Territórios
Cromossômicos Interfásicos
Genética Humana Molecular
Profa. Dra. Ana Elizabete Silva
INTRODUÇÃO








Organização Hierárquica da Cromatina
Avanços tecnológicos para avaliação dos
cromossomos interfásicos
Organização do genoma no núcleo
interfásico: Territórios Cromossômicos
Organização não-casual dos cromossomos
interfásicos
Dinâmica dos cromossomos
Posicionamento preferencial dos genes nos
TC
Compartimentalização do núcleo interfásico
Rearranjos cromossômicos e proximidade
espacial
Após a era genômica...




Como o genoma está funcionalmente
organizado e confinado no núcleo?
Qual a organização dos cromossomos dentro
do núcleo? Há um local preferencial?
Como ocorre a dinâmica entre o genoma e
seus fatores regulatórios para expressão e
silenciamento gênico?
Há diferenças no posicionamento de genes
ativos x inativos no núcleo?
Arranjos dos cromossomos no núcleo interfásico em nãoterritório (superior) e em territórios cromossômicos (inferior)
Genoma Humano

Cerca de 25.000 genes → 3.2 bilhões de pb
(2m de comprimento linear na forma despida)
→ empacotado em estrutura de ordem
superior (~10 mil vezes) → volume nuclear
600-1500μm3
Como
os
genes
estão
arranjados
no
núcleo
interfásico (46 cromossomos),
para que sejam acessíveis aos
reguladores transcricionais
(expressão e silenciamento)?
Níveis de Organização da
Cromatina
6
níveis interdependentes de organização da
cromatina: o DNA despido ao cromossomo
1º- DNA de dupla hélice enrolado ao redor do core de
octâmero de histonas (colar de contas)  fibra
nucleossômica de 10 nm → empacotamento 7x
2º- enrolamento do nucleossomo para formar a fibra de
30 nm (solenóide)  organização mais prevalente no
núcleo interfásico → empacotamento 40x
- Fibra de 30nm forma dobras em domínios de alças
(variando de 20-200Kb) → base para a regulação da
replicação/transcrição
- As alças são unidas à base de um eixo central
(esqueleto do cromossomo) → arranjamento radial das
alças
6º- Cromossomos metafásicos: maior nível de
compactação da cromatina → empacotamento 10.000x
Organização Hieráquica da Cromatina
http://mendel.creighton.edu/BIO517/Lecture%20Series%20B/517LectSeriesB2.ppt#36
0,14,nucleosomes and centromere structure
Organização hierárquica da cromatina
H2A
H2B
H3
H4
Era da Citogenética Molecular...
Desenvolvimento de
sondas fluorescentes
 Microscopia
fluorescente (análise 2D)


Microscopia confocal a laser (análise
3D)
Permitiu visualizar aspectos da expressão gênica e
dinâmica em alta resolução em células vivas
Núcleo virtual:
A- visualização da cromatina individual
B- Imagem de uma secção confocal
Organização do genoma no núcleo
interfásico
A cromatina descondensada no núcleo
interfásico ocupa espaço definido sem
sobreposições, separado por domínios
intercromossômicos
TERRITÓRIOS CROMOSSÔMICOS
Territórios Cromossômicos
ESPAÇO SUB-NUCLEAR LIMITADO, EM QUE CROMOSSOMOS
INDIVÍDUAIS NO NÚCLEO INTERFÁSICO SÃO OCUPADOS
NÃO-CASUALMENTE
•Proposto por Rabl e Boveri e confirmado por Cremer (1980)
Modelo proposto por Cremer et al. (1982):
organização de cromossomos individuais em
territórios compactos claramente delineados →
permite a exposição de sequências expressíveis
na superfície territorial. Estes territórios não se
sobrepõem, seriam separados por cargas
negativas das cromatinas, em pH fisiológico.
Organização não-casual dos
cromossomos interfásicos


HISTÓRICO
Carls Rabl (1885): plantas
cromossomos
ocupam domínios discretos durante intérfase,
reflete sua orientação mitótica
 orientação
polarizada da anáfase: permanece
até a prófase seguinte
 Configuração
de Rabl: telômeros presos no
envelope nuclear de um lado do núcleo e
centrômeros no lado oposto (plantas, dípteros,
mas não em mamíferos)
Orientação polarizada de Rabl no núcleo interfásico:
A- raiz de planta: centrômero (verde); telômeros (vermelho)
B- esquema interpretativo: cromossomos na orientação de Rabl com todos
centrômeros de um lado do núcleo e todos os telômeros em direção ao lado
oposto.
Obs.: levedura: cromossomos parecem misturar-se livremente
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/books/bv.fcgi?rid=mboc4.figgrp.684
Organização não-casual dos
cromossomos interfásicos


HISTÓRICO
década de 40:
 Alças
de ancoragem: heterocromatina
constitutiva, facultativa e telômeros
unem, na maioria dos casos ao
envoltório nuclear.
Cromatina Sexual - corpúsculo de Barr
Os cromossômos ocupam domínios definidos
na interfáse e movem-se muito pouco  portanto, a
placa metafásica reflete a organização interfásica
(orientação polarizada de Rabl durante a intérfase e
prófase)
Movimentos da cromatina no
núcleo interfásico
Actina/miosina
TFF1: cr. 21
GREB1: cr. 2
Cell. Author manuscript; available in PMC 2010 July 7.
Conclusões

Em geral, os cromossomos, distribuem-se ao acaso
(exceção dos Dípteros).

Desvios da distribuição metafásica ao acaso
podem ser em consequência:
- adesividade da heterocromatina;
- associação de satélite; e
- tendência dos cromossomos pequenos localizarse no meio da placa metafásica.

Em muitos núcleos diferenciados, os centrômeros
aderem-se no envoltório nuclear, nos nucléolos ou
em ambos
Distribuição Cromossômica Não-Aleatória


Cromossomos homólogos estão pareados durante toda a
intérfase?
Depende da espécie e do tipo celular

Linfócitos e fibroblastos humanos: para os cromossomos
grandes é infrequente, enquanto para os cromossomos
pequenos denso em genes é mais frequente a associação
homóloga de TCs.

Mamíferos: os TC homólogos são usualmente não-adjacentes


Apenas em Dípteros  os homólogos permanecem pareados
mesmo em metáfases tratadas com colcemide e solução
hipotônica
Cada cromossomo une-se em um ponto pré-determinado do
envoltório nuclear (poros ou lamina nuclear)  originando
uma ordem cronológica mais ou menos constante na
metáfase.
Posicionamento Radial dos
cromossomos em células de
mamíferos:
a) Configuração de Rabl: centrômeros
(vermelho) e telômeros (amarelos) →
alinhados em lados opostos do núcleo
b) posicionamento radial dos
cromossomos: localização
preferencial dos cromossomos na
periferia ou interior do núcleo
(conforme tamanho ou densidade
gênica)
c) posicionamento relativo dos TC em
posições preferenciais em relação ao
outros:
-cr grandes → periferia do núcleo
-cr pequenos → interior do núcleo
Território Cromossômico de galinha:
-9 pares de macrocromossomos (pobres em genes-replicação tardia):
localizados preferencialmente na periferia do núcleo
- 30 pares de microcromossomos (ricos em genes-replicação precoce):
interior do núcleo
d- cromossomos homólogos em localizações não-adjacentes
TC humanos: (a-c)
cr.grandes:1-5,X)
(vermelho-periferia);
cr.pequenos:(17-20)
Linfócitos
fibroblastos
(verde-interior)
TC galinhas: (d-h)
Microcromossomos:
replicação precoce
(interior do núcleo) 
Macrocromossomos:
replicação tardia
(periferia do núcleo)
Macrocromossomos
homólogos nãoadjacentes (periferia)
Territórios cromossômicos humanos ricos e pobres em genes
TCs com conteúdo de DNA similar mas com densidade gênica muito
diferentes: ocupam posição nuclear distinta no exterior ou interior do núcleo
→ conteúdo de genes é um determinante chave do posicionamento dos TCs.
Exemplo: cromossomos 18 e 19 humanos (conteúdo de DNA similar: 85 e 67
Mb)
-cr 18 (vermelho) pobre em genes-replicação tardia: periferia
-cr 19 (verde) rico em genes -replicação precoce: interior
LOCALIZAÇÃO DOS
TELÔMEROS
-compartilham pequenos territórios
 dinamicamente associados 
posicionados preferencialmente na
interface dos domínios de
cromatina
-movimento constrito dentro do TC
Cytometry Part A 75A: 428439, 2009
Movimento e Associação de Telômeros
Cytometry Part A 75A: 428439, 200
Proposta: cada cromossomo é marcado por um “zipcode” (determinantes) que determina sua posição não
casual no núcleo
Objetivos:
a-investigar se núcleo de camundongo reconhece “determinantes” de
posição nuclear de cromossomos humanos
b-se o posicionamento cromossômico e atividade transcricional
permanecem acopladas nessas condições trans-espécies
Núcleos de linhagem celular A9fibroblastos híbridos camundongohumano
vermelho: cr. 7 (pobre em genes) periferia nuclear
Amarelo: cr. 18 (pobre em genes) –
periferia nuclear
Verde: cr. 19 (rico em genes) – centro
nuclear
-o posicionamento dos cromossomos
humanos pobres e ricos em genes é
conservado em núcleos de camundongo.
-estudo de perfil gênico dos 3 crs.
humanos demonstrou que são
transcricionalmente ativos nas células de
camundongo
Verde: 19p
Vermelho: 19q
del(19q) : análise de
expressão gênica
evidenciou apenas
expressão de genes de
19p
Conclusões: cromossomos humanos introduzidos artificialmente em células são
transcricionalmente ativos no genoma de camundongo. Portanto a densidade
gênica/atividade transcricional de um cromossomo serve como “determinante”
para a posição do TC nos núcleos de mamíferos.
CONCLUSÕES
O posicionamento radial dos
cromossomos depende:




Tamanho do cromossomo: conteúdo de DNA
(pb)
Densidade gênica/atividade transcricional
Tempo de replicação (precoce x tardia)
Etapas do ciclo celular e tipos celulares
diferentes
O CENTRO NUCLEAR É MAIS PROPÍCIO
PARA A TRANSCRIÇÃO
Contudo, há exceções...
Há estudos mostrando genes ativos na periferia nuclear:
-Saccharomyces cerevisae: genes associados com
complexo do poro nuclear
-expressão do gene -globina iniciada na periferia 
movimento p/interior do núcleo durante maturação
eritróide
Dinâmica dos Cromossomos



Células fixadas: TCs ocupam região nuclear
discreta, mas TCs são dinâmicos em núcleos
interfásicos: posição pode ser dependente do
ciclo celular
Células G1: centrômero do cr 8: localizado
adjacente a periferia nuclear e braços
cromossômicos estendidos em direção ao
interior do núcleo
Células G2: reorientação do cromossomo:
centrômero posicionado interiormente e
braços estendidos em direção a periferia
nuclear
Dinâmica dos Cromossomos

Células vivas: análise do ciclo celular: movimento
de sítios marcados em direção ao interior nuclear
relacionado com replicação do DNA
região
nuclear mais interna, mais favorável para locos
potencialmente ativos

Células vivas: TCs mostram apenas pequenos
movimentos;
células neuronais: observado grandes movimentos
da cromatina durante a diferenciação, assim como
em Drosophila durante a interfase

Leveduras: núcleos em G1: movimentos grandes
rápidos dependentes de ATP, nos pontos de origem
de replicação
ação de enzimas
dependentes de ATP, envolvidas na transcrição e
remodelamento da cromatina
3-5
cell divisions
3-5
divisões
celulares
Early
S replicating
chromatin
domains
Domínio
de cromatina
de replicação
precoce
Mid
(Late)
replicating
chromatin–média-tardia
domains
Domínio
deScromatina
de replicação
Medida comparativa do movimento dos domínios da cromatina
dentro dos TC individuais em células vivas:
Após algumas gerações com marcação é possivel distinguir TC
individuais
TCs não são estáticos  cromatina e componentes não
cromatínicos no núcleo interfásico podem mudar em
associação com alterações na função celular 
potencialmente dirigidas por proteínas nucleares motoras
como acto-miosina
Manutenção da Posição dos Cromossomos Interfásicos
TC células vivas: movimento de translação limitado (G1 tardio, S e G2):
a-Restrição do volume nuclear; Retenção física:
b-interação da cromatina c/componentes da lâmina ou do envelope nuclear
c-ligação c/estruturas nucleares internas: lâmina interna (esqueleto nuclear); associação
c/nucléolo e compartimentos de fatores splicing do pré-mRNA.
INM(membrana nuclear interna)-compartimento da lamina nuclear:
a- em células de mamíferos: atua no estabelecimento e manutenção da cromatina
transcricionalmente inativa,
b- leveduras: a periferia nuclear atua tanto no silenciamento (repressão dos telômeros)
como ativação gênica (associação com complexos do poro nuclear-NPC)
Objetivos: estudar as consequências da atividade gênica após
compartimentalização direcionada p/INM-lamina, usando um segmento
cromossômico contendo sítio de ligação à proteínas da lamina nuclear e
um gene reporter.
-Gene pode ser reposicionado p/ INM-lamina e sofrer repressão como
consequência dessa compartimentalização? Ou
-Gene pode sofrer repressão no interior do núcleo e então ser
reposicionado p/INM-lamina para estabilizar a estrutura da
heterocromatina?
Sistema para compartimentalização direcionada de região genômica:
-Resultados demonstraram que recrutamento de genes alvos p/INM-lamina
resulta em repressão transcricional
Modelo proposto: INM-lamina reprime a atividade gênica até que um
transativador potente seja capaz de sobrepor a repressão imposta pela
interação com este compartimento.
-Vários genes associados a INM-lamina são transcricionalmente inativos
-estado não amarrado: lacO posicionado centralmente no
núcleo
-estado amarrado: lacO posicionado na borda do núcleo
Conclusão: compartimentalização nuclear parece ter uma função
importante na regulação gênica  INM-lamina reprime a atividade gênica
 Ex.: vários genes do desenvolvimento associados a INM-lamina quando
transcricionalmente inativos
Posicionamento preferencial
dos genes nos TC
Há alguma relação entre posição do gene no
TC com atividade gênica?



Alguns estudos têm sugerido:
Genes inativos: localizados no interior das
regiões do TC
Genes ativos: concentram na periferia do TC
→ adjacente ao espaço nucleoplásmico →
Domínio do Compartimento
Intercromossômico (ICD)
Modelo ICD: pré-mRNA nascente
localiza-se na superfície dos
domínios cromossômicos
Os TCs são separados por canais intercromatínicos
(retículo contínuo de espaço livre de DNA e
possivelmente ocupado por matriz nuclear e outros
fatores não-cromatínicos funcionalmente ativos) 
tais canais seriam contínuos com os poros nucleares e
representariam sítios de processamento póstranscricional direcional, culminando na passagem
núcleo-citoplasma.
ICD
IC
CT
Modelo de Domínio Intercromossomo (ICD) x Modelo de Compartimento
Intercromatina (IC)
Modelo ICD: genes ativos (verde) → localizados na superfície dos TC → acessíveis aos fatores
de transcrição/splicing do ICD → transcritos facilmente transportados para os poros nucleares.
Genes inativos ou locos intergênicos (vermelho) → encontrados no interior dos TC →
inacessíveis aos fatores do ICD.
Modelo IC: espaço de não-cromatina e fatores
→ localizam dentro dos TC
Genes ativos: superfície dos territórios ou superfície da cromatina condensada;
Genes inativos: dentro da cromatina condensada
Genes ativos: encontrados
no interior e periferia do
TC
Regiões
transcricionalmente
ativas: encontradas em
alças extendidas para fora
do TC
Regiões não codificadoras
e genes inativos
(vermelho): podem ser
encontradas na periferia ou
interior do TC
a) Cr 12 (vermelho); 14 (amarelo); 15 (verde): linfócitos
de camundongo
b-c) Intérfase: TC em fibroblastos de camundongo
d) Genes ativos x inativos
Exemplos:
EDC: 1q21 (>40genes)→ localizado externamente no TC 1 ou em grandes alças:
durante diferenciação de queratinócitos
MHC: 6p21.3 → localizado externamente no TC 6 ou em grandes alças:
principalmente em células B-linfoblastóides e fibroblastos após tratamento com
interferon
Associação com densidade gênica e expressão gênica.
Modelo funcional da
arquiterura nuclear:
a)TC: alça cromatínica genes
ativos; b)TC: domínios
separados para os braços
curto e longo e centrômero
(*). Genes (branco)
ativamente transcritos →
localizados na alça
cromatínica. Recrutamento
deles (preto) para a
heterocromatina
centromérica →
silenciamento;
c)TC densidade cromatínica variável (laranja: alta densidade; amarelo: baixa densidade);
d)TC: domínio de replicação precoce (verde) domínio de replicação média e tardia
(vermelho). Cromatina pobre em genes→periferia nuclear próxima a lâmina nuclear
(amarela), nas dobras da lâmina e redor do nucléolo.Cromatina rica em genes →
localizada entre os compartimentos pobre em genes.e)estrutura da cromatina de ordem
superior: genes ativos (branco)→superfície da fibra cromatínica, genes silenciados
(preto) interior; f) modelo IC: o IC (verde) contém complexos (pontos laranjas) e grandes
domínios não cromatínicos (agregações dos pontos laranjas) para transcrição, splicing,
replicação e reparo; g) TC com domínio cromatínico de ~1=Mb (vermelho) e IC (verde)
Diferentes modelos da arquitetura nuclear:
A- Modelo CT-IC (Chromosome Territory-Interchromatin Compartment)
B- Arquitetura nuclear conforme modelo CT-IC (PF:fibrila pericromatina):
genes parcialmente descondensados  RNA nascente (verde) e RNA pol
(branco)
C- pontos em azul (contatos intra e intercromossomal)
D- colocalização dos genes para expressão (pontos rosas: fatores de
transcrição  podem
recrutar
genes;
circulo
azul:
corregulação
trans;
Cite
this article
as Cold
Spring
Harb
Perspect Biolin2010;2:a003
Objetivos: análise da posição dos genes CCND1 (TC 11) e
HER-2/neu (TC 17) nos respectivos TCs em câncer de
esôfago e gástrico e relação com amplificação gênica e
expressão das proteínas
CCND1 ou HER-2/neu
(vermelho)
Frequências dos TCs
com genes localizados na
periferia/externo:
Tumores esôfago: 61% e
65% dos TCs
Mucosa normal: 56% e
33% dos TCs
Tumores gástricos: 84% e
67% dos TCs
Mucosa normal: 50% e
59% dos TCs
Não foi observada
associação entre a
localização dos genes nos
TCs com amplificação e
expressão das proteínas
Genes ANT2 e
ANT3: exterior
de ambos TC Xa
ANT2(Xq24):
submetido à inativação
do X → ativo no Xa e
inativo no Xi
ANT3(PAR): escapa
da inativação no Xi
(periferia de ambos
Xa e Xi)
Territórios cromossômicos em humanos:
a-b) braços cromossômicos ocupam CT distintos
c-d) bandas com genes ativos ocupam a periferia dos territórios dos
cromossomos Xa e Xi
e) ANT2 inativo no Xi encontra-se no interior do TC
ANT2 ativo no Xa na periferia do TC
Dinâmica da Relação EstruturaFunção no Núcleo Interfásico
Núcleo
Interfásico
NUCLÉOLO
CROMATINA
COMPONENTES
NÃO-CROMATÍNICOS
COMPARTIMENTALIZADO EM REGIÕES SUB-NUCLEARES
DISTINTAS  COM FATORES MACROMOLECULARES
ENVOLVIDOS EM PROCESSOS NUCLEARES ESPECÍFICOS 
COMPARTIMENTALIZAÇÃO DINÂMICA
NÚCLEO E COMPARTIMENTOS NUCLEARES
Repressão Gênica:
-Membrana nuclear
interna
-Lamina nuclear
-Cromatina perinucleolar
Expressão Gênica:
-Complexo do poro
nuclear
-Corpúsculo PML
-Speckles
Outros:
-Corpúsculo de Cajal
-Nucléolo
Curr Opin Genet Dev. Author manuscript; available in PMC 2010 April 1.
Compartimento Intercromatínico - IC
Espaço entre os territórios cromossômicos: com
rede de ribonucleoproteínas e alças cromatínicas
- corpúsculos PML (funcionais na leucemia mielóide
promielocítica): sítio nuclear dos quais o genoma
viral iniciam o centro de replicação viral →processos
celulares: defesa viral, supressão tumoral, reparo
DNA e regulação transcricional
-speckles:regiões formato irregular formada por
grânulos intercromatina, ricas em fatores de splicing
pré-mRNA
- corpúsculos de Cajal:organelas nucleares de função
desconhecida → biogênese de snRNP

Os TCs têm estrutura complexa dobrada em
contato com os canais IC → penetram no interior
do TC e permitem a transcrição de genes no
interior do TC
DOMÍNIOS NUCLEARES E EXPRESSÃO GÊNICA
...expressão gênica não é influenciada apenas pelo seu compartimento nuclear, mas
também por processos dinâmicos: sinalização celular, interação cromossômica,
microambiente...
Curr Opin Genet Dev. Author manuscript; available in PMC 2010 April 1.
M.O. Scheuermann et al. / Experimental Cell
Research 301 (2004) 266–279
Regiões ricas em GC (vermelho); pobres em GC (azul)
Rearranjos Cromossômicos e
Proximidade Espacial

A proximidade espacial de locos gênicos no núcleo
contribui para uma maior ocorrência de
translocações balanceadas?

Por que são mais frequentes alguns tipos de
translocações em alguns tipos celulares, como no
câncer?
Exemplos: linfomas de células B, leucêmias



Linfoma de Burkitt: t(8;14)(q24;q21), c-MYC
justaposto próximo à cadeia pesada da IGH;
IGL(22q11) ou IGK(2p11)
Leucêmia meilóide crônica: t(9;22), ABL-BCR
Efeito da proximidade dos cromossomos nas
frequências de translocações:
-determinada, em parte:
- organização espacial, em que alguns locos gênicos
estão preferencialmente espacialmente próximos em
tipos celulares específicos
A-Proximidade espacial de translocação preferencial: linhagem
dic(3) e t(8;17) resultando em t(dic3;8;17)
B-posição relativa do dic(3) e t(8;17): associados
significantemente (67% das células); cr. 3 e 8 (72%) e cr. 3 e
19 (40%), apesar da linhagem apresentar 4 cópias do cr. 19.
interior
mediana
periferia
Posicionamento radial não-casual dos locos em células B normais:
MYC, BCL e IGH: preferencialmente posicionados em proximidade espacial
-IGL e CCND1 (interior nuclear)
- IGH (mediana)
- BCL6, MYC e IGK (periferia nuclear)
Proximidade espacial de locos propensos a translocação:
-MYC:IGH → frequentemente próximos em núcleos de
linfoma de Burkitt
-MYC:TGFBR2 → controle negativo (distantes)
Sumário

Configuração de Rabl não é encontrada em núcleos de células
humanas

A cromatina não está organizada casualmente dentro do
núcleo
ocupa TERRITÓRIOS distintos

Os territórios dos cromossomos homólogos são usualmente
não adjacentes

Posição radial dos cromossomos conforme densidade gênica:
ricos em genes →interior do núcleo; pobres em genes →
direção à periferia

Localização estabelecida precocemente no ciclo celular e
mantida durante a intérfase
Sumário

Movimento restrito dos TC durante a interfáse

Genes: movimentos mais dinâmicos na replicação ou
transcrição

Reposicionamento de genes inativos p/centrômeros →
silenciamento

Posicionamento de genes ativos no TC não restrita à periferia,
devido os domínios intercromatina (IC)

IC: abrigam fatores splicing (speckles), maquinaria de
transcrição e corpúsculos nucleares (PML e Cajal)

Posicionamento relativo não-casual de TC específicos no
núcleo: relação com certas translocações mais frequentes