XVIII Exposição de Experiências Municipais
em Saneamento
De 4 a 9 de maio de 2014 - Uberlândia - MG
IMPLANTAÇÃO DE UMA METODOLOGIA
DE ANÁLISE DE Giardia E Cryptosporidium
EM UMA ESTAÇÃO DE TRATAMENTO DE
ÁGUA
Ivan Canale
Antonio Carlos Ferreira
Felipe Augusto Gasparotto
SEMAE – Piracicaba-SP
Protozoários Emergentes: Giardia e
Cryptosporidium
• Protozoários: grupo de microrganismos; vida livre ou
parasitas; alguns patogênicos.
• Giardia spp. e Cryptosporidium spp.: protozoários
patogênicos veiculados pela água contaminada.
• Contaminação: ingestão de água contaminada; preparo
de alimentos com água contaminada; contato recreacional
ou profissional.
• ETA de ciclo completo: processos de coagulaçãofloculação-decantação e filtração são as principais
barreiras para remoção de cistos e oocistos de
protozoários; tais organismos são resistentes à cloração
realizada nas ETAs.
Giardia spp. – Trofozoíto (a) e cisto (b)
Fonte: Karanis, 2011.
Giardia spp. – cisto (RID)
Cryptosporidium spp. - oocisto
Fonte: Cantusio Neto, 2008.
Presença de protozoários em
mananciais de abastecimento
• Descarga de esgotos domésticos tratados ou não
tratados e o lançamento de efluentes contendo fezes de
animais podem contaminar os mananciais superficiais
utilizados para abastecimento público com (oo)cistos
(KARANIS, 2011);
• Grau e o tipo de ocupação da bacia hidrográfica, a
existência de cobertura vegetal e a pluviosidade como
fatores que contribuem para a ocorrência de (oo)cistos
nos mananciais (LeCHEVALLIER; NORTON; LEE, 1991; ATHERHOLT et al.,
1998; KISTEMANN et al., 2002; BASTOS et al., 2004; HACHICH, et al., 2004; DIAS, et
al., 2008).
Presença de protozoários em mananciais da
região de Piracicaba
• Cantusio Neto (2004): Rio Atibaia – Giardia (0 a 94,5
cistos/L); ausência de Cryptosporidium.
• Oliveira (2005): Rio Atibaia (50 amostras analisadas) –
presença de Giardia em mais de 50% das amostras
analisadas; presença de Cryptosporidium em uma amostra.
• Monitoramento da CETESB (2001, 2002, 2003): Rio
Piracicaba: grande número de resultados positivos para
Giardia (0 – 153 cistos/L); em 2002, 11 coletas,
36%
resultados positivos para Cryptosporidium (0,1 a 0,6
oocistos/L).
•CETESB: Rio Corumbataí - presença de Giardia em
novembro de 2001 (0,8 cistos/L) e setembro de 2002 (6,9
cistos/L); ausência de Cryptosporidium.
Portaria 2914/2011 do Ministério da Saúde e
o monitoramento de protozoários
Art. 31, § 1º: “quando for identificada média geométrica
anual maior que 1000 Escherichia coli/100 mL, deve-se
realizar monitoramento de cistos de Giardia spp. e oocistos
de Cryptosporidium spp. no(s) ponto(s) de captação de
água”.
Art. 31, § 2º: “quando a média aritmética da concentração de
oocistos de Cryptosporidium spp. for maior ou igual a 3,0
oocistos/L no(s) pontos(s) de captação de água, recomendase a obtenção de efluente em filtração rápida com valor de
turbidez menor ou igual a 0,3 uT em 95% (noventa e cinco
por cento) das amostras mensais ou uso de processo de
desinfecção que comprovadamente alcance a mesma
eficiência de remoção de oocistos de Cryptosporidium spp”.
Portaria 2914/2011 do Ministério da Saúde e
o monitoramento de protozoários
Art. 31º, § 4º: “a concentração média de oocistos de
Cryptosporidium spp. referida no § 2º deste artigo deve ser
calculada considerando um número mínimo de 24 (vinte e
quatro) amostras uniformemente coletadas ao longo de um
período mínimo de um ano e máximo de dois anos”.
A Portaria também estabelece no seu artigo 30º, § 2º o valor
máximo permitido (VMP) de 0,5 uT para a água filtrada por
filtração rápida (tratamento completo ou filtração direta).
Objetivos
O objetivo deste trabalho é relatar a
implantação
de
uma
metodologia
de
monitoramento de Giardia e Cryptosporidium em
águas brutas e tratadas pelo Serviço Municipal de
Água e Esgoto de Piracicaba – SP – Brasil
(SEMAE – Piracicaba), os custos envolvidos
nesse processo e os resultados analíticos do
monitoramento nos mananciais utilizados para
abastecimento público (rios Piracicaba e
Corumbataí) e nas ETAs de Piracicaba, durante o
ano de 2013.
Técnicas analíticas para detecção de
protozoários em amostras de água
ETAPAS GERAIS:
•Concentração da amostra de água, com a finalidade de recuperar
ou capturar (oo)cistos;
•Purificação dos (oo)cistos, com separação dos organismos-alvo
de materiais particulados e interferentes presentes na amostra;
•Detecção por reação de imunofluorescência, identificação e
contagem em microscópio.
Principais metodologias recomentadas (para concentração da
amostra):
•Floculação com carbonato de cálcio
•Sistema Filta-Max®
•Filtração em membranas
Concentração por filtração em
membranas (Franco, et. al., 2012)
Vantagens:
 aplicabilidade a amostras de água tratada ou bruta
(mesmo
amostras
de
composição
físico-química
complexa);
 menor custo
laboratorial;
e
menor
tempo
de
processamento
 preserva a morfologia dos (oo)cistos.
Principal fator limitante: turbidez, que causa a obstrução
dos poros da membrana, gerando a necessidade de trocála para filtrar toda a amostra.
Concentração por filtração em
membranas (Franco, et. al., 2012)
Filtração da amostra: membrana éster
de celulose, 47 mm, 3 ou 1,2 µm.
Água Bruta: 0,3 a 2 litros
Água tratada: 15 a 20 litros
Raspagem da membrana:
Alça plástica estéril; 20 min.;
usar solução de eluição (Tween
80 0,1%)
Concentração por filtração em
membranas (Franco, et. al., 2012)
Raspagem da membrana (final)
Concentrado no tubo para
centrifugação: 1050 xg durante
10 min (realizar este
procedimento 2 vezes)
Concentração por filtração em
membranas (Franco, et. al., 2012)
Pellet final no eppendorf: desejável um
volume final de 500µL ou menor
Reação de Imunofluorescência Direta (RID)
Kit Merifluor para análise de
Cryptosporidium e Giardia: análise de
alíquotas de 10µL do pellet
Microscópio de Imunofluorescência
Critérios de Positividade
 Fluorescência verde-maçã brilhante;
 Ausência de poros ou apêndices;
 Tamanho e forma compatíveis: 8-18 µm de comprimento / 5 -15
µm de largura e formato oval para cistos de Giardia spp., e 4 - 6
µm de diâmetro, formato esférico e presença (não obrigatória)
de sutura para oocistos de Cryptosporidium spp. (CANTUSIO
NETO, 2008; USEPA, 2012).
Oocisto de Cryptosporidium (RID e DAPI) (USEPA, 2012)
Cisto de Giardia (RID e DAPI) (USEPA, 2012)
Investimento (em R$) para implantação da Metodologia de Filtração em
Membrana para Detecção de Giardia e Cryptosporidium em amostras de água
Equipamentos
Custo Estimado
Sistema de Filtração: bomba de pressão positiva
1.500,00
Porta filtro para membrana de 47 mm de diâmetro
1.000,00
Centrífuga de mesa, rotor com swing
6.200,00
Agitador de tubos Vórtex
1.400,00
Microscópio de Imunofluorescência
40.000,00
Reagentes
Kit para reação de imunofluorescência direta (Merifluor)
3.000,00
Reagentes para solução de eluição (Tween 80 e Anti-Espumante)
1.000,00
Materiais Diversos
Membrana de ésteres de celulose, porosidade 3 µm / 1,2 µm
600,00
Placas de petri de plástico 60 x 15 (100 placas)
140,00
Tubos plásticos tipo Falcon para centrífuga (15 mL) – pacote com 40 tubos
50,00
Tubos eppendorf de 1 mL (pacote com 500 unidades)
30,00
Pipetas automáticas e ponteiras (5-100 microlitros)
900,00
Outros pequenos materiais (lamínulas, alças (loop) estéril, pipetas plásticas descartáveis,
etc.)
80,00
Treinamento de um técnico em instituição especializada (IB – UNICAMP)
1.000,00
Total
56.900,00
Controle de Qualidade Analítica
• Experimentos Controle Positivos
• Experimentos Controle Negativos
Porcentagem média de recuperação para métodos de análise de Giardia
e Cryptosporidium estabelecidos pela USEPA (2005)
Porcentagem
média de
recuperação (%)
Desvio Padrão (%)
Precisão e recuperação inicial (água
destilada)
24 - 100
49
Precisão e recuperação contínua (efeito da
matriz)
15 - 118
30
Precisão e recuperação inicial (água
destilada)
24 - 100
55
Precisão e recuperação contínua (efeito da
matriz)
13 - 111
61
Giardia spp
Cryptosporidium spp
Resultados dos testes de precisão e recuperação em água
destilada: número de cistos / oocistos inoculados, recuperados,
percentual de recuperação, média e desvio padrão (DP)
Nº do Teste
Nº de cistos
inoculado
Nº de cistos
recuperado
% de
recuperação
de cistos
Nº de
oocistos
inoculado
Nº de
oocistos
recuperado
% de
recuperação
de oocistos
1
180
50
27,8
900
850
94,4
2
360
100
27,8
1800
1150
63,9
3
180
50
27,8
900
1100
122,2
4
180
150
83,3
900
800
88,8
Média
DP
41,675
27,75
Média
DP
92,325
23,93
Resultados dos testes de precisão e recuperação em água bruta de
manancial superficial: turbidez da água bruta, número de cistos / oocistos
inoculados, recuperados, percentual de recuperação, média e desvio
padrão (DP)
Nº do
Teste
Turbidez
(NTU)
Nº de
cistos
inoculado
Nº de
cistos
recuperado
% de
recuperação
de cistos
Nº de
oocistos
inoculado
Nº de
oocistos
recuperado
% de
recuperação
de oocistos
1
58,9
180
25
13,9
900
25
2,8
2
106,0
360
0
0,00
1800
50
2,8
3
11,2
180
300
166,7
900
1050
116,7
4
27,6
180
81
45,0
900
31
3,4
Média
DP
56,4
75,902
Média
DP
31,4
56,851
Controle negativo (2 testes): ausência de cistos e oocistos na
lâmina.
Monitoramento da turbidez (NTU), E. coli (NMP/100 mL) e
protozoários (Giardia – nº de cistos/L e Cryptosporidium
- nº de oocistos/L) na água bruta do rio Piracicaba
Coleta
Turbidez
E. coli
Giardia
Cryptosporidium
Janeiro / 2013
173
22.000
ND
ND
Fevereiro / 2013
24
13.000
102,6
ND
Março / 2013
241
24.000
ND
ND
Abril / 2013
16
11.000
66,7
ND
Maio / 2013
14
5.000
ND
ND
Junho / 2013
17
8.000
62,5
ND
Julho / 2013
63
17.000
400,0
ND
Agosto / 2013
5
5.000
ND
ND
Setembro / 2013
15
5.000
285,7
ND
ND: não detectado.
Monitoramento da turbidez (NTU), E. coli e protozoários
(Giardia – nº de cistos/L e Cryptosporidium - nº de
oocistos/L) na água bruta do rio Corumbataí
Coleta
Turbidez
E. coli
Giardia
Cryptosporidium
Janeiro / 2013
58,9
17.000
50,0
ND
Fevereiro / 2013
106
5.000
ND
ND
Março / 2013
61
24.000
50,0
ND
Abril / 2013
119
3.000
ND
ND
Maio / 2013
11
2.600
ND
ND
Junho / 2013
26
3.000
33,3
ND
Julho / 2013
28
5.000
19,2
19,2
Agosto / 2013
19
1.700
58,8
ND
Setembro / 2013
14
2.300
75,0
ND
ND: não detectado.
Cistos de Giardia isolados em amostras do rio Corumbataí –
reação de imunofluorescência direta (arquivo pessoal)
A turbidez média da água filtrada foi 0,43 NTU para as amostras da
ETA 1 e 0,52 NTU para as amostras da ETA 3. Não foram detectados
cistos ou oocistos de protozoários nas amostras de água filtrada
avaliadas em ambas as ETAs.
CONSIDERAÇÕES FINAIS
• Mananciais de abastecimento público no Brasil:
poluídos por esgotos domésticos e dejetos animais;
• Importância do monitoramento de organismos
patogênicos (Giardia e Cryptosporidium) pelas
estações de tratamento de água para consumo
humano (atendimento da Portaria 2914/2011);
• Metodologias
de
análises
de
protozoários:
necessidades de investimento ($), treinamento;
• Técnicas
analíticas:
variabilidade
reprodutibilidade de resultados;
• Turbidez da água: um dos
limitantes (inerente à amostra).
e
baixa
principais
fatores
DÚVIDAS E ESCLARECIMENTOS
????
OBRIGADO!!!
Contato:
SEMAE – Piracicaba
Setor de Controle de Qualidade
Fone: (19) 3413-1110 / 3421-0415
E-mail: [email protected]
www.semaepiracicaba.sp.gov.br
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO (CETESB). Relatório de Qualidade das Águas Interiores do Estado de
São Paulo 2002, Série Relatórios / Secretaria de Estado do Meio Ambiente, CETESB, São Paulo, 279 p., 2003.
COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO (CETESB). Relatório de Qualidade das Águas Interiores do Estado de
São Paulo 2001, Série Relatórios / Secretaria de Estado do Meio Ambiente, CETESB, São Paulo, 160 p., 2002.
COMPANHIA AMBIENTAL DO ESTADO DE SÃO PAULO (CETESB). Relatório de Qualidade das Águas Interiores do Estado de
São Paulo 2000, Série Relatórios - CETESB, São Paulo, 138 p., 2001.
FRANCO, R.M.B.; HACHICH, E.M.; SATO, M.I.Z.; NAVEIRA, R.M.; SILVA, E.C.; CAMPOS, M.M.C.; CANTUSIO NETO, R.;
CERQUEIRA, D.A.; BRANCO, N.; LEAL, D.A.G. Avaliação da performance de metodologias de detecção de Cryptosporidium spp. e
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KARANIS, P. Giardia and Cryptosporidium: Occurrence in Water Supplies. In: Encyclopedia of Environmental Health, vol. 2: 946954, Burlington, Elsevier, 2011.
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PADUA, V. L. (coord.) Remoção de microrganismos emergentes e microcontaminantes orgânicos no tratamento de água para
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UNITED STATES ENVIRONMENTAL PROTECTION AGENCY (USEPA). Office of Water. Washington DC. Method 1623.1:
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