8 RADICAIS LIVRES E USO DE ANTIOXIDANTES NO DOENTE GRAVE JOÃO AUGUSTO MÁTTAR INTRODUÇÃO A sólida compreensão de radicais livres e o uso racional de substâncias antioxidantes no doente grave implicam numa revisão dos princípios básicos de atomística e das reações de óxidorredução nos sistemas biológicos, particularidades estas que fogem ao escopo deste boletim, mas que podem ser vistas em trabalhos recentes(1-4). Os radicais livres e antioxidantes interessam há décadas profissionais e cientistas ligados às tecnologias de radiação, combustão, indústria de borracha e derivados, tintas e preservação de pinturas antigas, conservação de alimentos, etc. Em cada uma destas áreas o conceito de antioxidante varia com o ponto de vista próprio e a descoberta relativamente recente da importância de reações bioquímicas no organismo animal envolvendo radicais livres despertou o interesse médico e biológico, inaugurando-se um novo campo de grande expansão que engloba atualmente a medicina intensiva. NOMENCLATURA E ABREVIAÇÕES Existem várias definições de radicais livres, e dúvidas no uso do termo “livre” tido por muitos como supérfluo. Pela definição adotada por Halliwell e Gutteridge, os papas do assunto (vide referências 41,42,43 do trabalho 1 nesta bibliografia – referência dentro da referência! Uma nova forma de citação bibliográfica...) radical livre é qualquer espécie capaz de uma “existência independente” (daí o termo “livre”) que contém 1 (um) ou mais elétrons não pareados na camada de valência (a última camada de elétrons). Portanto deve-se distinguir entre radical livre como definido acima e radical simples ou íon (ânion), o que raramente é feito na prática originando-se uma grande confusão no entendimento e compreensão do tema! - ROS - reactive oxygen species (superóxido O02 ) e RNS – reactive nitrogen species, como por exemplo, óxido nitrico (NO), peroxinitritos, etc., sendo que o termo species é preconizado ao invés de molécula, pois os radicais livres não são moléculas completas ou verdadeiras são radicais (obviamente...), ou “fragmentos de moléculas”. Para sair pela tangente, muitos autores usam nomenclatura ROM - reactive oxygen metabolites, o termo metabolito englobando moléculas, radicais, compostos intermediários, etc. Redox - reação ou estado de óxidorredução. Lembrar que oxidação é a perda de elétrons e redução o seu ganho, sendo as reações sempre acopladas de óxidoredução. Agente oxidante retira elétrons e se reduz, enquanto o agente redutor cede elétrons e se oxida (1-4). 1 8 Oxidative stress – estresse oxidativo. Em condições normais a geração de ROS/ROM e outros radicais livres são inativados por sistemas enzimáticos endógenos e ingeridos (administrados), mantendo-se equilíbrio entre ambos processos. Quando ocorre desequilibro, com maior produção RL e menor inativação, estaria estabelecido o estresse oxidativo (1-4) ATOMÍSTICA E ESTRUTURA MOLECULAR DE UM RADICAL LIVRE E DE UM RADICAL SIMPLES Reações químicas iniciadas por várias substâncias podem cindir a ligação química entre 2 (dois) e-, cisão ou fissão esta que pode ser simétrica (homolítica) e assimétrica (heterolítica), como abaixo: Simétrica ou homolítica A:B Æ A• + •B (formação de radical livre); os 2 (dois) e- da ligação covalente cindida : cada um vai para um átomo diferente A e B Assimétrica ou heterolítica A:B Æ A+ + :B- (formação radical simples ou íons); somente 1 dos átomos recebe ambos e- da ligação covalente : quebrada Na prática as notações A• + • B que melhor simbolizariam radicais livres são em geral expressas simplesmente como símbolo negativo molecular ou atômico sem a pontuação • Mais confusão! Como já frisado, o termo “livre” deve ser intertrepado como independente, com vida e ação própria, devendo-se fazer distinção entre íon, carregado negativamente, como por exemplo, íon hidroxila (ânion), HO- normalmente formado em múltiplas reações bioquímicas fisiológicas sem ação deletéria e o radical livre hidroxila, HOz o maldito, o mais potente e destrutivo dentre os vários radicais livres formados no organismo. Nos exemplos de radiólise e ionização de uma molécula de água [H-O-H], estes conceitos pretensamente deverão ser entendidos, como a seguir: Átomo de oxigênio (O) número atômico z= 8 ou seja 8 prótons + 8 elétrons e- ; átomo de hidrogênio H z = 1, com 1 próton + 1 e- . Molécula de água H2O ou [H-O-H] , 10 prótons + 10 e- . Representação de Lewis H x * O x * H; x * representa o tracinho – (ligação covalente) na H – O – H, com dois elétrons (* x), um pertencente ao átomo de H e o outro ao átomo de oxigênio. Na formação do íon - hidroxila (ânion), HO-, bonzinho, representar-se-ia [OH] ou [H *x O * x] com 9 (nove) prótons + 10 (dez) elétrons e, portanto carga negativa (ânion) sendo o próton [H+] = 1 átomo de H sem o seu único elétron, o complemento da molécula de H2O. O radical livre (RL) hidroxila, bad guy, pittibull assassino, é representado como [H *x O *], [HO]z 9 (nove) prótons + 9 (nove) elétrons e- , portanto sem carga (daí o símbolo z ), mas com 1 elétron e- não pareado, portanto radical livre hidroxila. Lembrar que a molécula de hidrogênio (assim como a de oxigênio) é diatômica, H2 ou H-H, e o menor radical livre possível é o H atômico [H], constituído de um próton H+ e 1 elétron (representativamente x ou *), também sem carga. Deu pra entender? Não deu? Sorry 2 8 my friend!. I would advise you to be enrolled in the practical workshop of Biochemical and metabolism of HSPE UTI team. See Prof. Ederlon for details... COMO E PORQUE SE FORMAM OS RADICAIS LIVRES? Com exceção de certos organismos unicelulares anaeróbios ou aeróbios “parcialmente tolerantes” todos animais, plantas e bactérias necessitam de O2 para uma eficiente produção de energia. Outros organismos evoluíram com mecanismos de defesa antioxidantes para proteção contra a toxicidade pelo oxigênio e passaram a usá-los para transformação metabólica enzimática (oxidases, hidroxilases, oxigenases, etc.) por cadeia de transporte de elétrons na mitocondria, com o oxigênio representando o receptor final de elétrons, o que representa nos mamíferos cerca de 90% do ATP necessários para esta produção energética. As principais reações de óxidorredução que originam radicais livres estão demonstradas a seguir: O2 + (e) Æ O2- (radical superóxido) O2 + (e) + 2H+ Æ H2O2 (água oxigenada, peróxido de hidrogênio, não um radical livre mas pode liberar HOz) O2 + O2 + 2H+ SOD - superóxido dismutase Æ H2O2 + HOz (radical livre hidroxila) 2Fe++ + H2O2 Æ 2Fe+++ + HOz + HOz Fe++ + O2 Æ Fe+++ + O02ANTIOXIDANTES E SUBSTRATOS AFETADOS Os radicais livres têm sido implicados como causa importante de lesão tecidual em doentes graves sendo seus alvos as principais macromoléculas (proteínas, enzimas, ácidos graxos de membranas celulares, e DNA) e organelas celulares principalmente lisozomas, núcleo, membranas celular e subcelular, mitocôndria, o que na prática ocorre em choque, isquemia-reperfusão, trauma, sepse, etc., incitando trabalhos e ensaios clínicos com vários enfoques terapêuticos que incluem antioxidantes exógenos. É consenso que, com raras exceções, o uso isolado de antioxidantes não é suficiente para neutralizar a formação de radicais livres em vários locais do organismo, o que gerou a associação múltipla de antioxidantes, os assim chamados “coquetéis de antioxidantes”. A tabela I resume os principais antioxidantes exógenos usados atualmente e o respectivo substrato afetado: TABELA I - ANTIOXIDANTES EXÓGENOS Antioxidantes do tipo enzimático Substrato afetado 1. Superoxidodismutase (SOD), catalase, em liposomas encapsulados O2- 2. Inibidores da xantina oxidase (allopurinol, oxipurinol, folatos) Xantina oxidase H2O2 3 8 3. Inibidores da NADPH oxidase (adenosina, bloqueadores canal de cálcio, lidocaina, antiinflamatórios não esteróides) 4. Coenzima Q10 (ubiquinona/ubiquinol) NAPDH oxidase Cadeia respir. mitocondrial Antioxidante do tipo não enzimático A. Manitol, albumina, lazaróides, vit. E, C, β-caroteno, β-agonistas HOz, O2-, β-oxidação de lípides B. Flavonóides: fenois dos vinhos, quercetina, genisteina, miricestina, Isquemia, trombose, inflamação C. Quelantes metais pesados: ceruloplasmina, ferritina, desferoxamina Fe+++ D. Estimulantes da atividade antioxidante natural (N-acetilcisteina, probucol, selênio, glutationa, ácido úrico) Atividade endógena E. Agentes antineutrofílicos (anticorpos no plasma ou monoclonais) Neutrófilos F. Inibidores da ação de neutrófilos (pentoxifilina, cafeína) Fator de necrose tumoral TNF G. Extrato de Ginko Biloba Flavonóides + ação de SOD. Outros antioxidantes de uso recente N-2-mercapto-propionyl-glicina Efeitos da radioterapia Triterpinas (Trolox, um análogo da vit E) Beta oxidação lipídica Frutose di-fostato (FDP) Atenua isquemia reperfusão Anestésico gama-hidroxi-butirato Isq.- reperfusão em anestesia Flavonóides (purpurogallina) ↓ IAM experimental Solução de Ringer Etil-Piruvato (8) ↓ isquemia-reperfusão Trabalhos experimentais . USO EXPERIMENTAL E CLÍNICO DE SUBSTÂNCIAS ANTIOXIDANTES A intervenção terapêutica oportuna com substâncias antioxidantes teria efeitos protetores em muitas situações como em isquemia-reperfusão, síndromes inflamatórias, sepse, choque, trauma, SARA, etc. Em modelos experimentais, com estudos controlados e padronizados, tem-se provado a eficácia dos vários agentes citados em determinadas e definidas facetas funcionais e bioquímicas, mas em estudos humanos, apenas nos últimos anos o emprego judicioso de antioxidantes em situações agudas e crônicas, principalmente nos doentes graves com reações inflamatórias, sepse, trauma, queimaduras extensas, etc. têm produzido resultados satisfatórios. Na falta de estudos multicêntricos randomizados e controlados com número suficientes de doentes estudados para 4 8 definição do uso rotineiro de antioxidantes na área de medicina intensiva, a regra é usar o bom senso, e atender ao óbvio (por exemplo, se o doente nada recebe de vitaminas e antioxidantes ele não sara e muito pelo contrário com muita probabilidade pegara uma SARA). A tabela II resume os principais trabalhos experimentais e clínicos pertinentes ao uso de antioxidantes. TABELA II - PRINCIPAIS TRABALHOS EXPERIMENTAIS E CLINICOS DE ANTIOXIDANTES ANTIOXIDANTES Vitamina E Surgery 1985; 90:184 ESPÉCIE Rato CONDIÇÃO Sepse, choque, trauma RESULTADOS ↑ Sobrevida ↓ Lesão hepática Vitamina E + PBN Camundongo Hiperóxia ↑ Função cerebral Ann N Y Acad Sci 1998; 854 Coenzima Q10 Cão, coelho Sepse. ↑ Sobrevida Crit Care Med 1986; 14:570 Isquemia miocárdica ↑ Função miocárdica Inibidor xantine oxidase Gato Isquemia intestinal ↓ Lesão vascular Gastroenterology 1981; 81:23 NEJM 1985; 312:159 N-Acetilcisteina (NAC) Rato, cão, SARA, sepse ↑ Sobrevida; J Clin Inv 1984; 73:1772 Carneiro ↓ Lesão pulmonar Am J Physiol 1994; 266: H1746 Vitamina E (uso e ação aguda) Humana n = 12 Sepse, SARA, DAC ↓ Peroxidação Int Care Med 1989; 15:87 Crit Care Med 1990; 18:1 Vitamina E (uso e ação crônica) Humana n >500 Estudos arteriosclerose ↓ gravidade Am J Clin Nutr 1990; 52:557 Am J Clin Nutr 1991; 53 (Suppl) 326 S. NEJM 1993;328:1444 Vitamina C 21dias Humana n = 96 Ultramaratonistas ↑Imun.↓ resfriados Am J Clin Nutr 1993; 57:170 Coenzima Q10 – dias Humana n = 50 Cirurgia valvar cardíaca ↑ DC Ann Thorac Surg 1982; 33:145 Coenzima Q10- dias Humana n = 12 DAC, Isquemia, angina ↑ ergometria↓ angina Am J Cardiol 1985; 56:247 Coenzima Q10- dias Humana n=192 ICC ↑ função miocárdica J Clin Inv 1993; 71 (Suppl): S112 Coenzima Q10- dias Humana n = 43 ICC, isquemia ↑ DC bioimpedância Med Clin N Amer 1988; 72:243 Coenzima Q10- dias Humana n = 22 Pós cardioplegia ↑ histol. miocárdica Ann Thor Surg 1989; 47:939 NAC – dias Humana n = 24 SARA, sepse ↑ Sobrevida; ↑ IDO2 Am J Med 1991: 91(Suppl 3C): 54S Pancreatite aguda ↓ CIVD ↓ SIRS Lancet 1986; 1: 914 NAC - imediata Humana Intoxicação paracetamol ↑ Sobrevida Antídoto universal Acetaminofen (Tylenol) NAC - dias Humana n = 56 CA ginecológico ↑ hematologia Nutrition 1999;15:177 MISTURA (“Coqueteis”) VO (Vits.E,C,CoQ10, selênio)-3d Humana n = 10 Indivíduos normais Sem efeito(Xc, R) Bras Met Nutr (in press) 5 8 VO (Vit. E, C, selênio Humana n = 20 β-caroteno, metionina) 5 anos. Cross-over Adv Exp Med Biol 1990; 264:255 Fibrose pancreática ↑ Intervalo de crises Pancreatite crônica ↓ Intens. e duração das crises Crise pancreatite aguda EV + VO - 4 dias Humana n = 32 EV: Vit. C, selênio VO: Vit. E, NAC Crit Care Med (Abstract) 1989; 17:S153 SARA, sepse ↑ Sobrevida EV + VO - 3 a 7 dias Humana n = 92 (EV: Manitol, folato, lidocaina, Vit. C, selênio polimixina-B, Corticóides VO: Vit. A, E, glutamina, NAC) Crit Care Med (Abstract) 1998;26 A 142 Politrauma ↑ Sobrevida (?) ↑ pH mucosa gástrica por tonometria Estudo randomizado Centro Trauma nivel I ↓ tempo UTI e ventil, ↓ FMOS ↑ = aumenta, melhora; ↓ = diminui, piora; SARA = síndrome da angústia respiratória aguda; DAC = doença arterial coronariana; DC = débito cardíaco; IDO2 = índice de transporte de oxigênio; CIVD = coagulação intravascular disseminada; SIRS = síndrome da resposta inflamatória sistêmica (“systemic inflammatory response syndrome”); NAC = N-acetilcisteina; PBN = N-tertil-butil-alfa-phenilnitrone; Xc = reatância, Ohms; R = resistência Ohms. VO = via oral; EV = endovenosa. ICC = insuficiência cardíaca congestiva NADPH = dinucleotídeo adenina nicotinamida fosforada, forma reduzida; TNF = tumor necrosis factor (fator de necrose tumoral; IAM = infarto agudo do miocárdio; FMOS= Falência de múltiplos órgãos e sistemas. AVALIAÇÃO DO STRESS OXIDATIVO, AÇÃO DE ANTIOXIDANTES Em muitos casos a determinação direta ou indireta de antioxidantes no sangue não reflete o estado de antioxidação “in vivo”, particularmente de órgãos e tecidos onde o estresse oxidativo é maior, e a única técnica que detecta diretamente a presença de radicais livres é a espectroscopia por ressonância de elétrons seja paramagnética (eletron paramagnetic resonance – EPR) ou de “spins” (electron spin resonance – ESR), raramente usadas como rotina a beira de leito, e baseados em sua meia-vida efêmera e ação predominantemente local (macromoléculas e estruturas celulares), os radicais livres são estimados por métodos laboratoriais indiretos. A técnica de “trapping” consiste em reações em cadeia que aprisionam (“trap”) e detectam os radicais livres como parte de um complexo químico final, sendo o exemplo representativo o PBN α - fenil-tertbutil nitrona Os principais métodos de dosagens na prática médica utilizam a espectrofotometria ultravioleta que avalia as propriedades físico-químicas dos vários componentes plasmáticos oriundos de reações de óxidorredução e atividades de radicais livres. Existem atualmente kits e técnicas para medida de capacidade antioxidante total do plasma, pouco difundidos em nosso meio e o método mais antigo e o mais freqüentemente usado como medida indireta de peroxidação de ácidos graxos em nível de membranas e em alimentos de um modo geral é do ácido tiobarbitúrico (TBARS- do inglês “Thiobarbituric acid reactive species”) que quantifica o malondialdeido (MDA). Por um lado tem a vantagem de ser um método simples, o material usado se restringindo ao 6 8 aquecimento de ácido tiobarbitúrico (TBA) e medição com radiação de 532 nm e por outro lado é o método mais criticado pela complexidade bioquímica. Bioquimicamente ocorre a formação de malondialdeido (MDA) de fórmula O=C - C -C=O H H2 H que representa indiretamente atividade de peroxidação lípidica pela ação de radicais livres na cisão de ligações duplas dos ácidos graxos insaturados. O MDA reage no teste de TBARS para gerar uma coloração específica que absorve luz nas radiações de 532 nm e fluoresce a 553 nm, sendo extraído em solventes orgânicos como o butanol. Goode e cols demonstraram um aumento de TBARS plasmático e da excreção de nitritos urinários, concomitantes à queda do nível plasmático de vários sistemas antioxidantes como α-tocoferol, retinol, βcaroteno e licopeno em situações de sepse e reações inflamatórias generalizadas. Outros métodos de mensuração indireta de radicais livres incluem voltametria cíclica (“cyclic voltammetry”), dosagens de ácido cis-parinárico (ácido ocatadecatetraenóico), peróxidos, conjugação de diênicos, gases hidrocarbonados expirados, luminescência e fluorescência, espécies clorinadas, óxido nítrico, peroxinitritos, dosagens de vitaminas, oligoelementos plasmáticos, ácido úrico, bilirrubinas, proteína C reativa, etc. Recentemente a dosagem de isoprostano F-2 (8-epi-PPGF2-α e outros metabólitos de prostaglandinas) universalmente no sangue, plasma, urina, outras secreções orgânicas, em placas de ateromas e em tecido cerebral de doentes com Alzeihemer, tem sido proposta para avaliação de ação farmacológica de vários esquemas clínicos de antioxidantes.(7) CONCLUSÕES O antioxidante ideal seria aquele que interceptasse a formação de radicais livres no local de origem (ou perto dele) em ambiente intra e extracelular, com ação preferencial nas membranas biológicas tanto na sua superfície como no meio hidrófobo lipídico, o que na atualidade não existe. O avanço na terapia nutricional inclui atualmente a adição de substâncias antioxidantes com pretensa ação imunoestimulante (arginina, taurina, glutamina, mistura balanceada de omega-3 e omega-6, e outras), presentes em dietas enterais especiais, as assim chamadas dietas “imunomoduladoras”, com resultados clínicos VARIÁVEIS, em relação à morbidade, ao tempo de uso de ventiladores, permanência na UTI e hospital, e mortalidade (?) (5,6,7). Com os avanços nos conhecimentos bioquímicos e metabólicos dos nutrientes e da resposta inflamatória sistêmica, é de esperar nos próximos anos progressos significativos nesta fértil área de estudos (8) 7 8 LEITURAS BIBLIOGRÁFICAS SUGERIDAS Como já foi dito no início desta explanação, existem atualmente dezenas de milhares de publicações relativa ao tema antioxidante, radicais livres, doente grave, isoladamente ou em conjunto, quer em publicações científicas consagradas em Medicina, como nas várias apresentações pela Internet, o que torna difícil uma listagem “completa”. As referências abaixo correspondem apenas aos trabalhos do autor e outros trabalhos recentes. 1. Máttar JA: Radicais livres e antioxidantes no doente grave. In Ferro HC, Azevedo JRA, Loss SH (eds). Nutrição parenteral e enteral em UTI. Série: Clínicas Brasileiras de Medicina Intensiva ano 6. Volume 11, 2001. Atheneu pp 93-150. Contem 100 referências bibliográficas e Capítulo Apêndice sobre atomística. 2. Mattar JA: Radicais livres e antioxidantes. In Magnoni D e Cuckier C (eds) Perguntas e Respostas em Nutrição Clinica, 2001. Roca pp 357-360 3. Mattar J A: Reações de óxidorredução nos sistemas biológicos. SBNPE Boletim informativo ano VI, no. 27, maio/junho 2000 4. Mattar JA: Radicais livres e uso de antioxidantes no doente grave. SBNPE Boletim informativo ano VI, no. 28, julho/agosto 2000 5. Molecular Biology of Critical Illness. Guest Editors. Timothy G. Buchman, Arthur S. Slutsky New Horizons volume 3, number 2 May 1995. Todos os capítulos deste número da revista são de interesse ao medico intensivista, incluindo-se vários temas de radicais livres e antioxidantes. 6. Preiser JC, Gossum AV. Berre J, Vincent JL, Carpentier Y: Enteral feeding with a solution enriched with antioxidant vitamins A, C, and E enhances the resistance to oxidative stress. Crit Care Med 2000; 28:3828-3832. 7. Nathens AV, Neff MJ, Jurkovich GJ, et al: Randomized, prospective trial of antioxidant supplementation in critically ill surgical patients. Annals of Surgery 2002; vol 236, no.6, 814-822 8. Fink MP: Ethyl piruvate: A novel anti-inflammatory agent. Crit Care Med 2003;31(Suppl.):S51-S56 8