal -
Objectivo:
Contributo das novas Tecnologias na aferição da Autenticidade
do Vinho: Estratégias, Riscos e Oportunidades.
  A Ionização a pressão atmosférica: Selectividade
e
Sensibilidade
Caracterização por um número reduzido de atributos
  Analise Multivariada : “Anatomia do Vinho”
Caracterização por um elevado número de atributos
9/27/10
ALABE
Autenticidade…
“ Se desejares saber se ao teu vinho foi ou não
adicionada água, usa uma taça pequena de marfim.
Encha-a com o vinho que pensas ter sido adulterado.
Caso tenha sido adicionado água, o vinho será
absorvido pela taça ficando só a água pois uma taça
de marfim não retêm o vinho…”
2
Definição do dicionário
Autenticidade é …
… “ Qualidade do que é conforme à verdade ;
veracidade ;” … “Qualidade de uma obra que
comprovadamente pertence ao autor a que é
atribuída ”…
In Porto Editora Dic 2007
9/27/10
ALABE
4
Definição do dicionário
Autenticidade é …
… “ Qualidade do que é conforme à verdade ;
veracidade ;” … “Qualidade de uma obra que
comprovadamente pertence ao autor a que é
atribuída ”…
In Porto Editora Dic 2007
9/27/10
ALABE
Qualidade tecnológica
Conjunto de parâmetros
físico-químicas, que
permitem distinguir
o produto e que
senão respeitados
inviabilizam o seu
Consumo !
5
Qualidade “tecnológica” do vinho:
Etapas na definição dos parâmetros típicos do produto
1- Identificar :
Cartografia
2 - Quantificar :
Topografia
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ALABE
7
Qualidade tecnológica
Autenticidade…
??
? ?
ALABE
8
Qualidade tecnológica : Detectores
Química do vinho…
O
CH
O 3 R2 O CHH2O
OO
O C
HO
H
OH O HC
3
R2
OH 3 O
HO
OH
O OH
R2 O CH3
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?
?
CH
H
O 3 O NR1
O
OH
H3C HO
O
O CH3R2 H
O
H3C
Química do vinho…
O
CH
CH
H
O 3 R2 O CHH2O O 3 O NR1
OO
O C
HO
H HC OHO OH
OH O H
3 C R2 OH
R2 OH 3C O 3 O
H3
HO
O
OH
H3C
O OH
R2O CH3
UV-Visível :
Absorção Molecular
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ALABE
10
Qualidade tecnológica : Detectores
Química do vinho…
O
CH
CH
H
O 3 R2 O CHH2O O 3 O NR1
OO
O CH
O
HO
OH
H3C HO OH
R2OH OH 3C O 3 O
CHR2 OH
3
HO
O
OH
H3C
O OH
R2O CH3
Fluorescência
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ALABE
11
Qualidade tecnológica : Detectores
Química do vinho…
O
CH
CH
H
O 3 R2 O CHH2O O 3 O NR1
OO
O CH
O
HO
OH
H3C HO OH
R2OH OH 3C O 3 O
CHR2 OH
3
HO
O
OH
H3C
O OH
R2O CH3
Infra-Vermelho
Supressão Ruído : Cromatografia
H
O
CH3
CH
3 O N R1
O
R2
CHH O O
O O O O 2C
HO
H H C OHO OH
OH
OH
3 3
OH
3C O
R2
O CH3R2
OH
HO
O
OH
HC
3
R2 O CH3
O
OH
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ALABE
13
Sensibilidade
Supressão Ruído : Cromatografia
H
O
3
O
O
R2
H C
3
CH 3
O
CH
O
O
H
R2
O
O OH C
H
HO
O H
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ALABE
14
Sensibilidade
Supressão Ruído : Cromatografia
HO
OH
O
HO
OH
CH
3
O
R2
OH
O
R2
O
CH
Detecção por Espectrometria
de Massa :
•  Alta selectividade
•  Elevada sensibilidade
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ALABE
16
Cadeia de Análise: MS
Separação
Ionização
Detecção
Interpretação
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ALABE
17
MS : O que é ?
“Um sistema analítico
que permite
determinar o peso
molecular de
substâncias
químicas…
… por separação de
fragmentos iónicos em
função do seu rácio
…Introduzir uma partícula iónica
Encontrar um processo de
num campo magnético e/ou
“adicionar euma
carga” aos
umIões !!!
…detectar
CONTAR
eléctrico e medir
a velocidade
ou
átomo ou uma molécula
raio de curvatura relativa ao
(ionização)
quociente massa/carga…
+
_
Ion Source
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Mass Analyzer
Detector
ALABE
19
Ionização : GC
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ALABE
20
Ionização : GC
BC + + D
A + + BCD•
A • + BCD+
ABCD + eABCD+• + 2eq
(~70 eV ; 6700 kJ/mol)
AB • + CD+
CD • + AB+
C+D+
C ++ D A ++ B
D • + BC+
DBC+•
D + + BC•
A+B+
FRAGMENTAÇÃO
Detecção
DBC+•
Abundância
%
A+
AB +
B+
BC +
C+ D+
CD+
ABCD+•
BCD+
m/z
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ALABE
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Processo de fragmentação
Base Pic
Abundância
%
Fragmentation
( product Ions )
A+
AB +
B+
DBC+•
Molecular
Ion
BC +
C+ D+
( Precursor )
CD+
ABCD+•
BCD+
m/z
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ALABE
23
O
OH
O
CH
3 O
H O O
CH 2
O
OH
C
O
H
3 H 3C
R2
O
O CH
3
O
H C
3
O H
3C
3
OH
CH
R2
O
OH
O
CH
3
O
HO
H
N R1
OH
OH
O
R2
R2
O
HO
OH
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ALABE
25
Ionização : LC
Ionização
Iões na
Fase Liquida
Iões na
Fase Gasosa
H
O
CH3
CH
3 O N R1
O
R2
CHH O O
O O O O 2C
HO
H H C OHO OH
OH
OH
3 3
OH
3C O
R2
O CH3R2
OH
HO
O
OH
HC
3
R2 O CH3
O
OH
Evaporação
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Evaporação
Substancias
Fase Gasosa
MS
Ionização
ALABE
Electrospray Ionization
ESI
26
John Fenn and co-workers first published the successful ionization of
large synthetic polymers (PEGs), and subsequently proteins, using the
electrospray ionization (ESI) technique in the late 1980's while working at
Yale University. Fenn’s work built on that of Malcolm Dole from Northwestern
University in the late 1960's. Fenn added a counter-current dry gas to assist
with the drying of the electrosprayed droplets that greatly assisted in the
formation and detection of ions.
9/27/10
ALABE
28
Etapas no Processo Electrospray
Transferência de Iões da superfície das gotas
Redução do tamanho da Gota : Evaporação
pequenas
para a fase
gasosa :: Evaporação
Campo Eléctrico
na Agulha
rápida do Solvente ; Explosões Repetidas
Produção
de gotas Carregadas…
sem calor
… dessolvatação
… entrada no
forças de “Coulomb” (fissão)
“Analyser” …
Capilar
+/- 4 kV
9/27/10
ALABE
29
Etapas no Processo Electrospray
“Explosão
Coulômbica”
Agulha Spray
Cone de “Taylor”
Gotículas pequenas
Provoca…
“Spray” de
partículas
carregadas
Alta Densidade de Cargas
Gotículas tamanho intermédio
Gotas grandes não carregadas (solvente)
Gás Secagem tem 2 Funções
N2
Heater
1. Redução Tamanho da
Gota (dessolvatação)
N2 Gás Secagem
Gotas Grandes
IÕES
Droplets
Gotas Muito
Grandes
Vácuo Restrição
2. Dissociação “clusters”
ião/solvente antes da
entrada no “Analyser”
9/27/10
ALABE
31
ALABE
32
Capilar
Câmara
Vaporização
9/27/10
ESI Ionização : Molécula
Ganho Protão
M + H+ → [M+H]+
Ião (+)
Bases
(-NH2)
Adição de Catião [M+K]+ [M+Na]+ [M+NH4]+
Perda Protão
M → H+ + [M]-
Ião (-)
Ácidos
Adição de Anião M + A- → [M+A]-
Det.
modo
(+)
Det.
modo
(-)
•  Amostras Base (péptidos
•  Diminuir pH
arginina, Lisina...)
Acido acético
Acido Fórmico
Acido Trifluoracético
pH (3-4)
pH (2-3)
pH (1-2)
•  pH Fase móvel 2 unidades < pKa Amostra
•  Amostras Acidas (péptidos
•  Aumentar pH
aspart., glutamato...)
Hidróxido de Amónia
pH (8-10)
•  pH Fase móvel 2 unidades > pKa Amostra
Amostras Neutras : APCI
9/27/10
ALABE
34
Atmospheric Pressure
Chemical Ionization
APCI
9/27/10
ALABE
Aplicações APCI ?
•  SIM SE Moléculas pequenas não-polares ou
moderadamente polares
•  SIM SE Moléculas com heteroátomos.
•  NÃO SE amostras carregadas em solução
•  NÃO SE amostras termo instáveis ou
fotossensíveis
35
•  Vaporiza Rapidamente fase móvel
9/27/10
ALABE
37
Etapas no Processo APCI
•  Vaporiza Rapidamente fase móvel
•  Ionização moléculas de solvente pela
descarga corona
9/27/10
ALABE
38
Vaporização APCI
Liquido
•  Etapa #1: Nublização
–  Nebulização aumenta
o rácio Área / Volume
Gás : Nublização
•  APCI : è uma reacção na fase
gasosa
liquido
Gás
Secagem
Gás : Nublização
Tubo
quartzo
•  Analito deve estar disponível
na forma molecular estável na
fase gasosa
•  Componentes da matriz
podem sofrer evaporação
destrutiva
•  Evaporação depende de Gás
Auxiliar muito Quente
9/27/10
Fluxo
Gás
Quente
Vortex
ALABE
40
“Declustering” com o Gás Secagem
Vaporização
Agulha “Corona”
Gás
Secagem
N2
Solvente
& Iões
9/27/10
Iões
ALABE
41
Ionização e Câmara de APCI
Os gases de
Nublização e auxiliar
alem da fase móvel e
moléculas no estado
gasoso entram na
câmara APCI
Agulha “Corona”
Ionização Química
Ocorre entre a agulha
Corona e o
Spray
Inicia-se a Ionização com impacto de
electrões da agulha corona nos gases
abundantes neutros abundante…
e - + N2 →
N 2+ + N 2 →
9/27/10
N 2+ + 2 e N4 +
ALABE
43
Processo Ionização APCI
Cascata de reacções de transferência
de carga para a fase móvel exemplo da
H2O…
N4+ + H2O → 2N2 + H2O+
H2O+ + H2O → H3O+(H2O cluster) + OH-
9/27/10
ALABE
Processo Ionização APCI
Cascata de reacções de transferência
de carga da H2O para Solvente
Orgânico metanol…
H3O+ + CH3OH → CH3OH2+ + H2O
44
Cascata de reacções de transferência
de carga para o Analito…
CH3OH2 + + M → M+H + +
9/27/10
CH3OH
ALABE
46
Reacções Ião-Molécula APCI
 
Ião (+) APCI
–  Transferência de Protão (Ganho) : H3O+ + M → (M+H)+ + H2O
•  também … CH3OH2+, CH3CNH+, NH4+
N2 → H2O
–  Ligação de Aducto : NH4+ + M → (M+ NH4)+
N2 → NH4
•  também … CH OH +, CH CNH+, H 0+
3
2
3
3
–  Troca de Carga: CH3CN+ + M → M+ + CH3CN
  Ião
(-) APCI
–  Transferência de Protão (Perda) : OH- + M → (M-H)- + H2O
•  também … CH3O -, CH2CN –
–  Ligação de Aducto : CH3COO- + M → (M+ CH3COO)•  também … Cl- , HCOO–  Captura de Electrão
9/27/10
ALABE
Iões Reagentes em Fase Reversa
•  Sem Aditivos (aquosa/orgânica):
–  APCI (+)
–  APCI (-)
- [CH3OH2]+
- O2-
•  Com Aditivos, Ião mais fraco do reagente é o dominante…
–  APCI (+)
–  APCI (-)
- NH4+
- CH3COO-
•  A acidez (ou bas.) relativa na fase gasosa é critica em CI
47
Autenticidade…
9/27/10
ALABE
49
Riscos…
Controlo Saída
LD - Limite de detecção
Análise Substância (i)
LD1 > LD2
Rejeição
S
LD1 (i) > [ X ]
N
Controlo Entrada
S
Mercado
N
9/27/10
LD2 (i) > [ Y ]
Análise Substância (i)
ALABE
50
Autenticidade
Exemplos Adulteração de Bebidas Alcoólicas
  Adição de ingredientes mais baratos (agua, açúcar, álcool)
  Adição de Corantes e Aromatizantes
  Adição de outros compostos com “actividade sensorial”: Glicerol
 
 
 
“Blending” com produtos mais baratos
Indicação de Idade
Origem Geográfica
Detecção de adição de Glicerol ao Vinho
Vinho
1CH OH
2
2
CHOH
IRMS e/ou GC-IRMS
analise
3CH OH
2
13C/12C, 18O/16O
Analises de impurezas
por GC-MS
[C] em 3-MPD e CycD
Derivatisação
Quantitativa 2H-NMR (SNIF-NMR®)
(DH)1, (D/H)2, (D/H)3
9/27/10
ALABE
52
“Glycérinage ou Glycérolage”
O glicerol forma-se no
início da fermentação
alcoólica; os 1ºs 50 g
açúcares originam ½
desta molécula no vinho
…
9/27/10
ALABE
“Glycérinage ou Glycérolage”
O glicerol forma-se no início da fermentação
alcoólica; os 1ºs 50g açúcares originam ½ desta
molécula no vinho …
•  Glicerol : 6,5 a 10% massa vinho
•  Glicerol : 6-10g / 100g etanol 8,4g média
(1/10 a 1/15 do peso em álcool)
•  Glicerol / Etanol ~ 6 % (> 11 % fraude)
53
Glicerol e 2,3 - Butanediol
Espectofotometro 300 - 700 nm
Glicerol
2,3-Butanediol
Glicerol e 2,3 - Butanediol
Determinação
fotométrica
Método
enzimático
Determinação
fotométrica
Titulação
Periodimetria
Resultados
g/L
Resultados
g/L
Resultados
g/L
Resultados
g/L
9/27/10
ALABE
55
Diglicerina Cíclica: 3-MPD e CycD
Adição de glicerol produzido a partir de
gordura e/ou de petróleo
contém o metoxi-1,2-propanediol (3-MPD) e
glicerol dicíclico.
Estes compostos são inexistentes no vinho.
9/27/10
ALABE
Diglicerina Cíclica: 3-MPD e CycD
OH
HO
HO
O
O
O
HO
3-Metoxi-propanediol (3-MPD)
O
O
OH
CH 3
OH
cis,trans-2-hidroximetil-1,4-dioxepane
OH
O
OH
O
O
OH
O
cis,trans-2,5-bis-hidroximetil-1,4-dioxane
OH
HO
HO
O
O
HO
O
O
cis,trans-2,6-bis-hidroximetil-1,4-dioxane
56
•  “Salting out” : Adição de K2CO3;
•  Extracção Líquido - Líquido : Éter dietílico;
•  Análise por GC-MS numa coluna polar (FFAO/
CW20M);
•  Detecção por espectrometria de massa
–  Selected-ion monitoring (SIM) mode : Q
–  Full Scan : ITD
–  Quantificação m/z=57
9/27/10
ALABE
58
Método análise 3-MPD e CycDs : GCMS
10 ml Vinho
Padrão
Interno
Adição 10 g K2CO3
Solução a 20 ºC
num banho água
Adicionar 1 mL Éter dietílico
Agitar 5 min
Centrifugar a Solução
a 4000 rpm ;5 min
GCMS
9/27/10
ALABE
59
Método análise 3-MPD e CycDs : GCMS
Referência 4.0
mg/L
m/z = 57
Vinho Contaminado
1.4 mg/L
Desenvolvimento Método
Quantificação de 3-MPD e
CycDs por
LC-MSMS ESI (+)
9/27/10
ALABE
61
Método análise 3-MPD e CycDs : LCMSMS
10 ml Vinho
Vinho
OH
HO
O
CH3
pH 3
SPE
LCMSMS
Extração : Solid Phase
Extraction
Não
retido
Retido
Eluição :
Metanol 4 ml
LC MS/MS
9/27/10
ALABE
62
Método análise 3-MPD e CycDs : LCMSMS
Instrument parameters
Polarity
API drying gas
API chamber temperature
API nebulizing gas
Capillary voltage
Q2 collision cell pressure
Collision energy (V)
LC flow
Mobile phase
Scan time
Needle voltage
Shield voltage
Detector voltage
Precursor ion (m/z)
3-MPD
Positive
19 psi at 250 ºC
50 ºC
Air 51 psi
+ 20 V
Argon 1.30 mtorr
-5,0 V
0.3 ml/min
MetOH/H2O (80/20 v/v)
0,2 sec.
4500 V
600 V
Positive Extended Dynamic
Range
107
CycDs
Positive
19 psi at 350 ºC
50 ºC
Air 51 psi
+ 20 V
Argon 1.30 mtorr
-5,0 V
0.3 ml/min
MetOH/H2O (80/20 v/v)
0,2 sec.
4500 V
600 V
Positive Extended Dynamic
Range
149
3-MPD
OH
•  Vinho Branco
HO
O
CH3
•  Intervalo Concentração 0,1 - 1,4 mg/L;
Area
y = 25081x + 7418,4
R2
= 0,9992
mg/L
[3-MPD] = 0,30 mg/L
Curva Calibração
9/27/10
ALABE
64
Método análise 3-MPD e CycDs : LCMSMS
HO
•  Vinho Branco
HO
O
O
OH
OH
O
O
O
O
OH
OH
OH
O
O
O
O
•  Intervalo Concentração 0,1 – 2, mg/L
CycDs
OH
HO
HO
O
O
HO
HO
CycDs
Area
y = 72908x + 2296,5
R2 = 0,9981
[CysDs] = 1,43 mg/L
Conc. mg/L
9/27/10
ALABE
65
Métodos 3-MPD e CycDs : Comparação
Limite de Detecção
3-MPD
CycDs
PA : Preparação Amostra
DS – Detecção Sistema
130 min
GC-MS
LC-MS
DS
PA
PA DS
20 min
0,10 mg/L
0,05 mg/L
0,03 mg/L
0,05 mg/L
Antocianinas da uva
Antocianina da
baga de
sabugueiro
mAU
Malvidina-glucósido
Cianidinasambubiosido
150
100
50
0
0
9/27/10
5
10
15
20
25
Minutes
ALABE
67
Castas « non-Vitis vinifera »
•  Híbridos Tintos (Ribéreau-Gayon, 1954)
OCH3
OH
•  Malvidin-3,5-diglucoside
HO
O
+
OCH3
O-GLU
O-GLU
•  Híbridos brancos
•  antranilato de metilo (Power et Chesnut, 1921)
•  o-aminoacetofenona (Acree et al., 1990)
•  Furaneol (Rapp et al., 1980)
9/27/10
ALABE
68
Malvidina diglucosideo (OIV)
Método de referência (OIV):
•  Malvidin diglucosideo, oxida-se na presença de acido nítrico;
•  Emite uma cor verde viva (fluorescente) quando exposta a
uma luz ultravioleta;
•  A intensidade da cor fluorescente e medida pela comparação
com a fluorescência de uma solução titulada com sulfato de
quinino.
9/27/10
ALABE
70
Certificação Multivariada
Sensores Inferenciais
9/27/10
ALABE
Sensor Matemático
…
71
Aquisição do
Espectro
Qualidade da Uva
Filtrar Erros
de Sinal/Luz Externa
Correcção de
ângulo e posição
Espectro
Corrigido
9/27/10
ALABE
73
Processamento Multivariado: Vis-NIR
Aquisição do
Espectro
Qualidade da Uva
Erros no Sinal
Filtrar Erros
de Sinal/Luz Externa
Diferenças de
Intensidade
Correcção de
ângulo e posição
Espectro
Corrigido
Scattering
9/27/10
ALABE
Processamento Multivariado: Vis-NIR
Aquisição do
Espectro
Filtrar Erros
de Sinal/Luz Externa
Correcção de
ângulo e posição
Espectro
Corrigido
Qualidade da Uva
74
Aquisição do
Espectro
O Que é Sinal ? O que é Ruído ?
Filtrar Erros
de Sinal/Luz Externa
Correcção de
ângulo e posição
Espectro
Corrigido
Vamos comparar 1 a 1 ??
3648 variáveis diferentes... em
50 espectros
n!
C= [(n-p)! * p!]!
= 33 260 900
9/27/10
ALABE
76
Processamento Multivariado: Algoritmo
Aquisição do
Espectro
Matrix Original
X = U.S.V T
Filtrar Erros
de Sinal/Luz Externa
Correcção de
ângulo e posição
Espectro
Corrigido
Direcção
Relevante?
S
N
Matrix Decomposta (i)
Determinar o primeiro valorMatrix
próprio
da matrixRelevante
por
o-Ortogonal
decomposição
de valores singulares, …
Ruído
Análise Multivariada
9/27/10
Sinal
ALABE
Processamento Multivariado: Vis-NIR
Redução de dimensões e
categorização : HPLC
77
Redução de dimensões e
categorização : HPLC
9/27/10
ALABE
79
Processamento Multivariado: HPLC
Redução de dimensões e
categorização : HPLC
Relação com dados químicos…
9/27/10
ALABE
80
Processamento Multivariado: FUSÃO
Maturação d
Maturação A
Maturação B
Descriminação
Maturação d
das
Diferentes
Maturações!
9/27/10
ALABE
82
Processamento Multivariado : FID
Redução de dimensões e
categorização : FID
70 Anos
30-40
Anos
9/27/10
20 Anos
ALABE
Processamento Multivariado : FID
83
Carta de Controlo
Multivariado
Sensores Quantitativos
Amostras Fora
de Controlo
Sensores
Inferenciais
Limites de
Controlo (90 e 95%)
Sensores Categóricos
9/27/10
Amostras dentro
de Controlo
ALABE
85