CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DE
ECOSSISTEMAS
Dissertação de Mestrado
EFEITO CRÔNICO DO COBRE EM ROBALO PEVA (Centropomus
parallelus)
RODRIGO NUNES OSS
VILA VELHA
MARÇO DE 2011
CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM ECOLOGIA DE
ECOSSISTEMAS
Dissertação de Mestrado
EFEITO CRÔNICO DO COBRE EM ROBALO PEVA (Centropomus
parallelus)
Dissertação apresentada ao Centro
Universitário Vila Velha, como prérequisito do Programa de Pós-graduação
em Ecologia de Ecossistemas, para a
obtenção do título de Mestre em Ecologia.
RODRIGO NUNES OSS
Orientador:
Prof. Dr. Levy de Carvalho Gomes
CENTRO UNIVERSITÁRIO VILA VELHA (UVV)
VILA VELHA
MARÇO DE 2011
Catalogação na publicação elaborada pela Biblioteca Central / UVV-ES
O84e
Oss, Rodrigo Nunes.
Efeito crônico do cobre em robalo peva (Centropomus
parallellus) / Rodrigo Nunes Oss. – 2011.
62 f. : il.
Orientador: Levy de Carvalho Gomes.
Dissertação (mestrado Ecologia de Ecossistemas) - Centro
Universitário Vila Velha, 2011.
Inclui bibliografias.
1. Robalo (peixe). 2. Toxicologia ambiental. 3. Cobre.
4. Água – Poluição. I. Gomes, Levy de Carvalho. II. Centro
Universitário Vila Velha. III. Título.
CDD 639.3
A Deus por me sustentar até aqui e aos
meus pais, Luiz Valentin Oss e Ivone Maria
Nunes Oss, por todo amor e apoio.
DEDICO
AGRADECIMENTOS
Agradeço, primeiramente, a Deus, O autor da vida, por me dar mais esta Vitória,
pelo sustento e amor, por me fazer forte quando me senti fraco. A Ele toda Honra e
Glória!
Aos meus pais, Luiz Valentin Oss e Ivone Maria Nunes Oss por todo amor dedicado,
estando sempre ao meu lado sem medir esforços, sacrificando-se para me conceder
toda ajuda e apoio. Eles são os meus maiores e melhores exemplos. Eu amo vocês!
À minha esposa, Sarah Silveira Azoury Oss, por sempre me apoiar em todo esse
trajeto, por compreender minha ausência em muitos momentos. À esta que é minha
grande companheira, meus sinceros agradecimentos. Princesa, Eu te amo!
Ao meu Orientador, Levy de Carvalho Gomes, por mais esta oportunidade de
trabalhar com ele, acrescentando novos ensinamentos e pela paciência.
Ao Bruno Ferreira, Juliana Rabbi Alexandre, Maria Lorraine Fonseca Oliveira, Laila
Carine Medeiros, Maria Luiza Cosme Dias, Lara Schayder de Medeiros, Larissa
Novaes Simões, Adriana Amaral, Rômulo Salla, Felipe Domingues e Vinícius Baroni
pela ajuda na realização dos experimentos, incentivo e companheirismo. Este
trabalho também é de vocês!
Aos funcionários do Biopráticas, Adriana Canal, Marlene Ximenes, Claudinha e
Robson, por toda ajuda, sendo essenciais para a conclusão deste trabalho.
Ao Laboratório de Ecofisiologia e Evolução Molecular/INPA, aos professores
Adalberto Val e Vera Val, a Nazareth Paula, Thiago Nascimento, Rafael Duarte,
Reginaldo Oliveira e Ramon Baptista por me abrirem as portas.
Aos meus colegas de curso pela amizade e aos professores.
A FAPES pelo apoio através da bolsa PROCAP 2009.
SUMÁRIO
Resumo...................................................................................................... 1
Abstract...................................................................................................... 2
1. Introdução Geral....................................................................................
3
2. Fundamentação Teórica........................................................................
5
2.1. O Cobre em peixes......................................................................... 5
2.2. Recuperação…………....................................................................
6
2.3. Testes Ecotoxicológicos.................................................................
6
2.4. Organismo-teste ............................................................................
7
3. Objetivos…............................................................................................
9
4. Referências Bibliográficas.....................................................................
10
5. Capítulos:
Capítulo 1: Efeitos de concentrações subletais de cobre em robalo
peva (Centropomus parallelus) em exposição crônica
Resumo………………………………...…………....……................... 13
Abstract............................................................................................ 14
Introdução……………………………….....………………....…........... 15
Material e Métodos…………………………………........………......... 17
Resultados…………………………………………...……...................
20
Discussão…………………………………………...……….................
25
Conclusões……………………………………………………..............
30
Referências Bibliográficas……………………………………….........
31
Capítulo 2: Recuperação de robalo peva (Centropomus parallelus)
após exposição crônica ao cobre
Resumo……………………………….....………………....……........... 36
Abstract............................................................................................ 37
Introdução...............................….....………………....…...................
38
Material e Métodos……………………………...........……................. 39
Resultados………………............................……………...................
41
Discussão…………………………………………………....................
46
Conclusões……………………………………………….....................
51
Referências Bibliográficas…………………………………................. 52
RESUMO
EFEITO CRÔNICO DO COBRE EM ROBALO-PEVA (Centropomus parallelus)
A contaminação dos corpos d’água é um dos problemas ambientais mais antigos,
sendo ainda observado atualmente. Tal situação é observada em muitos rios e
estuários do Brasil e do Mundo, sendo necessárias medidas para minimizar a
contaminação e controlar a qualidade desses corpos d’água. Os testes
ecotoxicológicos são formas de monitoramento, utilizando biomonitores a fim de
determinar os efeitos tóxicos de substâncias tóxicas. O cobre é uma das substâncias
que merecem atenção quanto aos seus efeitos tóxicos, sendo encontrado nos
efluentes da maioria dos processos industriais e esgotos domético. O robalo peva,
Centropomus parallelus, é encontrado desde a Flórida/EUA até o Sul do Brasil,
sendo de grande importância econômica e utilizada como fonte alimentar em todo
litoral. O objetivo deste trabalho foi verificar: 1) os efeitos da adição de baixas
concentrações de cobre em robalo-peva, em exposição crônica; 2) a recuperação de
indivíduos de C. parallelus após exposição crônica em meio com adição de baixa
concentração de cobre. No primeiro trabalho os organismos foram expostos por 30 e
60 dias em tratamentos em que foram adicionados 13 e 26 µg Cu+2/L e no segundo
o tempo de exposição foi de 30 dias nas concentrações de 26 e 52 µg Cu+2/L,
seguido de recuperação em 4, 10 e 30 dias. Para os testes ecotoxicológicos e de
acúmulo de metal foi coletado sangue e tecidos (brânquias, fígado e músculo) dos
peixes. Os resultados do ensaio cometa e micronúcleo do primeiro experimento
mostraram a genotoxicidade do cobre, o que também verificou-se através do teste
de micronúcleo do segundo teste, o qual mostrou que mesmo após 30 dias de
recuperação essa situação não se modifica. O cobre adicionado também interferiu
no desenvolvimento dos peixes expostos ao cobre no primeiro teste. No primeiro
experimento não foi observada diferença significativa dos níveis de glicose e cortisol
entre os peixes. Verificou-se maior acúmulo de cobre nas brânquias dos peixes
expostos ao metal em ambos os testes, sendo que no segundo observou-se a
recuperação após 30 dias. No segundo trabalho verificou-se o acumulo de cobre no
músculo dos indivíduos expostos a meio com adição de cobre, identificando a
recuperação em 4 dias. Nesse também foi possível observar inibição da GST, a qual
retornou aos níveis do tratamento com exposição a concentração basal nos tempos
10 e 30 dias de recuperação. O cobre mesmo em baixas concentrações se mostrou
tóxico para o robalo peva.
Palavras-chave:
ECOTOXICOLOGIA,
METAIS
ECOTOXICOLÓGICOS, CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA.
1
PESADOS,
TESTES
ABSTRACT
EFFECT CHRONIC OF COPPER IN ROBALO PEVA (Centropomus parallelus)
The contamination of water bodies is one of the oldest environmental problems and
is still observed today. This situation is observed in many rivers and estuaries in
Brazil and the World, being necessary measures to minimize contamination and
quality control of these water bodies. The ecotoxicity tests are forms of monitoring,
using biomonitors to determine the toxic effects of toxic substances. Copper is one of
the substances that need attention in relation to its toxic effects being found in
effluents of most industrial processes and domestic sewage. The fat snook,
Centropomus parallelus, is found from Florida/USA to southern Brazil and is of great
economic importance and used as food resources around the coast. The aim of this
study was to determine: 1) the effects of adding low concentrations of copper in fat
snook in chronic exposure, 2) the recovery of C. parallelus after chronic exposure in
medium with addition of low concentrations of copper. In the first study the organisms
were exposed for 30 and 60 days in treatments that have been added 13 and 26 µg
Cu+2/L and the second exposure time was 30 days at concentrations of 26 and 52 µg
Cu+2/L followed by recovery at 4, 10 and 30 days. For ecotoxicological tests and the
accumulation of metal was collected blood and tissues (gills, liver and muscle) of fish.
The results of comet assay and micronucleus first experiment showed the
genotoxicity of copper, which was also observed by micronucleus test of the second
test, which showed that even after 30 days of recovery does not change this
situation. Copper added also interfered with the development of the fish exposed to
copper in the first test. In the first experiment there was no significant difference in
levels of glucose and cortisol between fish. A higher accumulation of copper in the
gills of fish exposed to the metal in both tests, while in the second recovery was
observed after 30 days. In the second study there was an accumulation of copper in
the muscle of individuals exposed to medium with the addition of copper, identifying
recovery in 4 days. This was also observed inhibition of GST, which returned to the
levels of treatment exposure to basal concentrations at 10 and 30 days of recovery.
Even at lower concentrations the copper was toxic to fat snook.
Keywords: ECOTOXICOLOGY, HEAVY METALS, ECOTOXICOLOGICAL TESTS,
AQUATIC CONTAMINATION
2
1. INTRODUÇÃO
A crescente contaminação dos corpos d’água por produtos e compostos
químicos oriundos das atividades antropogênicas, principalmente os processos
industriais, é um dos principais problemas ambientais atuais (Bopp et al., 2008).
Esses processos têm capacidade de modificar os ambientes, alterando ciclos
naturais de várias substâncias químicas, fazendo com que muitas delas retornem à
superfície terrestre como contaminantes (Pinheiro, 2004).
Segundo Pinheiro (2004) muitos rios e lagos recebem diariamente uma
elevada quantidade de esgoto sem tratamento ou com tratamento ineficazes e de
efluentes industriais que despejam metais pesados, entre eles o cobre (Bopp et al.,
2008). Desta maneira, fica claro, que os organismos aquáticos estão sofrendo ação
direta destes agentes tóxicos, causando nestes o acúmulo de metais em seus
tecidos. Além disso, no ambiente aquático os metais transitam por diversos níveis da
cadeia trófica e acabam atingindo o homem (Vieira et al., 2009; Bopp et al., 2008).
Alguns destes metais presentes nos efluentes lançados nos corpos
d’água também são encontrados e fazem parte dos sistemas aquáticos naturais, e
são requeridos em pequenas concentrações (partes por milhão a partes por bilhão),
nos processos fisiológicos normais dos organismos, sendo então denominados
elementos-traço (Buratini e Brandelli, 2006; Bopp et al., 2008; Oliveira et al., 2008;
Vieira et al., 2009). Mas estas substâncias quando em altas concentrações tem
efeito tóxico, sendo nocivo ao organismo, resultando em inúmeras disfunções. Estas
disfunções ocorrem devido a interações inapropriadas de tais elementos com
estruturas celulares. Os efeitos nocivos podem ser subletais, quando o indivíduo
apresenta mudanças em parâmetros bioquímicos, iônicos e fisiológicos, no
crescimento, na morfologia, na reprodução, no comportamento entre outros. E,
ainda, letal, causando a morte deste (Oliveira, 2003; Tomita e Beyruth, 2002). Na
maioria dos casos, os metais são transportados pelo sangue e assim podem ter
efeito nocivo em todos os órgãos (Nader, 2005).
Dessa forma, torna-se necessário a contenção da entrada desses
elementos nos corpos d’água por meio de medidas socioambientais e a aplicação da
Legislação.
Essa deve ser com base em estudos e pesquisas científicas para
assegurar a eficiência dos padrões estabelecidos. É claro que são várias as
substancias que precisam ter seu lançamento no meio natural controlado, mas
podemos destacar o cobre como um dos elementos mais nocivo e disponível, tendo
3
em vista sua ampla utilização. Assim, fazem-se necessários estudos para conhecer
melhor os efeitos desse químico nos ambientes e nos indivíduos que neles habitam.
4
2. FUNDAMENTAÇÃO TEÓRICA
2.1.
O Cobre em peixes
O cobre é um dos metais presente em efluentes industriais despejados
nos corpos d’água, e também desempenham funções nos organismos. Nos peixes,
o cobre tem importantes funções, sendo necessário para o metabolismo de vários
nutrientes e ainda como constituinte de varias enzimas (Ferrari et al., 2004; Oliveira
et al., 2008). Ele atua na cadeia respiratória, fazendo parte do complexo citocromo
oxidase; participa como cofator da enzima ALA-desidrogenase, a qual participa na
síntese do grupo prostético heme em sua incorporação à globulina formando o
pigmento hemoglobina. O cobre é um constituinte de eritrocupreína no eritrócito; no
aproveitamento adequado do ferro; na síntese do colágeno e da elastina; e está
presente no centro ativo da lisil oxidase, enzima que produz interligações entre as
cadeias polipeptídicas (Ferrari et al., 2004; Lenhinger, 2000; Gagnon et al., 2006).
Porém, o desenvolvimento urbano e a crescente atividade industrial vêm
aumentando o lançamento in natura deste metal em corpos d’água. O uso do sulfato
de cobre (CuSO4) como fungicida nas práticas agrícolas bem como no controle de
algas e patógenos na aqüicultura, principalmente nos sistemas extensivos de
produção, têm aumentado a concentração de cobre em sistemas aquáticos (Chairi et
al., 2010). Além disso, os acidentes ocasionais em indústrias têm contribuído para o
agravamento da situação, introduzindo quantidades substanciais de cobre em
ambientes aquáticos (Carvalho e Fernandes, 2008). Essas altas concentrações
acarretam disfunções aos peixes como a perda de apetite, crescimento reduzido,
elevada morte de embriões. Além disso, essa contaminação pode gerar perda de
íons, podendo resultar na hemoconcentração massiva. Diminuição da atividade
aeróbica, alterações histológicas das brânquias, do fígado e dos rins são mais
alguns dos efeitos deletérios do cobre em peixes. Também, o cobre, induz o
estresse oxidativo, promovendo a formação de espécies altamente reativas de
oxigênio, afetando as membranas lipídicas e a integridade do DNA, podendo resultar
em necrose e morte celular por apoptose (Oliveira et al., 2008). Essas disfunções
podem culminar na mortalidade dos indivíduos (Gagnon et al., 2006; Carvalho e
Fernandes, 2008).
A toxicidade do cobre para peixes é bem documentada, principalmente
pela sua letalidade aguda, gerando uma ampla gama de respostas toxicológicas dos
diversos órgãos, as quais têm sido relatadas em inúmeros trabalhos com várias
5
espécies de peixes. Porém estudos de tratamentos crônicos com concentrações
subletais e seus efeitos ainda são poucos e se fazem necessários, pois na maioria
das águas naturais os metais pesados são geralmente presente apenas nas
concentrações subletais. Além disso, pouco se sabe sobre os efeitos da exposição
crônica de concentrações subletais em peixes (McGeer et al., 2000).
Absorção de cobre em peixes ocorre principalmente através das
brânquias, seguido da pele e do intestino, agindo diretamente sobre os componentes
celulares ou gerando respostas de estresse (Mazon et al., 2004). Em ambos os
casos o rompimento da integridade celular é uma conseqüência da deficiência dos
sistemas bioquímicos (Carvalho e Fernandes, 2008).
2.2.
Recuperação:
Muitos esforços têm sido feitos para a recuperação de áreas degradadas
e poluídas, e isso não é diferente nos corpos d’água. A recuperação visa o retorno
de condições mais próximas ao original, objetivando melhores condições a biota na
área.
Assim, deve-se avaliar as respostas dos organismos, após exposição em
meio contaminado, em meio com baixa e/ou poluição ausente. Sabe-se que
posteriormente a exposição, a recuperação começa com o aumento dos processos
de biossíntese (mitose e aumento da síntese de proteínas), ajudando na reparação
dos danos e distúrbios fisiológicos. Ocorre também a fase de mobilização dos
metais, executada por algumas proteínas como a metalotioneína, e um aumento da
regulação de outros caminhos para neutralizar ou competir com os efeitos deletérios
do metal, por exemplo aqueles relacionados à regulação iônica (McGeer et al.,
2000). Posteriormente, a fisiologia interna do animal pode retornar para a condição
pré-exposição, ou, estabelecer um novo equilíbrio durante o período final de maior
tolerância (McGeer et al., 2000).
2.3.
Testes Ecotoxicológicos:
Os testes ecotoxicológicos são necessários para a determinação das
ações e efeitos dos agentes tóxicos nos organismos. Estes testes podem ser
relacionados a genotoxicidade do xenobiótico, absorção do químico pelos indivíduos
expostos, alterações de alguns parâmetros fisiológicos, enzimáticos e histológicos.
Assim, para as análises de genotoxicidade já é bem documentado o Teste
de Micronúcleo e o Ensaio Cometa, principalmente por se tratar de testes rápidos e
6
de baixo custo, além de ter boa aplicabilidade e eficiência. O Ensaio Cometa (EC) é
capaz de detectar danos no DNA induzidos por agentes tóxicos, podendo ser feito
com animais e plantas (Chairi et al., 2010). Através deste teste pode-se verificar a
intensidade da quebra da fita de DNA.
Com o teste micronúcleo pode-se detectar lise cromossômica e
aneuploidia, o que ocorre quando o material genético é fragmentado ou perdido e
não pode ser incorporado ao núcleo da célula filha, originando um novo núcleo de
tamanho menor que o principal, assim denominado micronúcleo (Cavas e Konen,
2008).
Os metais e outros tóxicos podem se acumular em vários órgãos. No caso
do cobre o principal órgão de absorção é o fígado, onde ocorre a homeostase deste
metal (Carvalho e Fernandes, 2008; Oliveira et al., 2008). As brânquias também
podem absorver tóxicos presentes na água, pois está em contato direto com a água,
com a qual troca gases e outras substâncias, sendo também um importante órgão
para a realização de testes de absorção (Oliveira et al., 2008).
Outros testes eficientes para determinação do efeito de xenobióticos em
organismos são os de alterações enzimáticas (Lee et al., 2008; Chairi et al., 2010). A
exposição a poluição pode gerar alterar os níveis da atividade das enzimas em
respostas a este estresse, como mecanismo de detoxificação das vias metabólicas
(Vieira et al., 2009; Chairi et al., 2010). A Glutationa S-transferase (GST), Catalase
(CAT) e a Acetilcolinesterase (AChE), são exemplos de enzimas que podem ser
utilizadas para identificar alterações das atividades enzimáticas em organismos
contaminados (Vieira et al., 2009; Chairi et al., 2010).
O cortisol é uma resposta primária de alterações ambientais, tal como a
exposição ao cobre (Gagnon et al., 2006). Peixes expostos as essas condições
apresentam hiperatividade interrenal, resultando em aumento da concentração
plasmática de corticosteróides e inibição da resposta inflamatória e imune. Como
resposta secundária, a Glicose é responsável pela canalização das ações e dos
efeitos imediatos da resposta primária, resultante do aumento dos batimentos
cardíacos e da absorção de oxigênio, aumentando a circulação dos corticosteróides
no sangue e tecidos (Gagnon et al., 2006).
2.4.
Organismo-teste:
Para testes ecotoxicológicos existem peixes utilizados mundialmente
como organismo teste, como o Danio rerio e Pimephales promelas. Porém novas
7
pesquisas têm direcionado para utilização de espécies representativas de uma
determinada Bacia Hidrográfica e Região (Mazon et al., 2002; Oliveira, 2003; Vieira
et al., 2009).
Para estabelecimento de organismos testes algumas características
devem ser observadas, tais como: a espécie deve ser preferencialmente nativa,
ecologicamente importante, adaptável às condições de laboratório, além de ser
abundante e facilmente disponível (Boock, 2005).
Robalos são peixes da família Centropomidae, habitando a região
costeira marinha, se reproduzindo em sistemas estuarinos e de água doce (Borges
et al., 2010; Tsuzuki et al., 2007). Após a reprodução eles podem continuar o ciclo
de vida em estuários ou ainda alternar entre o ambiente marinho e dulcicula,
dependendo de suas condições reprodutivas e alimentares, podendo ser
encontrados em lagoas salobras e hipersalinas (Borges et al., 2010; Tsuzuki et al.,
2007). São encontrados desde o sudeste da Flóriada, EUA até Florianópolis, Sul do
Brasil. São citadas quatro espécies de robalo no litoral brasileiro, Centropomus
undecimalis, Centropomus parallelus, Centropomus ensiferus e Centropomus
pectinatus, sendo C. parallelus, robalo-peva, predominante na região sudeste
(Borges et al., 2010; Tsuzuki et al., 2007). Devido ao seu alto valor comercial e
qualidade de sua carne, o robalo-peva, é muito apreciado para pesca esportiva e
artesanal, e por isso tem sido intensamente capturado, afetando seus estoques
naturais (Borges et al., 2010; Tsuzuki et al., 2007). O robalo é carnívoro,
alimentando-se principalmente de peixes, sem seleção de espécies, incluindo em
sua dieta crustáceos, moluscos, ovos de peixes e crustáceos, e até insetos (Borges
et al., 2010; Lemos et al., 2006). Em geral, esses peixes adaptam-se bem às
condições de cativeiro e às dietas artificiais, são resistentes ao manejo e variações
dos parâmetros físico-químicos da água, por isso possuem potencial para o cultivo
(Lemos et al., 2006; Tsuzuki et al., 2007).
8
3. OBJETIVOS
O objetivo deste trabalho foi verificar: 1) os efeitos da adição de baixas
concentrações de cobre (13 e 26 µg Cu+2/L) em robalo-peva, Centropomus
parallelus, em exposição crônica (30 e 60 dias); 2) a recuperação em 4, 10 e 30 dias
de indivíduos de C. parallelus após exposição crônica em meio com adição de baixa
concentração de cobre (26 e 52 µg Cu+2/L).
9
4. REFERÊNCIAS
Boock MV, Neto JGM. (2005) Estudos sobre a toxicidade aguda do oxicloreto de
cobre para o peixe Poecilia reticulata. Boletim do Instituto de Pesca. 01: 29-35
Bopp SK, Abicht HK, Knauer K. (2008) Copper-induced oxidative stress in rainbow
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Borges JCS, Pressinotti LNP, Gomes V, Cunha da Silva JRM. (2010) Lipidic and
proteic absorption in digestive tract of tropical fat snook (Centropomus parallelus,
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Buratini SV, Brandelli A. (2006) Bioacumulação. In: Zagatto, P. A. & Bertoletti, E.
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10
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de Mestrado. Programa de Pós Graduação em Ciências Fisiológicas, Universidade
Federal de São Carlos, SÃO CARLOS.
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de formação derivada da extração do petróleo da província petroleira do Urucu –
AM, sobre o tambaqui, Colossoma macropomum (Curvier, 1818). Dissertação de
11
Mestrado. Programa de Pós Graduação em Biologia de Água doce e Pesca Interior,
INPA/UFAM, MANAUS.
Oliveira M, Serafim A, Bebianno MJ, Pacheco M, Santos MA. (2008) European
eel (Anguilla anguilla L.) metallothionein, endocrine, metabolic and genotoxic
responses to copper exposure. Ecotoxicology and Environmental Safety. 70: 20–26
Pinheiro GHD. (2004) Respostas fisiológicas ao estresse em Prochilodus scrofa
durante a exposição ao cobre e subseqüente recuperação em água sem cobre.
Dissertação de Mestrado. Programa de Pós Graduação em Ecologia e Recursos
Naturais, Universidade Federal de São Carlos, SÃO CARLOS.
Tomita RY, Beyruth Z. (2002) Toxicologia de agrotóxicos em ambiente aquático.
Biológico. 64: 135-142.
Tsuzuki MY, Sugai JK, Maciel JC, Francisco CJ, Cerqueira VR. (2007) Survival,
growth and digestive enzyme activity of juveniles of the fat snook (Centropomus
parallelus) reared at different salinities. Aquaculture. 271: 319–325.
Vieira LR, Gravato AC, Soares CAMVM, Morgado CF, Guilhermino L. (2009)
Acute effects of copper and mercury on the estuarine fish Pomatoschistus microps:
Linking biomarkers to behavior. Chemosphere. 76: 1416–1427.
12
CAPÍTULO I
EFEITOS DE CONCENTRAÇÕES SUBLETAIS DE COBRE EM ROBALO PEVA
(Centropomus parallelus) EM EXPOSIÇÃO CRÔNICA
Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology
RESUMO
Os processos antropogênicos têm afetado várias comunidades através do
lançamento de efluentes contaminados nos corpos d’água. Para verificar os efeitos
dessa contaminação têm-se utilizado testes ecotoxicológicos, os quais são bem
difundidos no meio científico. O cobre pode ser encontrado nos efluentes da maioria
dos processos industriais e em outros efluentes. O robalo peva, Centropomus
parallelus, é encontrado desde a Flórida/EUA até o Sul do Brasil, sendo de grande
importância econômica e utilizada como fonte alimentar em todo litoral. Este trabalho
teve como objetivo a determinação dos efeitos do Cobre na espécie C. parallelus.
Os organismos foram levados para o laboratório e posteriormente a 15 dias de
aclimatação foram expostos por 30 e 60 dias em tratamentos em que foram
adicionados 13 e 26 µg Cu+2/L. Através do ensaio cometa e micronúcleo foi possível
observar efeito genotóxico do cobre, principalmente nos indivíduos expostos às
maiores concentrações. A exposição ao cobre também foi prejudicial ao crescimento
dos indivíduos de robalo peva. Observou-se que houve acúmulo do metal nas
brânquias dos peixes expostos, diferença não encontrada no fígado e músculo,
comparando com o grupo sem adição do metal. Glicose e cortisol mantiveram níveis
normais, indicando que tais concentrações não foram estressantes.
Palavras-chave:
ECOTOXICOLOGIA,
METAIS
ECOTOXICOLÓGICOS, CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA.
13
PESADOS,
TESTES
EFFECTS OF COPPER IN SUBLETHAL CONCENTRATIONS OF FAT SNOOK
(Centropomus parallelus) IN CHRONIC EXPOSURE
ABSTRACT
The anthropogenic processes have affected different communities through the
launch of contaminated effluents in water bodies. To verify the effects of such
contamination have been used ecotoxicological tests, which are very widespread in
the scientific. Copper can be found in the effluents of most industrial processes and
other effluent. The fat snook, Centropomus parallelus, is found from Florida/USA to
southern Brazil and is of great economic importance and used as food resources
around the coast. This study aimed to determine the effects of copper in the species
C. parallelus. The tests were performed in the laboratory of Aquatic
Ecotoxicology/UVV with specimens acquired in aquaculture. The organisms were
exposed for 30 and 60 days in treatments that have been added 13 e 26 µg Cu+2/L.
Through the comet assay and micronucleus was observed genotoxic effects of
copper, especially in individuals exposed to higher concentrations. Copper exposure
was also damaging to the growth of individuals of fat snook. Observed accumulation
of metal in the gills of exposed fish, a difference not found in liver and muscle,
compared with the group without addition of metal. Glucose and cortisol levels
remained normal, indicating that such concentrations were not stressful.
Keywords: ECOTOXICOLOGY, HEAVY METALS, ECOTOXICOLOGICAL TESTS,
WATER CONTAMINATION.
14
INTRODUÇÃO
É notória a contaminação dos corpos d’água, situação gerada pela falta
de controle dos efluentes gerados pelo homem (Bopp et al., 2008). Muitos rios e
lagos recebem diariamente uma elevada quantidade de esgoto sem tratamento ou
com tratamento ineficazes e de efluentes industriais que despejam metais pesados,
entre eles o cobre (Bopp et al., 2008), afetando os organismos aquáticos. Essa
situação é existente em vários rios, estuários e baías do mundo. Na baía de São
Francisco, Califórnia/EUA, apesar da diminuição das concentrações de cobre, ainda
são encontradas concentrações significativas desse metal (Buck et al., 2007).
Também na Baía de Vitória/ES foi verificada a presença de metais pesados, entre
eles o cobre, em peixes (Joyeux et al., 2004). No ambiente aquático os metais
transitam por diversos níveis da cadeia trófica, alcançando vários organismos, entre
eles o homem (Vieira et al., 2009; Bopp et al., 2008).
O cobre é um desses metais presente em efluentes industriais
despejados nos corpos d’água, e também desempenham funções nos organismos.
No organismo dos peixes, o cobre tem importantes funções, sendo necessário para
o metabolismo de vários nutrientes e ainda como constituinte de varias enzimas
(Ferrari et al., 2004; Oliveira et al., 2008). Porém, em altas concentrações acarretam
disfunções no organismo de peixes como a perda de apetite, crescimento reduzido,
elevada
morte
de
hemoconcentração
embriões,
massiva,
perda
de
diminuição
íons,
da
a
qual
atividade
pode
aeróbica,
resultar
na
alterações
histológicas das brânquias, fígado e rins (Oliveira et al., 2008; Gagnon et al., 2006).
Assim, se faz necessário o monitoramento dos efeitos de agentes tóxicos,
como o cobre, nos organismos. Estes testes podem ser relacionados à
genotoxicidade do xenobiótico, absorção do químico pelos indivíduos expostos,
alterações de alguns parâmetros fisiológicos, enzimáticos e histológicos.
Para este trabalho foi utilizado como organismo teste o robalo-peva,
Centropomus parallelus, peixes da família Centropomidae, que habita a região
costeira marinha, desde o Sudeste da Flóriada/EUA até Florianópolis, Sul do Brasil,
se reproduzindo em sistemas estuarinos e de água doce (Borges et al., 2010;
Tsuzuki et al., 2007).
15
Assim, o objetivo deste trabalho foi verificar os efeitos em robalo-peva,
Centropomus parallelus, da adição de baixas concentrações de cobre no meio, em
exposição crônica (30 e 60 dias), através de testes ecotoxicológicos.
16
MATERIAL E MÉTODOS
Foram adquiridos juvenis de C. parallelus de uma piscicultura particular
situada em São Mateus/ES, os quais foram transportados para o Laboratório. Nesse,
os peixes foram acondicionados e aclimatados em tanques de 500L por um período
de 15 dias com aeração contínua, sendo observada as condições de saúde dos
indivíduos e adaptação ao novo meio aquático. Para alimentação foi utilizada a
ração INVE® NRD 1,2mm, a qual foi oferecida 0,18±0,004 por aquário, 3 vezes ao
dia.
A substância para exposição foi o sulfato de cobre pentahidratado,
(CuSO4·5H2O; Sigma®). Exemplares de robalo-peva, 1,18±0,36 g e 4,83±0,53 cm,
foram adicionados à água na concentração nominal de 13 e 26 µg Cu+2/L. Houve
também o grupo exposto a concentração basal, a qual não havia qualquer adição de
cobre durante os experimentos, existindo uma pré concentração do metal.
O teste foi do tipo crônico, sendo os indivíduos de C. parallelus expostos
por 30 e 60 dias em 18 aquários de 30 litros com aeração constante, contendo 10
peixes cada. Durante o período de exposição, os peixes foram alimentados
diariamente 3 vezes ao dia, até a saciedade. O fotoperíodo foi controlado (14:10h) e
50% da água foi trocada a cada 3 dias. Para cada combinação de concentração e
tempo foram feitas 3 réplicas.
Após cada período de exposição os animais foram anestesiados com
benzocaína 1%, o sangue foi coletado por meio de punção da veia caudal com
utilização de seringas heparinizadas, sendo posteriormente cada indivíduo pesado e
medido (biometria), utilizado uma balança semi-analítica (três casas decimais) e
paquímetro, respectivamente. Após a biometria foram coletadas amostra de
músculo, brânquia e o fígado.
O sangue foi utilizado para os testes de genotoxicidade (micronúcleo e
cometa), e estresse (glicose e cortisol). Já os tecidos foram coletados para
quantificação da absorção do metal. A fim de calcular-se os parâmetros de
crescimento, foi quantificado a ração consumida em cada tratamento e suas
réplicas.
Para o teste de micronúcleo foi feito um esfregaço do sangue em lâmina,
posteriormente fixadas com metanol P.A. por 30 minutos e seguindo a coloração da
mesma com Giemsa 5% por 40 minutos (Grisolia et al., 2005). Após o preparo da
lâmina a mesma foi analisada em microscópio óptico, onde contou-se 1000 células
17
sanguíneas (eritrócitos) de cada indivíduo, a fim de se quantificar os micronúcleos
presentes.
O ensaio Cometa foi baseado em Tice et al. (2000) e Andrade et al.
(2004). O sangue foi diluído 20 vezes em tampão fosfato e posteriormente, misturouse 10ml do sangue diluído com 100ml de agarose low melting (0,15g de agarose em
20 ml de tampão fosfato alcalino, pH 7,4) a 40oC. Em seguida, uma alíquota desta
diluição foi distribuída sobre uma lâmina preparada coberta com agarose 1,5%
(1,80g de agarose e 120 ml de tampão fosfato alcalino, pH 7,4) e recobrindo-a por
uma lamínula, a qual foi retirada posteriormente a solidificação do gel. Na próxima
etapa colocou-se as lâminas em solução de lise (146,1g NaCl (2,5M), 37,2g EDTA
(100mM), 1,2g de Tris (10mM), 1 litro de água destilada e o pH da solução ajustado
para 13 com NaOH e no momento do uso adicionados 1% de Triton X-100 e 10%
DMSO) por um período mínimo de 2 horas em geladeira e protegidos da luz.
Posteriormente as lâminas foram transferidas para cuba de eletroforese com solução
tampão (300 mM NaOH e 1mM EDTA em pH>13), onde ficaram de repouso por 20
minutos e depois 15 minutos de corrida eletroforética (25V e 300mA). Estas etapas
foram feitas sem incidência de luz. Após o processo de eletrofore, as lâminas foram
fixadas em solução fixadora (15% de ácido tricloácetico, 5% de sulfato de zinco
(heptahidratado), 5% de glicerol e 1 litro de água destilada) por 10 min e distribuídas
em cubeta com solução de prata para coloração (66 ml da solução de carbonato de
cálcio (12,5g de carbonato de cálcio para 250 ml de água) e 34 ml da solução de
nitrato de prata (50mg de nitrato de prata, 50mg de nitrato de amônio, 250mg de
ácido tungstosalicílico e 125ml de formaldeído) por 15 minutos a 37oC., sendo
posteriormente analisadas em microscópio óptico.
Para a determinação de acúmulo de cobre nos tecidos, as amostras de
brânquias, de fígado e de músculo branco foram lavadas com água deionizada,
pesadas e digeridas com ácido nítrico 10% em estufa à 80oC por 24 horas. O total
de cobre nas amostras foi medido por espectrofotometria de absorção atômica com
forno de grafite, utilizando o equipamento AANALYST 800, da marca Perkin Elmer.
Os resultados foram expressos em µg/g de peso fresco. Também foi determinada a
quantidade de cobre total e dissolvido (filtrado com filtro Millipore Millex 0,45 µm) na
água de exposição.
A Glicose foi quantificada posteriormente a retirada de sangue utilizando
um aparelho digital medidor de Glicose (Accu®, Germany). Já o Cortisol foi
mensurado através do Kit Elisa de Cortisol da marca Humam®.
18
Durante os experimentos, o oxigênio dissolvido, a temperatura e a
condutividade foram mensurados com o multiparâmetro YSI 85, o pH foi medido com
um pHmetro digital (Quimis Q400). A dureza e amônia total foram medidos de
acordo com APHA (1992).
Para o cálculo de ganho de peso (GP) foi utilizada a fórmula GP=(∆peso),
a taxa de crescimento específico (TCE) foi determinada por TCE= ([ln peso final – ln
peso inicial]/tempo) x 100. Conversão alimentar (CA) foi calculado a partir da fórmula
CA= (ração consumida/GP) e o fator de condição (FC),teve seu cálculo de acordo
com a formula FC=(peso x 100/comprimento3). O coeficiente de variação (CV) do
comprimento foi determinado pela fórmula CV=(desvio padrão/média) x 100.
Foram utilizados os testes de Análise de variância de dois fatores
(ANOVA two way) e teste de Tukey (p<0,05) para determinação das diferenças
significativas
entre
os
tratamentos
testados,
comparando
as
diferentes
concentrações de cobre, o tempo de exposição e a interação entre eles. Para tais
testes foi utilizado o software SigmaStat®.
19
RESULTADOS
As características físico-químicas da água utilizada nos ensaios foram as
seguintes: pH 7,26±0,27 unidades; a temperatura 26,0±0,37ºC; a condutividade
151,2±6,28 µs/cm, concentração de oxigênio 6,89±0,59 mg/L. A dureza foi de
35,5±1,41 mg CaCO3/L e Amônia total de 2,05±0,37 mg/L.
O cobre total e dissolvido da água sem adição da substância foi de
56,05±15,51 e 38,72±8,72 µg/L, respectivamente. Nos tratamentos em que houve a
adição de 13 µg Cu+2/L, apresentou concentração total de cobre de 73,23±11,79
µg/L e dissolvido de 64,04±6,85 µg/L. Já nos que foram adicionados 26 µg Cu+2/L a
concentração de cobre total e dissolvido foi de 89,84±9,00 e 74,83±5,35 µg/L,
respectivamente.
Os peixes do tratamento sem adição de cobre apresentaram um
crescimento em peso e comprimento médio maior que os tratamentos com a adição
(tabela 1).
Tabela 1: Peso e comprimento em robalo peva (Centropomus parallelus) expostos a
diferentes concentrações de Cu+2 (0, 13 e 26 µg/L) e diferentes tempos (30 e 60 dias).
Cobre adicionado
Tempo (dias)
Peso (g)
Comprimento (cm)
(µg/L)
0
30
2,90±0,29*
6,57±0,17*
60
5,07±0,49*
7,96±0,53*
13
30
2,61±0,27
6,34±0,16
60
4,94±0,42
7,93±0,25
26
30
2,50±0,66
6,16±0,56
60
4,74±0,31
7,74±0,44
ANOVA (two-way)
Cobre (P)
0,046
0,013
Tempo (P)
<0,001
<0,001
Interação (P)
0,815
0,573
Os parâmetros de produção não apresentaram diferença significativa
entre os tratamentos com adição e o sem adição do metal (Tabela 2).
Tabela 2: Parâmetros de produção de robalo peva (Centropomus parallelus) expostos a
diferentes concentrações de Cu+2 (0, 13 e 26 µg/L) e diferentes tempos (30 e 60 dias).
Concentração de cobre (mg/L)
Parâmetros
0
0,013
0,026
Ganho de Peso (g)
3,87±0,49
3,75±0,43
3,54±0,31
TCE (%)
2,40±0,16
2,35±0,15
2,29±0,11
Conversão alimentar
0,93±0,11
0,96±0,17
1,04±0,06
Fator de condição
1,06±0,24
1,05±0,18
1,11±0,28
CV comprimento
5,26
7,07
6,76
20
O ensaio Cometa mostrou que os indivíduos expostos por 30 dias em
meio
com
incremento
de
26
µg
Cu+2/L
apresentaram
danos
no
DNA
significativamente maiores que os expostos por igual período ao grupo com adição
de 13 µg Cu+2/L e o sem adição (Tabela 3). Peixes expostos no período de 60 dias
apresentaram diferença significativa entre as duas concentrações e o grupo exposto
à concentração basal, quando analisado o comprimento da cauda, não havendo
diferenças na análise do momento da cauda.
Tabela 3: Comprimento e momento da cauda de células robalo peva (Centropomus
parallelus) expostos a diferentes concentrações de Cu+2 (0, 13 e 26 µg/L) por diferentes
tempos (30 e 60 dias).
Cobre adicionado
Comprimento da cauda
Momento da cauda
(µg/L)
30 dias
0
19,03
0,98
13
17,86
1,01
26
23,60*
1,98*
60 dias
0
11,14
0,03
13
12,60*
0,06
26
12,53*
0,05
No teste micronúcleo, os tratamentos com adição do cobre apresentaram
diferença significativa entre eles e comparado com o grupo sem adição, mas não
houve diferença entre os tempos e na interação tempo x tratamento (Figura 1). Em
30 dias o tratamento sem adição do metal apresentou média de 0,33±0,48
micronúcleos por indivíduo e 2,29±1,68 micronúcleos por indivíduo no tratamento
com adição de 26 µg/L. Na exposição por 60 dias encontrou-se 0,26±0,45 e
3,18±2,16, tratamento sem adição e com adição de 26 µg Cu+2/L, respectivamente.
21
6
Frequência de Micronúcleos (nº)
c
5
c
4
3
30
b
60
b
2
a
1
a
0
0
13
Concentração µg Cu+2/L
26
Figura 1: Número de micronúcleos
cronúcleos em robalo peva (Centropomus
Centropomus parallelus)
parallelus expostos a
+2
diferentes concentrações de Cu (0, 13 e 26 µg/L) por diferentes tempos (30 e 60 dias). As
letras indicam diferença significativa de um mesmo tratamento nos diferentes tempos (P≤
0,05).
90
80
Glicose (mg/dL)
70
60
50
40
30 dias
30
60 dias
20
10
0
0
13
26
Concentração de Cobre (µg/L)
Figura 2: Glicose (mg/dL) em robalo peva ((Centropomus parallelus)) expostos a diferentes
concentrações de Cu+2 (0, 13 e 26 µg/L) por diferentes tempos (30 e 60 dias). As letras
iguais indicam que não houve dif
diferença significativa entre os tratamentos e nos diferentes
tempos (P≤ 0,05).
Tanto a Glicose como o Cortisol não tiveram diferença significativa entre
os tratamentos e tempo de exposição, ou seja, não houve diferença nos indicadores
de estresse dos organismos expostos a diferentes conc
concentrações
entrações de cobre (Figura 2
e 3).
22
80
70
Cortisol (ng/mL)
60
50
40
30 dias
30
60 dias
20
10
0
0
13
26
Concentração de Cobre (µg/L)
Figura 3: Cortisol (ng/mL) em robalo peva ((Centropomus parallelus)) expostos a diferentes
concentrações de Cu+2 (0, 13 e 26 µg/L) por diferentes tempos (30 e 60 dias). As letras
iguais indicam que não houve dif
diferença significativa entre os tratamentos e nos diferentes
tempos (P≤ 0,05).
Não houve diferença significativa na concen
concentração
tração de cobre nas
brânquias no grupo exposto à concentração basal e tratamento com adição de 13 µg
Cu+2/L (Figura 4). O tratamento em que se adicionou 26 µg Cu+2/L apresentou
diferença
iferença significativa quando comparado aos demais
demais.. Na interação tempo x
tratamento
nto não foi observado diferença significativa. A concentração de cobre no
fígado
ígado e músculo não apresentou diferença significativa entre os tratamentos e nem
na interação tempo x tratamento (Figura 5 e 6).
Concentração de Cobre (µg/g)
250
b
200
b
150
100
a
a
30 Dias
a
a
60 Dias
50
0
0
13
26
Concentração de Cobre adicionado (µg/L)
Figura 4: Concentração de cobre nas brânquias em robalo peva (Centropomus
Centropomus parallelus)
parallelus
expostos a diferentes concentrações de Cu+2 (0, 13 e 26 µg/L) por diferentes tempos (30 e
60 dias). As letras indicam diferença significa
significativa
tiva de um mesmo tratamento nos diferentes
tempos (P≤ 0,05).
23
450
Concentração de Cobre (µg/g)
a
a
400
350
a
a
a
300
a
250
200
30 Dias
150
60 Dias
100
50
0
0
13
26
Concentração de cobre adicionado (µg/L)
Figura 5: Concentração de cobre no fígado em robalo peva (Centropomus parallelus)
expostos a diferentes concentrações de Cu+2 (0, 13 e 26 µg/L) por diferentes tempos (30 e
60 dias). As letras iguais indicam que não houve diferença significativa entre os tratamentos
e nos diferentes tempos (P≤ 0,05).
45
a
Concentração de Cobre (µg/g)
40
35
30
a
a
a
a
25
a
20
30 Dias
15
60 Dias
10
5
0
0
13
26
Concentração de cobre adicionado (µg/L)
Figura 6: Concentração de cobre no músculo em robalo peva (Centropomus parallelus)
expostos a diferentes concentrações de Cu+2 (0, 13 e 26 µg/L) por diferentes tempos (30 e
60 dias). As letras iguais indicam que não houve diferença significativa entre os tratamentos
e nos diferentes tempos (P≤ 0,05).
24
DISCUSSÃO
Os testes de toxicidade possibilitam, além do estabelecimento de limites
permissíveis de substâncias químicas para a proteção da vida aquática, avaliar o
impacto momentâneo e contínuo que esses contaminantes causam à biota dos
ecossistemas aquáticos (Aragão e Araújo, 2006).
Dentre os metais que mais tem recebido atenção da comunidade
científica está o cobre, por ser considerado um dos metais potencialmente mais
tóxico para peixes. A preocupação com o cobre em organismos aquáticos fica clara
quando são vistos os inúmeros trabalhos publicados sobre este metal (Sudo e Aiba,
1973); Nussey et al., 1995; Hall et al., 1997; Chen e Lin, 2000; Untersteiner et al.,
2003; O’Gara et al., 2004; Monterio et al., 2005; Handy e Shaw, 2006; AbdelTawwab et al., 2007; Boopp et al., 2008; Wang et al., 2009; Chairi et al., 2010.
Demonstrando uma continuidade necessária de estudos que enfoquem tal metal
para maior controle e conhecimentos dos efeitos causados por ele.
Para assegurar a qualidade da água foram observados alguns
parâmentros físico-químicos, os quais foram o pH, a temperatura, a condutividade e
a concentração de oxigênio, os quais devem ser monitorados tendo em vista que
eles podem afetar a saúde do peixe e toxicidade do químico (Carvalho e Fernandes,
2008). Esses parâmetros estavam de acordo com a qualidade da água de outros
trabalhos de exposição de peixes a metais como os de Carvalho e Fernandes,
(2008), e Monteiro et al. (2005).
As concentrações de ions divalentes de cálcio e magnésio determinam a
dureza da água. Esses cátions podem estar ligando-se às substâncias, as deixando
mais ou menos disponíveis para absorção pelos organismos (Markich et al., 2006).
No caso do cobre, quanto maior a dureza menor é a biodisponibilidade do químico
(Markich et al., 2006). A água deste trabalho possui pouca quantidade de cátions,
cálcio e magnésio, sendo uma água mole, estando disponibilizado a maior parte do
cobre adicionado (Pastrana-Martínez et al., 2010).
Segundo Randall e Tsui (2002), altas concentrações de amônia no
ambiente natural são tóxicas aos organismos aquáticos, podendo resultar em
disfunções e deve ser controlada. As concentrações de amônia total neste estudo
estiveram abaixo das concentrações reconhecidas como deletérias para vários
peixes (Randall e Tsui, 2002; Ruyet et al., 1995).
25
A diferença do crescimento dos indivíduos do grupo exposto à
concentração basal quando comparado com os dos tratamentos com adição de
cobre pode ser resultante do metal adicionado nestes. Segundo Hasen et al. (2002)
a diminuição da taxa de crescimento dos organismos expostos cronicamente a
concentrações subletais de cobre não é resposta direta de uma menor atividade
alimentar, mas sim ao consumo maior de energia pelos mecanismos de
desintoxicação, fazendo com que parte do alimento consumido seja revertido em
energia para tal fim. Resposta semelhante foi encontrado por Kim e Kang (2004),
que observaram correlação invertida entre a concentração de cobre e o crescimento,
onde os peixes expostos a concentrações de cobre, mesmo baixas, tendem a ter
crescimento menor comparado ao controle. Campagna et al. (2008) avaliou o
crescimento do Danio rerio expostos a 20, 60, 120 e 360 µg Cu+2/L, em teste agudo
(96h) e observou que mesmo em concentração baixas e exposição aguda, o cobre
compromete o crescimento e sobrevivência do organismo testado. Assim, os
organismos do presente trabalho expostos ao cobre, possivelmente, tiveram maior
gasto energético para atender a demanda dos processos de desintoxicação e
manter o metabolismo funcionando normalmente, tendo diminuído a incorporação de
parte da energia adquirida pela alimentação, resultando num menor crescimento
quando comprado com os organismos do grupo exposto a concentração basal.
Entre os tempos (30 e 60 dias) a diferença encontrada é natural, pois é
esperado que o organismo cresça no decorrer do tempo, implicando assim que em
60 dias os peixes cresceram mais que em 30 dias. Ainda, a análise comparando a
interação tratamento x tempo não apresentou diferença significativa, indicando que
os testes podem ser desenvolvidos apenas com 30 ou 60 dias, pois este menor
prazo também dará subsídios para chegar-se as mesmas conclusões, quanto ao
crescimento.
A exposição ao cobre, apesar de ter influenciado o crescimento, não
afetou significativamente o ganho de peso (GP), conversão alimentar (CA), taxa de
crescimento específica (TCE) e fator de condição (FC), parâmetros relacionados à
produção.
Em teste subcrônico, com exposição à 150 e 300 µg Cu+2/L por 15 dias,
Liu et al., (2010), observaram diferença significativa de GP e taxa de TCE em
Synechogobus hasta quando comparado com seu grupo controle. Resultado
diferente foi obtido no presente trabalho, o que pode estar relacionado às altas
26
concentrações testadas por Liu et al. (2010), sendo mais de 10 vezes maior que
neste estudo.
Testando concentrações profiláticas de sulfato de cobre (1,5 ppm),
utilizadas para controle de patógenos em piscicultura, Sanchez et al., (2006),
verificaran que este químico causa diminuição no crescimento de Ictalurus
punctatus, sendo necessário o cuidado na aplicação deste nos tanques a fim de não
comprometer a produção.
Os testes de Cometa e Micronúcleo têm sido amplamente utilizados em
trabalhos de Ecotoxicologia, havendo já publicações de vários contaminantes, sendo
testes eficientes para mensuração da genotoxicidade desses elementos (Çavas e
Konen, 2008; Frenzilli et al., 2009; Oliveira et al., 2008). A elevação do comprimento
e momento da cauda, verificado no ensaio cometa, dos peixes expostos por 30 dias
à 26 µg Cu+2/L indicaram que nessas condições, tempo e concentração, há danos
ao material genético. O mesmo foi possível verificar no comprimento da cauda dos
indivíduos expostos a 13 e 26 µg Cu+2/L por 60 dias. É possível observar que
mesmo em concentrações baixas, o cobre é genotóxico e desta forma pode
influenciar toda uma população, podendo gerar prejuízos ao material genético e
culminar em mutações irreversíveis e prejudiciais aos organismos (Cavas et al.,
2005). Essa resposta também foi encontrada por Frenzilli, et al., (2009), verificando
que embriões de Danio rerio expostos a cobre apresentaram dano ao material
genético quando avaliado por meio de teste Cometa. Atenta-se para a necessidade
de precaver principalmente a exposição de embriões ao cobre e a outros químicos a
fim de assegurar o desenvolvimento pleno dos organismos.
Micronúcleos são massas de cromatina citoplasmáticas, oriundos de
fragmentos ou cromossomos inteiros que ficaram para trás na anáfase, refletindo
problemas estruturais e/ou alterações cromossômicas durante a mitose (Cavas et
al., 2005). Nesse teste, foram observadas alterações nos padrões dos indivíduos
expostos quando comparados com o grupo sem adição de cobre, sendo elevada a
frequência de micronúcleos nos grupos com adição desse metal. Assim, verificou-se
a genotoxicidade do cobre para robalo peva. Em exposições agudas com truta arcoíris é possível verificar a maior frequência de micronúcleos nos tratamentos com
adição do cobre (Bagdonas e Vosyliene, 2006). O mesmo ocorreu em exposições
crônicas no presente estudo. Maior frequência de micronúcleos foi encontrado em
Cyprinus carpio, Carassius gibelio e Corydoras paleatus, expostos por 21 dias a
concentrações que variaram de 10 a 250 µg Cu+2/L. Estudos demonstraram também
27
aumento significativo na freqüência de micronúcleos em Anguilla anguilla L., em
exposição à 0,2 µmol Cu+2/L (27 µg Cu+2/L) por 7 dias (Oliveira et al., 2008). Yadav e
Trivedi (2009) expuseram indivíduos de Channa puncata por 7 dias a 0,407 mg
CuSO4·5H2O/L, ou seja, 100 µg Cu+2/L, sendo observado aumento significativo da
freqüência de micronúcleos.
Entre os tempos (30 e 60 dias) não houve diferença significativa, desta
forma o efeitos genotóxicos observado pelo teste micronúcleo resultantes da
exposição ao cobre em robalo peva é, estatisticamente, igual em 30 e 60 dias. Neste
caso, o teste executado em 30 ou 60 dias obtiveram os mesmo resultados, sendo
mais interessante do ponto de vista logístico que seja feito em 30 dias.
A maior frequência de micronúcleos pode está relacionada com efeitos
carcinogênicos, devendo ser observada com atenção, já que tal efeito pode causar
riscos a conservação e manutenção das espécies. Sabe-se que assegurar um
ambiente com qualidade para a conservação do é importantíssimo para
biodiversidade, oque é um apelo ambiental, mas, devido ao seu valor comercial e
qualidade de sua carne, a proteção dessa espécie é de interesse econômico
também. Então, a proteção de C. parallelus não estará apenas assegurando a
biodiversidade, mas também a economia de várias comunidades pesqueiras.
Peixes expostos a substâncias tóxicas, tal como o cobre, tendem a ativar
vários mecanismos compensatórios, dos quais alguns são mediados por respostas
não-específicas ao estresse (Monteiro et al., 2005). O Cortisol é uma dessas
respostas e tem como objetivo proteger o epitélio branquial às perdas de íons e
diminuir a permeabilidade epitelial (Monteiro et al., 2005). Indivíduos de C. parallelus
expostos nos tratamentos com incremento de 13 e 26 µg Cu+2/L apresentaram níveis
de cortisol semelhante, o que pode ser resultante do teste ser crônico. Segundo os
resultados de Monteiro et al., (2005), revelaram uma queda significativa no cortisol
plasmático de Oreochromis niloticus após 14 dias de exposição ao cobre. Isso indica
que em períodos longos de exposição os organismos podem apresentar adaptação
da sua resposta às condições do meio.
A Glicose, é uma resposta secundária ao estresse, sendo comum o
aumento dessa em decorrência de uma elevação do nível de cortisol, objetivado
pela necessidade do aumento da circulação de corticosteróides no sangue e tecidos.
No presente trabalho, as concentrações de Glicose e Cortisol não apresentaram
diferença significativa entre os tratamentos e tempo de exposição. Assim, de acordo
com as respostas de Cortisol e Glicose obtidas neste trabalho, verificou-se que a
28
exposição crônica por 30 e 60 dias em meio com adição de 13 e 26 µg Cu+2/L não
são estressantes para Centropomus parallelus.
A diferença de acúmulo de cobre nas brânquias de C. parallelus exposto
em tratamento com adição de 26 µg Cu+2/L, resultado semelhante aos encontrados
por Monteiro et al., (2005), os quais verificaram um incremento significativo de cobre
nesse tecido em O. niloticus exposto ao cobre.
Papagiannis et al. (2004) encontraram concentrações de 0,12 µgCu+2/L
no lago Pamvots, na Grécia, concentrações ainda mais baixas do que as testadas
no presente estudo. Os autores verificaram que mesmo estas baixas concentrações
causaram acúmulo de Cobre em exemplares de Cyprinus carpio. Apesar da
diferença encontrada no acúmulo de cobre nas brânquias dos tratamentos em
relação ao grupo controle, o mesmo não foi observado no fígado e músculo. Isso
indica que as concentrações de cobre adicionadas não causam acúmulo no tecido
hepático e muscular. O acúmulo observado nas brânquias pode estar relacionado
com o contato direto desse órgão com o meio contaminado, sendo mais passível a
interação com o metal e acúmulo do mesmo.
29
CONCLUSÕES
A adição das concentrações 13 e 26 µg Cu+2/L, mesmo que baixas, em
exposição crônica, afetam o crescimento do Centropomus parallelus. Ainda, essas
concentrações testadas, apesar de não serem cronicamente estressantes,
mostraram-se genotóxicas para robalo-peva.
30
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35
CAPÍTULO II
RECUPERAÇÃO DE ROBALO-PEVA (Centropomus parallelus) APÓS
EXPOSIÇÃO CRÔNICA AO COBRE
Comparative Biochemistry and Physiology - Part C: Toxicology & Pharmacology
RESUMO
A contaminação dos ambientes aquáticos é um problema notório em vários corpos
d’água do mundo, o que é gerado pela falta de controle e monitoramento dos
efluentes. Este trabalho teve como objetivo a determinação dos efeitos do cobre em
C. parallelus em exposição crônica e posterior recuperação. Os organismos foram
expostos por 30 dias em tratamentos em que foram adicionados 26 e 52 µg Cu+2/L e
posterior recuperação por 4,10 e 30 dias. Através do teste de micronúcleo foi
possível observar efeito genotóxico do cobre nos indivíduos expostos no meio com
adição de cobre, não sendo observada a recuperação após 30 dias em meio sem
adição de cobre. Foi observada acumulação de cobre em brânquias e músculo após
a exposição. Nas brânquias só houve diminuição significativa da acumulação após
30 dias, já nos músculos a recuperação já foi observada a partir de 4 dias. A
glutationa-s-transferase foi inibida nos indivíduos expostos nos tratamentos com
adição de cobre, retornando ao níveis dos expostos a concentração basal em 10
dias. Assim, o cobre apresentou-se genotóxico para Centropomus parallelus, não
havendo recuperação desse efeito após 30 dias de recuperação, acumula-se em
brânquias e músculo e inibe a atividade da GST.
Palavras-chave: ECOTOXICOLOGIA,
CONTAMINAÇÃO AQUÁTICA.
METAIS
36
PESADOS,
RECUPERAÇÃO,
RECOVERY FAT SNOOK (Centropomus parallelus) AFTER CHRONIC
EXPOSURE TO COPPER
ABSTRACT
The contamination of aquatic environments is a notorious problem in many water
bodies in the world, which is generated by lack of control and monitoring of the
effluent. This study aimed to determine the effects of copper in C. parallelus in
chronic exposure and subsequent recovery. The organisms were exposed for 30
days in treatments that have added 26 and 52 µg Cu+2/L and subsequent recovery
by 4, 10 and 30 days. Through the micronucleus test was observed genotoxic effects
in individuals exposed copper in the medium with the addition of copper, the recovery
was not observed after 30 days in medium without added copper. Copper
accumulation was observed in gills and muscle after exposure. Gills only significant
decrease in accumulation after 30 days, since the muscles recovery was already
observed after 4 days. Glutathione-s-transferase was inhibited in the exposed
individuals with addition of copper, returning to levels of exposure to basal
concentrations within 10 days. Thus, copper presented genotoxic Centropomus
parallelus, there was no recovery of this effect after 30 days of recovery,
accumulates in gills and muscle inhibited the activity of GST.
Keywords: ECOTOXICOLOGY,
CONTAMINATION.
HEAVY
37
METALS,
RECOVERY,
AQUATIC
INTRODUÇÃO
A poluição por metais pesados é um problema importante, principalmente
pela sua acumulação e persistência no meio ambiente, constituindo um risco a
conservação da biodiversidade. Os corpos d’água são os destinatários dos
poluentes produzidos por fontes naturais e antropogênicas (Fleeger et al., 2003).
Dentre os vários poluentes lançados nos corpos d’água encontra-se o
cobre. Em níveis naturais, esse metal desempenha várias funções nos organismos,
atuando no metabolismo, sendo requerido em pequenas concentrações (Ferrari et
al; 2004; Oliveira et al., 2008). Porém em altas concentrações é tóxico, gerando
vários danos ao organismo, inclusive de peixes. Entre outros efeitos deletérios o
cobre induz o estresse oxidativo, promovendo a formação de espécies altamente
reativas de oxigênio, afetando as membranas lipídicas e a integridade do DNA
(Carvalho e Fernandes, 2008).
Conhecer ainda mais os efeitos de poluentes é imprescindível, mas devese atentar também para a depuração dos organismos em condições de ausência ou
baixa poluição. Sabe-se que posteriormente a exposição, a recuperação começa
com o aumento dos processos de biossíntese (mitose e aumento da síntese de
proteínas), ajudando na reparação dos danos e distúrbios fisiológicos. Ocorre
também a fase de mobilização dos metais, executada por algumas proteínas como a
metalotioneína, e um aumento da regulação de outros caminhos para neutralizar ou
competir com os efeitos deletérios do metal, por exemplo aqueles relacionados à
regulação iônica (McGeer et al., 2000).
O robalo-peva, Centropomus parallelus, foi escolhido como organismo
teste por ser nativo, possuir importância econômica, e ser amplamente utilizado
como fonte alimentar (Tsuzuki et al., 2007). Assim, o objetivo deste trabalho foi
verificar os efeitos em robalo-peva, Centropomus parallelus, da adição de pequenas
concentrações de cobre no meio, em exposição crônica por 30 dias, e posterior
recuperação em 4, 10 e 30 dias.
38
MATERIAL E MÉTODOS
Os indivíduos de C. parallelus foram adquiridos numa piscicultura
particular situada em São Mateus/ES. Esses foram transportados para o Laboratório
onde foram aclimatados por um período de 15 dias em tanques de 500L com
aeração contínua, sendo observadsa as condições de saúde dos indivíduos e
adaptação ao novo meio aquático. Para alimentação foi utilizada a ração INVE®
NRD 1,2mm, a qual foi oferecida 2 vezes ao dia.
O teste foi do tipo crônico, sendo os indivíduos de C. parallelus expostos
por 30 dias em 36 aquários com 25 litros de água, com aeração constante, havendo
5 peixes em cada aquário. Durante o período de exposição, os peixes foram
alimentados 2 vezes ao dia. O fotoperíodo foi controlado (14:10h) e 80% da água foi
trocada a cada 1 dia. A substância para exposição foi o sulfato de cobre
pentahidratado, (CuSO4·5H2O; Sigma®). Exemplares de robalo-peva, 1,98±0,58 g e
5,96±0,64 cm, foram expostos a um meio com adição de 26 e 52 µg Cu+2/L. Houve
também o grupo com concentração basal, a qual não havia qualquer adição de
cobre durante os experimentos, existindo uma pré-concentração do metal. Foram
utilizadas 12 réplicas por tratamento.
Também foi observada a mortalidade de peixes, sendo estes retirados.
Devido à mortalidade no grupo com adição de 52 µg Cu+2/L não foi possível a etapa
de recuperação deste tratamento, a qual foi realizada com os tratamentos sem
adição de cobre e com adição de 13 µg Cu+2/L.
Após a exposição por 30 dias, os peixes de 3 réplicas de cada
concentração foram anestesiados com benzocaína 1%, o sangue foi coletado por
meio de punção da veia caudal com utilização de seringas heparinizadas, sendo
posteriormente cada indivíduo pesado e medido (biometria), utilizado uma balança
semi-analítica e paquímetro, respectivamente. Após a biometria foram coletadas
amostra de músculo, as brânquias e o fígado de cada indivíduo.
As demais réplicas foram divididas em grupos de recuperação, resultando
em 3 réplicas de cada tratamento por períodos de recuperação, os quais foram de 4,
10 e 30 dias. Após esse período foi retirado sangue, tecidos e realizada a biometria,
conforme processo supracitado.
O sangue foi utilizado para o teste de micronúcleo. As brânquias e o
músculo foram coletados para verificação da acumulação do metal e o fígado para
quantificação da Glutationa-S-transferase (GST).
39
Para o teste de micronúcleo foi feito um esfregaço do sangue em lâmina,
posteriormente fixadas com metanol P.A. por 30 minutos e seguindo a coloração da
mesma com Giemsa 5% por 40 minutos (Grisolia et al., 2005). Após o preparo da
lâmina a mesma foi analisada em microscópio óptico, onde contou-se 1000 células
sanguíneas (eritrócitos) de cada indivíduo, a fim de se quantificar os micronúcleos.
Para a determinação de acúmulo de cobre nos tecidos, as amostras de
brânquias, de fígado e de músculo branco foram lavadas com água deionizada,
pesadas e digeridas com ácido nítrico 10% em estufa à 80oC por 24 horas. O total
de cobre nas amostras foi medido por espectrofotometria de absorção atômica com
forno de grafite, utilizando o equipamento AANALYST 800, da marca Perkin Elmer.
Os resultados foram expressos em µg/g de peso fresco. Também foi determinada a
quantidade de cobre total e dissolvido (filtrado com filtro Millipore Millex 0,45 µm) na
água de exposição.
Durante os experimentos, o oxigênio dissolvido, a temperatura e a
condutividade foram mensurados com o multiparâmetro YSI 85, o pH foi medido com
um pHmetro digital (Quimis Q400). A dureza e amônia total foram medidos de
acordo com APHA (1992).
Os níveis de atividade enzimática foram realizados no tecido hepático,
utilizando a técnica descrita por Ramos-Vasconcelos e Hermes-Lima (1998),
baseando-se no seguinte protocolo: 50mM de tampão fosfato, 1mM GSH (glutationa
reduzida) pH 7,2 a 25oC. As reações iniciaram com adição de 1mM de CDNB (1cloro-,4-dinitrobenzeno). A leitura das absorbâncias foi realizada em 340nm. A
atividade absoluta foi estimada usando o coeficiente de extinção do CDNB.
Foram utilizados os testes de Análise de variância (ANOVA) e teste de
Tukey (p<0,05) para determinação das diferenças significativas entre os tratamentos
testados, comparando as diferentes concentrações de cobre e o tempo de
recuperação. Para tais testes foi utilizado o software Systat 12.
40
RESULTADOS
As características físico-químicas da água utilizada nos ensaios foram as
seguintes: pH 7,16±0,07 unidades; a temperatura 22,73±0,22ºC; a condutividade
69,2±6,71 µs/cm, concentração de oxigênio 7,96±0,08 mg/L. A dureza foi de
24,4±0,64 mg CaCO3/L e Amônia total de 0,33±0,21 mg/L. A concentração basal de
cobre, total e dissolvido, foi de 37,5±19,5 e 26,3±16,7 µg /L. Nos tratamentos em que
houve a adição de 26 µg Cu+2/L, a concentração total de cobre foi de 74,9±22,9 µg/L
e dissolvido de 63,2±21,7 µg /L. Já nos que foram adicionados 52 µg Cu+2/L a
concentração de cobre total e dissolvido foi de 109,1±21,0 e 98,5±23,8 µg/L,
respectivamente. Foi detectada na água de recuperação a concentração dissolvida
de 13,3±5,6 µg Cu+2/L, e total de 16,0±4,9 µg Cu+2/L.
No tratamento em que houve adição de 52 µg Cu+2/L, iniciou a
mortalidade de indivíduos após 9 dias de exposição (Figura 1). Já no tratamento
com adição de 26 µg Cu+2/L ocorreu a morte de peixes no 28º e 29º dia de
exposição, totalizando 91,6% de peixes mortos no tratamento com maior adição de
Mortalidade (%)
cobre e 3,3% na menor (Figura 1).
100,0
90,0
80,0
70,0
60,0
0 µg/L
26 µg/L
52 µg/L
50,0
40,0
30,0
20,0
10,0
0,0
1
3
5
7
9 11 13 15 17 19 21 23 25 27 29
Dias de Exposição
Figura 1: Mortalidade acumulada de peixes expostos a diferentes concentrações de cobre
por 30 dias.
No teste de micronúcleo, os tratamentos apresentaram diferença
significativa entre eles (Figura 2). Em 30 dias de exposição (0 dias de recuperação)
os peixes expostos a concentração basal apresentaram, em média, 1,09±0,83
micronúcleos por indivíduo, já nos tratamentos em que houve a adição de 26 µg
41
Cu+2/L, a frequência de micronúcleos foi de 3,82±2,14 e na maior concentração
adicionada foi de 10,00±5,65.
A frequência de micronúcleo não apresentou uma variação significativa
em um mesmo tratamento nos diferentes tempos de amostragem. A frequência de
micronúcleo nos peixes expostos ao tratamento com adição de 26 µg Cu+2/L, foi
significativamente maior do que os peixes expostos a concentração basal de cobre
em todos os tempos de amostragem.
Frequência de Micronúcleos (nº)
18
C
16
0 µg/L
26 µg/L
52 µg/L
14
12
10
8
Ba
6
Ba
4
Aa
2
Aa
Ba
Aa
Ba
Aa
0
0
4
10
30
Dias de Recuperação
Figura 2: Frequência de micronúcleos de peixes expostos a diferentes concentrações de
cobre por 30 dias (0 dias de recuperação) e posterior tempo de recuperação (4, 10 e 30
dias). Letras maiúsculas indicam diferença entre os grupos em um determinado tempo de
recuperação (P<0,05). Letras minúsculas indicam diferença de um determinado grupo nos
diferentes tempos de recuperação (P≤0,05).
Após 30 dias de exposição (0 dias de recuperação) a concentração de
cobre na brânquia dos peixes do tratamento com incremento de 52 µg Cu+2/L foi
significativamente maior do que a dos peixes expostos a concentração basal e a 26
µg Cu+2/L (Figura 3). Com 30 dias de recuperação, houve uma diminuição
significativa na concentração de cobre na brânquia dos peixes do tratamento 26 µg
Cu+2/L (Figura 3). A concentração de cobre na brânquia dos peixes expostos ao
tratamento basal foi semelhante ao longo do tempo, não apresentando diferença
significativa.
42
600
B
Concentração de Cobre (µg/g)
500
400
0 µg/L
26 µg/L
300
200
Ba
52 µg/L
Ba
Ba
Aa
Aa
Aa
100
Aa
Ab
0
0
4
10
Dias de recuperação
30
Figura 3: Concentração de cobre nas brânquias de peixes expostos a diferentes
concentrações de cobre por 30 dias (0 dias de recuperação) e posterior tempo de
recuperação (4, 10 e 30 dias). Letras maiúsculas indicam diferença entre os grupos em um
determinado tempo de recuperação (P< 0,05). Letras minúsculas indicam diferença de um
determinado grupo nos diferentes tempos de recuperação (P≤0,05).
Após 30 dias de exposição, os tratamentos com adição de cobre
apresentaram diferença significativa da concentração de cobre no músculo quando
comparado com o grupo em que não houve adição do metal. Logo após 4 dias de
recuperação a diferença entre o grupo com adição de 26 µg Cu+2/L
e a
concentração basal não foi mais observada, (Figura 4). A concentração de cobre no
músculo dos peixes expostos ao tratamento basal foi semelhante ao longo do
tempo, não apresentando diferença significativa.
43
100
Ba
90
80
Concentração de Cobre (µg/g)
0 µg/L
B
26 µg/L
70
52 µg/L
60
50
40
30
Aa
Aa
Ab
Ab
Aa Ab
Aa
20
10
0
0
4
10
Dias de recuperação
30
Figura 4: Concentração de cobre no músculo de peixes expostos a diferentes
concentrações de cobre por 30 dias (0 dias de recuperação) e posterior tempo de
recuperação (4, 10 e 30 dias). Letras maiúsculas indicam diferença entre os grupos em um
determinado tempo de recuperação (P<0,05). Letras minúsculas indicam diferença de um
determinado grupo nos diferentes tempos de recuperação (P≤0,05).
Posterior ao tempo de exposição, observou-se uma atividade maior da
Glutationa-S-transferase (GST) no grupo exposto a concentração basal, sendo esta
significativamente diferente dos grupos com incremento de 26 e 52 µg Cu+2/L, os
quais se mostraram semelhantes (Figura 5). Nos tempos de recuperação, em 10 e
30 dias, os níveis de GST do grupo com adição de 26 µg Cu+2/L não apresentou
diferença significativa do tratamento exposto a concentração basal (Figura 5).
44
700
600
Aa
0 ug/L
Aa
Aa
GST (nmol/min/mg proteina)
26 ug/L
500
Aa
µg/L
5652ug/L
400
Aa
Aa
300
200
Ba
Ba
Ba
Aa
100
0
0
4
10
30
Dias de Recuperação
Figura 5: Atividade da GST de peixes expostos a diferentes concentrações de cobre por 30
dias (0 dias de recuperação) e posterior tempo de recuperação (4, 10 e 30 dias). Letras
maiúsculas indicam diferença entre os grupos em um determinado tempo de recuperação
(P<0,05). Letras minúsculas indicam diferença de um determinado grupo nos diferentes
tempos de recuperação (P≤0,05).
45
DISCUSSÃO
Análises biológicas, tais como os testes de toxidade com organismos
aquáticos, tem sido cada vez mais utilizados na caracterização e concentração basal
dos resíduos provenientes de indústrias e residências lançados nos corpos d’água,
os quais podem causar impactos ao ambiente aquático, sendo estes bastante
eficazes (Cavas et al., 2005).
Qualidade da água:
A dureza da água é um fator que afeta a toxicidade dos metais, entre eles
o cobre, influenciando na sua biodisponibilidade. Elevadas concentrações de cátions
polivalentes de cálcio e magnésio diminuem a toxicidade do metal (Buratini e
Brandelli, 2006). A água utilizada nos testes é classificada como mole de acordo
com Pastrana-Martínez et al., (2010), ou seja, possuía pouca quantidade de cátions.
Isso significa que grande parte do cobre colocado nos aquários estava disponível,
podendo ser absorvida pelos indivíduos.
Elevada concentração de amônia no ambiente aquático é capaz de gerar
vários efeitos deletérios aos organismos, entrando no sistema dos indivíduos por ter
alta permeabilidade às membranas (Randall e Tsui, 2002). A concentração de
amônia total neste esteve dentro dos padrões de qualidade da água e abaixo das
concentrações reconhecidas como deletérias aos peixes (Randall e Tsui, 2002).
As demais características físico-químicas da água utilizada nos ensaios
do presente trabalho estiveram todas dentro dos padrões de qualidade de água de
trabalhos de exposição a metais. Assim, os organismos estavam em um meio sem
outros fatores que não a adição de cobre que pudesse gerar efeitos deletérios,
assegurando que os resultados obtidos são válidos para a observação da toxicidade
do cobre em C. parallelus.
Mortalidade
A mortalidade de indivíduos expostos a baixas concentrações de cobre
mostra a vulnerabilidade do organismo testado a este metal. Verifica-se um pico de
crescimento da mortandade no 9º dia de exposição, indicando o limite de suporte do
organismo a esta concentração de metal adicionado e que a adição de 52 µg Cu+2/L
em exposição crônica é altamente nociva ao robalo peva. É importante destacar que
a reta formada pela frequência de mortalidade não tende a estabilizar e/ou cair,
mostrando que não há adaptação do organismo a esta concentração gerada pela
46
adição do cobre, podenso-se supor que havendo maior período de exposição todos
os indivíduos morreriam. Assim, mesmo que pequeno, um lançamento de cobre em
determinado corpo d’água se alcançar tal concentração de cobre pode afetar
sensívelmente a população de robalo peva após certo período de exposição.
Observou-se também que ao final do período de exposição os organismos expostos
em meio com incremento de 26 µg Cu+2/L começaram a morrer também, podendo
supor que ocorreria o mesmo fenômeno do tratamento com a adição de 52 µg
Cu+2/L.
Anormalidades nucleares
Ensaio de Micronúcleo é uma ferramenta importante e eficaz para a
avaliação da genotoxicidade, uma vez que é simples, confiável, sensível e é
independente das características cariotípicas do animal de ensaio. Peixes são
excelentes organismos para o estudo do potencial efeito mutagênico ou
carcinogênico de contaminantes que podem estar presentes em amostras de água,
pois metabolizam, concentram e armazenam estes poluentes da água. Essa
anormalidade é caracterizada pelo aparecimento de massas de cromatina
citoplasmáticas, geradas por uma falha na anáfase (mitose), onde fragmentos ou
cromossomos inteiros ficam para trás (Cavas et al., 2005). A presença de células
com tal anormalidade é uma reflexão de falhas estruturais e/ou aberrações
cromossômicas numéricas surgidas durante a mitose (Cavas et al., 2005). Esta
divisão celular anormal resultaria em desequilíbrio genético nas células, que também
podem estar envolvidos na carcinogênese. Estudos comprovam que o teste
micronúcleo em peixes é uma técnica válida para monitoramento de efeitos
genotóxicos induzidos por metais pesados, inclusive o cobre (Bombail et al., 2001;
Cavas et al., 2005).
Foi possível observar o efeito genotóxico do cobre em robalo peva
exposto às concentrações testadas. Assim, os indivíduos expostos nos tratamentos
com adição de cobre apresentaram maior frequência de micronúcleos, quando
comparados com o grupo sem adição de cobre (concentração basal). Observou-se
que quanto maior a concentração de cobre em que os peixes foram expostos, maior
foi a frequência dessas anormalidades nucleares eritrocitárias. Oliveira et al., (2008),
encontrou resultado semelhante, quando expôs Anguilla anguilla L., à 27 µg Cu+2/L
por 7 dias e observou aumento significativo na frequência de micronúcleos. O
mesmo foi visto em testes com Cyprinus carpio, Carassius gibelio e Corydoras
47
paleatus, expostos ao cobre (10 – 250 µg Cu+2/L) por 21 dias, onde os indivíduos
expostos na maior concentração apresentaram aumento significativo na freqüência
de micronúcleos, tendo o cobre efeito genotóxico nessas espécies. Indivíduos de
Channa puncata expostos a 100 µg Cu+2/L, por 7 dias apresentaram aumento na
freqüência de micronúcleos nos períodos intermediários ao total de tempo de
exposição (1, 2, 3 e 4 dias), elevando o número de micronúcleos proporcionalmente
ao tempo de exposição (Yadav e Trivedi, 2009).
Levando em consideração que a maior freqüência de micronúcleos é
indicativo de problemas no DNA, refletindo em efeito carcinogênico, clastogênico e
aneugênico, é de extrema importância resguardar e monitorar os ambientes
aquáticos a fim de mantê-los com concentrações naturais de cobre, visando assim a
preservação das espécies nativas, como o robalo peva, assegurando a reprodução e
permanência dessas.
Isso é ainda mais essencial quando observa-se os resultados da
frequência de micronúcleo após 30 dias de recuperação, ou seja, em água sem
adição de cobre, onde não foi verificado a diminuição da frequência do micronúcleo.
Infere-se assim, que o robalo peva ainda que em meio sem adição de cobre não
recupera-se após 30 dias. Segundo Campana et al., (1999) a variação da frequência
de micronúcleos está relacionada com a cinética de substituição das células
sanguíneas. Logo, esse período de recuperação pode não ser suficiente para
substituição das células sanguíneas, não sendo possível a eliminação dessas
células com anormalidades.
Acúmulo de cobre
O acúmulo do cobre nas brânquias dos indivíduos expostos no tratamento
com maior adição de cobre é similar aos resultados de Grosell et al., (2004), que
verificou um incremento linear e contínuo de cobre no tecido branquial de Opsanus
beta exposto ao cobre por 30 dias.
Após 4 e 10 dias de recuperação os níveis de acumulação de cobre nas
brânquias era o mesmo que verificado depois da exposição por 30 dias no
tratamento com adição de 26 µg Cu+2/L, mostrando que nesse período não há
recuperação desse tecido. A recuperação foi observada após 30 dias em meio sem
incremento do metal.
Esse resultado na recuperação é diferente do encontrado na acumulação
do cobre no músculo. Os indivíduos expostos em meio com adição de cobre
48
apresentaram aumento da acumulação desse metal no tecido muscular, mas a
recuperação foi verificada já após 4 dias. Assim, o tempo para que o nível de cobre
no músculo seja reduzido é semelhante a dos indivíduos do grupo exposto na
concentração basal e é de 4 dias em meio sem adição de cobre.
Mostra-se assim que a brânquia possui recuperação mais lenta que o
músculo, o que pode estar relacionado com a influência que as brânquias têm na
bioacumulação de cobre, sendo um dos tecidos com maior importância na absorção
de metais (Gale et al., 2003). As brânquias tendem a acumular maiores
concentrações de cobre, o que está veiculado com a maior permeabilidade desse
tecido em relação ao músculo, resultando nessa maior concentração (Grosell et al.,
2004). Também, essa menor bioacumulação de metal no músculo pode estar
relacionado à indução de proteínas de ligação de metais, tais como a
metalotioneínas (Uysal et al., 2008).
Porém é importante frisar que enquanto exposto o tecido muscular
apresentou alto acúmulo de cobre. Se tratando de um processo contínuo de
exposição ao longo do desenvolvimento do organismo, tal acumulação pode
apresentar risco de biomagnificação, elevando os níveis de cobre naqueles que o
consumirem. No caso do robalo, esse risco é real também para população humana,
já que é um peixe bastante utilizado como fonte alimentar. Assim, este é mais um
ponto para que sejam maximizados os esforços para diminuir e controlar o
lançamento desse metal nos corpos d’água.
Mesmo que em baixas concentrações é possível que o cobre seja
acumulado
por
peixes,
podendo
gerar
efeitos
deletérios
relacionados
a
contaminação desse metal, mesmo que a médio e/ou longo prazo, não apenas aos
organismos expostos, mas também a toda cadeia alimentar. Em trabalho realizado
por Papagiannis et al. (2004), foi encontrado concentrações de 0,12 µgCu+2/L no
lago Pamvots, na Grécia, as quais resultaram em acúmulo de cobre em exemplares
de Cyprinus carpio. Também Joyeux et al., (2004) observaram em espécimes de
Centropomus sp. e
Mugil sp., na Baía de Vitória, no Brasil, acumulo de vários
metais, entre eles o cobre.
Estresse oxidativo
A GST tem importante função tanto na desintoxicação quanto na
prevenção da peroxidação lipídica.
Produtos petroquímicos, hidrocarbonetos
aromáticos policíclicos induzem a atividade deste grupo de enzimas, porém, quanto
49
ao efeito dos metais nesse grupo de enzimas, vários tipos de mecanismo de ação e
efeitos contraditórios têm sido relatados. Cunha et al. (2007) verificou significativa
redução da atividade da GST de indivíduos de Nucella lapillus expostos ao cobre.
Resposta semelhante encontrou Dautrememepuits et al. (2002), quando verificou
inibição da GST em Cyprinus carpio em exposição aguda de 96h a 100 e 250
µgCu+2/L. No presente trabalho resultados semelhantes aos estudos supracitados
foram encontrados, mesmo que em concentrações menores, sendo verificada uma
diminuição da atividade da GST nos tratamentos com adição do cobre. Isso pode ter
ocorrido pela ação direta do metal sobre a enzima, ou indiretamente pela interação
das espécies reativas de oxigênio, induzidas pela contaminação, com a enzima e
assim o esgotamento de seu substrato (Cunha et al., 2007). Assim a acumulação de
metal nas células pode resultar em diminuição da GSH (substrato da GST) devido
tanto a ligação quanto a oxidação (Cunha et al., 2007).
A inibição observada após 4 dias de recuperação pode estar relacionada
com o estresse, e assim possível desencadeamento de espécies reativas de
oxigênio, causado pela troca de água e demais atividades de manutenção
necessária para a fase de recuperação. Em 10 e 30 dias foi possível verificar a
recuperação dos níveis da atividade da GST, quando os indivíduos expostos em
meio com adição de cobre, após esses períodos, tiveram a atividade da GST
semelhante aos indivíduos expostos a concentração basal.
50
CONCLUSÕES
A adição das concentrações 26 e 52 µg Cu+2/L, mesmo que baixas, em
exposição crônica, são genotóxicas a Centropomus parallelus e mesmo após 30
dias esses prejuízo não é recuperado. Ainda, essas concentrações testadas
aumentam as concentrações de cobre nas brânquias e músculo, ou seja, é
bioacumulado. A diminuição das concentrações de cobre nas brânquias ocorre após
30 dias e no músculo 4 dias já são suficientes para a recuperação. O cobre inibiu a
atividade da GST, retornando aos níveis semelhantes ao do grupo exposto a
concentração basal entre 5 e 10 dias.
51
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