UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
TIAGO JOÃO DA SILVA FILHO
EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE GLUT-1 E MARCADORES DE
PROLIFERAÇÃO E APOPTOSE EM ANOMALIAS VASCULARES ORAIS
Natal / RN
2014
1
TIAGO JOÃO DA SILVA FILHO
EXPRESSÃO IMUNOISTOQUÍMICA DE GLUT-1 E MARCADORES DE
PROLIFERAÇÃO E APOPTOSE EM ANOMALIAS VASCULARES ORAIS
Dissertação
apresentada
ao
Programa de Pós Graduação em
Patologia Oral da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte
como parte dos requisitos para
obtenção do Título de Mestre em
Patologia Oral.
Orientadora: Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz
Natal / RN
2014
2
Catalogação na Fonte. UFRN/ Departamento de Odontologia
Biblioteca Setorial de Odontologia “Profº Alberto Moreira Campos”.
Silva Filho, Thiago João da.
Expressão imunoistoquímica de GLUT-1 e marcadores de proliferação e
apoptose em anomalias vasculares orais / Tiago João da Silva Filho. – Natal, RN,
2014.
119 f. : il.
Orientadora: Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz.
Dissertação (Mestrado em Patologia Oral) – Universidade Federal do Rio
Grande do Norte. Centro de Ciências da Saúde. Departamento de Odontologia.
Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral.
1. Hemangioma – Dissertação. 2. Diagnóstico diferencial – Dissertação. 3.
Proteínas facilitadoras de transporte de glucose – Dissertação. 4. Proliferação de
células – Dissertação. 5. Granuloma piogênico – Dissertação. I. Queiroz, Lélia
Maria Guedes. II. Título.
RN/UF/BSO
RN/UF/BSO
Black D65
Black D74
3
4
“Eu vejo a vida melhor no futuro
Eu vejo isso por cima de um muro de hipocrisia
Que insiste em nos rodear
Eu vejo a vida mais clara e farta
Repleta de toda satisfação
Que se tem direito
Do firmamento ao chão
Eu quero crer no amor numa boa
Que isto valha pra qualquer pessoa
Que realizar a força que tem uma paixão
Eu vejo um novo começo de era
De gente fina, elegante e sincera
Com habilidade
Pra dizer mais sim do que não
Hoje o tempo voa, amor
Escorre pelas mãos
Mesmo sem se sentir
Não há tempo que volte, amor
Vamos viver tudo o que há pra viver
Vamos nos permitir.”
(Tempos modernos – LULU SANTOS)
5
DEDICATÓRIA
6
Dedico este trabalho a meus pais, João da Silva e Josilene Pereira da Silva, às
minhas irmãs, Mara Priscila, Maiara Kézia e Mayane Jéssica e às minhas
sobrinhas, Maria Eduarda e Maria Clara.
“…I have loved you for a thousand years
I'll love you for a thousand more…”
(A Thousand Years -CHRISTINA PERRI)
7
AGRADECIMENTOS
8
AGRADECIMENTO ESPECIAL
À minha companheira de pesquisa, Denise Hélen Imaculada Pereira de Oliveira.
Muito se fala a respeito da importância de se ter um braço direito no desempenho de
algumas tarefas. Na minha “irmã patológica” tive o privilégio de encontrar um braço
direito, esquerdo, cabeça pensante e coração gigante. Sou eternamente grato por
todos os ensinamentos e companheirismo. Sua participação em cada etapa foi de
suma importância na transformação do que era um projeto em, agora, algo concreto.
Com ela aprendi valores que levarei comigo para sempre. É uma pessoa que
definitivamente luta por seus objetivos com garra e graça.
Tenho certeza do seu sucesso e espero estar presente em sua vida para juntos
comemoramos cada uma das suas grandes conquistas.
“Que o Senhor galardoe o seu feito!
Que seja ricamente recompensada pelo Senhor, sob cujas asas você veio buscar refúgio!"
(Rute 2:12)
9
AGRADECIMENTOS
A Deus, que considero o maior responsável por este feito.
“E sabemos que todas as coisas contribuem juntamente para o bem daqueles que amam a Deus...”
(Romanos 8:28)
Aos meus pais, Seu Joca (o deuso) e Dona Lena(a deusa), que sempre me
ensinaram a importância do conhecimento e me apoiaram nas minhas escolhas. São
meus grandes mestres nos ensinamentos da vida. Por toda a compreensão, pela
forma que guiaram seus conselhos sobre o eu achava que era melhor para mim,
fazendo com que a decisão fosse minha, mas sempre dando um toque de sabedoria
de vida. Aos meus grandes referenciais,minha eterna gratidão.
“...Nunca se esqueçam nem um segundo
Que eu tenho o amor maior do mundo
Como é grande o meu amor por vocês...”
(Como égrande o meu amor por você - ROBERTO CARLOS)
Às minhas irmãs Mara, Maiara e Mayane pelo apoio e companheirismo durante toda
a vida, por tornarem minha família tão linda.
“…Hey sister, know the water's sweet
But blood is thicker
Oh, if the sky comes falling down, for you
There's nothing in this world I wouldn't do…”
(Hey Brother – AVICII)
Às minhas sobrinhas, Duda e Clarinha, que desde os seus nascimentos me
fizeram viver o verdadeiro sentido da palavra amor. Difícil é entender como duas
crianças conseguem me ensinar tanto. Um dos seus principais ensinamentos é o
sentido da palavra “literalmente”. Eu literalmente as amo, pelo bom uso do termo.
“…Those three words,
They are said too much,
And they're not enough...”
(Chasing Cars - SNOW PATROL)
10
À minha irmã dada pela vida, Dacy, uma pessoa queconsegue melhorar qualquer
ambiente com sua espontaneidade e humor. Os laços de amizade se prenderam tão
forte que já simulam laços de sangue. Uma amiga que sei que posso contar. Por ti
tenho uma amizade que nem o tempo pode abalar.
“Em todo o tempo ama o amigo e para a hora da adversidade, nasce o irmão.”
(Provérbios 17:17)
Àsminhas amigasda graduação Alice Helena e Veruska Lima:
Alice, a quem foi dada a missão de me trazer para Natal. Jamais me esquecerei da
sua insistência em me fazer vir parar nesta cidade. Uma insistência a que eu cedi,
pelo seu intenso poder de persuasão. A isso tenho imensa gratidão. Ademais, tê-la
como amiga é uma dádiva!
Veruska, o meu grande espelho. É aquele tipo de pessoa que eu penso “é assim
que quero ser quando crescer”. A fortaleza em pessoa, um gênio que Deus tratou de
colocar no meu caminho. Mesmo distante cuida de mim, me conhece como
ninguém, sabe dos meus pensamentos antes mesmo que me venham à cabeça.
Não existe unidade de medida que dimensione o tamanho do meu carinho.
If you need me, call me
No matter where you are
No matter how far (don't worry, baby)
Just call my name
I'll be there in a hurry
You don't have to worry
'Cause, baby, there
Ain't no mountain high enough
Ain't no valley low enough
Ain't no river wide enough
To keep me from getting to you, baby
(Ain't No Mountain High Enough - MARVIN GAYE)
O “tripé” jamais poderá ser desfeito. Nem o tempo, nem a distância, nem qualquer
outra adversidade será capaz de desfazer o que nos uniu. Continuaremos para
sempre na filosofia do “um ri, todos riem”, “um chora, todos choram”, porque vossa
tristeza é a minha e a minha felicidade compartilho com vocês.
11
Àminha orientadora e “mãe patológica”Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz,
que se mostrou uma excelente orientadoranesses dois anos de convívio. A missão
de dividir a relação orientador/orientando nos foi dada por sorteio quando eu mesmo
não poderia ter feito escolha melhor. Uma orientadora sempre presente quando
solicitada, que me deu a liberdade de expor e defender minhas opiniões gerando
discussões saudáveis e produtivas. A mim foi dada a oportunidade de ter uma
grande tutora, a quem sou muito grato.
À Profa Dra Éricka Janine Dantas da Silveira, uma sumidade quando se fala em
Patologia Oral. Uma pessoa que emana conhecimento por onde passa. De todos os
mestres que já passaram pela minha vida, alcança um lugar de destaque.
Ao Prof. Dr. Cassiano Francisco Weege Nonakapor sua grande contribuição na
análise estatística do presente estudo.
Aos demais professores do Programa de Pós Graduação em Patologia Oral da
UFRN que contribuíram de forma direta e/ou indireta na minha formação como
mestre.
Ao Programa de Pós Graduação em Patologia Oral da UFRN por ter me aceito como
aluno e ter me dado a oportunidade de absorver uma infinidade de conhecimentos,
transcendendo os limites da Patologia Oral.
Aos membros da banca examinadora. Agradeço pelas colaborações dadas para o
enriquecimento da pesquisa.
Ao corpo de funcionários da Patologia Oral, agradeço pelo auxílio e disponibilidade.
Cada um tem um nível de importância em fazer a Patologia Oral funcionar.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) pelo
auxílio financeiro que subsidiou minha estadia em Natal e permitiu a realização
desta pesquisa.
12
Aos meus colegas de classe Thâmara Manoela, Thaís Aline, Andréia do Carmo,
Marcelo Nascimento, Viviane Alves, Luciana de Castro, Maria Luiza e Luiz
Juliasse.
Thamis, um gênio que nos ensina tanto enquanto nos deixa cuidar dela. E como é
bom cuidar de uma pessoa assim tão especial. Uma das pessoas mais solícitas que
conheci e por quem criei um carinho instantâneo, aliás, não há esse que não o crie.
“…And when you smile
The whole world stops and stares for a while
'Cause girl you're amazing
Just the way you are…”
(Just The Way You Are - BRUNO MARS)
Thaizinha, bela pela própria natureza e de opiniões fortes. Uma amizade criada de
forma sólida, com muitos risos, conversas e companheirismo servindo como
alicerce.
Andréia, a pessoa boa em tudo o que faz (tenho dito isso diversas vezes). Tão
jovem e com tanta coisa para ensinar. Uma professora inata que serve de exemplo
para nós outros. Seu carisma, forma de pensamento, inteligência e dedicação são
admiráveis.
Ela é forte, ela é filha do Norte!
Marcelo, o que me acolheu na minha estadia em Natal. Sou muito grato pelo
acolhimento e pela divisão de espaço, de estudos e, por que não, de vida? Com
tantas coisas diferentes entre nós, conseguimos ser ótimos “roomates”. Nossos
papos de cozinha e nossa comum visão de vida (quase sempre) jamais serão
esquecidos. O apartamento que dividimos por dois anos guarda estórias
memoráveis e sempre que passar por ele haverá um momento de nostalgia. Muito
obrigado por tudo.
Vivi,uma das pessoas que mais conquistou minha admiração. Linda, de fala doce e
opiniões seguras. Consegue fazer mil coisas, sendo cada uma delas feitas com
perfeição. Feliz é quem tem alguém como ela por perto.
13
Lu, um exemplo de dedicação. Estudiosa, sempre com seu caderno cheio de
considerações. Uma pessoa por quem criei um carinho imenso e fez esses dois
anos de convivência serem mais leves. Dela gostei de graça e vai custar muito para
que seja tirado de mim esse sentimento.
Malu, uma pessoa singular, muito diferente de mim em tantas maneiras. O seu jeito
de ser me deu grandes lições de como ser e de como não ser como pessoa. Com
ela aprendi coisas que ela não sabia que estava me ensinando. Sou muito grato por
sua solicitude, palavras de afago e por me contrariar quando não achava que eu
estava certo. Ela é o tipo de pessoa que apresenta fortaleza em suas fragilidades e
minha admiração por sua dedicação é enorme.
Luiz,um homem inteligente pela própria natureza. Sempre solícito e que sabe
escolher bem as palavras certas a serem aplicadas a qualquer momento. Uma
pessoa que admiro como profissional Cirurgião-Dentista. Sou grato pelo
compartilhamento de conhecimentos odontológicos e pelos momentos de
descontração.
Com vocês, meus amigos, não dividi apenas uma sala de aula, dividi dois anos da
minha vida e vocês foram responsáveis por tornar tudo isso melhor.
“Now I've had the time of my life
No, I've never felt like this before
Yes I swear it's the truth
And I owe it all to you…”
(The Time Of My Life - DIRTY DANCING)
Aos doutorandos do programa, agradeço por tornarem o ambiente de trabalho mais
amigável e descontraído e por todos os conhecimentos repassados.
“Cedo ou tarde
A gente vai se encontrar,
Tenho certeza, numa bem melhor...”
(Cedo Ou Tarde - DIEGO FERRERO e LEANDRO ROCHA)
14
Às “gatas do mestrado” ou à “família de Natal”, como a gente se considera.
Belle, uma das pessoas mais espontâneas que conheci. A gata guiada pelo
coração, que se joga em busca do que acha certo (até quando não é). Tivemos
tantos momentos de diversão, viagens e conversas únicas que foram de suma
importância para a minha estadia em Natal. Nossa necessidade comum de “fuga”
fez com que tivéssemos os melhores momentos de “escapismo”. Agradeço por sua
amizade e confidencialidade.
(They are not you – PEYTON, OTH)
Ivana, a gata com quem dividi moradia por um ano. Ela consegue executar tarefas
de forma rápida e com perfeição, sua dedicação é admirável. Ao mesmo tempo
consegue festejar com intensidade. O convívio me ensinou que a gente deve dar
duro pelo que quer e sempre nos recompensar com aquilo que nos faz feliz.
“..Hey, said a hustler's work is never through
We're making it cos we make it move
The only thing we know how to do
Said it's the only thing we know how to do
Work hard, play hard, work hard, play harder!”
(Play Hard - DAVID GUETTA)
Clara, a gata que ilumina o ambiente. O seu senso de humor único e a divisão de
dramas e experiências fez com que nos tornássemos grandes amigos. Ela é uma
pessoa especial que emana brilho pelos olhos, pela sua alma e pelo seu sorriso
branco A1. Aprendemos juntos que devemos apenas deixar brilhar e isso registrou
nossa união eterna. É a gata que se fez forte, mas que faz com que a gente tenha
prazer em cuidar. E eu digo calma alma minha, Clarinha, você tem muito que
aprender!
Let it be,
Let it go,
Let it shine!
15
Karyna, a gata que é gata!Sua dedicação ao trabalho, aos esportes e a uma vida
saudável é invejável. É linda e se garante no que faz. Um exemplo de mulher que
tem a cara de menina. Foi uma pessoa com quem eu pude contar sempre que
precisei, me ajudou tantas vezes e de tantas maneiras diferentes. Com ela aprendi
que devemos dar duro pelo que desejamos e sempre procurar o nosso lugar ao sol.
“She is only happy on the sun”
Larissa, agata que não é mestranda (ainda), mas que não poderia estar alocada
melhor do que aqui. A que chegou por último para constituir a “família de Natal”, mas
que não se fez menos importante. O carinho foi imediato diante dessa beleza que
encanta. A vida nos guarda tantas coisas e pessoas, e nós, por muitas vezes, nos
sentimos agraciados quando percebemos que acabamos de receber um presente da
vida.
“Um tesouro eu encontrei, eu encontrei...”
Às minhas queridas “gatas o mestrado” meu muito obrigado por tornarem a minha
estadia em Natal um dos melhores espaços de tempo da minha vida. No futuro,
quando nos reunirmos, nenhum assunto será mais relevante do que esse tempo que
passamos juntos, que com certeza teremos boas risadas ao relembrar.
Ao meu amigo Roger, uma das pessoas mais sábias que já conheci. Dele recebi os
melhores conselhos sobre quaisquer aspectos da vida. Um amigo de coração
gigante que me acolheu e que me faz sentir estar sendo cuidado. Sua honestidade,
seus pontos de vista diretos, sua objetividade em passar a mensagem que quer são
coisas que têm minha admiração. É um amor de amigo, é um amigo por quem tenho
amor.
“Você, meu amigo, é no mínimo, o máximo!”
16
Aos meus eternos amigos do colégio Vanessa Lacerda, Priscila Sampaio e Hilton
Jameson.
VNS, a minha amiga para todas as horas. Não importa a distância ou a hora, sei que
posso contar com ela. Uma das pessoas mais inteligentes que conheci. Ao mesmo
tempo frágil e resiliente, me admira o seu jeito de ser. Uma amiga que eu amo
simplesmente por amar.
Pri e Hiltin, meus compadres. Estive com vocês desde o começo de tudo e a data
13/06/2006 será sempre lembrada com carinho por mim. O casal que tenho o maior
carinho e que não consigo desvincular, vocês para mim já são como um só e os amo
de forma igual.
I miss that town
I miss the faces
You can't erase
You can't replace it
I miss it now
I can't believe it
So hard to stay
Too hard to leave it
If I could relive those days
I know the one thing that would never change
(Photograph – NICKELBACK)
Vocês, meus amigos, até hoje me acompanham me dando força. Sou muito feliz por
cada vitória alcançada por vocês. Como nesta conquista, em todas as futuras, quero
que vocês estejam sempre presentes comigo.
Aos meus queridíssimos amigos de João Pessoa “Portito”, “Marcellindo”,
“Jozito”, “Thaizão” e “Pats”. Quão bom é ter para onde voltar. Com eles me sinto
em casa. Os amo sem desejar nada em troca. Quando estou com eles não há
espaço para tristeza. Nenhum deles consegue imaginar o tamanho do meu amor,
mesmo que eu já tenha externado tantas vezes.
“I love you more than those ones before.”
Com vocês compartilho esta conquista e toda minha gratidão.
17
“... Nada pode o olvido
contra o sem sentido
apelo do Não.
As coisas tangíveis
tornam-se insensíveis
à palma da mão
Mas as coisas findas,
muito mais que lindas,
essas ficarão.”
(CARLOS DRUMMOND DE ANDRADE)
18
RESUMO
19
RESUMO
As anomalias vasculares constituem um grupo de lesões distintas, mas que podem
apresentar características clínicas e histopatológicas semelhantes, que podem levar
a equívocos diagnósticos.Este estudo objetivou por meio da histopatologia e da
expressão imuno-histoquímica daproteína humana transportadora de glicose (GLUT1), identificar e classificar corretamente as anomalias vasculares orais, além de
analisar a imunoexpressão de marcadores de proliferação e apoptose (Ki-67 e Bcl2).Todos os casos diagnosticados como “hemangiomas orais” pertencentes aos
arquivos do Serviço de Anatomia Patológica da disciplina de Patologia Oral do
Departamento de Odontologia (DOD) da Universidade Federal do Rio Grande do
Norte (UFRN) foram revisados, totalizando 77 casos. A análise imuno-histoquímica
para GLUT-1 revelou que apenas 26 (33,8%) dos espécimes tratavam-se de
hemangiomas da infância (HIs) verdadeiros. Os 51 (66,2%%)espécimes GLUT-1
negativos foram então reclassificados em granulomas piogênicos (GPs) e
malformações vasculares (MVs) a partir de suas características histopatológicas,
totalizando 26 (33,8%) casos de HIs, 20 (26,0%) de GPs e 31 (40,2) casos de MVs
orais. Os casos submetidos à análise do marcador Ki-67 apresentaram medianas
diferentes HI (13,85), GP (33,70) e MV (4,55) com diferenças estatisticamente
significantes entre elas (p<0,001). Em relação à proteína Bcl-2, os grupos também
apresentaram diferentes medianas dos escores estabelecidos HI (1,00), GP (1,50),
MVs (0,0), demonstrando diferenças estatisticamente significantes entre elas
(p<0,001). Não foi observada correlação estatisticamente significante entre os
índices de positividade para o Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2 em
nenhum grupo.Dessa maneira, podemos concluir que se faz necessário uma revisão
criteriosa e parametrizada dos casos de anomalias vasculares utilizando ferramentas
auxiliares, como a GLUT-1, uma vez que os achados histopatológicos sozinhos, às
vezes, não são suficientes para diferenciar algumas anomalias. Além disso, a
análise das expressões de marcadores envolvidos nos níveis de proliferação das
lesões é um aspecto importante para o melhor entendimento do seu comportamento
biológico.
Palavras-chave: Hemangioma. Diagnóstico Diferencial. Proteínas Facilitadoras de
Transporte de Glicose. Proliferação de células.Granuloma Piogênico.
20
ABSTRACT
21
ABSTRACT
Vascular anomalies constitute a distinct group of lesions, but they may present
similar clinical and histopatological characteristics, which can lead to diagnostic
mistakes. This study aimed by histopathology and immunohistochemical expression
of human glucose transporter protein (GLUT-1), correctly identify and classify oral
vascular anomalies, besides analyzing the immunoexpression of markers
proliferation and apoptosis (Ki-67 and Bcl-2). All cases diagnosed as "oral
hemangiomas" belonging to the archives of the Service of Pathological Anatomy from
the subject of Oral Pathology of the Department of Dentistry (DOD), of the Federal
University of Rio Grande do Norte (UFRN) were reviewed, totalizing 77 cases.
Immunohistochemical analysis for GLUT-1 showed that only 26 (33.8%) of the
specimens were true infantile hemangiomas (IHs). The 51 (66.2%%) GLUT-1
negative specimens were then reclassified as pyogenic granulomas (PGs) and
vascular malformations (VMs) from their histopathologic characteristics,totalizing 26
(33.8%) cases of IHs, 20 (26.0%) of PGs and 31 (40.2) cases of oral VMs. The cases
analyzed by the marker Ki-67 showed different median IH (13,85), PG (33,70) and
VM (4.55) with statistically significant differences between them (p <0.001). In
relation to the protein Bcl-2, the groups also showed different median of the
established scores IH (1.00), PG (1.50), VMs (0.0) demonstrating statistically
significant differences between them (p<0,001). No statistically significant correlation
between the indexes of positivity for Ki-67 and the scores of immunoexpression of
Bcl-2 were observed in any group. Thus, we can conclude that it is necessary a
careful and parameterized review of cases of vascular anomalies making use of
auxiliary tools such as GLUT-1, since the histopathological findings alone,
sometimes, are not sufficient to differentiate some anomalies. Furthermore, analysis
of the expressions of markers involved in the levels of proliferation of lesions is
important for a better understanding of its biological behavior aspect.
Key words: Hemangoma. Diagnosis, Differential.Glucose Transporte Proteins,
Facilitative. Cell Proliferation. Pyogenic, Granuloma.
22
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
23
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Página
Figura 1-
Estrutura molecular bidimensional da GLUT..................................................
Figura 2-
Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da GLUT-1 em GP (A),
49
HI (B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33,
Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121)......................................
Figura 3-
79
Fotomicrografia demonstrando as características histopatológicas (H/E) do
GP (A), HI (B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 2933, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121)................................
Figura 4-
80
Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão deKi-67 em GP (A), HI
(B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33,
Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121)......................................
Figura 5-
81
Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão deBcl-2 em GP (A), HI
(B) e MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33,
Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H-1121)......................................
Quadro1-
82
Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de
incubação do anticorpo primário anti-GLUT-1................................................
64
Quadro 2-
Critérios histopatológicos para o diagnóstico das lesões vasculares.............
68
Quadro 3-
Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de
incubação dos anticorpos primários anti-Ki-67 e anti-Bcl-2............................
Gráfico 1-
Box-plot relativo aos índices de positividade para o Ki-67 de acordo com os
grupos. Natal – RN, 2014...............................................................................
Gráfico 2-
69
76
Box-plot relativo aos escores de imunopositividade para o Bcl-2 de acordo
com os grupos. Natal – RN, 2014...................................................................
77
24
LISTA DE TABELAS
25
LISTA DE TABELAS
Página
Tabela 1-
Distribuição absoluta e relativa dos casos de “hemangiomas orais” de
acordo com a imunoexpressão de GLUT-1. Natal – RN, 2014.........................
Tabela 2-
74
Distribuição absoluta e relativa dos casos de “hemangiomas orais” de
acordo com os diagnósticos obtidos após as análises da imunoexpressão de
GLUT-1 e dos achados morfológicos. Natal – RN, 2014..................................
Tabela 3-
74
Distribuição absoluta e relativa dos casos de acordo com o diagnóstico
histopatológico inicial e os diagnósticos obtidos após as análises da
imunoexpressão de GLUT-1 e dos achados morfológicos. Natal – RN, 2014..
Tabela 4-
75
Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma
dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para os índices de
positividade para o Ki-67 em relação ao grupos. Natal – RN, 2014.................
Tabela 5-
76
Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma
dos postos, estatística KW e significância estatística (p) para os escores de
imunopositividade para o Bcl-2 em relação aos grupos. Natal – RN, 2014......
Tabela 6-
77
Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação de
Spearman (r) e significância estatística (p) para os índices de positividade
para o Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2, de acordo com os
grupos. Natal, RN – 2014..................................................................................
78
26
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
27
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
µm
Micras de metro;
A1
Proteína anexina 1
ATP
Do inglês adenosine triphosphate, traduzido como adesosina
trifosfato;
Bad
Refere-se à proteína antiapoptótica Bad;
Bak
Refere-se à proteína pró apoptótica Bak;
Bax
Do inglês Bcl-2-associated X protein, refere-se à proteína Bax;
Bcl-2
Do inglês B-cell/lymphoma 2, refere-se à proteína Bcl-2;
Bcl-w
Do inglês B-cell lymphoma-w, refere-se à proteína Bcl-w;
Bcl-x
Do inglês B-cell lymphoma-extra, refere-se à proteína Bcl-x;
Bcl-Xl
Do inglês B-cell lymphoma-extra large, refere-se à proteína BclxL;
Bcl-xS
Do inglês B-cell lymphoma-extra small, refere-se à proteína BclxS;
BH1
Refere-se a um domínio homólogo da proteína Bcl-2;
BH2
Refere-se a um domínio homólogo da proteína Bcl-2;
BH3
Refere-se a um domínio homólogo da proteína Bcl-2;
Bim
Refere-se à proteína antiapoptótica Bim;
BSA
Do inglês bovin serun albumin,traduzido como albumina de soro
bovino;
CD31
Também conhecida como PECAM-1, do ingês platelet
endothelial cell adhesion molecule-1;
CD34
Do inglês Cluster of Differentiation 34, traduzido como
grupamento de diferenciação 31;
CEP
Comitê de Ética em Pesquisa;
CNS
Conselho Nacional de Saúde;
COOH
DNA
Refere-se à extremidade carbóxi-terminal;
Do inglês deoxyribonucleic acid, traduzido como ácido
desoxirribonucleico;
DOD
Fcγ receptor ΙΙ
Departamento de Odontologia;
Receptor para imunoglobulina G-2;
28
G
GLUT
Gramas;
Do ingês glucose transporter, traduzido como transportador de
glicose;
GLUT-1
Do ingês glucose transporter protein type 1, traduzido como
proteína humana transportadora de glicose tipo 1;
GP
Granuloma piogênico;
HCNI
Hemangioma congênito não involutivo;
HCRI
Hemangioma congênito rapidamente involutivo;
HI
HMIT
Hemangioma da infância ou hemangioma infantil;
Do inglês H+/myo-inositol co-transporter, traduzido como
transportador H+/ligado ao mio-inositol;
ISSVA
Do inglês International Society for the Study of Vascular
Anomalies, traduzido como Sociedade Internacional para o
Estudo de Anomalias Vasculares;
kDa
Ki-67
KW
Quilodaltons;
Refere-se ao antígeno celular Ki-67 ou anticorpo anti-Ki-67;
Teste estatístico não-paramétrico de Kruskal-Wallis;
Lewis Y
Refere-se ao antígeno celular Lewis Y ou anticorpo anti-Lewis-Y;
LYVE-1
Do ingles cell surface receptor on lymphatic endothelial cells,
traduzido como receptor endotelial de vaso linfático;
mAb
Anticorpo monoclonal;
Mcl-1
Do inglês pilha mielóide leukemia-1, refere-se à proteína Mcl-1;
MIB-1
Anticorpo monoclonal para identificação do antígeno Ki-67 ou
anticorpo anti-Ki-67;
Mm
Milímetros;
MV
Malformações vasculares;
N
NADPH
Quantidade;
Do inglês nicotinamide adenine dinucleotide phosphate, traduzido
como nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato;
Nd:Yag
Do inglês neodymium-doped yttrium aluminum garnet laser,
traduzido como Laser Nd:Yag;
NH2
Refere-se à extremidade amino terminal;
p53
Do inglês protein 53, refere-se à proteína p53;
29
Prox-1
proteína homeobox linfático-específica;
R
Valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman;
SGLT
Do inglês sodium-dependent glucose transport, traduzido como
transportador de glicose ligado ao íon sódio;
SNC
TA
Sistema nervoso central;
Temperatura ambiente;
TM10
Refere-se ao domínio transmembrana 10;
UFRN
Universidade Federal do rio Grande do Norte;
USA
Do inglês United States of América, traduzido como Estados
Unidos da América;
VEGFR-3
Do ingês vascular endothelial growth factor-C receptor, traduzido
como Receptor do Fator de Crescimento Endotelial Vascular tipo
3.
30
SUMÁRIO
31
SUMÁRIO
1
INTRODUÇÃO .......................................................................................... 34
2
REVISÃO DA LITERATURA .................................................................... 37
2.1
ANOMALIAS VASCULARES .................................................................. 37
2.2
TUMORES VASCULARES ..................................................................... 40
2.2.1 Hemangioma da infância ...................................................................... 40
2.2.2 Granuloma piogênico ........................................................................... 45
2.5
3
Ki-67 e Bcl-2 ........................................................................................... 55
OBJETIVOS .............................................................................................. 62
3.1
OBJETIVOS GERAIS: ............................................................................ 62
3.2
OBJETIVOS ESPECÍFICOS: .................................................................. 62
4
METODOLOGIA........................................................................................ 64
4.1
CONSIDERAÇÕES ÉTICAS................................................................... 64
4.2
CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO: ........................................................ 64
4.3
POPULAÇÃO.......................................................................................... 64
4.4
AMOSTRA .............................................................................................. 65
4.4.1 Caracterização da amostra .................................................................. 65
4.4.2 Critérios de inclusão............................................................................. 65
4.4.3 Critérios de exclusão ............................................................................ 65
4.5
COLETA DE DADOS .............................................................................. 65
4.6
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO (GLUT-1) ............................................ 65
4.7
ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUÍMICO (GLUT-1) ........................ 68
4.8
ESTUDO MORFOLÓGICO ..................................................................... 68
4.9
ANÁLISE DO PERFIL MORFOLÓGICO ................................................. 69
4.10
ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO (Ki-67 e Bcl-2) ................................. 71
4.11
ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUÍMICO(Ki-67 e Bcl-2) .............. 72
4.11.1 Ki-67 .................................................................................................... 72
4.11.2 Bcl-2 .................................................................................................... 73
4.12
5
ANÁLISE ESTATÍSTICA ..................................................................... 74
RESULTADOS .......................................................................................... 76
5.1
ANÁLISE MORFOLÓGICA E DA IMUNOEXPRESSÃO DA GLUT-1 ..... 76
5.2
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DO KI-67 ........................................ 77
5.3
ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DA Bcl-2 ......................................... 78
32
5.4
CORRELAÇÃO DAS IMUNOEXPRESSÕES DE Ki-67 E Bcl-2 ............. 79
6
DISCUSSÃO ............................................................................................. 86
7
CONCLUSÕES ......................................................................................... 97
REFERÊNCIAS ................................................................................................ 99
APÊNDICE1 ................................................................................................... 109
ANEXO1 ......................................................................................................... 118
33
INTRODUÇÃO
34
1 INTRODUÇÃO
Anomalias vasculares são lesões de natureza congênita ou adquirida cujos
componentes que predominam são estruturas vasculares. São incluídos neste grupo
os tumores vasculares benignos, como o hemangioma da infância ou hemangioma
infantil (HI) e granuloma piogênico (GP), os tumores vasculares malignos e todas as
malformações congênitas do sistema vascular (MULLIKEN; GLOWACKI, 1982;
ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997;METRY; HEBERT, 2000; ENJORAS; WASSEF;
CHAPOT, 2013).
O HI é a anomalia vascular mais comum da infância e apresenta formação de
vasos sanguíneos de arquitetura incompleta que se apresentam circundados por
células endoteliais hiperplásicas, estando presente ao nascimento ou não, e
exibindo um padrão característico de proliferação seguido de eventual involução
espontânea (MULLIKEN; GLOWACKI, 1982; TUCCI et al., 2009; DROLET;
ESTERLY; FRIEDEN, 1999; MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000; TUCCI et al.,
2009). Em contraste, malformações vasculares (MVs) não contêm célulasendoteliais
hiperplásicas, mas consistem na ampliação progressiva e formação de vasos
aberrantes e ectásicos, compostos de uma arquitetura vascular particular, como
veias, vasos linfáticos, vênulas, capilares, artérias ou uma mistura de padrões
vasculares (KOHOUT et al., 1998).
O GP é um tumor comum, de natureza não neoplásica, que surge geralmente
como resultado de um trauma constante e de baixo grau, má higiene oral e, em
alguns casos, por desequilíbrios hormonais (SHAIKH et al., 2012). Histologicamente,
GPs
são
massas
exofíticas
normalmente
cobertas
por
uma
membrana
fibrinopurulenta. As lesões mostram um tecido conjuntivo com arranjo lobular
distinto, com vasos centrais de maior calibre e agregados de capilares bem
formados vistos na periferia. É observado um tecido de granulação com leucócitos
polimorfonucleares especialmente em áreas adjacentes à superfície necrótica ou
ulcerada (PARIKH; SHAH; SHAH, 2011; VAIYAPURI et al., 2012).
Uma investigação precisa e uso de terminologia adequada se faz importante
para as decisões do cirurgião-dentista ao acompanhar o desenvolvimento de uma
anomalia vascular. Em muitos casos, uma anamnese detalhada e exame clínico
podem guiar o diagnóstico, porém outros métodos devem ser considerados em
casos de dúvida a partir dos dados clínicos existentes e quando a diferença no
35
diagnóstico pode influenciar no tratamento proposto. A proteína humana
transportadora de glicose (GLUT-1), identificada por North et al. (2000), tem se
mostrado útil como ferramenta auxiliar para a avaliação do prognóstico de alguns
tumores e diagnóstico diferencial entre anomalias vasculares, uma vez que se trata
de um marcador sensível e específico para a identificação de HIs de quaisquer
órgãos.
O comportamento biológico de entidade patológica é altamente dependente
da sua atividade proliferativa (REZVANI et al., 2010; RANJBARI; RAHIM, 2013).
Existem alguns marcadores para a avaliação da atividade de proliferação celular,
dentre eles o Ki-67, que se apresenta expresso nas fases G1, S e G2 do ciclo celular
e durante a mitose, mas não em repouso, indicando este ser um bom marcador para
células em proliferação (FOLTYN et al., 2012; RANJBARI; RAHIM, 2013).
A taxa de crescimento de tumores depende não só da atividade proliferativa
das células tumorais, mas também da taxa de morte celular (NAKAMURA, 2000). A
apoptose é uma via de morte celular onde a célula destinada a morrer ativa enzimas
que degradam seu próprio DNA e as proteínas nucleares e citoplasmáticas (KERR;
WYLLIE; CURRIE, 1972).
Os mais importantes reguladores da apoptose, através da via mitocondrial,
são os participantes da família das proteínas Bcl-2 (COLLITI, 2012). Essa família
inclui proteínas pró- apoptóticas, como Bax, Bcl-x, e Bcl-w e antiapoptóticas, como
Bcl-2, Bad e Bim. A redução das taxas de apoptose pode favorecer o crescimento
tumoral e permitir a permanência de células neoplásicas, estimulado a progressão
tumoral (WU et al., 1999).
Diante da necessidade de obtenção de mais conhecimento acerca do
comportamento biológico dessas anomalias, este estudo busca identificar e
reclassificar os diferentes tipos de anomalias vasculares através de recursos
histopatológicos e da imunoexpressão da GLUT-1, além de comparar a expressão
de marcadores de proliferação celular e apoptose. Com os resultados obtidos,
pretende-se contribuir na compreensão das particularidades de cada lesão.
36
REVISÃO DA LITERATURA
37
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 ANOMALIAS VASCULARES
Por um longo período de tempo, as lesões de origem vascular que apareciam
ao nascimento foram denominadas nevus maternus, refletindo a crença popular da
participação da mãe nas lesões de seus filhos. Acreditava-se que emoções e
desejos da mãe durante a gestação poderiam imprimir uma marca nos recémnascidos e, dependendo da cultura de cada população, as mães eram culpadas por
ingerir ou não determinadas frutas vermelhas ou outros tipos de alimento durante a
gravidez, advindo daí os termos que adjetivavam as lesões como morango,
framboesa, vinho do Porto e salmão (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000;
FEVURLY; FISHMAN, 2012).
Conceitua-se anomalia vascular a lesão de etiologia congênita ou adquirida
cujos componentes em predomínio são estruturas vasculares. São incluídas neste
grupo todas as malformações congênitas do sistema vascular, tais como as
malformações arteriais, venosas, linfáticas, capilares e suas combinações, os
tumores vasculares benignos, como os HIs, hemangioendoteliomas, angiomas em
tufos, glomangiomas, GPs e também os tumores vasculares malignos, como os
hemangioendoteliossarcomas e os angiossarcomas (JACKSON et al., 1993;
DROLET; ESTERLY; FRIEDEN, 1999; METRY; HEBERT, 2000).
Durante muito tempo não houve consenso em relação à terminologia e
classificação destas lesões, gerando impacto negativo nas indicações terapêuticas,
muitas vezes aplicadas de forma heterogênea e não parametrizada, elevando a
possibilidade de condutas iatrogênicas (HIRAKI; GOLDENBERG, 2010). As
primeiras classificações adotadas para a categorização das anomalias vasculares
apresentavam
características
puramente
descritivas.
Sucessivamente,
foram
substituídas pelas classificações baseadas em achados anatomopatológicos,
embriológicos e pelas baseadas no comportamento biológico das lesões
(ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997; ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2013).
Virchow (1863) classificou pela primeira vez as anomalias vasculares, levando
em consideração seu quadro microscópico, em angioma simples, cavernoso e
racemoso. De acordo com sua classificação, acreditava-se que cada um desses
38
tipos poderia transformar-se em outro por proliferação celular ou dilatação dos
vasos.
O termo “hemangioma” foi empregado durante anos, de forma ampla e
indiscriminada, para designar anomalias vasculares totalmente distintas quanto à
sua gênese, características clínicas e histopatológicas, evolução e prognóstico
(GONTIJO; SILVA; PEREIRA, 2003). Assim sendo, os termos “hemangioma capilar”
ou “hemangioma em morango” eram utilizados para designar o que atualmente se
conhece como a forma superficial do HI, um tumor propriamente dito, onde se
observa a multiplicação das células endoteliais, presente ou não ao nascimento,
com fases consecutivas de crescimento, paralisação e regressão, geralmente
desprovidas de maior significado clínico e de consequências, na maioria das vezes,
apenas cosméticas (GONTIJO; SILVA; PEREIRA, 2003; DROLET; ESTERLY;
FRIEDEN, 1999; MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000).
Ao mesmo tempo, “hemangioma plano” era a denominação do que hoje é
classificado como mancha em vinho do Porto, uma MV, na quase totalidade dos
casos presente ao nascimento, com crescimento proporcional ao desenvolvimento
da criança, de caráter permanente, podendo associar-se a síndromes diversas,
como a Síndrome de Bean e a Síndrome de Mafucci. Além disso, adjetivos como
cavernoso, um termo descritivo histológico e que deve ser preservado com esse fim,
referiam-se a características clínicas como a cor azulada sugestiva de lesões
profundas (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000; HIRAKI et al., 2010).
Dessa forma, lesões de naturezas diferentes, como a forma profunda do HI
(que regride espontaneamente) e as MV subcutâneas (permanentes), que
apresentam
em
comum
apenas
a
coloração
azulada,
eram
igualmente
caracterizadas como cavernosas. A nomenclatura confusa e a ausência de uma
classificação adequada foram os principais responsáveis pelas dificuldades
diagnósticas e terapêuticas das anomalias vasculares (GONTIJO; SILVA; PEREIRA,
2003).
Em 1982, Mulliken e Glowacki propuseram uma nova classificação das lesões
vasculares baseada nas manifestações clínicas, quadro histopatológico e história
natural, distinguindo-as em “hemangiomas” e “malformações vasculares”.
A falta de classificação diagnóstica aceita internacionalmente não permitia,
até recentemente, a padronização terapêutica adequada, dificultando a criação de
39
condutas protocoladas, além de comprometer a comparação entre diferentes opções
de tratamento (HIRAKI e GOLDENBERG, 2010).
Em função disso, em 1996, a classificação de Mulliken e Glowacki foi revista,
e criada uma nova classificação, adotada como oficial pela Sociedade Internacional
para o Estudo de Anomalias Vasculares – ISSVA, que divide as lesões vasculares
em dois grupos: “tumores” e “malformações” vasculares (ENJOLRAS; MULLIKEN,
1997).
Os tumores vasculares são caracterizados pela proliferação de células
endoteliais e incluem HI, hemangioma congênito rapidamente involutivo (HCRI),
hemangioma
congênito
não
involutivo
(HCNI),
angioma
em
tufos,
GPe
hemangioendotelioma kaposiforme. As MVs consistem em erros da morfogênese
vascular e são classificadas de acordo com o tipo de vaso predominante
(ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997; HAND; FRIEDEN, 2002; BRUCKNER, FRIEDEN,
2003; HASSENEIN, et al., 2011).
Na atualidade, a classificação baseada no aspecto biológico é adotada
internacionalmente. Baseia-se na correlação entre comportamento biológico celular
e evolução clínica, com impacto direto no tipo de tratamento a ser definido (HIRAKI e
GOLDENBERG, 2010). No entanto, o uso de nomenclaturas antigas persiste
causando diagnósticos e, consequentemente, tratamentos incorretos (HASSENEIN,
et al., 2011; LOWE et al., 2012).
Hassenein et al. (2011) verificaram no banco de dados PubMed todas as
publicações que continham o termo “hemangioma” no título/resumo durante o ano
de 2009, excluindo os estudos com temática veterinária. Levando em consideração
a classificação proposta pelo ISSVA, os autores constataram que o termo
“hemangioma” foi utilizado de maneira incorreta em 71,3% das publicações. Os
pacientes cujas lesões eram erroneamente classificadas eram mais propensos a
receber tratamento incorreto (20,6%), enquanto os que tiveram suas lesões
classificadas de acordo com o proposto pelo ISSVA apresentaram 0,0% de conduta
incorreta durante o tratamento. Além disso, os indivíduos eram mais jovens nos
estudos que utilizavam tal classificação (4,1 meses) do que nos estudos que não
utilizavam (36,1 anos).
Assim como todas as classificações, essa não é absoluta. Porém, sua
simplicidade e relevância clínica possibilitaram um avanço importante na abordagem
das anomalias vasculares (GONTIJO; SILVA; PEREIRA, 2003).
40
2.2 TUMORES VASCULARES
2.2.1 Hemangioma da infância
“Hemangioma da infância” ou “hemangioma infantil” é o tumor vascular mais
comum, afetando cerca de 10% de todos os infantes com um ano de idade.
(DROLET; ESTERLY; FRIEDEN, 1999; CORNISH; REDDY, 2011). Entretanto,
outros tumores vasculares mais raros têm sido descritos (GONTIJO; SILVA;
PEREIRA, 2003).
Ocorre mais frequentemente em bebês prematuros, caucasianos, do sexo
feminino, com baixo peso ao nascimento, chegando a 30% em neonatos com menos
de 1000g (GAMPER; MORGAN, 2002). Fatores de risco maternos incluem idade
avançada, pré-eclampsia e anormalidades placentárias (FRIEDEN et al., 2005). O
aumento do risco de HIs em populações submetidas a procedimentos que podem
causar embolização trofoblástica e ruptura da placenta dão suporte à teoria de
origem placentária dos hemangiomas (KAPLAN et al., 1990).
Tipicamente surgem entre duas semanas e dois meses de vida, podendo ser
simples ou múltiplos, envolver um ou vários sistemas, e pode ser focal ou regional
(CHILLER; PASSARO; FRIEDEN, 2002). Aproximadamente 80% dos pacientes
apresentam lesões únicas, sendo rara a presença de quatro ou mais lesões. A pele
é o órgão mais comumente acometido, e as regiões da cabeça e do pescoço (60%),
e o tronco (25%) são as mais afetadas. O tamanho pode variar de poucos milímetros
até vários centímetros (WERNER et al., 2001; FEVURLY; FISHMAN, 2012).
O tumor apresenta proliferação endotelial pré-natal ou pós-natal, crescimento
por
hiperplasia
e
hipertrofia
celular,
com
características microscópicas
e
ultramicroscópicas de tecido neoplásico.Apesar da sua elevada incidência, a origem
dos HIs ainda é incerta, porém teorias propostas incluem alterações intrínsecas do
feto, resposta inadequada das células endoteliais aos fatores estimuladores e
inibidores da angiogênese, incluindo também a modulação hormonal materna e
defeitos clonais nos precursores das células endoteliais (BAULAND et al., 2006;
BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009; FEVURLY; FISHMAN, 2012).Evidências acerca da
sua patogênese apontam para a expansão clonal de células progenitoras endoteliais
sujeitas a sinais celulares anormais locais ou a mutações somáticas iniciais que
favorecem a rápida proliferação (BISCHOFF, 2009; BOYE et al., 2001). No entanto,
41
a
fonte
dessas
células
progenitoras
endoteliais
permanece
desconhecida
(FEVURLY; FISHMAN, 2012). Duas principais teorias sobre a origem dos HIs foram
postuladas.
A primeira foi proposta por North et al. (2001a). Em seu estudo foi objetivado
investigar as possíveis similaridades entre os vasos sanguíneos presentes nos HIs e
na placenta. Para esta investigação fizeram uso de marcadores vasculares que
apresentam imunopositividade em placenta, dentre eles, GLUT-1, Lewis Y, merosina
e Fcγ receptor ΙΙ (receptor para imunoglobulina G-2). Foram então avaliados 66
casos de “hemangiomas”, 26 de MVs, 13 de GPs, 6 angiomas em tufo, 7
hemangioendoteliomas epitelióides, 1 hemangioendotelioma Kaposiforme infantil, 14
angiossarcomas e de placenta.Foi então observado a coexpressão dos quatro
marcadores entre HIs e placenta, não sendo observados níveis de expressão nas
outras lesões,o que, segundo os autores, implica em uma relação íntima entre essas
duas entidades, sugerindo uma associação na origem do tumor.
Uma segunda teoria foi proposta por Dadras et al. (2004). Em seu estudo,
verificaram a expressão do receptor endotelial de vaso linfático (LYVE-1), proteína
homeobox linfático-específica (Prox-1), CD31 e CD34. Foi demonstrado que LYVE-1
é particularmente expresso em células endoteliais de HIs durante a fase proliferativa
e que essa expressão diminui com a involução da lesão. Além disso, tais células
também apresentam positividade para VEGRF-3, CD31 e CD34 e negatividade para
Prox-1.
LYVE-1 é um marcador específico para vasos linfáticos normais e associados
a tumores, que neste estudo, demonstrou estar fortemente expresso em células de
HIs, porém não expresso em outros tumores vasculares (DADRAS et al., 2004).
Este imunofenótipo das células endoteliais dos HIs se assemelha ao
encontrado na veia cardinal durante as fases iniciais da embriogênese, antes de os
vasos se tornarem maduros e/ou adquirirem características linfáticas.O estudo
sugeriu que uma população de angioblastos residentes, presos em um estágio inicial
do desenvolvimento vascular, dá origem às células endoteliais dos HIs de quaisquer
órgãos. Depois das fases iniciais de formação do sistema vascular, uma
subpopulação de células endoteliais passa a expressar Prox-1, um marcador
específico para vasos linfáticos (DADRAS et al., 2004).
Diversos fatores causais do desenvolvimento de HIs estão sendo estudados
na tentativa de compreender a sua fisiopatologia. O foco dos estudos é o
42
microambiente (BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009). Evidências sugerem que os tumores
vasoproliferativos são resultantes da vasculogênese (formação de vasos sanguíneos
primitivos a partir de angioblastos) em vez de angiogênese (o crescimento de vasos
a partir de vasos preexistentes) (COHEN, 2002; NGUYEN et al., 2004), como se
pensava anteriormente (CARMELIET; JAIN, 2000).
Clinicamente, a história natural do HI é dividida em três fases: a inicial, de
crescimento ou fase proliferativa, seguida da regressão espontânea ou fase
involutiva e uma terceira fase de equilíbrio final ou fase involuída (MULLIKEN;
GLOWACKI, 1982; BRUCKNER; FRIEDEN, 2003; TUCCI et al., 2009; BALLAH et
al., 2011).
Durante a proliferação, o tumor se caracteriza como lesão sólida,
compressível, que apresenta aumento de temperatura, bem delimitada e com sinais
de hiperfluxo. Eventualmente, pode se observar aumento da vascularização
peritumoral, o que explica o aumento de volume aos esforços e ao chorar (FRIEDEN
et al., 1997; BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009).
As biópsias de lesões superficiais e profundas apresentam quadros
histopatológicos semelhantes. Na fase de crescimento, observam-se agregados de
células endoteliais proliferativas constituindo cordões sólidos e massas, por vezes
com formação de pequenos lumens. Essas células tendem a se agrupar formando
lóbulos separados por finos feixes de tecido conjuntivo. Nenhum dos lóbulos é
encapsulado ou fibrótico e muitos contêm tecido normal e uma artéria alimentadora.
Podem ser evidenciados ainda trombose e depósitos de hemossiderina, que se
apresentam limitados às áreas de ulceração ou inflamação aguda. Pericitos,
fibroblastos e particularmente mastócitos são numerosos na fase tardia da
proliferação (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000).
Nesta fase, o tumor cresce de maneira rápida, podendo assumir dimensões
consideráveis em proporção ao tamanho da criança. Dependendo de sua
localização, pode causar comprometimento funcional, estético e psíquico. O
crescimento neoplásico pode causar necrose da lesão por insuficiência vascular,
principalmente em suas porções centrais, levando a ulcerações de repetição e a
sangramentos e processos infecciosos locais, fatores que não exibem relação com o
potencial de regressão da lesão. A fase proliferativa é mais pronunciada nos
primeiros 3 a 6 meses de vida e alcança, na maior parte dos casos, suas dimensões
43
máximas por volta de 9 a 12 meses de vida, podendo estender-se até o segundo
ano de vida (BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009; TUCCI et al., 2009).
A fase de involução é caracterizada pela diferenciação das células
mesenquimais em adipócitos e as células endoteliais que circundam os pequenos
lumens vasculares sofrem apoptose, levando à mudança de coloração (do vermelho
vivo ao pálido ou cinza) e consequente resolução da lesão (YU et al., 2006). O
processo tipicamente se inicia do centro para a periferia da lesão (FRIEDEN et al.,
1997; BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009).
Estima-se que o ritmo de involução seja de 10% ao ano e que cerca de 70%
das lesões já estejam involuídas aos sete anos de idade. Uma vez estabilizada esta
fase, considera-se o hemangioma involuído (BOYE; JINNIN; OLSEN, 2009). A fase
involuída do hemangioma não implica obrigatoriamente em retorno à normalidade,
uma vez que no local da lesão podem permanecer sequelas, como tumor residual,
atrofia cutânea, áreas cicatriciais, telangectasia (pequenos vasos dilatados próximo
à superfície de pele ou mucosa), hipo ou hipercromia cutânea, alopécia (redução
parcial ou total de pelos ou cabelos em uma determinada área de pele) e
irregularidades de contorno (BRUCKNER; FRIEDEN, 2003).
Embora classicamente diagnosticados por seu histórico, exame físico e curso
clínico previsível, HIs biopsiados são as únicas lesões vasculares que apresentam
marcação positiva para a isoforma 1 da proteína transportadora de glicose (GLUT-1)
e demonstram maior volume de células endoteliais (MULLIKEN; ENJOLRAS, 2004).
Estima-se que apenas de 10 a 20% dos HI precisam realmente ser tratados
(BRUCKNER; FRIEDEN, 2003).Para a maioria dos casos não é necessária qualquer
intervenção e as lesões regridem espontaneamente. A pele ou mucosa que recobre
a lesão pode apresentar atrofia leve, palidez e finalmente resolução da
telangiectasia vascular (TUCCI et al., 2009).
Eventualmente, a histórial natural dos HIs demonstra complicações, e, por
vezes, apenas a conduta proservativa, se torna impossível. Durante a fase
proliferativa, a ulceração é a complicação mais comum. A localização anatômica é
muito importante, além disso, muitas complicações estão relacionadas a este
parâmetro, como por exemplo, a compressão pelo crescimento tumoral de estruturas
importantes como na região parotídea, comprometimento da via respiratória, e
tumores localizados em área orbital e de pálpebra (TUCCI et al., 2009). O
tratamento deve considerar a idade do paciente, tamanho, número e localização das
44
lesões, estágio evolutivo e presença de outros sintomas associados (FRIEDEN,
1997).
Doses elevadas de corticosteróides podem ser a base do tratamento para HIs
que comprometem funções normais do paciente. A utilização de Prednisolona e
Propanolol de forma separada ou combinada pode controlar a proliferação. A dose
pode ser diminuída gradualmente durante as semanas subsequentes (MALIK et al.,
2013). Outra opção de tratamento é a injeção de corticóide intralesional, que tem
sido aplicada com sucesso: até 40mg de Triancinolona pode ser injetado, a
depender do peso corporal do paciente, podendo ser utilizadas várias injeções com
4 a 6 semanas de intervalo (TUCCI et al., 2009).
Dentre as opções de tratamento, a escleroterapia vem sendo utilizada com
grande sucesso em lesões pequenas, sem a necessidade de intervenção cirúrgica,
alcançando resultados satisfatórios clinica e esteticamente, sendo uma opção viável
e de baixo custo para os casos de HIs orais (PALACIOS; HERRERA; LUGO, 2000).
Os hemangiomas também podem se apresentar na forma congênita, diferindo
do HI por se apresentarem completamente formados ao nascimento. Os
hemangiomas
congênitos
são
classificados
em
hemangiomas
congênitos
rapidamente involutivos (HCRI) ou hemangiomas congênitos não involutivos (HCNI)
(BALLAH et al., 2011).
Por muito tempo estas entidades foram consideradas variantes dos HIs, no
entanto, alguns estudos têm demonstrado diferenças histopatológicas e do
imunofenótipo entre esses dois grupos, fazendo com que pouco provavelmente eles
façam parte do mesmo espectro de lesões (NORTH et al., 2000; BALLAH et al.,
2011). North et al. (2001b) demonstraram em seu estudo que há expressão positiva
de GLUT-1 nos HI, porém esta positividade não é demonstrada nos casos de formas
congênitas, categorizando-as então como lesões distintas.
HCRI parecem ser lesões incomuns, porém não raras, pois com sua rápida
involução, podem facilmente passar despercebidas. Apresentam-se geralmente
como lesões únicas de cinza a violáceas, podendo ser planas ou elevadas e estão
associadas à telangiectasia. Geralmente se apresentam associados a alguma
condição sistêmica e regridem antes de o indivíduo completar um ano de vida
(KROL; MACARTHUR, 2005).
O HCNI é um tumor raro, que se apresenta completamente formado ao
nascimento, com crescimento proporcional ao crescimento geral da criança, sem
45
regressão e, menos comumente, ulceração central, cicatriz ou nodularidade. (KROL;
MACARTHUR, 2005; SHAM; SULTANA, 2012). Seu padrão de crescimento o
distingue
dos
HI
verdadeiros.
As
características
histopatológicas
incluem
organização vascular lobular, com células endoteliais apresentando núcleo
achatado, presença de veias dilatadas e, por vezes, artérias permeando os lóbulos.
Fístula arteriovenosa dérmica, um grande vaso no centro dos lóbulos e áreas de
calcificação
também
são
comumente
encontrados.
Os
HCNI
devem
ser
diferenciados dos HI devido às diferenças na sua evolução e necessidade de
diferentes condutas pelo clínico. Devem ser observados por 18 meses e em caso de
não involução da lesão, deve ser considerada a realização de análise
imunoistoquímica, uma vez que o HCNI é GLUT-1 negativo (SHAM; SULTANA,
2012).
2.2.2 Granuloma piogênico
O GP é um tipo de proliferação não neoplásica. O termo “hiperplasia
inflamatória” é usado para descrever uma grande variedade de crescimentos
nodulares na mucosa oral, como os GPs, e, histologicamente, inflamação e tecido
de granulação (JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006).
O “hemangioma lobular capilar”, como era antigamente denominado o GP, é
uma lesão vascular adquirida, clinica e histologicamente semelhante ao HI, porém,
em geral, de dimensões menores (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000).
O GP é uma das lesões tumorais mais comuns da cavidade oral. Mostra uma
proliferação altamente vascular, por vezes organizada em agregados lobulares.
Devido a alguns tipos de comportamento, como crescimento rápido, ocorrência
múltipla e frequente recorrência, alguns pesquisadores o consideram como uma
neoplasia benigna, porém, é, sobretudo, considerada uma lesão tumoral reacional,
como resposta a vários estímulos, tais como fatores traumáticos, hormonais
(aumento dos níveis de estrógeno e/ou progesterona) ou certos tipos de drogas
(NAKAMURA, 2000; JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006; VERMA et
al., 2012).
Apesar de originalmente acreditar-se que o GP era causado por
microorganismos piogênicos, atualmente é sabido que a lesão não está relacionada
com infecção. Dessa maneira, o termo “granuloma piogênico” é um termo impróprio
46
porque a lesão não contém pus nem é um granuloma propriamente dito
(JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006; REGEZZI; SCIUBBA; JORDAN,
2008).
Alguns fatores como tais como o indutor da proteína óxidonítrico sintase, fator
de crescimento endotelial vascular, fator de crescimento fibroblástico básico e fator
de crescimento do tecido conjuntivo estão envolvidos na sua angiogênese e rápido
crescimento (JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006). No entanto, deve
ser enfatizado que o rápido crescimento dos GPs não é dependente apenas de
fatores proliferativos, mas também de sua taxa de morte celular, como sugerido por
Nakamura et al. (2000), que a baixa taxa apoptótica está intimamente relacionada
com o rápido crescimento do tumor e que esse aspecto é dependente das proteínas
da família Bcl-2, que regulam funções pró e antiapoptóticas.
Aproximadamente um terço das lesões ocorre após trauma e a pobre higiene
oral pode ser um fator precipitante para muitos dos pacientes. Adicionalmente,
algumas drogas, como a ciclosporina mostram um importante papel na patogênese
dessas lesões (JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006; TOLENTINO;
TOLENTINO, 2009).
Embora
possa
acometer
pacientes
de
qualquer
idade,
acomete
predominantemente adultos jovens do sexo feminino, possivelmente devido à
influência dos hormônios femininos sobre a proliferação vascular (JAFARZADEH;
SANATKHANI; MOTASHAM, 2006).
O GP oral é, na verdade, o tumor gengival mais comum, demonstrando uma
forte predileção pela gengiva, atingindo 75% de todos os casos, onde ele é
possivelmente causado por cálculo gengival ou material externo dentro da gengiva
cervical. Seguem como lugares de mais comum acometimento o lábio, língua e
mucosa jugal (JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006).
As lesões são discretamente mais comuns na gengiva maxilar do que na
mandibular. A região anterior é mais frequentemente acometida que a posterior e a
vestibular mais que a lingual ou palatina, alguns alcançando maiores dimensões e
atingindo tanto a região vestibular quanto lingual ou palatina (JAFARZADEH;
SANATKHANI; MOTASHAM, 2006).
Gordón-Núñezet al. (2010) em seu estudo realizaram um levantamento
epidemiológico acerca desses tumores em uma população brasileira. Com uma
amostra constituída de 293 casos de GPs, verificaram que havia uma predileção
47
pelo sexo feminino, com relação feminino/masculino de 2,38:1. A idade média dos
pacientes era de 27 anos e um elevado grau de ocorrência foi observado na
segunda década de vida. Pacientes brancos foram mais comumente afetados
(44,7%) do que aqueles com outra cor de pele. O local maior acometimento foi a
gengiva (83%), com maior prevalência na maxila. A maioria dos casos era
sintomática e com sangramento.As lesões foram descritas como nódulos (71,9%) de
consistência mole (62,3%), superfície eritematosa (73,2%), pediculadas em 61,1%
dos casos, e o tamanho médio foi de 1,3 cm. Diante dos dados obtidos, os autores
concluíram que as características clínicas, demográficas e patológicas do GP na
população brasileira foram semelhantes aos estudos de populações de outros
países.
Clinicamente se apresenta como uma lesão de crescimento exofítico, de
superfície lisa ou lobulada, eritematosa, de base séssil ou pediculada e comumente
sangrante (AL-KHATEEB; ABABNEB, 2003; MARTINS-FILHO et al., 2011).
O tamanho pode variar de poucos milímetros até alguns centímetros, no
entanto, raramente os 25mm são excedidos. Pode apresentar crescimento lento e
assintomático
ou
aumentar
de
tamanho
rapidamente.
A
superfície
é
caracteristicamente ulcerada e friável, podendo ser sobreposta por uma membrana
fibrinosa amarelada (JAFARZADEH; SANATKHANI; MOTASHAM, 2006; MARTINSFILHO et al., 2011).
Lesões recentes se apresentam com aparência altamente vascular porque
são compostas basicamente por tecido de granulação hiperplásico onde o grande
número de capilares é proeminente. O menor trauma na lesão pode levar ao
sangramento devido sua evidente vascularidade. Lesões maduras se tornam mais
colagenizadas e róseas (GOODMAN-TOPPER; BIMSTEIN, 1994).
Ao exame microscópico, o GP demonstra alta proliferação vascular e infiltrado
inflamatório, semelhante a um tecido de granulação. Observam-se numerosos
pequenos vasos, muitos deles congestos por hemácias, limitados por células
endoteliais variando, em sua morfologia, de fusiformes a ovoides, podendo
apresentar atividade mitótica. Os numerosos vasos se dispõem em aglomerados
lobulares vasculares separados por septos de tecido conjuntivo fibrovascular. Um ou
mais vasos centrais desenvolvem um lúmen maior com uma camada muscular
espessa
(PATIL;
MAHIMA;
LAHARI,
2006;
JAFARZADEH;
SANATKHANI;
MOTASHAM, 2006). O estroma é constituído de fibroblastos de morfologia
48
arredondada a fusiforme e é evidente a presença de um moderado a intenso
infiltrado inflamatório misto. A superfície da lesão é frequentemente ulcerada e
substituída por uma membrana fibrinopurulenta, sendo a população de células
inflamatórias polimorfonucleares predominante nessas áreas (REGEZI; SCIUBBA,
JORDAN, 2008).
O GP faz diagnóstico diferencial com outras anomalias vasculares, como os
HI, podendo ser completamente indistinguíveis clínica e histologicamente. O estudo
imunoistoquímicoatravés do anticorpo anti-GLUT-1 tem mostrado ser uma poderosa
ferramenta
para
a
diferenciação
dessas
lesões
(LEON-
VILLAPALOS; WOLFE; KANGESU, 2005).
O tratamento indicado para a lesão é a biópsia excisional, exceto quando o
procedimento possa produzir marcante deformidade local. Nesses casos, a biópsia
incisional é mandatória. O manejo da lesão depende da severidade dos sintomas.
Embora a excisão cirúrgica conservadora e a remoção dos agentes irritantes sejam
o tratamento usual, para lesões em gengiva, a excisão cirúrgica deve ser estendida
até o periósteo e o dente adjacente criteriosamente raspado para a eliminação da
origem
da
irritação
constante
(ESMELI;
LOZADA-NUR;
EPSTEIN,
2005).
Adicionalmente, algumas abordagens alternativas como a criocirurgia, excisão por
laser Nd:YAG, laser de corante pulsado, injeção de corticosteróide ou etanol, e
escleroterapia com sulfato de sódio tetradecil tem sido relatadas como eficazes no
tratamento dos GPs orais (ESMELI; LOZADA-NUR; EPSTEIN, 2005; JAFARZADEH;
SANATKHANI; MOHTASHAM, 2006).
2.3 MALFORMAÇÕES VASCULARES
As MVs são resultantes de erros na formação vascular durante a vida
embrionária, que não exibem atividade proliferativa ou tumoral. Na verdade, os
vasos sanguíneos que se acumulam nessas lesões vão gradualmente aumentando
de diâmetro sem proliferação do endotélio vascular. Podem ser classificadas com
base no seu tipo de fluxo de sangue em lesões de fluxo lento (as de origem venosa,
capilar e linfática) e lesões de alto fluxo (arteriovenosa). Combinações de diferentes
tipos de malformações também podem ser observadas mais raramente. (KANG;
SONG, 2008; FEVURLY; FISHMAN, 2012; CANDAMOURTY et al., 2012).
49
Estão sempre presentes ao nascimento (congênitas) e não proliferam ou
involuem. Apresentam crescimento proporcional ao crescimento geral do indivíduo e
não demonstram regressão espontânea e microscopicamente apresentam vasos
dilatados, limitados por fino endotélio. As MVs são ocasionalmente propensas à
expansão devido a diversos estímulos, como trauma, alterações endócrinas
(puberdade, gravidez) ou infecção (KANG; SONG, 2008).
MVs congênitas estão presentes em cerca de 1 a 1,5% da população. A
maioria é esporádica, ou seja, não familiar, mas alguns casos exibem clássica
herança mendeliana. Embora a patogênese das malformações do sistema vascular
permaneça desconhecida, avanços recentes foram feitos na compreensão do
desenvolvimento vascular sanguíneo e linfático, que abrem as portas para um maior
conhecimento sobre as aberrações observadas (FEVURLY; FISHMAN, 2012).
Essa anomalia pode causar graves alterações estéticas e complicações locais
(destruição
de
estruturas
anatômicas,
infecção,
obstrução,
dor,
trombose,
ulceração), podendo também levar à coagulação intravascular disseminada, embolia
pulmonar, trombocitopenia e insuficiência cardíaca congestiva (ABRAMOWICZ;
PADWA, 2012). Ressecções geralmente são requeridas, especialmente para
malformações arteriovenosas (KANG; SONG, 2008).
No passado, a utilização de um único termo para designar uma variedade de
anomalias vasculares, muitas vezes conduzia ao pensamento equívoco de que
essas lesões supostamente iriam desaparecer nos primeiros anos de vida dos
infantes acometidos. Como consequência, MVs congênitas eram muitas vezes
erroneamente mal diagnosticadas e não tratada, e a abordagem para o diagnóstico
correto não era homogênea (TUCCI et al., 2009; HASSENEIN et al., 2011).
MVs assintomáticas não necessitam de nenhum tratamento, porém em caso
de complicações, como ulcerações e/ou sangramento, o tratamento cirúrgico é
mandatório. Durante o estágio pré-operatório, a realização de ressonância
magnética e angiografia se fazem essencial. Uma terapia alternativa é a
escleroterapia por meio de inoculação direta de substâncias esclerosantes
culminando na oclusão dos vasos. Para as MVs capilares, o tratamento de escolha
pode ser a laserterapia com laser de corante pulsado (TUCCI et al., 2009).
50
2.4 ISOFORMA 1 DA PROTEÍNA TRANSPORTADORA DE GLICOSE
(GLUT-1)
A glicose éa principal fontede energia eé umsubstratoimportante paraa
síntese deproteínas elipídeosem células de mamíferos. Ela forneceenergia na
formade ATPatravés da glicólise e do ciclo de ácidocítrico (ciclo de Krebs) e na
forma de NADPHpela via da pentose fosfato. Também é utilizada na síntese de
glicerol e para a produção de triglicérideos e proporciona intermediários para a
síntese de aminoácidos não essenciais (ZHAO; KEATING, 2007).
Nos mamíferos, uma vez que os níveis de glicose no sangue estejam
mantidos dentro de uma estreita gama de mecanismos de homeostase, a maioria
das células recebe glicose a partir do fluido intersticial por um processo de
transporte passivo, a difusão facilitada, impulsionada pelo gradiente de concentração
para o interior celular através da membrana plasmática (WIDDAS, 1988).
Apenas em células epiteliais com bordas em escova do intestino delgado e
dos túbulos contorcidos proximais dos rins, a glicose é absorvida, ou reabsorvida,
contra o seu gradiente eletroquímico por um mecanismo de transporte ativo
secundário, a bomba de sódio e potássio (ZHAO; KEATING, 2007).
Os processos de transporte de glicose são mediados por duas famílias
distintas de transportadores de glicose estruturalmente relacionados. O processo de
transporte passivo facilitado é mediado pela família das proteínas facilitadoras do
transporte de glicose (GLUTs) e o transporte ativo é mediado pela família de
proteínas co-transportadoras dependentes de sódio (SGLTs), que apresenta seis
membros, porém apenas SLGT1 e SLGT2 já são bem caracterizadas (JOOST et al.,
2002; WRIGHT; TURK, 2004; MACHADO; SCHANN; SERAPHIM, 2006).
As GLUTs apresentam peso molecular entre 50 e 60 kDa e são denominadas
GLUT-1 a 12, HMIT-H+- ligado ao mio-inositol e GLUT14 de acordo com a ordem
cronológica de caracterização (WU; FREEZE, 2002; SCHEEPERS; JOOST;
SCHURMANN, 2004; MACHADO; SCHANN; SERAPHIM, 2006;). A GLUT-1 se
apresenta,
em
humanos,
com
492
aminoácidos
e
peso
molecular
de
aproximadamente 54kDa (ZHAO; KEATING, 2007).
Uma ampla pesquisa do genoma no GenBank indicou que as GLUT1-12 e
HMIT podem representar todos os membros de facilitadores do transporte passivo
de glicose em humanos (JOOST; THORENS, 2001).
51
Estas proteínas são estruturalmente semelhantes e relacionadas. A análise
destas proteínas indica que esta família de transportadores apresenta uma estrutura
terciária de 12 domínios transmembranares hidrofóbicos. Esses domínios são
conectados por segmentos hidrofílicos intra e extracelulares e possuem porções
terminais NH2 e COOH citoplasmáticas (Figura 1) (THORENS; CHARRON; LODISH
1990; JOOST; THORENS, 2001; MACHADO; SCHANN; SERAPHIM, 2006).
Figura 1- Estrutura molecular bidimensional da GLUT.
Fonte: Adaptado de Machado, Schaan e Seraphim, 2006.
Comparações de sequência de todos os membros da família mostram que as
sequências são mais conservadoras nas regiões transmembranares, sugerindo que
esses domínios são responsáveis pela característica comum a todas as GLUTs, que
é a capacidade de transportar a glicose, e mais divergente nas regiões de loops e
regiões C e N-terminais (KASANICH; PILCH; 1990; ZHAO; KEATING, 2007).
Estes dados sugerem que os aminoácidos conservados desempenham
papéis importantes na ligação ao substrato e/ou na alteração de conformação
durante o processo de transporte. Ademais, a presença de áreas comuns sugere
que esta família pode ter origem a partir de um gene ancestral comum (ZHAO;
KEATING, 2007).
As regiões mais divergentes são os loops 1 e 9 e as duas regiões terminais,
seugerindo que esses domínios sejam responsáveis pela especificidade de cada
isoforma, tais como localização celular, características cinéticas, regulação hormonal
e imunogenicidade. (KASANICH; PILCH; 1990; ZHAO; KEATING, 2007).
52
Além disso, há 18 resíduos de glicina conservados, 11 dos quais são
adjacentes a um ou mais aminoácidos conservados. Experimentalmente, um
triptofano do domínio transmembrana (TM10) tem sido demonstrado ser essencial
para a ligação da GLUT-1 aos ligantes da citocalasina B e forscolina. E o triptofano
conservado em todas as GLUTs no domínio transmembrana 11 é essencial para o
transporte de glicose pela GLUT-1 através da membrana plasmática (GARCIA et al.,
1992; SCHURMANN et al., 1993). Além da glicose, a GLUT1 também transporta
galactose, manose e glicosaminas (ULDRY et al., 2002).
A troca da arginina conservada no loop 2, duas argininas em loop 8,
glutamato em loop 8, prolina no domínio transmembrana 10, glutamato ou arginina
no loop 10 reduz ou suprime a atividade de transporte de glicose da GLUT-1 (MORI
et al., 1994; SCHURMANN et al., 1997). Os últimos 24 aminoácidos na região Cterminal da GLUT-1 demonstraram ser desnecessários para a atividade de
transporte (MURAOKA, 1995).
A GLUT-1 é altamente expressa em endotélio microvascular de tecidos de
barreira, onde o fluxo seletivo de glicose do sangue para os tecidos é de extrema
importância, tais como sistema nervoso central (SNC), retina, íris, músculo ciliar,
endoneuro de nervos periféricos e placenta (TAKATA et al., 1990; YOUNES et al.,
1997; NORTH et al., 2000; WOOD; TRAYHURN, 2003). A GLUT-1 pode
desempenhar um papel vital para a entrada de glicose nesses tecidos firmemente
protegidos (TAKATA et al., 1990).
Também é observada expressão em eritrócitos, correspondendo a cerca de
5% das proteínas de membrana deste tipo celular, centros germinativos dos tecidos
linfoides e túbulos renais, além de tecido adiposo e algumas células hepáticas
(TAKATA et al., 1990; YOUNES et al., 1997; WOOD; TRAYHURN, 2003; ZHAO;
KEATING, 2007).
Hogan, Gjedde e Hakim (1991) em seu estudo, coletaram embriões de ratos
antes da implantação do zigoto, entres os estágios de ovócito e blastocitso, e
identificaram a presença da isoforma 1 da GLUT em quase todos os tecidos
examinados, incluindo cérebro e eritrócitos.
Essa proteína não é expressa na vasculatura de qualquer outro tecido normal
ou tumor vascular. Não apresenta relação com atividade mitótica e é considerado
um marcador sensível e específico para diagnóstico do HI mostrando-se presente
em todas as suas diferentes fases evolutivas (ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997;
53
ENJORAS; WASSEF; CHAPOT, 2013). Células da placenta e de HIs parecem ter o
mesmo ciclo de vida, o que sugere que os HI podem resultar de células placentárias
embolizadas (NORTH et al., 2001a). Células progenitoras que podem ter origem a
partir da placenta são encontradas dentro da anomalia (LO; MIHM; FAY, 2009;
NORTH et al., 2001a).
North et al. (2000) realizaram um estudo sobre a marcação imunoistoquímica
de GLUT-1 em diferentes anomalias vasculares. Eles encontraram intensa
imunorreatividade para GLUT-1 nos HIs, demonstrando mais de 50% de marcação
nas células endoteliais dos microvasos lesionais em 97% dos casos. Além disso,
não foi observada imunorreatividade para GLUT-1 em nenhum caso de MVs, GPs e
hamangioendoteliomas. Esses achados estabeleceram a GLUT-1 como um
marcador altamente sensível e específico para a identificação de HIs de qualquer
órgão.
Em seu estudo, North et al. (2001b) objetivaram comparar as características
histológicas e imunoistoquímicas dos HIs e HCNIs. Foram utilizados no estudo 43
lesões obtidas a partir de 36 pacientes, incluindo 25 casos de HIs, 10 GPs, 1
angioma em tufo, 1 hemangioendotelioma kaposiforme infantil e 6 casos de HCNIs
de pacientes com até 4 meses de idade. Foi então realizada a análise
imunoistoquímica fazendo-se uso dos antígenos GLUT-1 e LeY e foi verificado que
100% dos HIs demonstravam imunpositividade para ambos os marcadores e, de
maneira adversa, nenhum dos outros casos demonstrou tal positividade.
Foram
observadas também diferenças histopatológicas entre os HIs e os HCNIs. Os
autores concluíram que os HCNIs são histologicamente e imunofenotipicamente
diferentes dos HIs e que esses dois tipos de tumores representam entidades
diferentes, apesar de algumas similaridades clínicas.
MO et al. (2004) verificaram que havia deficiência de uma terminologia
adequada para as anomalias vasculares hepáticas. Diante disso realizaram um
estudo com 19 casos utilizando diversos marcadores vasculares, incluindo a GLUT1. Seus resultados indicaram que há dois distintos grupos de lesões vasculares
hepáticas em neonatos e crianças, o HI hepático, que apresenta positividade para
GLUT-1, e as MV hepáticas que são GLUT-1 negativas. Desta maneira os autores
concluíram que a GLUT-1 se apresenta como uma eficiente ferramenta na distinção
entre HIs e MVs hepáticos.
54
Nguyen et al. (2004), observaram em seu estudo, uma intensa marcação para
GLUT-1, em células endoteliais de todos os casos de HIs localizados em tronco,
genitália e na cabeça, incluindo 4 casos em boca (2 casos no lábio e 2 em mucosa
jugal).
Johann et al. (2007), objetivando verificar a acurácia do diagnóstico
histológico de “hemangiomas”, MVs e GPs orais, investigaram a imunoexpressão da
GLUT-1 nessas anomalias. Foram utilizados 19 casos de hemangiomas, 48 GPs e
17 MVs orais. Foi observado que nenhum dos casos de lesões vasculares benignas
orais apresentou imunopositividade para GLUT-1. Os 19 casos diagnosticados
inicialmente como hemangiomas orais mostraram negatividade para GLUT-1, sendo
então reclassificados como GPs ou MVs, através de uma análise mais detalhada
dos casos. A análise histológica não foi suficiente para concluir o diagnóstico dos
HIs pelo fato de nenhum desses se tratar HI verdadeiro. Além disso, todos os casos
que foram inicialmente classificados como GPs e MVs foram imunonegativos para
esta proteína, o que demonstrou a eficácia da análise histológica para estas lesões.
Dessa maneira, os autores concluíram que a GLUT-1 se trata um marcador efetivo
no auxílio para a definição do diagnóstico das lesões vasculares benignas orais.
Browning et al. (2009) diante do fato de que GPs em infantes são comumente
confundidos com HIs, realizaram uma análise imunoistoquímica fazendo-se uso do
marcador GLUT-1. Em ambos os casos não foi observada a imunopositividade para
o marcador, dando suporte à manutenção do GP como diagnóstico apropriado.
Song et al. (2011) realizaram um estudo na tentativa de distinguir HCNIs de
HIs através de estruturas histopatológicas e da imunoexpressão de GLUT-1. Foram
incluídos no estudo 13 casos de HCNI, 13 casos de HI em proliferação e 13 casos
de HI em involução coletados através de biópsias. Nos casos de HCNI, os lóbulos
de capilares se mostravam bem definidos, cercados por tecido fibroso abundante,
com os vasos capilares íntegros, por vezes, de calibres aumentados. Figuras de
mitose e corpos apoptóticos eram vistos eventualmente em células endoteliais e
estromais. Os achados patológicos dos HIs, segundo ou autores, eram totalmente
diferentes. A análise muno-histoquímica revelou que a GLUT-1 foi expressa nas
células endoteliais dos HIs, mas nos casos de HCNI essa expressão não foi
observada.
Osaki et al. (2013) realizaram um estudo com anomalias vasculares orbitais.
Foram utilizados no estudo 10 casos de HIs e 10 casos de “lesão venosa
55
encapsulada cavernosa” ou MVs orbitais. Foi observado que todos os casos de HIs
apresentaram positividade para GLUT-1, enquanto que nenhum dos casos de MVs
apresentou tal positividade. De acordo com os autores, a imunopositividade para
GLUT-1 observada apenas nos HIs destacou uma diferença essencial, uma vez que,
este marcador melhorou a precisão diagnóstica, principalmente quando as áreas
sólidas dos HIs, em fase tardia, sofrem transformação em canais vasculares
ectásicos, mas ainda assim apresentam-se GLUT-1 positivas.
Oliveira et al. (2014) em seu estudo analisaram a expressão imunoistoquímica
de 30 casos diagnosticados inicialmente como “hemangiomas” e 30 casos
diagnosticados como GP orais. A partir do teste imunoistoqúimico foi verificado que
apenas 7 dos casos de “hemangiomas” tratavam-se de HIs verdadeiros, enquanto
que os outros 23 casos não apresentaram positividade para GLUT-1. Os espécimes
GLUT-1 negativos foram então reclassificados em GP (10) e MV(13) orais. Nenhum
dos casos de GP apresentou positividade para GLUT-1, sendo então mantido o seu
diagnóstico histológico inicial. Dessa maneira, os autores concluíram que apenas as
características histopatológicas não são suficientes para o correto diagnóstico dos
HIs orais.
2.5 Ki-67 e Bcl-2
A proliferação celular é um processo biológico de fundamental importância
para todos os seres vivos por seu importante papel na homeostase tecidual e é
controlada por mecanismos altamente coordenados. Progressos substanciais na
compreensão dos mecanismos e da regulação do ciclo celular foram feitos nos
últimos anos e verificou-se que numerosas moléculas são associadas ao ciclo
celular e suas modulações (SCHLÜTER et al., 1993; BOLOGNA-MOLINA et al.,
2012).
O ciclo celular é constituído por uma série de fases, durante a qual ocorrem
alterações que conduzem a divisão celular. Genes de células reguladoras modulam
o ciclo celular de uma forma altamente sofisticada através de uma variada
quantidade de proteínas (SCULLY; FIELD; TANZAWA, 2000).
Marcadores de proliferação referem-se a proteínas específicas ou outros
fatores cuja presença em células em divisão serve como um indicador de
crescimento ativo para tais células. Hoje em dia, o método mais comum para a
56
determinação da atividade proliferativa é a utilização de técnicas imunoistoquímicas,
que são cada vez mais aplicadas na rotina patológica. (BOLOGNA-MOLINA et al.,
2012).
Em 1983, um anticorpo monoclonal (mAb), designado Ki-67, que reage
seletivamente com os núcleos das células em proliferação em todos os tecidos
humanos testados foi descrito (GERDES et al., 1983). Trata-se de um marcador
clássico de proliferação celular, que tem sido amplamente aplicado nos campos de
pesquisa de diagnóstico. O anticorpo padrão para a detecção de Ki-67 é o MIB-1
(BOLOGNA-MOLINA et al., 2012).
Análises detalhadas do ciclo celular revelaram que este antígeno associado à
proliferação é expresso em todas as partes ativas do ciclo celular (G1, S, G2, e
mitose), mas está ausente na fase de repouso (G0), indicando que o antígeno Ki-67
pode ser utilizado como um marcador para as células em proliferação (GERDES et
al., 1984; KIM et al., 2012).
O controle deste importante processo é completamente desregulado em
alguns tipos de neoplasias. Em consequência, a determinação da fase de
crescimento com o antígeno Ki-67 tem sido largamente utilizada na histopatologia,
particularmente em numerosos estudos sobre o valor prognóstico da avaliação da
proliferação de células em amostras clínicas de neoplasmas humanos (SCHLÜTER
et al., 1993; BOLOGNA-MOLINA et al., 2012)
Na fase G1, o antígeno Ki-67 é predominantemente localizado na região
perinucleolar e, nas últimas fases do ciclo celular, é detectado também em todo o
interior nuclear, sendo predominantemente localizado na matriz nuclear. Na mitose,
está presente em todos os cromossomos e aparece em uma estrutura reticulada que
envolve os cromossomos metafásicos (VERHEYEN et al., 1989; GERDES et al,
1984; SCHLÜTER et al., 1993;).
Em contraste com muitas outras proteínas celulares associadas ao ciclo
celular, o antígeno Ki-67 é ausente em células quiescentes e não é detectável
durante os processos de reparação do DNA. Assim, a presença do antígeno Ki-67 é
estritamente associada com o ciclo celular e confinada ao núcleo, sugerindo um
papel importante desta estrutura para a manutenção e/ou regulação do ciclo de
divisão celular (SCHLÜTER et al., 1993; KIM et al., 2012;).
North et al. (2000) em seu estudo analisaram a possibilidade de haver alguma
analogia entre o marcador GLUT-1 e a atividade proliferativa medida pela
57
imunomarcação para KI-67. Os autores encontraram em seus resultados que a
expressão de GLUT-1 não apresenta ligação direta com o marcador de proliferação
Ki-67, uma vez que HIs GLUT-1 positivos, em fase tardia, apresentavam pouca, ou
nenhuma, imunorreatividade para KI-67 ou figuras de mitose aparentes, no entanto
demonstravam intensa marcação para GLUT-1. Em contraste, células endoteliais de
amostras de GP e tecido de granulação apresentavam intensa imunorreatividade
para Ki-67, mesmo sendo observada completa ausência de marcação para GLUT-1
nessas lesões.
Em seu estudo, Nakurama (2000) comparou a imunoexpressão de Ki-67 em
GPs, “hemangiomas capilares” e amostras de tecido de granulação, onde
apresentou marcação com intensidade variável sem diferença estatisticamente
significativa entre as lesões.
Dyduch et al. (2004) também tentaram estabelecer uma ligação entre GLUT-1
e Ki-67. Em seu estudo foram utilizados 26 casos de “hemangioma capilar infantil”
(HI), 15 de “hemangioma capilar lobular” (GP) e 9 de “hemangiomas epitelióides” da
pele. Os autores encontraram uma relação inversamente proporcional da expressão
desses marcadores, no entanto, tal relação não apresentava significância estatística.
Dessa maneira, os autores concluíram que a expressão da GLUT-1 nas anomalias
vasculares não era dependente do seu potencial proliferativo.
Apesar de as MVs serem consideradas um tipo de anomalia vascular sem a
presença de proliferação endotelial, Meijer-Jorna et al. (2012) demonstraram que
áreas de vasos imaturos dentro das malformações vasculares podem apresentar
imunopositividade para o Ki-67, sugerindo que essas áreas podem apresentar o
mesmo padrão de proliferação celular e maturação que é observado em outras
lesões vasculares de pele e mucosa, como o GP e o HI de quaisquer órgãos.
O comportamento biológico de qualquer lesão é altamente dependente da sua
atividade proliferativa (REZVANI et al., 2010; RANJBARI; RAHIM, 2013). No entanto,
a taxa de crescimento das lesões depende não apenas do nível de proliferação das
células tumorais, mas também das taxas de morte celular (NAKAMURA, 2000).
A apoptose é a via de morte celular que é induzida por um programa
intracelular altamente regulado, onde as células que estão destinadas a morrer
ativam enzimas que degradam seu material nuclear e as proteínas citoplasmáticas
(KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010).
58
Ela
é
caracterizada
morfologicamente
por
encolhimento
da
célula,
condensação e marginação da cromatina nuclear, brotamento da membrana celular,
fragmentação celular formando corpos apoptóticos e ausência de uma reação
inflamatória (IWATA et al., 1996). A membrana plasmática da célula permanece
intacta, mas sua estrutura é alterada de forma que a célula apoptótica se torna um
alvo primário da fagocitose. A célula morta é eliminada rapidamente, antes que seu
conteúdo possa extravasar e, dessa forma, não desencadeia uma reação
inflamatória pelo hospedeiro (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010).
Bioquimicamente, o DNA de células apoptóticas é clivado devido à ativação
de endonucleases. A apoptose desempenha um papel importante na morfogênese
fetal e em várias condições fisiológicas e patológicas. Vários fatores têm sido
propostos como reguladores deste fenômeno. O antígeno Fas, e a proteína p53
estimulam a apoptose, enquanto que a proteína Bcl-2 a inibe (IWATA et al., 1996).
A apoptose é uma forma de morte celular com características diferentes das
da necrose, que é caracterizada pela perda da integridade das membranas, digestão
enzimática das células e ocorre reação inflamatória do hospedeiro. (IWATA et al.,
1996; KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010).
A proliferação e regressão das células endoteliais são rigidamente
controladas por mecanismos fisiopatológicos sob várias condições. No entanto, em
células neoplásicas, que se caracterizam pelo crescimento excessivo descontrolado,
o equilíbrio entre a proliferação e morte celular é interrompido (NÖR et al., 2001).
A família Bcl-2, um grupo de proteínas reguladoras, controla a via central
apoptótica e protege as células, através da via mitocondrial, de uma variedade de
estímulos apoptóticos (MURAKAMI et al., 2008). Esta família inclui proteínas
antiapoptóticas, tais como Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, Bcl-B e A1 e pró-apoptóticas,
como Bax, Bcl-xS, Bad e Bim. A apoptose é regulada por estas proteínas através de
mecanismos que envolvem alterações na permeabilidade da membrana mitocondrial
externa (COLITTI, 2012).
A
sequência
de
aminoácidos
homólogos
de
ambos
os
membros
antiapoptóticos e pró-apoptóticas é confinada a quatro regiões específicas
chamadas de domínios homólogos Bcl-2 (BH1-4). Estes domínios são essenciais
para a função destas proteínas, incluindo o seu impacto sobre a sobrevivência das
células e a sua capacidade de interagir com outros membros da família e proteínas
reguladoras, de modo a formar homo ou heterocomplexos (HIROTANI et al., 1999)
59
As proteínas também contêm um domínio C-terminal hidrofóbico, que
acredita-se
estar
envolvido
na
orientação
das
proteínas
de
membranas
intracelulares (COLITTI, 2012)
As proteínas multidomínios antiapoptóticas residem principalmente na
mitocôndria e possuem quatro ou dois domínios BH. Os domínios BH1 e BH2 são
necessários para a proteína Bcl-2 e Bcl-xL interagir com Bax e para suprimir a
apoptose. Nas proteínas pró-apoptóticas, o domínio BH3 foi demonstrado ser
necessário para a sua atividade de morte. Como especialmente demonstrado por
uma abordagem genética, o BH3 não só neutraliza os membros da família Bcl-2
antiapoptóticos, mas também pode ativar diretamente Bax ou Bak, que são
componentes essenciais da via de apoptose mitocondrial (COLITTI, 2012; MERINO
et al., 2009; WEI et al., 2001).
A proteína Bcl-2 prolonga a sobrevida celular, no entanto, não dispõe de
vantagens proliferativas. Num contexto adverso, as células que expressam Bcl-2,
consequentemente demonstram um potencial de resistência à apoptose, podendo
apresentar a supressão da morte celular programada, adquirir mutações e culminar
com a progressão tumoral (FARIAS; SOUZA; AARESTRUP, 2005).
Itawa et al. (1996) em seu estudo comparando taxa de proliferação e
apoptose em “hemangioma capilar infantil” (HI) e “hemangioma capilar lobular” (GP)
verificaram marcação positiva para o antígeno de proliferação Ki-67 sem diferenças
significativas entre os grupos. E, ao mesmo tempo, encontraram nenhuma ou muito
pouca expressão de Bcl-2 em ambos os grupos. Por outro lado, fazendo uso do
antígeno Lewisy, um marcador pró-apoptótico, foi observado marcação positiva para
HI e negativa para GP, sugerindo a apoptose como a causa da involução
espontânea dos HIs observados.
Nakamura (2000) em seu estudo, analisaram a expressão de proteínas
reguladoras da apoptose em GP, “hemagiomas capilares” e tecido de granulação.
Foi observado maior expressão de Bcl-2/Bax em GP do que em tecidos de
granulação sugerindo que o baixo índice apoptótico em GP está estreitamente
relacionado com a sua característica de crescimento rápido e é regulado por
proteínas da família Bcl-2. Mostrou também que não havia diferenças no padrão de
marcação destas proteínas entre GPs e “hemangiomas capilares”.
Dyduch et al. (2004) em seu estudo também compararam a expressão
imunoistoquímica da proteína Bcl-2 em casos de “hemangioma capilar infantil”,
60
“hemangioma capilar lobular” e “hemangiomas epitelióides” da pele, No entanto, os
resultados acerca deste marcador não apresentaram significância estatística. Os
autores observaram que a expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 nas células
endoteliais lesionais dos HIs vai alterando de forma inversamente proporcional à
evolução da lesão e seus níves se apresentam diminutos na fase involuída. Dessa
maneira, os autores sugerem que esta proteína está relacionada tanto na
proliferação quanto na morte celular programada dos casos de HI de pele.
O estudo de marcadores que estão envolvidos na variação das taxas de
proliferação celular se faz importante para auxiliar na elucidação de questões
pertinentes ao comportamento biológico das anomalias vasculares.
61
OBJETIVOS
62
3 OBJETIVOS
3.1 OBJETIVOS GERAIS:
Investigar a expressão imunoistoquímica de GLUT-1 e marcadores de
proliferação e apoptose em amostras de anomalias vasculares orais.
3.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Verificar a expressão imunoistoquímica da GLUT-1 em todos os casos
diagnosticados histopatologicamente como “hemangiomas orais” no Serviço
de Anatomia Patológica da disciplina de Patologia Oral do Departamento de
Odontologia (DOD) da Universidade Federal do Rio Grande do Norte (UFRN).

Reclassificar as anomalias vasculares orais como HIs orais a partir da
positividade para GLUT-1;

Reclassificar as anomalias vasculares orais imunonegativas para GLUT-1 em
GP, MV, HCRI ou HCNI, a partir de características clínicas e histopatológicas;

Correlacionar
a
variedade
de
diagnósticos
histopatológicos
dados
(hemangioma celular, capilar, lobular, capilar lobular e cavernoso) com a
nomenclatura estabelecida após a análise imunoistoquímica para GLUT-1 e
dados clínicos e histopatológicos;

Analisar a expressão imunoistoquímica de Ki-67nas amostras reclassificadas
como HI, GP e MV orais;

Analisar a expressão imunoistoquímica de Bcl-2 reclassificadas como HI, GP
e MV orais;

Verificar se há diferenças nos níveis de expressão do Ki-67 de acordo com a
positividade ou negatividade para GLUT-1 nas amostras analisadas;

Verificar se há diferenças nos níveis de expressão do Bcl-2 de acordo com a
positividade ou negatividade para GLUT-1 nas amostras analisadas;

Verificar se há correlações entre os índices de positividade para o Ki-67Bcl-2
nas amostras de HIs, GPs e MVs orais.
63
METODOLOGIA
64
4 METODOLOGIA
4.1 CONSIDERAÇÕES ÉTICAS
Antes da coleta de dados para a realização da pesquisa, este projeto foi
enviado para a apreciação do Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da UFRN, de
acordo com a resolução 196/96 do Conselho Nacional de Saúde (CNS). Após a
aprovação, com emissão de parecer nº 309.526 (Anexo 1), os dados começaram a
ser coletados. O presente trabalho foi executado a partir de espécimes teciduais,
emblocados em parafina, pertencentes ao arquivo do Serviço de Anatomia
Patológica da Disciplina de Patologia Oral do Departamento de Odontologia da
UFRN.
Diante disso, não houve, portanto, exposição dos pacientes portadores das
lesões que foram removidas com intuito terapêutico e não para fins da pesquisa.
Tentamos contato para em um segundo momento obtermos o termo de
consentimento livre e esclarecido dos pacientes (Apêndice 1).
4.2 CARACTERIZAÇÃO DO ESTUDO:
Este experimento caracteriza-se como um estudo descritivo, constituído pela
observação, análise, quantificação e registro da marcação imunoistoquímica das
células pelos anticorpos anti-GLUT-1, anti-Ki-67 e anti-Bcl-2 em uma série de casos
de anomalias vasculares previamente selecionadas. Constitui-se também de uma
avaliação comparativa entre HI, GP e MV a partir da imunomarcação por esses
anticorpos.
4.3 POPULAÇÃO
O banco de registro de espécimes diagnosticados no Serviço de Anatomia
Patológica da disciplina de Patologia Oral do DOD da UFRN no período de 1970 a
2013 foi revisado. Dentro dos 12300 casos registrados, foi retirada a população
objeto deste estudo, constituída por todos os 109 casos diagnosticados como
“hemangiomas orais”.
65
4.4 AMOSTRA
4.4.1 Caracterização da amostra
A amostra envolvida na pesquisa foi composta pelos 77 casos diagnosticados
histologicamente como “hemangiomas orais” no período determinado e que
obedeciam aos critérios de inclusão. Foram coletados dados referentes às
informações clínicas desses pacientes (sexo, idade, raça, localização e tempo de
evolução da lesão) e anotados em elaboradas para esta pesquisa (Apêndice 2).
4.4.2 Critérios de inclusão

Espécimes diagnosticados como hemangiomas orais e suas respectivas
classificações (capilar, lobular, celular, infantil, da infância, juvenil, cavernoso);

Espécimes cujos blocos parafinados apresentavam condições de corte em
micrótomo e com material biológico suficiente e significativo para estudo
imunoistoquímico.
4.4.3 Critérios de exclusão

Espécimes que foram diagnosticados apresentando, além do “hemangioma”,
outra lesão associada (por exemplo, “hemangioma associado a linfangioma”);

Espécimes que foram submetidos previamente à terapia esclerosante.
4.5 COLETA DE DADOS
Foi realizada a análise da expressão imunoistoquímica de GLUT-1, em
seguida feita uma nova análise morfológica para fins diagnósticos e, finalmente, a
análise do perfil imunoistoquímico do Ki-67 e Bcl-2.
4.6 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO (GLUT-1)
A partir dos blocos parafinados, cortes histológicos de 3µm de espessura
foram obtidos para o estudo. Em seguida, estendidos em lâminas de vidro
66
previamente limpas e preparadas com adesivo à base de 3-aminipropiltrietoxysilano, utilizando o anticorpo primário anti-GLUT-1, de acordo com as especificações
do quadro:
Quadro 1-Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação do
anticorpo primário anti-GLUT-1.
Especificidade
GLUT-1 (SLC2A1)
Fabricante Diluição Recuperação Antigênica Incubação
Gene Tex
1:400
Citrato pH 6,0, Pascal, 3'
60min
A técnica de coloração pela imunoistoquímica procedeu-se da seguinte
maneira:

Desparafinização em dois banhos de xilol:
- Xilol 1 (10 minutos) – temperatura ambiente (TA);
- Xilol 2 (10 minutos) – temperatura ambiente (TA);

Re-hidratação em cadeia descendente de etanóis:
- Etanol I absoluto (5 minutos) – TA;
- Etanol II (5 minutos) – TA;
- Etanol III (5 minutos) – TA;
- Etanol 95° (5 minutos) – TA;
- Etanol 80° (5 minutos) – TA;

Remoção do pigmento formólico com Hidróxido de amônia a 10% em Etanol
95° (10 minutos) – TA;

Lavagem do material em água corrente (10 minutos);

Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);

Recuperação antigênica de acordo com as especificações sugeridas pelo
fabricante de cada anticorpo;

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);

Duas incubações dos cortes, pelo período de 10 minutos cada, em solução de
peróxido de hidrogênio 10 volumes, em uma proporção de 1/1 para bloqueio
da peroxidase endógena tecidual;
67

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);

Incubação em solução de TRIS-HCL – pH 7,4 – (tris-hidroxi-metilaminometano, Sigma Chemical CO. USA) – 2 trocas (5 minutos cada);

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);

Incubação dos cortes com os anticorpos primários diluídos, em preparado
com albumina bovina (BSA) a 1%;

Duas passagens em solução de Tween 20 a 1% em TRIS-HCL pH 7,4 por 5
minutos cada;

Lavagem e incubação em TRIS-HCL pH 7,4, duas trocas (5 minutos cada);

Incubação do anticorpo secundário (diluição 1:200) durante 30 minutos – TA;

Lavagem em solução tampão TRIS-HCL pH 7,4 – duas trocas (5 minutos
cada);

Incubação com o complexo estreptoavidina-biotina HRP (DAKO, A/S,
Glostrup, Dinamarca) durante 30 minutos, à temperatura ambiente;

Lavagem com TRIS-HCL – duas trocas (5 minutos cada);

Revelação da solução cromógena de diaminobenzidina a 0,03% (3,3diaminobenzidina, Sigma Chemical CO. USA), diluída em 100 mL de TRISHCL e acrescida de 1,2 mL de peróxido de hidrogênio 10 volumes, aplicada
por um período de 3 minutos, em câmara escura;

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagem em água destilada;

Contracoloração com Hematoxilina de Mayer (10 minutos) – TA;

Lavagem em água corrente (10 minutos);

Passagem dupla em água destilada (5 minutos cada);

Desidratação em cadeia ascendente de etanóis:
- Etanol 80° (2 minutos) – TA;
- Etanol 95° (2 minutos) – TA;
- Etanol I absoluto (5 minutos) – TA;
- Etanol II absoluto (5 minutos) – TA;
- Etanol III absoluto (5 minutos) – TA;

Diafanização em dois banhos de xilol:
68
- Xilol 1 (2 minutos);
- Xilol 2 (2 minutos);

Montagem da lamínula em resina permount® (Fischer Scientific, USA) para a
observação em microscopia de luz.
4.7 ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUÍMICO (GLUT-1)
Foi realizada uma análise, por dois observadores, previamente calibrados, em
momentos diferentes através de um microscópio óptico (Olympus CH30, Olympus
Japan Co., Tokyo, Japão)em um aumento final de 400x. Os achados foram anotados
em uma ficha para posterior análise dos resultados (Apêndice 3). Em casos de
discordância entre os avaliadores, o espécime foi revisto até que houvesse o
consenso.
Foi utilizado como controle positivo interno eritrócitos evidentes no interior de
vasos, além de eritrócitos extravasados e epineuro, e como controle negativo o
anticorpo foi substituído por albumina de soro bovino a 1% (BSA - bovine serum
albumin).
Levando em consideração que o GLUT-1 é um marcador sensível e
específico para HI, alterações na classificação, tendo em base o proposto pelo
ISSVA em 1996, foram feitas.
Foram consideradas como HI verdadeiros as lesões em que as células
endoteliais limitantes dos vasos sanguíneos apresentaram imunomarcação positiva
para GLUT-1, mostrando coloração amarronzada dessas células, independente da
sua intensidade de marcação.
As amostras GLUT-1 negativas foram então reclassificadas como HCRI,
HCNI, GP ou MV de acordo com seu padrão morfológico através de critérios préestabelecidos.
4.8 ESTUDO MORFOLÓGICO
A partir dos fragmentos das amostras GLUT-1 negativas incluídos em
parafina, foram obtidos cortes histológicos de 5µm de espessura que foram
submetidos à coloração pela técnica de rotina da Hematoxilina e Eosina (HE),
descrita a seguir:
69

Xilol I (15 minutos);

Xilol II (15 minutos);

Álcool absoluto (3 minutos);

Álcool 95º GL (3minutos);

Álcool 70º GL (3minutos);

Água corrente (5 minutos);

Hematoxilina de Harris (5minutos);

Água corrente (5 minutos);

Rápida raspagem em solução de álcool – ácido a 1%;

Água corrente (5 minutos);

Eosina de Lison (2 minutos);

Álcool 70º GL (3minutos);

Álcool 95º GL (3minutos);

Álcool absoluto (3 minutos);

Xilol I (3 minutos);

Xilol II (3 minutos);

Xilol III (3 minutos);

Montagem da lamínula contra a lâmina com Permount.
4.9 ANÁLISE DO PERFIL MORFOLÓGICO
Após a obtenção das lâminas coradas em HE, realizou-se a análise
morfológica dos tecidos, por dois observadores, previamente calibrados, em
momentos diferentes através de um microscópio óptico (Olympus CH30, Olympus
Japan Co., Tokyo, Japão) em um aumento final de 400x.Tendo como base a
literatura vigente, as lesões foram então reclassificadas obedecendo a alguns
critérios(Quadro 2) e os dados então anotados em fichas apropriadas (Apêndice 4).
70
Quadro 2- Critérios histopatológicos para o diagnóstico das lesões vasculares.
Tipo de anomalia
Características morfológicas

Grandes
lóbulos
de
pequenos
vasos
sanguíneos limitados por tecido fibroso;
*Hemangioma congênito

Células endoteliais achatadas;
rapidamente involutivo

Grande vaso estrelado no centro dos lóbulos;

Áreas de fibrose;

Calcificações focais;

Lóbulos de tamanho variável constituídos de
pequenos vasos;
*Hemangioma congênito não
involutivo
Granuloma piogênico

Grandes vasos extralobulares;

Células endoteliais com formato ovoide;

Agregados lobulares de células endoteliais;

Células endoteliais em proliferação;

Numerosos vasos sanguíneos capilares;

Presença de infiltrado inflamatório misto de
moderado a intenso;

Membrana fibinopurulenta;

Áreas de ulceração e necrose.

Vasos sanguíneos tortuosos limitados por
endotélio maduro e achatado;
Malformação vascular

Ectasia vascular;

Infiltrado inflamatório escasso ou inexistente;

Agregados de células endoteliais jovens e em
proliferação escasso ou ausente.
Fonte: Enjolras e Mulliken (1997), North et al. (2000), North et al. (2001a e b), Mo et al. (2004), LeonVillapalos et al. (2005),Mulliken eEnjolras(2004), Nguyen et al. (2004) e Enjolras, Wassef e Chapot,
(2013).
*Necessidade de recorrer à ficha clínica para verificar idade do paciente e tempo de evolução da
lesão.
Após a reclassificação das lesões em HI, GP e MV, pelos dois avaliadores, foi
verificado o nível de concordância intraexaminadores através do cálculo do
coeficiente Kappa. Além disso, foi realizada a comparação desses novos
71
diagnósticos com os diagnósticos histológicos dados inicialmente (hemangioma
capilar, lobular, celular, cavernoso, etc) na tentativa de avaliar se algum dos subtipos
antes
utilizados
correspondia
a
algum
diagnóstico
definitivo
a
partir
da
imunoexpressão do GLUT-1 e das características histopatológicas (Apêndice 5).
4.10 ESTUDO IMUNOISTOQUÍMICO (Ki-67 e Bcl-2)
Seguiram
para
uma
nova
etapa
imunoistoquímica
os
espécimes
reclassificados em HI, GP ou MV seguindo a proporção 1:1:1 de acordo com o tipo
de lesão que apresentou menor quantidade de exemplares. A determinação foi feita
de forma intencional sendo selecionadas as lesões que, segundo os avaliadores,
demonstraram mais características inerentes ao tipo de anomalia.
A partir dos blocos de parafina, cortes histológicos de 3µm de espessura
foram obtidos para esta etapa do estudo. Em seguida, estendidos em lâminas de
vidro previamente limpas e preparadas com adesivo à base de 3-aminipropiltrietoxysilano, usando os anticorpos primários anti-Ki-67 e anti-Bcl-2, de acordo com as
especificações do quadro 3:
Quadro 3-Especificidade, fabricante, diluição, recuperação antigênica e tempo de incubação dos
anticorpos primários anti-Ki-67 e anti-Bcl-2.
Especificidade Fabricante Diluição
Recuperação Antigênica
Ki-67 (MIB-1)
Dako
1:200
Tris/EDTA pH 9,0, Pascal, 3'
Bcl-2 (124)
Dako
1:50
Citrato pH 6,0, Pascal, 3'
Incubação
18h
(overnight)
18h (overnight)
72
4.11 ANÁLISE DO PERFIL IMUNOISTOQUÍMICO(Ki-67 e Bcl-2)
4.11.1 Ki-67
Os
espécimes
foram
escaneados
pelo
Scanner
Panoramic
MIDI
(3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str.Budapest, Hungary, H-1121) e as
imagens obtidas foram observadas através do programa de visualização Panoramic
Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft.29-33, Konkoly-Thege M. str.Budapest, Hungary,
H-1121). Com o auxílio desse programa foi possível observar toda a extensão do
espécime, onde identificamos a região da lâmina que apresentava maior número de
células endoteliais com imunomarcação para este marcador. Uma vez encontrada
essa área, a imagem foi aumentada em 40x, de acordo com as especificações do
programa, onde foram fotografados dez campos consecutivos de cada caso com o
auxílio do mesmo programa de visualização anteriormente citado. Em lesões
ulceradas, estas áreas foram evitadas.
Com auxílio do programa Imaging Processing and Analysis in Java (ImageJ®,
National Institute of Mental Health, Bethesda, Maryland, USA) foi realizada então
uma análise quantitativa da imunomarcação para o Ki-67. O estudo foi do tipo duplocego onde o examinador não tinha acesso aos diagnósticos dados previamente. A
contagem das células positivas e negativas foi feita por um único avaliador
previamente calibrado até que fosse atingida a quantidade de 1000 células
endoteliais, fazendo-se uso de uma adaptação do método de contagem utilizado por
Sarmento et al. (2013), com isso possibilitou-se uma comparação entre os dados
das lesões com maior fidedignidade, uma vez que, independente da lesão avaliada,
o valor das células total era o mesmo.
Diante da dificuldade de obter, ao término da contagem, o número exato de
1000 células, optou-se por fazer a contagem das células até o último campo em que
a contagem total fornecesse um número de células contadas inferior a 1000. Então,
era realizada uma proporção das células positivas e negativas encontradas em
relação às células requeridas para obtenção do total final de 1000 células. Para a
obtenção do número requerido de células positivas para completar o número total de
células contadas foi realizada a seguinte equação:
73
A= B x C
D
A = número de células positivas requeridas
B = número de células positivas do último campo contado
C = 1000 – número total de células contadas até o último campo
D = número total de células do último campo
Para a obtenção do número requerido de células negativas (E) para completar
o número total de células contadas foi realizada a seguinte equação:
E= C – A
A partir deste montante, foi retirada a porcentagem de células positivas e
negativas os dados anotados em fichas apropriadas (Apêndice 6).Foi utilizada, como
controle interno positivo, a camada basal do epitélio que revestia as lesões e como
controle negativo o anticorpo foi substituído por albumina de soro bovino a 1% (BSA
- bovine serum albumin).
4.11.2 Bcl-2
Toda a área do espécime foi verificada por dois examinadores previamente
calibrados, em momentos diferentes através de um microscópio óptico (Olympus
CH30, Olympus Japan Co., Tokyo, Japão) em um aumento final de 100x, que
realizaram uma análise semiquantitava atribuindo os seguintes escores, fazendo-se
uso de uma adaptação do que foi utilizado no estudo de Meijer-Jorna et al. (2012):

0 a 5% - escore 0;

6 a 50% - escore 1;

51 a 100% - escore 2.
O estudo foi do tipo duplo-cego onde os examinadores não tinham acesso
aos diagnósticos dados previamente. Os escores obtidos por cada avaliador para
cada caso foram anotados em fichas apropriadas (Apêndice 7) e, em seguida
comparados. Em eventuais desacordos, o espécime foi revisto e os critérios foram
discutidos até que os avaliadores chegassem ao consenso.
74
Foram utilizados como controle positivo externo, casos de hiperplasia linfoide
e como controle negativo o anticorpo foi substituído por albumina de soro bovino a
1% (BSA - bovine serum albumin).
4.12 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados obtidos com a análise imunoistoquímica foram digitados em
planilha eletrônica Excel (Microsoft Office 2007®) e posteriormente exportados para
o programa Statistical Package for the Social Sciences (versão 17.0; SPSS Inc.,
Chicago, IL, USA), no qual foram realizadas as análises estatísticas.
Os dados obtidos com a avaliação dos índices de positividade para o Ki-67,
variável quantitativa discreta, foram submetidos ao teste de Kolmogorov-Smirnov,
com o intuito de observar o tipo de distribuição dos mesmos em cada um dos
grupos. Como os dados não apresentaram distribuição normal, a comparação das
medianas dos índices de positividade para o Ki-67 entre HIs, GPs e MVs foi
realizada por meio do teste não paramétrico de Kruskal-Wallis. Em relação aos
escores de imunopositividade para Bcl-2, variável categórica ordinal, a comparação
das medianas entre HIs, GPs e MVs foi realizada por meio do teste não paramétrico
de Kruskal-Wallis. Em cada um dos grupos, o teste de correlação de Spearman foi
utilizado para analisar possíveis correlações entre os índices de positividade para o
Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2.
Para todos os testes estatísticos utilizados no presente estudo, o nível de
significância foi estabelecido em 5% (p < 0,05).
75
RESULTADOS
76
5 RESULTADOS
Dos 109 casos diagnosticados inicialmente como “hemangiomas orais” e suas
respectivas classificações, apenas 77(70,64%) obedeciam aos critérios de inclusão
e exclusão e foram selecionados para compor a amostra do estudo.
5.1 ANÁLISE MORFOLÓGICA E DA IMUNOEXPRESSÃO DA GLUT-1
A análise da imunoexpressão de GLUT-1 revelou positividade em 26 (33,8%)
dos 77 casos estudados (Tabela 1). Com base na imunoexpressão dessa proteína e
após a realização das análises morfológicas, do total de casos analisados, 26
(33,8%) foram reclassificados como HIs, 20 (26,0%) como GPs e 31 (40,2%) como
MVsorais (Tabela 2)(Figura 2A, 2B e 2C) (Figura 3A, 3B e 3C).
Tabela 1- Distribuição absoluta e relativa dos casos de “hemangiomas orais” de acordo com
aimunoexpressão de GLUT-1. Natal – RN, 2014.
Imunoexpressão de GLUT-1
Grupo
Hemangioma oral
Positivo
Negativo
n (%)
n (%)
26 (33,8)
51 (66,2)
Total
n (%)
77 (100,0)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Tabela 2- Distribuição absoluta e relativa dos casos de “hemangiomas orais” de acordo com os
diagnósticos obtidos após as análises da imunoexpressão de GLUT-1 e dos achados morfológicos.
Natal – RN, 2014.
Diagnóstico final
Grupo
Hemangioma oral
HI
GP
MV
n (%)
n (%)
n (%)
26 (33,8)
20 (26,0)
31 (40,2)
Total
n (%)
77 (100,0)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Legenda: HI – Hemangioma da infância; GP – Granuloma piogênico; MV – Malformação vascular.
Ao serem relacionados os diagnósticos histopatológicos iniciais com os
diagnósticos obtidos após as análises da imunoexpressão de GLUT-1 e dos
achados morfológicos, foi observado que a maioria dos hemangiomas cavernosos (n
= 16; 88,8%) foram reclassificados como MVs orais. Por sua vez, a maioria dos
hemangiomas capilares (n = 9; 56,2%) foram reclassificados como GPs orais. Por
outro lado, foi observada maior frequência de casos reclassificados como HIs
77
oraisno grupo das lesões diagnosticadas inicialmente como hemangiomas (n = 19;
47,5%) (Tabela 3).
Tabela 3- Distribuição absoluta e relativa dos casos de acordo com o diagnóstico histopatológico
inicial e os diagnósticos obtidos após as análises da imunoexpressão de GLUT-1 e dos achados
morfológicos. Natal – RN, 2014.
Diagnóstico final
Diagnóstico inicial
Total
HI
GP
MV
n (%)
n (%)
n (%)
Hemangioma
19 (47,5)
8 (20,0)
13 (32,5)
40 (100,0)
Hemangioma capilar
5 (31,3)
9 (56,2)
2 (12,5)
16 (100,0)
Hemangioma celular
1 (33,3)
2 (66,7)
0 (0,0)
3 (100,0)
Hemangioma cavernoso
1 (5,6)
1 (5,6)
16 (88,8)
18 (100,0)
n (%)
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Legenda: HI – Hemangioma; GP – Granuloma piogênico; MV – Malformação vascular.
Para avaliar o nível de concordância entre os diagnósticos estabelecidos
pelos dois examinadores (HI, GP ou MV oral), após a realização das análises da
imunoexpressão de GLUT-1 e dos achados morfológicos, foi calculado o coeficiente
Kappa. O valor obtido foi de 0,921, considerado excelente.
Com finalidade de analisar os dos demais marcadores, foram selecionados
casos de cada grupo na proporção 1:1:1 de acordo com o que apresentasse menor
número de casos. O grupo com o menor número de casos foi o dos GPs,
apresentando 20 casos (26%) (Tabela 2). A escolha dos casos dos grupos
remanescentes que seguiram para as etapas seguintes do estudo foi realizada de
forma intencional que, de acordo com os avaliadores, demonstravam mais
características inerentes ao tipo de anomalia.
5.2 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DO KI-67
A análise da imunoexpressão do Ki-67 revelou (Figura 4), para o grupo dos
HIs, índices de positividade que variaram de 4,00% a 68,70%, com mediana de
13,85%. No grupo dos GPs, os índices de positividade variaram de 6,60% a 90,80%,
com mediana de 33,7%. Por sua vez, para as MVs, foram observados índices de
positividade que variaram de 1,40% a 23,80%, com mediana de 4,55%. O teste nãoparamétrico de Kruskal-Wallis revelou diferença estatisticamente significativa entre
78
as medianas de imunopositividade para o Ki-67 entre os grupos, com as MVs
exibindo menor mediana em comparação com os GPs E HIs, respectivamente. Por
sua vez, os GPs revelaram maior mediana de imunopositividade para o Ki-67 em
relação aos HIs orais (p< 0,001) (TABELA 4) (GRÁFICO 1).
Tabela 4- Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos,
estatística KW e significância estatística (p) para os índices de positividade para o Ki-67 em relação
ao grupos. Natal – RN, 2014.
Grupos
N
Mediana
Q25-Q75
Média dos postos
KW
P
HI
20
13,85
6,55 – 19,97
29,60
28,807
<0,001
GP
20
33,70
25,20 – 50,65
45,75
MV
20
4,55
2,62 – 11,02
16,15
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Legenda: HI – Hemangioma da infância; GP – Granuloma piogênico; MV – Malformação vascular.
Gráfico 1- Box-plot relativo aos índices de positividade para o Ki-67 de acordo com os grupos. Natal –
RN, 2014.
5.3 ANÁLISE DA IMUNOEXPRESSÃO DA Bcl-2
A análise da imunoexpressão daBcl-2 revelou (Figura 5), para o grupo dos
HIs, distribuição relativamente similar dos casos nos escores 0 (n = 7; 35,0%), 1 (n =
6; 30,0%) e 2 (n = 7; 35,0%). No grupo dos GPs, a maioria dos casos foi classificada
como escore 2 (n = 10; 50,0%), com frequências menores para os escores 1 (n = 7;
35,0%) e 0 (n = 3; 15,0%). No grupo das MVs, constatou-se maior frequência do
escore 0 (n = 16; 80,0%), seguido dos escores 1 (n = 3; 15,0%) e 2 (n = 1; 5,0%). O
teste
não-paramétrico
de
Kruskal-Wallis
revelou
diferença
estatisticamente
79
significativa nos escores de imunopositividade para o Bcl-2 entre os grupos
analisados, com as MVs exibindo mediana inferior em comparação com os GPs e
HIs orais (p< 0,001) (Tabela 5) (Gráfico 2).
Tabela 5- Tamanho da amostra, mediana, quartis 25 e 75, média dos postos, soma dos postos,
estatística KW e significância estatística (p) para os escores de imunopositividade para o Bcl-2 em
relação aos grupos. Natal – RN, 2014.
Média dos
Grupos
N
Mediana
Q25-Q75
HI
20
1,00
0,00 – 2,00
33,10
GP
20
1,50
1,00 – 2,00
39,85
MV
20
0,00
0,00 – 0,00
18,55
postos
KW
P
17,803
<0,001
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
Legenda: HI – Hemangioma da infância; GP – Granuloma piogênico; MV – Malformação vascular.
Gráfico 2- Box-plot relativo aos escores de imunopositividade para o Bcl-2 de acordo com os grupos.
Natal – RN, 2014.
5.4 CORRELAÇÃO DAS IMUNOEXPRESSÕES DE Ki-67 E Bcl-2
Foram analisadas possíveis correlações entre os índices de positividade para
o Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2. Para todos os grupos, o teste de
correlação de Spearman revelou não existir correlação estatisticamente significativa
entre os índices de positividade e os escores de imunoexpressão das proteínas
avaliadas (Tabela 6).
80
Tabela 6- Tamanho da amostra, valor estatístico para o coeficiente de correlação de Spearman (r) e
significância estatística (p) para os índices de positividade para o Ki-67 e os escores de
imunoexpressão de Bcl-2, de acordo com os grupos. Natal, RN – 2014.
Grupos
N
R
P
Granuloma piogênico
20
0,245
0,298
Hemangioma
20
- 0,021
0,931
Malformação vascular
20
0,292
0,212
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
81
Figura 2- Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão da GLUT-1 em GP (A), HI (B) e MV (C) Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H1121).
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
82
Figura 3- Fotomicrografia demonstrando as características histopatológicas (H/E) do GP (A), HI (B) e
MV (C) - Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest,
Hungary, H-1121).
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
83
Figura 4- Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão deKi-67 em GP (A), HI (B) e MV (C) Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H1121).
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
84
Figura 5- Fotomicrografia demonstrando a imunoexpressão deBcl-2 em GP (A), HI (B) e MV (C) Panoramic Viewer 1.15.2 (3DHISTECH® Kft. 29-33, Konkoly-Thege M. str. Budapest, Hungary, H1121).
Fonte: Programa de Pós-Graduação em Patologia Oral/ UFRN.
85
DISCUSSÃO
86
6 DISCUSSÃO
As anomalias vasculares são distúrbios da vasculogênese, angiogênese ou
linfangiogênese e estão entre as anormalidades pediátricas mais comuns, ocorrendo
em cerca de 1% das crianças (TASNADI, 1993). Iatrou et al. (2013) em seu estudo
realizaram um levantamento epidemiológico com lesões de crianças e adolescentes
gregos e verificaram que as anomalias vasculares eram as leões benignas de maior
prevalência, representando 22,1% dos casos. Apesar de sua elevada frequência,
uma falta de padronização permanece entre os clínicos e patologistas em relação à
sua terminologia. Uma mesma nomenclatura pode ser aplicada a diferentes
entidades e, por outro lado, a mesma lesão pode ser atribuída a diferentes
categorias por diferentes profissionais da saúde. Tal confusão terminológica pode
contribuir tanto para incoerências na gestão clínica dos pacientes portadores, quanto
para o surgimento de vieses em estudos nesta área (AL-ADNANI et al., 2006;
HASSANEIN et al., 2011;).
O entendimento e padronização das anomalias vasculares foi facilitado com a
classificação proposta por Enjolras, Wassef e Chapot, e aprovada em Roma, no XI
Workshop em Anomalias Vasculares, em 1996(ENJOLRAS; MULLIKEN, 1997;
ENJOLRAS; WASSEF; CHAPOT, 2013). Essa nova classificação é baseada no
comportamento biológico das anomalias, através de estudos sobre achados clínicos,
história natural e características celulares das lesões, dividindo-as em dois grupos:
tumores (lesões que crescem a partir da hiperplasia endotelial, como por exemplo,
HIs e GPs) e malformações vasculares (lesões que surgem a partir de falhas na
morfogênese vascular e exibem contagem normal de células endoteliais). Esta
divisão simples é clinicamente útil para o diagnóstico e prognóstico e auxilia na
decisão terapêutica (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS; 2000; HASSANEIN et al.,
2011).
Apesar de as anomalias vasculares estarem entre o grupo de lesões mais
comuns em infantes e neonatos (TUCCI et al., 2009), com maior frequência relativa
representada pelos hemangiomas (MULLIKEN; GLOWACKI,1982; BALLAH, et al.,
2011), dos 12300 casos diagnosticados e arquivados no Serviço, apenas 109 foram
diagnosticados como “hemangiomas orais”, representando 0,88% de todos os
casos. Alguns fatos podem justificar esse número diminuto de casos, tais como: a
real involução dos HIs, dispensando a necessidade de realização de biópsias
87
(TUCCI et al., 2009); a resolução total ou parcial dos casos com terapia esclerosante
(TUCCI et al., 2009); a crença de que se trata de uma marca de nascença comum
que não necessita de tratamento, mesmo quando da não involução total da lesão
(MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS, 2000; FEVURLY; FISHMAN, 2012) e o
tratamento inadequado para HCNI e MVs que são erroneamente diagnosticados
como HIs orais (TUCCI et al., 2009). Além disso, um grande número de CirurgiõesDentistas continua negligenciando algumas lesões, realizando o tratamento cirúrgico
sem o posterior encaminhamento do espécime para análise laboratorial.
Historicamente, uma grande variedade de termos tem sido utilizada para
descrever esse grupo de lesões, porém, infelizmente, um mesmo termo
(hemangioma) tem sido frequentemente utilizado para uma grande variedade de
anomalias vasculares, gerando confusões na confirmação do diagnóstico e
proposição de tratamento (MULLIKEN; FISHMAN; BURROWS; 2000; WERNER et
al., 2001; HASSANEIN et al., 2011).
O diagnóstico diferencial histológico entre as diferentes anomalias vasculares
observadas no estudo (HIs, GPs e MVs) pode ser difícil, uma vez que, o HI em sua
fase proliferativa e apresentando inflamação se assemelha muito com os casos de
GP orais. Por outro lado, na fase de involução, semelhanças histológicas com os
casos de MVs podem ser observadas. Assim sendo, a obtenção de informações
clínicas bem descritas e uma anamnese detalhada se faz bastante importante. Além
disso, a utilização de biomarcadores com finalidade de contribuir no diagnóstico
diferencial, assim como, a reclassificação dessas lesões, quando necessário, devem
ser realizadas (NORTH et al., 2000; FREITAS et al., 2005; LEON-VILLAPALOS et
al.,2005; JOHANN et al., 2007; SEO et al., 2009; BUCKMILLER, SUEN 2010;
VASCONCELOS et al., 2011).
Diante do conhecimento de que a GLUT-1 é específica para a identificação
dos HIs, no presente estudo a análise da imunoexpressão para tal marcador foi
realizada nos 77 casos obtidos, demonstrando que apenas 26 (33,8%) tratavam-se
de
HIs
verdadeiros
e,
para
os
51
(66,2%)
casos
que
apresentaram
imunonegatividade, houve a reclassificação em GPs e MVs, baseada em
características clínicas e histopatológicas pré estabelecidas nos estudos de Enjolras
e Mulliken (1997), North et al. (2000), North et al. (2001a e b), Berenque et al.
(2003), Mulliken e Enjolras (2004) e Enjolras, Wassef e Chapot, (2013).
88
Os achados do presente estudo não corroboram com os resultados
encontrados por North et al. (2001a e b), Li et al. (2003), Mo et al. (2004), Lyons et
al. (2004), Drut e Drut (2004), Nguyen et al. (2004), Song et al. (2011), Osaki et al.
(2013) e Intiteang et al. (2013), uma vez que nestes estudos, todos os casos de HIs
apresentaram imunopositividade para o antígeno GLUT-1, não apresentando
necessidade de reclassificação das lesões.
Embora quase 20 anos tenham se passado depois do estabelecimento da
classificação proposta pelo ISSVA, erros de nomenclatura ainda são recorrentes
(HASSANEIN et al., 2011). A identificação correta do tipo de anomalia vascular é
essencial, não apenas devido as suas características clínicas, radiográficas e
patológicas e sua morbidade, mas também devido seus tratamentos apresentarem
diferenças (HIRAKI; GOLDENBERG, 2010). O tratamento adequado se inicia com o
correto diagnóstico, uma vez que, um número significativo de pacientes portadores
de lesões vasculares recebe tratamento ineficaz e potencialmente lesivo em função
de diagnósticos errôneos (BURROWS et al., 1998).
Em virtude disso, no nosso estudo, fizemos uso da classificação atualmente
aceita pelo ISSVA utilizando uma série de casos diagnosticados histologicamente
como “hemangiomas orais” e verificou-se, diante da aplicação de análises
imunoistoquímica e morfológica a necessidade de reclassificação dos casos
analisados.
Dessa maneira, o nossa amostra foi redefinida como sendo composta de 26
(33,8%) casos de HI, 20 (26,0%) casos de GP e 31 (40,2%) casos de MV orais.
Essa necessidade de reclassificação das anomalias vasculares também foi
observada nos estudos de Dyduch et al. (2004), Johann et al. (2007), Srinivasan et
al. (2009), Patiño-Seijas et al. (2012) e Oliveira et al. (2014), devido ao fato de que
nem
todos
os
espécimes
diagnosticados
histopatologicamente
como
HIs
apresentavam imunopositividade para a proteína GLUT-1.
A designação do termo “hemangioma” para uma variada gama de anomalias
vasculares não é o único problema na hora de designar um nome para essas lesões.
Uma variedade de subclassificações e neologismos não parametrizados são
observados ainda na atualidade, dificultando a padronização da terminologia e, em
consequência o diagnóstico e tratamento.
De acordo com o estudo de Hiraki e Goldenberg (2010), a aplicação da
classificação proposta pelo ISSVA fez com que se tornasse possível um melhor
89
diálogo entre os profissionais e uniformização da nomenclatura das anomalias
vasculares entre clínicos, cirurgiões e patologias. A partir de então, o termo HI
passou a significar apenas um tumor vascular benigno, com as características
peculiares descritas anteriormente. Além disso, as antigas denominações de
“hemangiomas”
cavernoso,
tuberoso
e
capilar
são
agora
classificadas
e
denominadas como MVs artério-venosas, venosas e capilares, respectivamente.
Almaraz et al. (2010) destaca em seu estudo que fica claro que depois da
padronização proposta pela classificação do ISSVA, termos como “angioma em
morango” se tratam, na verdade de HI, um “hemangioma plano” é realmente uma
malformação vascular capilar e “hemangioma cavernoso” é uma malformação
venosa. Da mesma forma, foram categorizadas novas entidades diferentes dos HIs,
como os HCNI, os HCRI e os hemangioendoteliomas kaposiformes.
No estudo realizado por Lowe et al. (2012), os autores observaram que
variadas nomenclaturas eram utilizadas de forma errônea no passado, tais como:
“hemangioma capilar” (de quaisquer órgãos), “hemangioendotelioma infantil do
fígado”, “hemangiomas cavernosos” (de quaisquer órgãos), “hemangioma hepático
do adulto”, “hemangioma vertebral do adulto” e “hemangioma cavernoso orbital do
adulto”. Quando da comparação dessas lesões assim nomeadas com o que foi
proposto pelo ISSVA em 1996, os autores observaram que: os “hemangiomas
capilares” e os “hemangioendoteliomas infantis do fígado” tratam-se, na verdade de
HIs e que as outras entidades anteriormente citadas tratam-se, na verdade, de
malformações vasculares.
No nosso estudo, também observamos uma variedade de nomenclaturas e
subclassificações para os hemangiomas orais. Do total de 77 casos analisados, 40
(51,94%) receberam o nome de “hemangioma”, 16 (20,77%) de “hamangioma
capilar”, 3 (3,89%) de “hemangioma celular” e 18 (23,37%) de “hemangioma
cavernoso”. Tal fato pode ser justificado pelo fato de que parte das amostras
coletadas foram biopsiadas e analisadas entre 1970 e 1996, antes do surgimento da
classificação do ISSVA e reforça a necessidade dos centros de estudo
anatomopatológicos reavaliarem os casos de anomalias vasculares e realizar a
reclassificação.
Dentre
histopatológica
os
casos
como
diagnosticados
“hemangiomas”,
inicialmente
apenas
47,5%
por
meio
da
tratavam-se
análise
de
HIs
verdadeiros. A maioria (56,2%) dos casos diagnosticados como “hemangioma
90
capilar” tratavam-se, na verdade de GPs, refletindo o conceito de estudos realizado
antes (ITAWA et al., 1996) e depois (MULLIKEN, FISHMAN, BURROWS, 2000) da
classificação do ISSVA de que o termo “hemangioma capilar lobular” pode ser
utilizado, para os GPs, como sinônimo. Dos 3 casos designados como “hemangioma
celular”, 2 deles tratavam-se de GPs e um de HI, isso pode ser justificado pela
intensa celularidade e proliferação endotelial dos GPs e dos HIs em sua fase
evolutiva. Ademais, a grande maioria (88,8%) dos casos designados como
“hemangiomas cavernosos” tratavam-se, na verdade, de MVs corroborando com as
informações encontradas nos estudos de Hiraki e Goldenberg (2010), Almaraz et al.
(2010), Lowe et al. (2012) e Osaki et al.(2013).
Tendo em mãos dados clínicos referentes às lesões analisadas não foi
verificada a necessidade da reclassificação de nenhum dos casos em HCNI ou
HCRI. Assim sendo, o presente estudo sugere que os achados histopatológicos
sozinhos não são suficientes para definir o correto diagnóstico de HIs e que uma
apurada investigação clínica e uso de biomarcadores, como a GLUT-1, são
essenciais no auxílio da investigação diagnóstica.
É sabido que o comportamento biológico de qualquer lesão é altamente
dependente do equilíbrio entre os níveis de proliferação e morte celular, e, que
alguns marcadores imunoistoquímicos podem auxiliar na identificação da dimensão
desses aspectos. Diante disso, o presente estudo se propôs a verificar e
correlacionar, através do teste de correlação de Spearman, a expressão
imunoistoquímica dos antígenos Ki-67 e Bcl-2 em uma parcela dos casos
reclassificados como HIs, GPs e MVs orais, na tentativa de verificar se a atividade
proliferativa e expressão de marcadores de apoptose estão relacionadas com as
diferenças no comportamento biológico destas três lesões.
O antígeno Ki-67 é utilizado em estudos imunoistoquímicos como um
marcador indicador de atividade mitótica e potencial crescimento (OSAKI et al.,
2013). No presente estudo, através de uma análise quantitativa, foi observado que,
em ordem decrescente, o grupo que apresentou maiores índices de positividade foi
o dos GPs (mediana 33,70), seguidos dos HIs (mediana 13,85) e MVs (mediana
4,55), respectivamente, demonstrando diferença estatisticamente significante (p<
0,001).
Itawa et al. (1996), em seu estudo, compararam as taxas de proliferação em
casos de “hemangioma capilar infantil” (HI) e “hemangioma capilar lobular” (GP). Os
91
autores observaram que as taxas proliferativas de ambos os tumores eram bastante
elevadas, refletindo seu rápido crescimento, contudo, de forma adversa ao presente
estudo, não foram observadas diferenças estatisticamente significantes.
Outro estudo (NORTH et al., 2000) verificou que não havia uma correlação
entre a positividade para o antígeno GLUT-1 e os níveis de imunopositividade para
Ki-67. Eles sugeriram, através da dupla marcação para GLUT-1/Ki-67 em casos de
HIs, GPs e tecidos de granulação, que a expressão da GLUT-1 é independente da
sua atividade mitótica, conceito posteriormente ratificado nos estudos de Dyduch et
al (2004) e Enjoras, Wassef e Chapot (2013). Esses resultados corroboram com o
presente estudo, uma vez que as amostras de GP, que não apresentam
imunopositividade para GLUT-1 exibiram níveis maiores de proliferação.
Nakamura (2000) verificaram os níveis de imunoexpressão de Ki-67 em GP,
“hemagiomas capilares”e de tecido de granulação. A expressão de KI-67 se
apresentou variável entre os casos de cada grupo e não foi observada nenhuma
diferença estatisticamente significante quando comparados os grupos, lançando-se
mão do teste tde Student e do teste t de Welch. Além disso, os autores sugeriram
que apesar de a atividade proliferativa vascular ser um importante fator no
desenvolvimento dessas lesões (GP e HI), ela pode ser diferente de acordo com o
estágio de desenvolvimento de cada lesão no momento da ressecção.
Dyduch et al. (2004) ao comparar a expressão de GLUT-1 e Ki-67 em casos
de HIs e GPs, verificaram que os níveis do segundo antígeno eram muito maiores
nos casos de GP do que de HIs, encontrando uma relação inversa da expressão
desses
marcadores,
mesmo
esses
resultados
não
sendo
estaticamente
significantes. Esses dados corroboram com o achado do presente estudo, quando
comparados apenas HIs e GPs, e esse aumento do potencial proliferativo dos GPs
pode ser justificado pela presença de um maior infiltrado inflamatório, contendo
células e liberando citocinas que induzem a proliferação celular.
O estudo de Osaki et al. (2013) sugere que há uma relação diretamente
proporcional entre a imunopositividade para GLUT-1 e os níveis de Ki-67, o que não
foi observado no presente estudo. Isso pode ser explicado pelo fato de que no
estudo desses autores foram utilizados apenas casos de HIs e MVs, onde realmente
podem ser observadas diferenças nos níveis de expressão de Ki-67 de acordo com
a imunopositivade para GLUT-1. No presente estudo também foi observado que os
níveis de Ki-67 nos HIs eram maiores do que nas MVs, entretanto, foram incluídos
92
na amostra casos de GPs, que também são imunonegativos para GLUT-1, porém
apresentaram níveis de marcação para o antígeno Ki-67 superiores, impossibilitando
o pensamento de que as anomalias vasculares GLUT-1 positivas são mais
proliferativas que as GLUT-1 negativas.
Apesar de as MVs serem consideradas um tipo de anomalia vascular sem a
presença de proliferação endotelial(KANG; SONG, 2008; FEVURLY; FISHMAN,
2012; CANDAMOURTY et al., 2012),no estudo de Meier-Jorna et al. (2006) foi
observada a presença de proliferação microvascular em 30% dos casos de MVs de
pele e tecidos moles estudados. Corroborando com tais achados, Meijer-Jorna et al.
(2012) demonstraram que áreas de vasos imaturos dentro das malformações
vasculares podem apresentar imunoexpressão estatisticamente significativa para o
Ki-67, sugerindo que essas áreas podem demonstrar o mesmo padrão de
proliferação celular e maturação que é observado em outras lesões vasculares de
pele e mucosa, como o GP e o HI, respectivamente. Dados semelhantes foram
encontrados no presente estudo, onde observamos, apesar de em menor
quantidade (variação de 1,40% a 23,80%, com mediana de 4,55%), células
endoteliais positivas para o antígeno Ki-67. Da mesma maneira, Osaki et al. (2013)
observaram positividade em células endoteliais de alguns casos de MVs orbitais
(≤1%), apesar de que em outras lesões não ter sido observado nenhum grau de
imunopositividade.
Tendo em vista o que foi demonstrado, sugerimos que as taxas de
proliferação, principalmente dos HIs e GPs, apresentam relevâncias para a
compreensão de aspectos importantes acerca do comportamento biológico dessas
anomalias. No entanto, não podemos inferir que os níveis proliferativos dessas
lesões e a imunopositividade para o antígeno GLUT-1 apresentam algum nível de
interdependência.
A proteína Bcl-2 é amplamente conhecida como uma proteína anti apoptótica
por agir impedindo a liberação do citocromo C, que é uma estrutura importante na
ativação da via proteolítica, regulada pela família das caspases, que culminaria na
morte celular (KUMAR; ABBAS; FAUSTO, 2010). Ademais, segundo Wu et al.
(1999), a redução dos níveis de apoptose pode favorecer o crescimento tumoral. No
presente estudo, onde foi avaliada a imunoexpressão da Bcl-2 através de uma
análise semiquantitativa, foi verificado que os maiores níveis de imunopositividade
estavam nos casos pertencentes ao grupo dos GPs, seguidos dos HIs, e os
93
menores níveis nos casos pertencentes ao grupo das MVs, apresentando diferença
estatisticamente significativa (p<<0,001).
Enquanto alguns estudos descrevem uma ausente ou fraca expressão de Bcl2 em GPs (ITAWA et al. 1996; FOREMAN et al., 1996), no presente estudo foi
observada imunopositividade considerável deste marcador para as células
endoteliais destes tumores, quando comparado com HIs e MVs, consequentemente
sugerindo que as proteínas da família Bcl-2, pelo menos em parte, tem contribuição
na supressão da apoptose nos casos de GP orais.
Itawa et al. (1996) em seu estudo, compararam as taxas de apoptose em
casos de “hemangioma capilar infantil” (HI) e “hemangioma capilar lobular” (GP). Os
autores fizeram uso do Kit de Detecção de Apoptose in situ (ApopTag) para medir o
índice de apoptose (AI) e observaram que o AI era estatisticamente significante
maior do nos HIs do que nos GPs (p<0,01). Em relação à proteína Bcl-2, de forma
adversa ao presente estudo, ambos os grupos se mostravam imunonegativos ou,
em apenas em um pequeno número de casos, fracamente positivos, sem diferenças
estatisticamente significantes entre os grupos. Os autores não conseguiram obter
nenhuma evidência da relação entre a proteína Bcl-2 e as taxas de apoptose.
Ademais, neste mesmo estudo, através da análise da imunoexpressão do Ki-67, os
autores observaram que as taxas proliferativas de ambos os tumores eram bastante
elevadas, refletindo seu rápido crescimento, no entanto, não foram observadas
diferenças estatisticamente significantes. O estudo demonstrou que a atividade
apoptótica é muito maior nos HIs do que nos GPs, sugerindo que a apoptose seria a
causa da involução espontâneadesta neoplasia.
Dyduch et al. (2004) em seu estudo também compararam a expressão
imunoistoquímica da proteína Bcl-2 em casos de “hemangioma capilar infantil”,
“hemangioma capilar lobular” e “hemangiomas epitelióides” da pele, No entanto, os
resultados acerca deste marcador não apresentaram significância estatística, de
forma contrária ao que foi demonstrado no presente estudo. Os autores observaram
que a expressão da proteína antiapoptótica Bcl-2 nas células endoteliais lesionais
dos HIs vai alterando de forma inversamente proporcional à evolução da lesão e que
seus níves se apresentam diminutos na fase involuída da lesão. Dessa maneira, os
autores sugerem que esta proteína está relacionada tanto na proliferação quanto na
morte celular programada dos casos de HI de pele.
94
Nakamura (2000) em seu estudo, analisaram a expressão de Bcl-2 e Bax,
duas proteínas reguladoras da apoptose, em casos de GP, “hemagiomas capilares”
e tecido de granulação. Em relação à proteína Bcl-2, não foram encontradas
diferenças estatisticamente significativas entre os grupos GP e hemangiomas
através do Teste Exato de Fisher, mas foi encontrado entre GP e tecido de
granulação. Os autores sugeriram que essa alta taxa de supressão da apoptose
demonstrada pelos altos níveis de imunoexpressão para Bcl-2 nos GPs pode estar
concatenada com o rápido crescimento desses tumores, o que pode ser reforçado
pelo conceito proposto por Wu et al. (1999), de que os baixos níveis de apoptose
podem favorecer o crescimento tumoral. Além disso, foram demonstrados resultados
inconclusivos em relação aos hemagiomas.
Em busca de possíveis correlações entre os índices de imunoexpressão do
Ki-67 e os escores de imunoexpressão de Bcl-2, no presente estudo realizado o
teste de correlação de Spearman, que, dentre todos os grupos, não revelou não
existir correlação estatisticamente significativa entre os índices de positividade e a
imunoexpressão das proteínas avaliadas (GP: p=0,298; HI: p=931 e MV: p=0,212).
No estudo de Itawa et al. (1996), eles utilizaram o teste não paramétrico de MannWhitney utilizando como variáveis a relação taxa de apoptose/imunoexpositividade
para Ki-67 e encontraram diferenças estatisticamente significativas (p<0,01) entre os
dois grupos analisados no estudo, que pode ser justificado pelo fato de que os
autores utilizaram o mesmo método de contagem celular para ambos os
marcadores.
No nosso estudo encontramos os menores níveis de imunoexpressão para a
proteína Bcl-2 nos casos pertencentes ao grupo das MVs (mediana dos escores
0,00), no entanto, foram encontradas dificuldades em obter estudos que avaliassem
a expressão dessa proteína nesse tipo de lesão. Outrossim, reforçamos a
necessidade de testes com a proteína GLUT-1 nos estudos semelhantes, visando
uma melhor padronização entre os estudos, para que seja possível estabelecer
relações mais fidedignas quando do estudo das anomalias vasculares para outros
marcadores.
Os resultados encontrados nesse estudo reforçam que as anomalias
vasculares alocadas em cada grupo demostram, de fato, comportamentos biológicos
diferentes, uma vez que foi encontrado maiores índices de proliferação e da proteína
95
supressora de apoptose nos GPs, seguido dos HIs e os menores níveis nos casos
de MVs orais, reforçando assim, a importância da distinção dessas lesões.
96
CONCLUSÕES
97
7 CONCLUSÕES
Tendo em vista os resultados deste estudo, podemos concluir que:

Os diferentes tipos de anomalias vasculares orais são lesões que podem
apresentar características clínicas e histopatológicas semelhantes, porém são
lesões distintas que devem ser classificadas de forma criteriosa;

Dianteda suspeita de que uma lesão trata-se de um caso de HI, devem-se
considerar GP e MV como diagnóstico diferencial;

A GLUT-1 é uma importante ferramenta na identificação dos HIs orais;

Apenas características histopatológicas não são suficientes para o correto
diagnóstico de HIs, GPs, e MV orais;

Neologismos e o uso de subclassificações que remetem características
puramente histológicas devem ser evitados quando da designação dos HIs,
GPs e MVs;

Os GPs apresentam os maiores índices proliferativos e de imunopositividade
para a proteína anti apoptótica Bcl-2, e as MVs os menores, dentre os grupos
de leões estudadas.

Os níveis de proliferação e de expressão da Bcl-2 independem da
imunopositvidade para a GLUT-1;

Mecanismos
de
proliferação
e
apoptose
estão
relacionados
ao
comportamento biológico das diferentes anomalias vasculares e auxiliam na
compreensão de questões pertinentes sobre os diferentes cursos clínicos das
lesões avaliadas.
98
REFERÊNCIAS
99
REFERÊNCIAS
ABRAMOWICZ, S.; PADWA, B. L. Vascular Anomalies in Children. Oral
Maxillofacial Surg Clin N Am, v. 24, n. , p.443-455, 2012.
AL-ADINANI et al. Histopathological reporting of paediatric cutaneous vascular
anomalies in relation to proposed multidisciplinary classification system.J Clin
Pathol., v.12, n. 59, p. 1278–1282, 2006.
AL-KHATEEB, T.; ABABNEB, K. Oral pyogenic granuloma in Jordanians: a
retrospective analysis of 108 cases. J. Oral Maxillofac. Surg., v. 61, p. 1285-1288,
2003.
BALLAH, D. et al. Vascular anomalies: what they are, how to diagnose them, and
how to treat them. Curr Probl Diagn Radiol., v. 6, n. 40, p. 233-247, 2011.
BAULAND, C. G. et al. The pathogenesis of hemangiomas: a review. Plast Reconstr
Surg, v. 117, n. 2, p.29-35, 2006.
BISCHOFF, J. Progenitor cells in infantile hemangioma. J Craniofac Surg., v. 20, p.
695-697, 2009.
BOLOGNA-MOLINA, R. et al. Comparison of the value of PCNA and Ki-67 as
markers of cell proliferation in ameloblastic tumors. Med Oral Patol Oral Cir Bucal,
AHEAD OF PRINT - ARTICLE IN PRESS, p.1-6, 2012.
BOYE, E. et al. Clonality and altered behavior of endothelial cells from
hemangiomas.J Clin Invest., v. 107, p. 745-752, 2001.
BOYE, E.; JINNIN, M.; OLSEN, B. R. Infantile hemangioma: challenges, new
insights, and therapeutic promise. J Craniofac Surg, v. 20, n. 1, p.678-684, 2009.
BROWNING et al. Congenital disseminated pyogenic granuloma. Pediatr Dermatol.,
v. 3, n, 26, p. 323-327, 2009.
BRUCKNER, A. L.; FRIEDEN, I. J. Hemangiomas of infancy. . J Am Acad Dermatol,
v. 48, n. 3, p.477-493, 2003.
BUCKMILLER, L.M.; RICHTER, G.T.; SUEN, J.Y. Diagnosis and management of
hemangiomas and vascular malformations of the head and neck.Oral Dis., v.16,
p.405-418, 2010.
BURROWS, P.E. et al. Diagnostic imaging in the evaluation of vascular
birthmarks.Dermatol Clin., v. 16, n. 3, p. 455-488, 1998.
CANDAMOURTY, R. et al. Low flow vascular malformation of the buccal mucosa
treated conservatively by sclerotherapy (3% sodium tetradecyl sulfate). J Nat Sci
Biol Med., v. 3, n. 2, p.195-198, 2012.
100
CARMELIET, P; JAIN, R. K. Angiogenesis in cancer and other diseases.Nature, v.
407, p. 249–257, 2000.
CHILLER, K. G.; PASSARO, D.; FRIEDEN, I. J. Hemangiomas of infancy: clinical
characteristics, morphologic subtypes, and their relationship to race, ethnicity, and
sex. Arch Dermatol, v. 138, n. 12, p.1567-1576, 2002.
CHRISTISON-LAGAY, E. R; FISHMAN, S. J. Vascular anomalies.Surg Clin North
Am., v. 86, p. 393-425, 2006.
COHEN, M. M. Vasculogenesis, angiogenesis, hemangiomas, and vascular
malformations. Am J Med Genet., v. 108, n. 4, p.265-274, 2002.
COLITTI, M. Bcl-2 family of proteins and mammary cellular fate. Anat Histol
Embryol., v. 41, n. 4, p.237-247, 2012.
CORNISH, S. K.; REDDY, A. R.The use of propranolol in the management of
periocular capillary haemangioma--a systematic review. Eye (lond)., v. 25, n. 10,
p.1277-1283, 2011.
DADRAS. S. S. et al. Infantile hemangiomas are arrested in an early developmental
vascular differentiation state. Mod Pathol.v. 9, n. 17, p. 1068-1079, 2004.
DROLET, B. A.; ESTERLY, N. B.; FRIEDEN, I. J. Hemangiomas in children. N Engl
J Med., v. 341, n. 3, p.173-181, 1999.
DYDUCH, G.; OKON, K.; MIERZYNSKI, W. Benign vascular proliferations – an
immunohistochemical and comparative study. Pol J Pathol., v.55, n.2, p.59-64, 2004.
ENJOLRAS, O.; MULLIKEN, J. B. Vascular tumors and vascular malformations (new
issues). Adv Dermatol, v. 13, n. , p.375-423, 1997.
ENJOLRAS, O.; WASSEF, M.; CHAPOT, R. Introduction: ISSVA classification.
Cambridge University Press. [Online] [Cited: 2013 19-02.]
http://assets.cambridge.org/97805218/48510/excerpt/9780521848510_excerpt.pdf.
ESMEILI, T.; LOZADA-NUR, F.; EPSTEIN, J. Common benign oral soft tissue
masses. Dent Clin North Am., v. 49, n. 1, p.223-240, 2005.
FARIAS, R. E.; SOUZA, A. R.; AARESTRUP, F. M. Assesment of apoptosis in breast
cancer: association with histological grade and prognostic factors. Revista Brasileira
de Cancerologia, v. 3, n. 51, p. 209-218, 2005.
FEVURLY, R. D.; FISHMAN, S. J. Vascular Anomalies in Pediatrics. Surg Clin N
Am, v. 92, n. , p.769-800, 2012.
FOLTYN, W. et al.The value of the Ki-67 proliferation marker as a prognostic factor in
gastroenteropancreatic neuroendocrine tumours.Endokrynol Pol., v. 63, n. 5, p.362366, 2012.
101
FOREMAN et al. Kaposi's sarcoma tumor cells preferentially express Bcl-xL. Am J
Pathol., v.3, n. 149, p.795-803, 1996.
FREITAS, T.M.C. et al. Assessment of angiogenic markers in oral hemangiomas and
pyogenic granulomas. Exp Mol Pathol., v.79, n.1, p.79-85, 2005.
FRIEDEN, I. J. et al. Guidelines of care for hemangiomas of infancy.American
Academy of Dermatology Guidelines/Outcomes Committee. J Am Acad Dermatol,
v. 37, n. 4, p.631-637, 1997.
FRIEDEN, I. J. et al. Infantile hemangiomas: current knowledge, future directions.
Proceedings of a research workshop on infantile hemangiomas, April 7-9, 2005,
Bethesda, Maryland, USA. Pediatr Dermato, v. 22, n. 5, p.383-406, 2005.
FRIEDEN, I. J. Management of hemangiomas. Special Symposium.Ped Dermatol,
v. 14, n. 1, p.57-83, 1997.
GARCIA, J. C. et al. Amino acid substitutions at tryptophan 388 and tryptophan 412
of the HepG2 (Glut1) glucose transporter inhibit transport activity and targeting to the
plasma membrane in Xenopus oocytes. J. Biol. Chem., v. 267, p. 7770-7776,1992.
GAMPPER, T. J.; MORGAN, R. F. Vascular anomalies: hemangiomas. Plast
Reconstr Surg, v. 110, n. 2, p.572-585, 2002.
GERDES, J. et al. Cell cycle analysis of a cell proliferation-associated human nuclear
antigen defined by the monoclonal antibody Ki-67. J Immunol., v. 133, n. 4, p.17101715, 1984.
GERDES, J. et al. Production of a mouse monoclonal antibody reactive with a human
nuclear antigen associated with cell proliferation. Int J Cancer., v. 31, n. 1, p.13-20,
1983.
GONTIJO, B.; SILVA, C. M. R.; PEREIRA, L. B. Hemangioma of infancy. An Bras
Dermatol, v. 78, n. 6, p.651-673, 2003.
GOODMAN-TOPPER, E. D.; BIMSTEIN, E.. Pyogenic granuloma as a cause of bone
loss in a twelve-year-old child: report of case. Int. J. Morphol, v. 61, n. 1, p.65-7,
1994.
HAND, J. L.; FRIEDEN, I. J. Vascular birthmarks of infancy: resolving nosologic
confusion. . Am J Med Genet, v. 108, n. 4, p.257-264, 2002.
HASSANEIN, A. H. et al. Evaluation of terminology for vascular anomalies in current
literature. Plast Reconstr Surg, v. 127, n. 1, p.347-351, 2011.
HIRAKI, P. Y.; GOLDENBERG, D. C. Diagnosis and treatment of infantile
hemangioma. Rev. Bras. Cir. Plást., v. 25, n. 2, p.388-397, 2010.
102
HIROTANI, M. et al. NH2-terminal BH4 domain of Bcl-2 is functional for
heterodimerization with Bax and inhibition of apoptosis. J Biol Chem., v. 274, n. 29,
p.20415-20420, 1999.
HOGAN, M. J; GJEDDE, A.; HAKIM, A. M. In vivo binding of nimodipine in the brain:
II. Binding kinetics in focal cerebral ischemia. V. 5, n. 11, p. 771-778, 1991.
INTITEANG et al. Mast cells in infantile haemangioma possess a primitive myeloid
phenotype. J Clin Pathol., v. 7, n. 66, p. 597-600, 2013.
IWATA, J. et al. High frequency of apoptosis in infantile capillary haemangioma. J
Pathol., v. 179, n. 4, p.403-408, 1996.
JACKSON, I. T. et al. Hemangiomas, vascular malformations, and lymphovenous
malformations: classification and methods of treatment. Plast Reconstr Surg., v. 91,
n. 7, p.1216-1230, 1993.
JAFARZADEH, H.; SANATKHANI, M.; MOHTASHAM, N. Oral pyogenic granuloma:
a review. J Oral Sci, v. 48, n. 4, p.167-175, 2006.
JOHANN, A.C.B.R. et al. GLUT-1 in oral benign vascular lesions.Oral Dis., v. 13, n.
1, p. 51-5, 2007.
JOOST, H. G. et al. Nomenclature of the GLUT/SLC2A family of Sugar/Polyol
transport facilitators. Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab., v. 282, p. 974-976, 2002.
JOOST, H. G.; THORENS, B. The extended GLUT-family of sugar/polyol transport
facilitators: nomenclature, sequence characteristics, and potential function of its
novel members (review). Mol. Membr. Biol., v. 18, p. 247-256, 2001.
KANG, G. C.; SONG, C. Forty-one cervicofacial vascular anomalies and their
surgical treatment--retrospection and review. Ann Acad Med Singapore, v. 37, n. 3,
p.165-179, 2008.
KAPLAN, P. et al. Malformations and minor anomalies in children whose mothers
had prenatal diagnosis: Comparison between CVS and amniocentesis. Am J Med
Genet, v. 37, n. 3, p.366-370, 1990.
KASANICK, M. A.; PILCH, P. F. Regulation of glucose-transporter function.Diabetes
Care, v. 13, p.219-227, 1990.
KERR, J. F. R.; WYLLIE, A. H.; CURRIET, A. R. Apoptosis: a basic biological
phenomenon with wideranging implications in tissue kinetics. Br. J. Cancer, v. 26, n.
4, p.239-257, 1972.
KIM, B. H. et al. Usefulness of Ki-67 (MIB-1) immunostaining in the diagnosis of
pulmonary sclerosing hemangiomas. Apmis, v. 121, n. 2, p.105-110, 2013.
KOHOUT, M. P. et al. Arteriovenous malformations of the head and neck: natural
history and management. Plast Reconstr Surg., v. 102, n. 3, p.643-654, 1998.
103
KROL, A.; MACARTHUR, C.J. Congenital hemangiomas: rapidly involuting and
noninvoluting congenital hemangiomas. Arch Facial Plast Surg.,v. 5, n. 7, p. 307311, 2005.
KUMAR,V.; ABBAS, A. K.; FAUSTO, N. Robbins & Cotran:Patologia -Bases
Patológicas das Doenças. 8ª Ed. Rio de Janeiro: Elsevier, 2010.
LEON-VILLAPALOS, J.; WOLFE, K.; KANGESU, L. GLUT-1: an extra diagnostic tool
to differentiate between haemangiomas and vascular malformations. Br J Plast
Surg., v. 58, n. 3, p.348-352, 2005.
LO, K.; MIHM, M.; FAY, A. Current theories on the pathogenesis of infantile
hemangioma. Semin Ophthalmol, v. 24, n. 3, p.172-177, 2009.
LOWE, L. H. et al. Vascular malformations: classification and terminology the
radiologist needs to know. Semin Roentgenol, v. 47, n. 2, p.106-117, 2012.
MACHADO, U. F.; SCHANN, B. D. ; SERAPHIM, P. M. Glucose transporters in the
metabolic syndrome. Arq Bras Endocrinol Metab., v. 50, n. 2, p. 177-189, 2006.
MALIK, M. A. et al. Effect of propranolol vs prednisolone vs propranolol with
prednisolone in the management of infantile hemangioma: A randomized controlled
study. Journal of Pediatric Surgery, v. 48, n. 12 , p. 2453-2459, 2013.
MARTINS-FILHO, P. R. S. et al. Aggressive Pregnancy Tumor (Pyogenic
Granuloma) with Extensive Alveolar Bone Loss Mimicking a Malignant Tumor: Case
Report and Review of Literature. Int. J. Morphol, v. 29, n. 1, p.164-167, 2011.
MEIJER-JORNA, L. B. et al. Proliferation and maturation of microvessels in
arteriovenous malformations--expression patterns of angiogenic and cell cycledependent factors. J Cutan Pathol., v. 39, n. 6, p.610-620, 2012.
MÉRINO, D. et al. The role of BH3-only protein Bim extends beyond inhibiting Bcl-2like prosurvival proteins. J Cell Biol., v. 186, n. 3, p.355-362, 2009.
METRY, D. W.; HEBERT, A. A. Benign cutaneous vascular tumors of infancy: when
to worry, what to do. Arch Dermatol., v. 136, n. 7, p.905-914, 2000.
MO, J. Q.; DIMASHKIEH, H. H.; BOVE, K. E. GLUT1 endothelial reactivity
distinguishes hepatic infantile hemangioma from congenital hepatic vascular
malformation with associated capillary proliferation. Human Pathol., v.35, n.2, p.
200-209, 2004.
MORI, H. et al. Substitution of tyrosine 293 of GLUT1 locks the transporter into an
outward facing conformation. J. Biol. Chem., v. 269, p.11578-83, 1994.
MULLIKEN, J. B.; ENJOLRAS, O. Congenital hemangiomas and infantile
hemangioma: Missing links. J Am Acad Dermatol, v. 50, n. 6, p.875-882, 2004.
104
MULLIKEN, J. B.; FISHMAN, S. J.; BURROWS, P. E. Vascular anomalies. Curr
Probl Surg, v. 37, n. 8, p.518-584, 2000.
MULLIKEN, J. B.; GLOWACKI, J. Hemangiomas and vascular malformations in
infants and children: a classification based on endothelial characteristics.Plast
Reconstr Surg, v. 69, n. 3, p.412-422, 1982.
MURAKAMI, M. et al. Expression of the anti-apoptotic factors Bcl-2 and survivin in
canine vascular tumours. J Comp Pathol., v. 39, n. 1, p.1-7, 2008.
MURAOKA, A. et al. Analysis of the structural features of the C-terminus of GLUT1
that are required for transport catalytic activity. Biochem.J., v. 311, p. 699-704,
1995.
NAKAMURA, T. Apoptosis and expression of Bax/Bcl-2 proteins in pyogenic
granuloma: a comparative study with granulation tissue and capillary hemangioma. J
Cutan Pathol., v. 27, n. 8, p.400-405, 2000.
NGUYEN, V. A. et al. Infantile hemangioma is a proliferation of beta 4-negative
endothelial cells adjacent to HLA-DR-positive cells with dendritic cell
morphology. Hum Pathol, v. 35, n. 6, p.739-744, 2004.
NÖR, J. E. et al. Up-Regulation of Bcl-2 in microvascular endothelial cells enhances
intratumoral angiogenesis and accelerates tumor growth. Cancer Res., v. 61, n. 5,
p.2183-2188, 2001.
NORTH, P. E. et al. A unique microvascular phenotype shared by juvenile
hemangiomas and human placenta.Arch Dermatol, v. 137, n. 5, p.559-570, 2001a.
NORTH, P. E. et al. Congenital nonprogressive hemangioma: a distinct
clinicopathologic entity unlike infantile hemangioma. Arch Dermatol.,v. 12, n. 137, p.
1607-1620, 2001b.
NORTH, P. E. et al. GLUT1: A newly discovered immunohistochemical marker for
juvenile hemangiomas.Hum Pathol, v. 31, n. 1, p.11-22, 2000.
NORTH, P. E. et al. Vascular tumors of infancy and childhood: Beyond capillary
hemangioma. Cardiovasc Pathol., v.15, p. 303-317, 2006.
OLIVEIRA, D. H. I. P. et al. Study of the etiopathogenesis and differential diagnosis
of oral vascular lesions by immunoexpression of GLUT-1 and HIF-1α. J Oral Pathol
Med., v. 43, p. 76-80, 2014.
OSAKI, T. H. et al. Immunohistochemical Investigations of Orbital Infantile
Hemangiomas and Adult Encapsulated Cavernous Venous Lesions (Malformation
Versus Hemangioma). Ophthal Plast Reconstr Surg., v. 29, n. 3, p. 183-195, 2013.
PALACIOS CJ, HERRERA CP, LUGO MV. La escleroterapia como una alternativa
en el tratamiento de los hemangiomas de los tejidos blandos de la cavidade bucal.
Acta Odontol Venez., v. 2, n. 38, p. 4-8, 2000.
105
PARIKH, K.; SHAH, P.; SHAH, M. Pyogenic Granuloma: A report of three cases. J
Dent Sci., v. 2, n. 1, p.53-55, 2011.
PATIL, K.; MAHIMA, V. G.; LAHARI, K. Extragingival pyogenic granuloma. Indian J
Dent Res, v. 17, n. 4, p.199-202, 2006.
PATIÑO-SEIJAS, B. et al. Vascular Lesions: GLUT-1 expression as a diagnostic tool
to discriminate tumors from malformations. J Oral Maxillofac Surg., v. 10, n. 70, p.
2333-2342, 2012.
RAI, S.; KAUR, M.; BHATNAGAR, P. Laser: A Powerful Tool for Treatment of
Pyogenic Granuloma. J Cutan Aesthet Surg., v. 2, n. 4, p. 144-147, 2011.
RANJBARI, N.; RAHIM, F.The Ki-67/MIB-1 index level and recurrence of papillary
thyroid carcinoma. Med Hypotheses, v. 80, n. 3, p.311-314, 2013.
REGEZI, J. A.; SCIUBBA, J. J.; JORDAN R. C. K. Patologia oral: correlações
clínico-patológicas. 5ª ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 2008.
REZVANI, G. et al. Proliferative activity in oral pyogenic granuloma: a comparative
immunohistochemical study.Indian J Pathol Microbiol., v. 53, n. 3, p.403-407, 2010.
SARMENTO, D. J. S. et al.Immunohistochemical analysis of mismatch proteins in
carcinogenesis of the lower lip. Histopathology (Oxford. Print), v. 63, p. 371-377,
2013.
SCHEEPERS, A.; JOOST, H. G.; SCHURMANN, A. The glucose transporter families
SGLT and GLUT: Molecular basis of normal and aberrant function. J Parenter
Enteral Nutr.,v. 5, n. 28, p. 364-371,2004.
SCHLÜTER, C. et al. The cell proliferation-associated antigen of antibody Ki-67: a
very large, ubiquitous nuclear protein with numerous repeated elements,
representing a new kind of cell cycle-maintaining proteins. J Cell Biol., v. 123, n. 3,
p.513-522, 1993.
SCHURMANN, A. et al. Glucose transport activity and photolabelling with 3[125I]iodo-4-azidophenethylamido-7-O-succinyldeacetyl (IAPS)-forskolin of two
mutants at tryptophan-388 and - 412 of the glucose transporter GLUT1: dissociation
of the binding domains of forskolin and glucose. Biochem.J., v. 290, p. 497501,1993.
SCHURMANN, A. et al. Role of conserved arginine and glutamate residues on the
cytosolic surface of glucose transporters for transporter function. Biochemistry, v.
36, p.12897-12902,1997.
SCULLY, C.; FIELD, J. K.; TANZAWA, H. Genetic aberrations in oral or head and
neck squamous cell carcinoma (SCCHN): 1. Carcinogen metabolism, DNA repair and
cell cycle control. Oral Oncol., v. 36, n. 3, p.256-263, 2000.
106
SEO, J. et al. Escleroterapia de hemangioma labial.Rev Odonto, v. 17, n. 34, p. 106,
2009.
SHAIKH, S. et al. Pyogenic granuloma of unusual size with alveolar resorption in a
75-year-old patient. Natl J Maxillofac Surg., v. 3, n. 1, p.75-79, 2012.
SHAM, M.E.; SULTANA, N. Vascular anomalies in maxillofacial in children –
Review.Journal of Oral and Maxillofacial Surgery, Medicine and Pathology, v.
24, p. 137-146, 2012.
SRINIVASAN, et al. Intraosseous 'haemangioma' of the zygoma: more appropriately
termed a venous malformation. Int J Oral Maxillofac Surg., v. 10, n. 38, p. 10661070, 2009.
TASNADI, G. Epidemiology and etiology of congenital vascular malformations.Semin
Vasc Surg., v.4, n. 6, p. 200-203, 1993.
TAKATA, K. et al. Erythrocyte/HepG2-type glucose transporter is concentrated in
cells of blood-tissue barriers. Biochem.Biophys.Res. Commun., v. 173, p. 67-73,
1990.
THORENS, B.; CHARRON, M. J.; LODISH, H. F. Molecular physiology of glucose
transporters.Diabetes Care, v. 13, p. 209-218, 1990.
TOLENTINO, E. S.; TOLENTINO, L. S. Recurrent intraoral pyogenic granuloma:
case report. Odontol.Clín.-cient, v. 8, n. 3, p.263-267, 2009.
TUCCI, F. M. et al. Head and neck vascular anomalies in children.Int J Pediatr
Otorhinolaryngol, v. 73, p. 71-76, 2009.
ULDRY, M. et al. GLUT2 is a high affinity glucosamine transporter. FEBS Lett.,v. 3,
n. 524, p. 199-203, 2002.
VAIYAPURI, R. et al. Pyogenic granuloma of labial mucosa: A misnomer in an
anomolous site. J Pharm Bioallied Sci., v. 4, n. 2, p.194-196, 2012.
VASCONCELOS, M.G. et al. Expression of CD34 and CD105 as markers for
angiogenesis in oral vascular malformations and pyogenic granulomas. Eur Arch
Otorhinolaryngol., v.268, p.1213-1217, 2011.
VERHEIJEN, R. et al. Ki-67 detects a nuclear matrix-associated proliferation-related
antigen. II. Localization in mitotic cells and association with chromosomes.Journal
Of Cell Science, v. 92, n. 4, p.531-540, 1989.
VERMA, P. K. et al. Pyogenic granuloma - hyperplastic lesion of the gingiva: case
reports. Open Dent J, v. 6, n. , p.153-156, 2012.
VIRCHOW R. Angioma in die Krankhaften Geschwülste. v. 3, p. 306-425, 1863.
107
WANG, B. et al. Expression of apoptosis and Bcl-2, Bax in hemangioma and
vascular malformations. Zhonghua Zheng Xing Wai Ke Za Zhi., v. 19, n. 5, p.347349, 2003.
WEI, M. C. et al. Proapoptotic BAX and BAK: a requisite gateway to mitochondrial
dysfunction and death.Science., v. 292, n. 5517, p.727-730, 2001.
WERNER, J. A. et al. Current concepts in the classification, diagnosis and treatment
of hemangiomas and vascular malformations of the head and neck. Eur Arch
Otorhinolaryngol, v. 258, n. 3, p.141-149, 2001.
WIDDAS, W. F. Old and new concepts of the membrane transport for glucose in
cells. Biochim.Biophys.Acta.,v. 947, p. 385-404,1988.
WOUOD, I. S.; TRAYHURN, P. Glucose transporters (GLUT and SGLT): expanded
family of sugar transport proteins. Br. J. Nutr, v.89, p. 553-557, 2003.
WRIGHT, E. M.; TURK, E. M. The sodium/glucose cotransport family SLC5.
Pflugers Arch., v. 447, p. 510-518,2004.
WU, J. et al. Prognostic role of p27Kip1 and apoptosis in humam breast cancer.Br J
Cancer, v.10, n. 79, p. 1572-1578, 1999.
WU, X.; FREEZE, H. H. GLUT14, a duplicon of GLUT3, is specifically expressed in
testis as alternative splice forms. Genomics, v. 80, p. 553-557, 2002.
YOUNES, M. et al. Overexpression of GLUT-1 and GLUT-3 in stage 1 nonsmall cell
lung carcinoma is associated with poor survival. Cancer, v. 80, n. 6, p. 1046-1051,
1997.
YU, Y. et al. Mesenchymal stem cells and adipogenesis in hemangioma
involution. Stem Cells, v. 24, n. 6, p.1605-1612, 2006.
ZHAO, F; KEATING, A. F. Functional Properties and Genomics of Glucose
Transporters.Current Genomics, v. 8, p. 113-128, 2007.
108
APÊNDICES
109
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA ORAL
APÊNDICE1
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Este é um convite para você participar da pesquisa “EXPRESSÃO
IMUNOISTOQUÍMICA DE GLUT-1 E MARCADORES DE PROLIFERAÇÃO E
APOPTOSE EM ANOMALIAS VASCULARES ORAIS”, que é coordenada pela
Profª. Drª. Lélia Maria Guedes Queiroz. Sua participação é voluntária, o que significa
que você poderá desistir a qualquer momento, retirando seu consentimento, sem
que isso lhe traga nenhum prejuízo ou penalidade.
Esta pesquisa estudará marcadores (substâncias) presentes em anomalias
vasculares (lesões com sangue em seu interior) benignas que foram removidas da
sua boca, Caso você decida aceitar o convite, não passará por nenhum tratamento
clínico nem fará nenhuma cirurgia. Se você permitir iremos utilizar o material que já
foi retirado da sua boca quando foi feita a sua cirurgia.
Os riscos de você sofrer qualquer dano físico, psicológico ou de qualquer
outro tipo por participar da pesquisa, serão mínimos e, caso aconteçam,
providenciaremos assistência médica e/ou psicológica em serviços especializados
na UFRN, procurando, dessa forma, restaurar a sua saúde..
Todas as informações obtidas serão sigilosas e seu nome não será
identificado em nenhum momento. Os dados serão guardados em local seguro e a
divulgação dos resultados será feita de forma a não identificar os voluntários.
Sua participação é importante, pois esta pesquisa tem como benefício
contribuir com o entendimento sobre o comportamento (crescimento, tamanho,
desenvolvimento) das lesões vasculares. Caso exista mudança de diagnóstico, você
será informado e se necessitar de algum tipo de tratamento, o mesmo será realizado
no Departamento de odontologia da Universidade Federal do Rio Grande do Norte.
Se você tiver algum gasto que seja devido à sua participação na pesquisa,
você será ressarcido. Se você sofrer algum dano, comprovadamente decorrente
desta pesquisa, terá direito a indenização.
110
Você ficará com uma cópia deste Termo e toda a dúvida que você tiver a
respeito desta pesquisa, poderá perguntar diretamente para a Profª. Drª. Lélia Maria
Guedes Queiroz, no Departamento de Odontologia da UFRN, no endereço Av. Sen.
Salgado Filho, nº 1787, Lagoa Nova, Natal – RN, ou pelos telefones (84) 3215-4138,
(84) 9907-7970. Dúvidas a respeito da ética dessa pesquisa poderão ser
questionadas ao Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN, localizado no Campus
Universitário da UFRN, ou pelo telefone (84)3215-3135.
Consentimento Livre e Esclarecido
Eu,
___________________________________________________________
,
declaro que compreendi os objetivos desta pesquisa, como ela será realizada, os riscos e
benefícios
envolvidos
“EXPRESSÃO
e
concordo
em
IMUNOISTOQUÍMICA
participar
DE
voluntariamente
GLUT-1
E
da
pesquisa
MARCADORES
PROLIFERAÇÃO E APOPTOSEEM ANOMALIAS VASCULARES ORAIS”.
_________________________________________________________
Assinatura do Participante
_______________________________________________________________
Profa. Dra. Lélia Maria Guedes Queiroz
Pesquisador Responsável
Av. Sen. Salgado Filho, nº 1787. Lagoa Nova, Natal/RN. CEP – 59056-000
Comitê de Ética em Pesquisa da UFRN(Tel: 84-32153135).
DE
111
APÊNDICE 2
Ficha para coleta de dados clínicos da amostra selecionada:
Nº do caso
Sexo
Idade
Raça
Localização da
lesão
Tempo de
evolução
112
APÊNDICE 3
Ficha para avaliação qualitativa da expressão imunoistoquímica do anticorpo antiGLUT-1 nas amostras selecionadas:
Nº do caso
GLUT-1 (+)
GLUT-1 (-)
Nº do caso
GLUT-1 (+)
GLUT-1 (-)
113
APÊNDICE 4
Ficha para reclassificação das amostras GLUT-1(-) de acordo com seu padrão
morfológico e clínico.
Nº do
caso
Diagnósitico após a
reclassificação
Nº do
caso
Diagnósitico após a
reclassificação
114
APÊNDICE 5
Ficha para comparação entre os diagnósticos histopatológicos dados anteriormente
e os diagnósticos dados após a reclassificação.
Nº do caso
Diagnósitico
Antes
Depois
Nº do caso
Diagnósitico
Antes
Depois
115
APÊNDICE 6
Ficha para análise quantitativa da imunoexpressão do antígeno Ki-67.
Nº DE CÉLULAS POR CAMPO
Ki-67
1
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Nº do caso
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
Positiva
Negativa
2
3
4
5
6
7
8
9
10
Total
%
116
APÊNDICE 7
Ficha para comparação entre os escores dados pelos avaliadores a partir da
imunoexpressão do antígeno Bcl-2.
Nº do caso
Escore 0
Imunoexpressão de Bcl-2
Escore 1
Escore 2
117
ANEXO
118
ANEXO1
119
120