UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO NORTE
CENTRO DE BIOCIÊNCIAS
DEPARTAMENTO DE BIOQUÍMICA
TICIANA MARIA LÚCIO DE AMORIM
CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE QUE CODIFICA O
INIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA DE Erythrina velutina WILLD. CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL
FARMACOLÓGICO
NATAL
2014
TICIANA MARIA LÚCIO DE AMORIM
CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE QUE CODIFICA O
INIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA DE Erythrina velutina WILLD. CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL
FARMACOLÓGICO
Tese apresentada ao Departamento de
Bioquímica da Universidade Federal do
Rio Grande do Norte como requisito
parcial para obtenção do título de
Doutor em Bioquímica.
Orientador: Elizeu Antunes dos Santos.
Co-orientadora: Adriana Ferreira Uchôa
NATAL
2014
Catalogação da Publicação na Fonte. UFRN / Biblioteca Setorial do Centro de
Biociências
Amorim, Ticiana Maria Lúcio de.
Clonagem e expressão do gene que codifica o inibidor de quimotripsina de
erythrina velutina WILLD.: caracterização e avaliação de seu potencial
farmacológico / Ticiana Maria Lúcio de Amorim. – Natal, RN, 2014.
92 f.: il.
Orientador: Prof. Dr. Elizeu Antunes dos Santos.
Coorientadora: Profa. Dra. Adriana Ferreira Uchôa.
Tese (Doutorado) – Universidade Federal do Rio Grande do Norte. Centro
de Biociências. Programa de Pós-Graduação em Bioquímica.
1. Mulungu. – Tese. 2. Inibidor recombinante. - Tese. 3. Atividade próinflamatória. – Tese. I. Santos, Elizeu Antunes dos. II. Uchôa, Adriana
Ferreira. III. Universidade Federal do Rio Grande do Norte. IV. Título.
RN/UF/BSE-CB
CDU 577.1
TICIANA MARIA LÚCIO DE AMORIM
CLONAGEM E EXPRESSÃO DO GENE QUE CODIFICA O
INIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA DE Erythrina velutina WILLD. CARACTERIZAÇÃO E AVALIAÇÃO DE SEU POTENCIAL
FARMACOLÓGICO
Aprovada em : ___/___/___
Tese apresentada ao Departamento
de Bioquímica da Universidade
Federal do Rio Grande do Norte
como requisito parcial para obtenção
do título de Doutor em Bioquímica.
BANCA EXAMINADORA
_________________________________________
Orientador: Prof . Dr. Elizeu Antunes dos Santos
Departamento de Bioquímica – UFRN
_________________________________________
Coorientadora: Profª Drª Adriana Ferreira Uchôa
Departamento de Biologia Celular e Genética - UFRN
________________________________________
Drª Maria Fátima Grossi de Sá
Pesquisadora Embrapa – CENARGEN
________________________________________
Profª Drª Celina Maria Pinto Guerra Dore
Centro Universitário Maurício de Nassau - UNINASSAU
_______________________________________
Prof. Dr. Eduardo Henrique Cunha de Farias
Centro Universitário do Rio Grande do Norte – UNI-RN
_______________________________________
Profª Drª Janeusa Trindade de Souto
Departamento de Microbiologia e Parasitologia – UFRN
_______________________________________
Prof. Dr. João Paulo Matos
Departamento de Bioquímica - UFRN
“In this great future, you can’t forget your past”
Bob Marley
Dedico este trabalho aqueles que me apoiaram, me ergueram e torceram pelo meu
sucesso neste percurso, em especial ao professor Maurício Pereira de Sales (in
memoriam) que desde o início me ensinou, à sua maneira, muito além da pesquisa.
AGRADECIMENTOS
À minha mãe, Gisélia; e às minhas irmãs pelo apoio incondicional, pela
compreensão nas ausências e por sempre se orgulharem de mim. Se tivesse a
oportunidade de escolher uma família, vocês fariam parte da minha vida do mesmo
jeito e eu teria a mesma sorte de ter vocês em minha vida.
Ao meu companheiro, melhor amigo, namorado, Leonardo Henrique, por todo o
apoio, compreensão e paciência inesgotáveis sempre. Tenho a sorte de ter
encontrado em você o que muitos procuram. Pra sempre.
À Professora Adriana Ferreira Uchôa, por todo o apoio e atenção durante a minha
formação na pós graduação, especialmente na orientação desta tese de doutorado.
Apesar dos obstáculos que encontramos, com sua determinação, os deixamos para
trás.
Ao Professor Elizeu Antunes dos Santos que assumiu minha orientação e,
juntamente com a Professora Adriana, me apoiou em todo o processo, aumentando
minha admiração pelo professor e profissional.
À Professora Maria Fátima Grossi de Sá, por ter me recebido em seu laboratório e
ter me feito sentir como um de seus alunos, além de gentilmente participar da banca
de defesa desta tese. Não teria como agradecê-la de forma suficiente.
Ao Professor Paulo Marinho que abriu as portas do seu laboratório para a realização
dos experimentos de expressão.
Às professoras da banca de qualificação: Professora Katia Castanho Scortecci,
Professora Daniella Regina Arantes Martins Salha e Professora Janeusa Trindade
de Souto pelas valiosas contribuições, não só na tese escrita, mas também, e
principalmente, no cotidiano.
Aos professores da banca de defesa: Professor Eduardo Henrique Cunha de Farias,
Professor João Paulo Matos e Professora Celina Dore, por aceitarem participar da
banca de defesa deste trabalho
À Professora Janeusa Trindade de Souto pelas orientações na realização dos
ensaios biológicos e por aceitar participar também da banca de defesa deste
trabalho.
Ao Professor Marcello Bemquerer pela realização do sequenciamento da proteína
em estudo.
Ao amigo Leonardo Lima Pepino de Macêdo por sempre me auxiliar e me orientar
quando mais preciso. Um obrigado é muito pouco para agradecê-lo por tudo que fez
por mim.
À Virgínia Penéllope e Roberta Farias por serem amigas e família em todos esses
anos. A generosidade, apoio, amizade de vocês são presentes que ganhei e que
nunca vou ter como retribuir. As melhores amigas, com quem aprendi tanto e
continuo aprendendo.
Á Gioconda Moura, Katya Anaya e Ariane Lacerda que mesmo à distância não
deixam de se fazerem presentes e não me deixam esquecer do carinho e amizade.
À Vanessa Lima e Anderson Felipe por serem as melhores companhias todo dia, o
dia todo. As risadas, as conversas sobre qualquer assunto inútil e até as discussões
profissionais tornaram os dias mais leves. Muito obrigada aos dois que tornaram o
LQFPB 2 o melhor lab de todos.
À Paula Ivani, Luciana, Jonalson, Raphael Serquiz, Samilly e, em especial, Iana, que
foram essenciais na realização dos experimentos além de fazerem os meus dias
mais felizes.
A todos os alunos do LQFPB que tornam este grupo forte, tranquilo, melhor. Tive a
honra de conhecê-los, os que saíram e os que estão, e compartilhar com vocês
momentos tão importantes da minha vida. Obrigada a todos.
Aos colegas do Departamento de Bioquímica pela ajuda sempre que necessária.
A todos os professores e funcionários do Departamento de Bioquímica pelo apoio
que sempre encontrei quando precisei.
À Capes pelo suporte financeiro durante a minha formação.
A todos que contribuíram de maneira direta ou indireta para a realização deste
trabalho e minha formação acadêmica.
Hoje desaprendo o que tinha aprendido até ontem e que
amanhã recomeçarei a aprender. Todos os dias desfaleço e
desfaço-me em cinza efêmera: todos os dias reconstruo
minhas edificações, em sonho eternas. Esta frágil escola que
somos, levanto-a com paciência dos alicerces às torres,
sabendo que é trabalho sem termo. E do alto avisto os que
folgam e assaltam, donos de riso e pedras. Cada um de nós
tem sua verdade, pela qual deve morrer. De um lugar que não
se alcança, e que é, no entanto, claro, minha verdade, sem
troca, sem equivalência nem desengano permanece
constante, obrigatória, livre: enquanto aprendo, desaprendo e
torno a reaprender.
Cecília Meireles
(Hoje desaprendo o que tinha aprendido até ontem)
RESUMO
Proteinases são enzimas amplamente distribuídas em diferentes organismos e que
desempenham as mais diversas funções, desde a manutenção da homeostase até o
agravamento de algumas doenças como câncer, doenças autoimunes e infecções.
As proteínas responsáveis pelo controle e atuação destas enzimas são os inibidores,
que são classificados de acordo com suas proteases alvo e são encontrados desde
organismos mais simples, como bactérias, aos mais complexos, como plantas de
grande porte e mamíferos. Inibidores de proteinases de plantas agem reduzindo ou
inativando a atividade de enzimas alvo, dessa forma, estas proteínas vêm sendo
estudadas como possíveis ferramentas no tratamento de doenças relacionadas às
atividades proteásicas. Neste contexto, um inibidor de quimotripsina de Erythrina
velutina, denominado EvCI, foi previamente purificado e foi observado que esta
proteína desempenha atividades anticoagulante in vitro a anti-inflamatória em
modelo in vivo. Buscando reduzir o impacto ecológico causado pela purificação de
EvCI em grandes quantidades e facilitar o processo de obtenção desta proteína, o
inibidor de quimotripsina recombinante de Erythrina velutina foi produzido após
clonagem e expressão em células de Escherichia coli. As bactérias foram crescidas
em meio LB e após indução da expressão este material foi submetido a
procedimentos de lise celular e o produto foi aplicado em uma coluna de afinidade
de Níquel. As proteínas ligadas à coluna foram digeridas por trombina, aplicadas em
uma coluna de afinidade de Quimotripsina-Sepharose obtendo-se o inibidor
purificado, denominado recEvCI. Após eletroforese, o inibidor recombinante
apresentou uma massa molecular de, aproximadamente, 17 kDA e reduziu a
atividade de quimotripsina e elastase in vitro. O inibidor recombinante foi
sequenciado e foi detectada a presença de aminoácidos iguais a outros inibidores
depositados em banco de dados, com algumas modificações. recEvCI demonstrou
alta estabilidade quando submetido a variações de pH e sob condições redutoras,
mantendo sua atividade inibitória em torno de 80%. Esta proteína aumentou o tempo
de coagulação sanguínea in vitro por atuação sobre a via intrínseca e não
demostrou citotoxicidade contra as linhagens de fibroblasto de camundongo 3T3 e
de macrófagos RAW 264.7. recEvCI apresentou atividade microbicida relacionada à
liberação de óxido nítrico e consequente ativação de macrófagos, além de possuir
efeito pró-inflamatório avaliado pelo aumento da liberação de TNF-α. Estes
resultados indicam que recEvCI pode ser utilizado biotecnologicamente como uma
nova ferramenta no controle de doenças relacionadas à coagulação assim como
pode vir a ser um agente ativador do sistema imune em indivíduos
imunossuprimidos.
Palavras-chave: Mulungu. Inibidor
microbicida. Atividade pró-inflamatória
recombinante.
Anticoagulante.
Atividade
ABSTRACT
Proteinases are enzymes distributed widely founded in several organisms and
perform many different functions, from maintaining homeostasis to the worsening of
some diseases such as cancer, autoimmune diseases and infections. The proteins
responsible of controlling the action of these enzymes are the inhibitors, that are
classified based on their target proteases and are founded since simple organisms,
such as bacteria, to higher organisms, such as larger plants and mammals. Plant
proteinase inhibitors act by reducing or inactivating the activity of target proteases,
thus, these proteins have been studied as potential tools in the treatment of diseases
related to protease activities. In this context, an inhibitor of chymotrypsin from
Erythrina velutina, called EvCI was previously purified and it was observed that this
protein plays in vitro anticoagulant activity and anti-inflammatory activity in in vivo
model. Aiming to reduce the environmental impact caused by the purification EvCI in
high amounts and to facilitate the process of obtaining this protein, the recombinant
chymotrypsin inhibitor from Eryhrina velutina was produced after cloning and
expression in Escherichia coli. The bacteria were grown in LB medium and after
induction of the expression this material was subjected to procedures for cell lysis
and the product was applied on Nickel-affinity column. The proteins adsorbed were
digested by thrombin and applied on Chymotrypsin-Sepharose affinity column,
obtaining the purified inhibitor, named recEvCI. After electrophoresis, the
recombinant inhibitor showed an approximately molecular mass of 17 kDa, and
reduced the chymotrypsin and elastase activities in vitro. The recombinant inhibitor
was sequenced and was found similar amino acids residues when compared to other
inhibitors deposited in the database, with some modifications. recEvCI showed high
stability under pH variations and reducing conditions, maintaining its activity around
80%. This protein increased the blood coagulation time in vitro by acting on the
intrinsic pathway and did not show cytotoxicity against strains of mouse 3T3
fibroblasts and RAW 264.7 macrophages. recEvCI showed microbicide activity
related to release of nitric oxide and consequently the activation of macrophages,
futhermore having proinflammatory effects assessed by increased release of TNF-α.
These results indicate that recEvCI can be biotechnologically used as a new tool in
the control of coagulation-related diseases as well as can be an activating agent of
the immune system in immunosuppressed individuals.
Keywords: Mulungu. Recombinant inhibitor. Anticoagulant. Microbicide activity.
Proinflammatory activity.
LISTA DE FIGURAS
FIGURA 1- Erythrina velutina - mulungu. A) Sementes de mulungu. B)
Árvore.........................................................................................................................16
FIGURA 2- Distribuição de Erythrina velutina no Brasil.............................................17
FIGURA 3- Vias da cascata de coagulação...............................................................31
FIGURA 4- Diapedese e fagocitose de neutrófilos apoptóticos por
macrófagos.................................................................................................................35
FIGURA
5
Sequência
do
inibidor
de
quimotripsina
de
E.
variegata.....................................................................................................................42
FIGURA 6- Vetor de clonagem pCR 2.1 – Invitrogen.................................................44
FIGURA 7- Vetor de expressão pEt 32a....................................................................48
FIGURA 8- Extração de RNA total de semente de E. velutina...................................57
FIGURA 9- Produtos de PCR das reações para amplificação do gene de
interesse.....................................................................................................................58
FIGURA 10- Produtos de PCR das reações feitas a partir de colônias de E. coli
transformadas com EvCI/pCR2.1...............................................................................58
FIGURA 11- Análise de sequenciamento BLASTx para Inibidor de Quimotripsina
recombinante de E. velutina (EvCI)............................................................................59
FIGURA 12- Digestão da construção EvCI/pCR2.1-2................................................60
FIGURA 13- Produto de PCR de DNA plasmidial de células transformadas com a
construção EvCI/pEt32a.............................................................................................60
FIGURA 14- Perfil de eluição de recEvCI, de coluna de afinidade de Níquel Histrap
FF crude.....................................................................................................................61
FIGURA 15- Coluna de afinidade de Níquel Histrap FF crude...................................62
FIGURA 16- Perfil de eluição de recEvCI em coluna de quimotripsina-sepharose 4B
CnBr-ativada...............................................................................................................63
FIGURA
17SDS-PAGE
15%
revelado
com
nitrato
de
prata...........................................................................................................................63
FIGURA 18- Sequência proteica de recEvCI.............................................................64
FIGURA 19 - Estabilidade de recEvCI em condições desnaturantes, testados contra
quimotripsina..............................................................................................................65
FIGURA 20- Efeito de recEvCI no prolongamento do tempo de formação de coágulo
pelos testes ApTT (via intrínseca) e PT (via extrínseca)............................................66
FIGURA 21- Efeito de recEvCI sobre a viabilidade de células normais
(3T3)...........................................................................................................................67
FIGURA 22- Efeito de recEvCI sobre a viabilidade de macrófagos...........................68
FIGURA 23- Quantificação da produção de nitrito/nitrato em macrófagos RAW 264.7
induzida por diferentes concentrações de recEvCI....................................................69
FIGURA 24 - Produção de TNF-α por macrófagos....................................................70
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Proteinases: Classificação, sítios ativos e inibidores específicos..............21
Tabela 2. Classes e famílias de inibidores de proteinases........................................23
Tabela 3. Inibidores de proteinases de plantas e seus efeitos contra células
tumorais......................................................................................................................27
Tabela 4: Atividade inibitória de recEvCI contra proteases serínicas........................64
LISTA DE ABREVIATURAS/SIGLAS
ACN- Acetronitrila.
Amp - Ampicilina
APTT- Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada.
BApNa - N-α-benzoil-arginina-p-nitroanilida.
BSA - Albumina sérica bovina.
CAT - Cloranfenicol
DEMEM - Meio Eagle Modificado por Dulbecco
DMSO - Dimetilsulfóxido.
DTT - 1,4- ditiotreitol ou 1,4-bis(sulfanil)butano-2,3-diol.
EDTA – Ácido etilenodiamino tetraacético
EvCI – Inbidor de quimotripsina de Erythrina velutina
HNE – Elastase neutrofílica humana
IL - Interleucina
lFN- ɣ - Interferon gama.
iNOS - Ôxido nítrico sintase induzível.
IPTG - Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo
LPS - Lipopolissacarídeo.
MALDI - Ionização e dessorção por laser assistida pela matriz.
Miniprep – Extração de DNA plasmidial
MS - Espectrometria de massa.
NO – Óxido nítrico
NOS – Óxido Nítrico Sintase
PAGE - Eletroforese em gel de poliacrilamida.
PAMPs - Padrões moleculares associados a patógenos.
PBS - Tampão Fosfato com cloreto de sódio.
PT - Tempo de Protrombina.
recEvCI – Inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina recombinante
ROS - Espécies reativas de oxigênio.
SDS - Dodecil sulfato de sódio.
SFB - Soro fetal bovino.
TCA - Ácido tricloroacético.
TEMED - N, N, N’,N’-tetrametiletilenodiamino.
TFA - Ácido trifluoroacético.
TLR - Receptores tipo toll.
TNF-α - Fator de necrose tumoral alfa.
TOF - Analisador de massa por tempo de vôo.
Trx – Tiorredoxina.
UI – Unidades de Inibição
X-GAL - 5-bromo-4-cloro-3-indolil-beta-D-galacto-piranosídeo
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ........................................................................................... 17
1.1. Erythrina velutina – MULUNGU ........................................................... 17
1.2. ENZIMAS PROTEOLÍTICAS – PROTEASES ...................................... 20
1.2.1. Classificação das Proteinases ....................................................... 20
1.3. INIBIDORES DE PROTEINASES DE PLANTAS ................................. 22
1.3.1. Potencial biotecnológico dos inibidores de proteinases ................. 26
1.3.1.1. Importância agroeconômica .................................................. 26
1.3.1.2. Aplicações farmacológicas .................................................... 27
1.4. COAGULAÇÃO .................................................................................... 29
1.4.1. Via intrínseca ................................................................................. 30
1.4.2. Via extrínseca ................................................................................ 30
1.4.3. Via comum ..................................................................................... 31
1.5. INFLAMAÇÃO ...................................................................................... 33
1.6. JUSTIFICATIVA ................................................................................... 38
2. OBJETIVOS ............................................................................................... 40
2.1. Objetivo Geral: ..................................................................................... 40
2.2. Objetivos Específicos: .......................................................................... 40
3. MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................................... 41
3.1. MATERIAIS BIOLÓGICOS .................................................................. 41
3.1.1. Sementes de Erythrina velutina ..................................................... 41
3.2. REAGENTES ....................................................................................... 41
3.3. MÉTODOS ........................................................................................... 42
3.3.1. Extração de RNA total de sementes de E. velutina ....................... 42
3.3.2. Síntese de cDNA – RT-PCR e 3’ RACE (Rapid Amplification of
cDNA Ends) ................................................................................... 42
3.3.3. Desenho dos iniciadores (primers) ................................................ 43
3.3.4. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) ..................................... 44
3.3.5. Ligação dos insertos ao vetor de clonagem pCR 2.1..................... 45
3.3.6. Transformação de células de E. coli por choque térmico para
clonagem ....................................................................................... 46
3.3.7. Extração de DNA plasmidial .......................................................... 46
3.3.8. Sequenciamento completo do gene de inibidor de E. velutina ...... 47
3.3.9. Clonagem e Expressão do inibidor de quimotripsina em E. coli .... 47
3.3.9.1. Clonagem do gene em pCR2.1 ............................................. 47
3.3.9.2. Eletroeluição de DNA a partir de fragmentos de gel de
agarose ................................................................................. 48
3.3.9.3. Ligação do inserto ao vetor de expressão pET32a ............... 48
3.3.9.4. Expressão do inibidor de quimotripsina em pET32a ............. 49
3.3.9.5. Cromatografia de afinidade de Níquel HisTrap FF crude ...... 50
3.3.9.6. Liberação da proteína de fusão Tiorredoxina ........................ 50
3.3.9.7. Purificação de recEvCI .......................................................... 51
3.3.10.
Quantificação de proteínas .................................................... 51
3.3.11.
Análise do inibidor recombinante........................................... 51
3.3.11.1. Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)............. 51
3.3.11.2. Sequenciamento de recEvCI ................................................. 52
3.3.11.3. Preparo da solução de azocaseína 1% - Substrato............... 53
3.3.11.4. Atividade anti-quimotripsina .................................................. 53
3.3.11.5. Atividade anti-tripsina ............................................................ 53
3.3.11.6. Atividade anti-elastase .......................................................... 54
3.3.11.7. Estabilidade térmica .............................................................. 54
3.3.11.8. Estabilidade em diferentes pHs ............................................. 54
3.3.11.9. Estabilidade na presença do agente redutor DTT ................. 55
3.3.12.
Ensaios Biológicos ................................................................ 55
3.3.12.1. Cultura de células .................................................................. 55
3.3.12.2. Ensaio de viabilidade celular - MTT....................................... 56
3.3.12.3. Atividade anticoagulante in vitro ............................................ 56
3.3.12.4. Avaliação da produção de óxido nítrico por macrófagos ....... 57
3.3.12.5. Avaliação da produção de TNF-α e IL-6 por macrófagos ...... 57
3.3.13.
Análises Estatísticas.............................................................. 57
4. RESULTADOS ........................................................................................... 58
4.1. EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL, SÍNTESE DE CDNA, CLONAGEM E
EXPRESSÃO DE UM INIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA DE E.
VELUTINA............................................................................................ 58
4.1.1. Extração de RNA total de semente de mulungu ............................ 58
4.1.2. Reação da Polimerase em Cadeia para amplificação do gene de
interesse, Clonagem e Sequenciamento ....................................... 58
4.1.2.1. Amplificação do gene de interesse por PCR ......................... 58
4.1.2.2. Ligação do inserto EvCI ao vetor pCR2.1 e clonagem de
células de E. coli OMNIMAX ................................................. 59
4.1.3. Clonagem e Expressão de recEvCI em Escherichia coli ............... 60
4.1.3.1. Ligação do gene de EvCI ao vetor de clonagem pCR2.1. ..... 60
4.1.3.2. Transformação de células de E. coli BL21 DE3 pLyss .......... 61
4.1.3.3. Expressão do inibidor de quimotripsina recombinante –
recEvCI .................................................................................. 62
4.1.3.4. Purificação do inibidor de quimotripsina recombinante –
recEvCI .................................................................................. 63
4.1.3.5. Sequeciamento de recEvCI ................................................... 65
5.1.3.6. Atividade de recEvCI contra diferentes proteases serínicas ... 65
4.2. AVALIAÇÃO DA ESTABILIDADE DE RECEVCI EM DIFERENTES
CONDIÇÕES DESNATURANTES. ...................................................... 65
4.2.1. Estabilidades térmica de recEvCI em diferentes pHs e após
tratamento com DTT ...................................................................... 65
4.3. ENSAIOS BIOLÓGICOS ...................................................................... 67
4.3.1. Atividade anticoagulante ................................................................ 67
4.3.2. Avaliação de citotoxicidade para linhagem de células normais –
3T3................................................................................................. 67
4.3.3. Avaliação do efeito de recEvCI na produção de óxido nítrico por
macrófagos .................................................................................... 69
4.3.4. Avaliação do efeito de recEvCI na produção de TNF-α e IL-6 ....... 70
5. DISCUSSÃO .............................................................................................. 72
6. CONCLUSÃO ............................................................................................. 80
17
1. INTRODUÇÃO
1.1.
Erythrina velutina – MULUNGU
O gênero Erythrina compreende 115 espécies pertencentes à família
Fabaceae e à subfamília Papilionoidaea. As árvores pertencentes à espécie
Erythrina velutina podem atingir 15 metros de altura (Figura 1), e são conhecidas
popularmente como mulungu, bucaré, mulungá, variando de acordo com a região
(RAMALHO, 2008).
Figura 1. Erythrina velutina - mulungu. A) Sementes de mulungu. B) Árvore.
A)
B)
1
A) Fonte: Ramalho, 2008.
2
B) Fonte: Disponível em http://olhares.sapo.pt/erythrina-velutina-
foto1465026.html acesso em 26 de março de 2014.
Estas plantas apresentam ampla distribuição no mundo, podendo ser
encontradas desde o sul da África até o sudeste dos Estados Unidos. No Brasil, são
encontradas cerca de doze espécies, das quais oito ocorrem no Nordeste
(RAMALHO, 2008) (Figura 2).
18
Figura 2: Distribuição de Erythrina velutina no Brasil.
Fonte: Ramalho, 2008.
Muitas comunidades dependem de preparos baseados em plantas em
substituição à utilização de medicamentos comerciais (AHMAD et al., 2014). O seu
conhecimento se baseia no fato de que as plantas abrigam uma fonte inesgotável de
ingredientes ativos de valor inestimável no combate a doenças (PAREKH; CHANDA,
2007). Apesar da utilização de plantas na medicina popular ser feita geralmente a
partir do preparo de chás ou infusões, extratos de compostos ativos fitoterápicos
possuem vantagem de, apesar de estarem vinculados a outros compostos, ainda
desempenham a função para a qual são direcionadas (PAREKH; CHANDA, 2007).
No Brasil, as plantas do gênero Erythrina são utilizadas na medicina popular
principalmente no controle de doenças relacionadas ao sistema nervoso (DANTAS
et al., 2004).
Diferentes partes das árvores de Erythrina sp. produzem alcalóides que estão
envolvidos em alguns efeitos observados, tais como, ações tranquilizantes,
anticonvulsivantes, anestésicas, hipotensivas (GARÍN-AGUILAR et al., 2000;
VASCONCELOS et al., 2011; RIBEIRO et al., 2006) e ansiolíticas (RIBEIRO et al.,
19
2006). Algumas plantas possuem atividade semelhante a venenos vegetais
chamados curare, causando paralisia muscular, este efeito é atribuído às grandes
quantidades de alcalóides tetracíclicos encontrados no vegetal (AMER, 1991).
Extratos alcoólicos provenientes da casca da planta de E. velutina foram
avaliados quanto ao seu potencial antibacteriano e foi concluído que as amostras
apresentaram atividade contra Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes
(VIRTUOSO et al., 2005).Em estudo realizado por Vasconcelos et al. (2011),
extratos hidroalcoólicos da casca de Erythrina mulungu e Erythrina velutina
demonstraram possuir atividade anti-inflamatória em modelos de edema de pata em
camundongos.
Além de aplicações farmacológicas terem sido descritas a partir de extratos
da casca de plantas do gênero Erythrina, folhas e sementes também foram
analisadas. Ozawa e colaboradores (2009) isolaram 7 alcalóides de sementes de E.
velutina e analisaram o potencial citotóxico destas moléculas para células
cancerígenas, quando combinados com um dos membros da família de fator de
necrose tumoral (TRIAL- ligante indutor de apoptose relacionado a TNF) que
seletivamente induz a apoptose em uma variedade de tipos de câncer e células
transformadas sem causar danos às células normais. Entretanto, a aplicação clínica
de TRIAL individualmente é limitada, pois as células cancerígenas são resistentes
ao efeito citotóxico desta molécula.
Diferentes estudos demonstraram o efeito do extrato aquoso de folhas, o qual
causou um efeito anti-nociceptivo em ratos (MARCHIORO et al., 2005), aumentou o
tempo de sono e redução da atividade motora em ratos e camundongos (DANTAS et
al., 2004), assim como aumentou a contração muscular no modelo de indução
elétrica em íleo de Cavia porcellus (CARVALHO et al., 2009) o que indica uma
possível aplicação deste extrato em problemas como insônia e convulsões. Embora
vários efeitos tenham sido comprovados em estudos envolvendo compostos
secundários de plantas do gênero Erythrina, os mecanismos de ação que elucidam
tais efeitos ainda não foram esclarecidos (CARVALHO et al., 2009).
Outras moléculas encontradas em plantas do gênero Erythrina também foram
descritas apresentando atividades farmacológica e inseticida, como observado por
Singh et al. (2009) que purificou uma lectina de E. indica que causa interferência no
desenvolvimento de mosca da fruta (Bractocera cucurbitae). Kimura, Kouzuma e
Yamasaki (1993) purificaram, a partir de sementes de E. variegata, três inibidores de
20
proteases dentre os quais um deles inibia fortemente o ativador de plasminogênio
tecidual (t-Pa), assim como apresentaram ações anti-inflamatória e anticoagulante
(NAKAGAKI et al., 1996). Resultados semelhantes foram encontrados por Machado
et al. (2013), que detectou as mesmas atividades em um inibidor de tripsina de E.
velutina. Nesta mesma espécie também já foi descrita a ação inseticida de uma
vicilina (proteína de armazenamento) contra Plodia interpunctella e Ceratitis capitata
(AMORIM et al., 2008; MACEDO et al., 2008).
1.2.
ENZIMAS PROTEOLÍTICAS – PROTEASES
Proteases são enzimas amplamente encontradas em animais, plantas e
microrganismos, perfazendo um total de, aproximadamente, 2% de todo o produto
gênico. Estas enzimas desempenham um papel crucial na fisiologia e patologia de
diferentes organismos por meio do controle da síntese e função de proteínas (FAN;
WU, 2005), participando também em processos biológicos como na coagulação
sanguínea (JACKSON; NEMERSON, 1980), na apoptose (NUNES et al., 2005), e
também como importantes fatores no desenvolvimento de inúmeras doenças
humanas, como câncer (WANG et al., 2013; YADAV et al., 2014), artrite (YADAV et
al., 2014) e infecções parasitárias (SIBLEY, 2013).
O termo peptidase define todas as enzimas que hidrolisam ligações
peptídicas, de acordo com o Comitê de Nomenclatura da União Internacional de
Bioquímica e Biologia Molecular (NC-IUBMB, 1992). Estas enzimas são subdividas
de acordo com o local de clivagem, sendo classificadas como exopeptidases,
quando a clivagem ocorre nas porções N- ou C- terminais, e endopeptidades (ou
proteinases), quando a hidrólise ocorre em ligações no interior de cadeias
polipeptídicas.
1.2.1. Classificação das Proteinases
As proteinases, ou endopeptidases, são classificadas de acordo com os
resíduos e cofatores envolvidos em seu sítio ativo em cinco classes: Proteinase
serínicas, proteinases cisteínicas, proteinases aspárticas, metaloproteinases e
treonina endopeptidases (NC-IUBMB, 1992).
21
Proteinases Serínicas: Esta classe de enzimas possui duas famílias
distintas, a família das quimotripsinas, que incluem quimotripsina, tripsinas,
elastases e calicreínas; e a família das subtilisinas (FAN; WU, 2005). As enzimas
que pertencem a esta classe são específicas para diferentes substratos, entretanto,
o processo de hidrólise é semelhante para todas. Este ocorre em duas etapas e tem
a participação de três resíduos, os quais formam a tríade catalítica que é essencial
para o processo de clivagem das ligações peptídicas. Esta tríade é formada por
resíduos de Histidina na posição 57, Asparagina na posição 102 e Serina na posição
195 (a numeração é baseada na localização dos resíduos em quimotripsina).
Durante o primeiro passo ocorre a formação de um complexo covalente entre a Ser
do sítio ativo da enzima e a porção acil do substrato, originando um intermediário
tetraédrico, e a ligação peptídica é clivada. Em seguida, no segundo passo, ocorre
uma desacilação onde o intermediário acil-enzima é hidrolisado por uma molécula
de água liberando o peptídeo e restabelecendo a estrutura original da enzima (FAN;
WU, 2005; HAQ; ATIF; KHAN, 2004; HAQ; KHAN, 2003).
Proteinases Cisteínicas: Esta classe inclui as proteases de plantas
(papaínas e bromelaínas), diversas catepsinas de mamíferos e proteases de
parasitas (Trypanossoma, Scistossoma), sendo as papaínas as mais bem estudadas
(FAN; WU, 2005). O processo de catálise ocorre de forma semelhante ao descrito
para proteinases serínicas, há formação de um intermediário covalente e tem a
participação de resíduos de cisteína (Cys 25) e histidina (His 159), que irão
desempenhar o papel antes descrito como sendo, respectivamente, da Ser e His em
serinoproteinases (FAN; WU, 2005; HAQ; ATIF; KHAN, 2004; YOZA, et al., 2002;
KURODA et al., 2001). Proteinases cisteínicas estão envolvidas em diversos
processos biológicos, como o processamento de interleucinas (THRONBERRY et
al., 1992), e também no crescimento, replicação e virulência de protozoários,
incluindo Trypanosoma e Leishmania spp (ORDÓÑEZ-GUTIÉRREZ et al., 2009).
Proteinases Aspárticas: As enzimas que fazem parte da classe de
proteinases aspárticas são divididas em duas famílias, pepsina e proteinases virais
(retropepsina, protease do vírus da imunodeficiência humana - HIV). A primeira
compreende o maior número de proteinases tais como enzimas digestivas tipo
pepsinas, quimosinas, catepsinas D lisossomais e algumas proteases fúngicas
(FAN; WU, 2005).
22
Metaloproteinases: As metaloproteinases são consideradas as mais antigas
classes de endopeptidases descritas encontradas em fungos, bactérias e
organismos superiores. As enzimas que pertencem a esta classe diferem tanto em
relação às suas sequências quanto às suas estruturas, mas a maioria apresenta
uma característica em comum, possui um átomo de zinco em seu sítio ativo,
podendo ser encontrados outros metais como cobalto e níquel (FAN; WU, 2005).
Estas enzimas não são apenas capazes de degradar quase todos os componentes
da matriz extracelular (VIHINEN; KAHARI, 2002) como também participam de
processos fisiológicos e biológicos normais tais quais a embriogênese, a
remodelagem tecidual, a cicatrização e a angiogênese. Entretanto o envolvimento
destas proteinases também ocorre em doenças como artrite, câncer e ulceração
tecidual (SEKHON, 2010; YADAV et al., 2014).
Na tabela 1 estão descritos os diferentes sítios ativos envolvidos na ação
catalítica de cada classe de proteinase, bem como, os seus inibidores específicos,
sintéticos ou naturais.
Tabela 1. Proteinases: Classificação, sítios ativos e inibidores específicos
CLASSES
SÍTIOS ATIVOS
INIBIDORES
Proteinases Serínicas
Serina e Histidina
TPCK, TLCK, PMSF, SBTI
Proteinases Cisteínicas
Cisteína
E-64, Iodoacetamida
Proteinases Aspárticas
Envolvimento de resíduos
de carboxil
Compostos diazo
Metaloproteinases
Dependência de íons
metálicos
EDTA, Fenantrolina
Fonte: Adaptado de Fan; Wu, 2005.
1.3.
INIBIDORES DE PROTEINASES DE PLANTAS
A biossíntese e a regulação dos compostos químicos das plantas estão
associadas com os mecanismos de defesa. Este mecanismo defensivo natural é
encontrado em vários tecidos vegetais, como componentes constitutivos que fazem
parte do desenvolvimento normal da planta ou são sintetizados em resposta ao
23
ataque de patógenos ou pragas. Dentre estes compostos estão incluídos
antibióticos, alcalóides, terpenos e as proteínas (enzimas, lectinas, inibidores de
enzimas e outras) (MELO et al., 1999).
Os inibidores de proteinases são importantes ferramentas utilizadas pela
natureza para o controle da atividade de suas proteases-alvo. Estas proteínas
formam complexos reversíveis com enzimas alvo, semelhantes aos formados pelas
enzimas e substratos, levando à inativação (MOSOLOV; VALUEVA, 2011). Existem
quatro classes de inibidores de proteinases, separados de acordo com suas
atividades específicas, tais como: Inibidores de Proteinases Serínicas, Inibidores de
Proteinases Cisteínicas, Inibidores de Proteinases Aspárticas e Inibidores de Metaloproteinases. Os inibidores conhecidos e caracterizados são, em sua maioria,
inibidores de proteinase serínica, porém nos últimos anos um grande número de
inibidores de proteinase cisteínica tem sido isolado e caracterizado (BODE e
HUBER, 1992). Os inibidores de proteinases aspárticas e de metalo-proteases de
plantas são estudados em menor escala nas plantas (CARRILHO et al., 2009).
Os inibidores de proteinases serínicas de plantas são classificados em 8
famílias: Kunitz, Bowman-Birk, Batata 1, Batata 2, Inibidores de Tripsina de Abóbora,
Família dos Cereais, Inibidores de Tripsina de Mostarda e Serpinas. Os inibidores de
proteinases cisteínas são englobados na família das Fitocistatinas, enquanto que os
inibidores de proteinases aspárticas não possuem uma sub-classificação. Por fim, os
inibidores
de
metaloproteinases
são
classificados
como
Inibidores
de
Carboxipeptidases A e B (MOSOLOV; VALUEVA, 2005; RYAN, 1990). Existe uma
ampla variação entre as famílias de Inibidores de proteinases, incluindo o número de
sítios ativos e pontes dissulfeto, como descrito na Tabela 2.
24
Tabela 2. Classes e famílias de inibidores de proteinases
Proteinases
alvo
Classe de
Inibidores
Famílias de
Inibidores
Quantidade de
pontes
dissulfeto
2
Referências
Kunitz
Quantidade
de sítios
ativos
1
Serínicas
Inibidores de
Proteinases
Serínicas
Bowman-Birk
2
7
Mosolov;
Valueva, 2005
Batata 1
1
1 (Ausente em
alguns
inibidores)
Mosolov;
Valueva,
2005; Mares
et al., 1989
Batata 2
2
Variável
Mares et al.,
1989; Schirra
et al., 2009
Inibidores de
Tripsina de
Abóbora
1
3
Mosolov;
Valueva, 2005
Família dos
Cereais
1
5
Mosolov;
Valueva, 2005
Inibidores de
Tripsina de
Mostarda
1
3
Mosolov;
Valueva, 2005
Serpinas
1
3
Mosolov;
Valueva, 2005
Mosolov;
Valueva, 2005
Cisteínicas
Inibidores de
Proteinases
Cisteínicas
Fitocistatinas
1
Não possuem
Mosolov;
Valueva, 2005
Aspárticas
Inibidores de
Proteinases
Aspárticas
-
1
Variável
Ryan, 1990
Metaloproteinases
Inibidores de
Metaloproteinases
Carboxipeptidases
AeB
1
3
Ryan, 1990;
Ryan; Hass;
Kuhn, 1974
Inibidores de proteinases são proteínas amplamente expressas em plantas
superiores (VILLANUEVA et al., 1998; STEFAN et al., 2009), tendo sido encontrados
inicialmente em órgãos de reserva de plantas como sementes e tubérculos (XAVIER
– FILHO, 1992) e posteriormente em tecidos vegetativos (SHEWRY e LUCAS,
1997), e sua regulação é feita a nível transcricional (BOTELLA et al, 1996). Muitos
destes inibidores são ativos contra proteases de insetos, e sua expressão em
plantas é ativada por dano mecânico ou herbivoria, por isso, é suposta sua
participação em sistemas de defesa de plantas contra ataques de insetos
25
(VILLANUEVA et al., 1998), podendo também ocorrer em resposta a outros eventos,
como a germinação (BOTELLA et al, 1996).
Em relação à ativação da síntese de inibidores promovida pelo ataque de
insetos, acredita-se no envolvimento de hormônios vegetais que atuariam na
indução da síntese de proteínas inibitórias. Um desses hormônios é o jasmonato, o
qual teve sua participação primeiramente detectada em tomate (KOO; HOWE,
2009). Entretanto, a forma como precursores e enzimas envolvidas no metabolismo
deste hormônio são controlados em resposta à dano mecânico ou ataque de insetos
ainda é incerta.
Além da ativação da expressão de inibidores de proteinases em resposta ao
ataque de insetos e patógenos, alguns tipos de estresses abióticos também induzem
a síntese desta classe de proteínas, podendo favorecer o desenvolvimento da planta
em condições adversas (MOSOLOV; VALUEVA, 2011), como o observado em
plantas de arroz transgênicas, as quais foram induzidas a aumentar a expressão de
um inibidor de quimotripsina levando a um aumento na tolerância à seca (HUANG;
XIAO; XIONG, 2007). Resultados semelhantes foram observados quando um gene
que codifica para um inibidor de tripsina e expresso em Arabidopsis thaliana
aumentou a tolerância da planta a altas concentrações de sal (SHAN et al., 2008) e
um inibidor de proteinase cisteínica aumentou a tolerância da mesma planta para
diferentes tipos de estresses abióticos (ZHANG; LIU; TAKANO, 2008).
Em plantas, a função dos inibidores de proteinases, além de defesa, ainda
não foi esclarecida. Tais proteínas representam uma possibilidade para o controle da
atividade proteolítica e existem evidências de que inibidores agem como proteção
para tecidos específicos, atuam como proteínas de armazenamento, regulam a
atividade de proteinases e direcionam a sua liberação (HARTL et al., 2011;
MOSOLOV; VALUEVA, 2005).
Em consequência da capacidade de interação dos inibidores com proteinases
alvo, estas proteínas podem agir contra enzimas proteolíticas no interior do intestino
de insetos e parasitas despertando o interesse biotecnológico, tornando, portanto,
estas moléculas foco de estudos voltados para a sua utilização na agricultura como
inseticidas naturais. Além da importância agroeconômica, os inibidores de
proteinases
demonstram
outras
atividades,
como
anti-inflamatória
e
anticarcinogênica (LIPPMAN; MATRISIAN, 2000), indicando o seu potencial para
tratamentos de doenças (STEFAN et al., 2009).
26
1.3.1. Potencial biotecnológico dos inibidores de proteinases
1.3.1.1.
Importância agroeconômica
A frequente necessidade de aumento na produção de alimentos para suprir a
necessidade de consumo depende do desenvolvimento e aplicação de novas
biotecnologias que permitam um fornecimento rápido e eficaz (HAQ; ATIF; KHAN,
2004). Este aumento do consumo vem acompanhado de altas perdas na agricultura,
causadas por diversas pragas e patógenos, fungos, bactérias e vírus. As plantas
possuem certo grau de resistência aos insetos e, apenas um número limitado destes
é hábil para se alimentar de cada espécie individualmente (MELO et al., 1999). Esta
resistência é baseada nos vários mecanismos de defesa desenvolvidos pelas
plantas, durante a evolução, incluindo a síntese de inibidores para enzimas
digestivas (SCHULER et al., 1998; MELO et al., 1999; FÜRSTENBERG-HÄGG;
ZAGROBELNY; BAK, 2013).
Os inibidores de proteases atuam no aparelho digestivo dos insetos
diminuindo a assimilação dos nutrientes, por intermédio de uma ligação específica
com as enzimas proteolíticas do intestino impedindo a realização das funções
primordiais no processo de digestão das proteínas. Quando os insetos são
submetidos a dietas artificiais, contendo inibidores específicos, para a principal
classe de proteinases intestinais, os mesmos além de apresentarem um
desenvolvimento retardado, podem apresentar índices de mortalidade significativos
(MCMANUS e BURGESS, 1995; MELO et al., 1999; MACEDO; FREIRE, 2011).
Diversos
estudos
demonstram
efeitos
adversos
dos
inibidores
no
desenvolvimento ou na mortalidade de insetos, como evidenciam os resultados
obtidos por Cruz et al. (2013) e Rufino et al. (2013) nos quais, inibidores de tripsina
do tipo Kunitz foram efetivos tanto em testes in vivo quanto in vitro contra insetos de
diferentes ordens. Entretanto, devido à capacidade de adaptação dos insetos, a
utilização de um inibidor em conjunto com outra proteína, como a toxina Cry1Ac de
Bacillus thuringiensis, se mostrou uma abordagem mais efetiva contra Helicoverpa
armigera (LOMATE; HIVRALE, 2013).
27
1.3.1.2.
Aplicações farmacológicas
Nas últimas décadas, inibidores de proteases têm sido investigados como
agentes terapêuticos, especialmente devido à sua comprovada ação no tratamento
de infecção pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV), na hipertensão (FEAR;
KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007), além de estudos demonstrarem uma ação efetiva
de inibidores contra diferentes linhagens de células cancerígenas (FEAR;
KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007; FERREIRA et al., 2013; GARCÍA-GASCA et al.,
2002; JOANITTI; AZEVEDO; FREITAS, 2010; KOBAYASHI et al., 2004; MARÍNMANZANO et al., 2008) e também no controle da proliferação de protozoários,
incluindo L. infantum (ORDÓÑEZ-GUTIÉRREZ et al., 2009).
O uso de inibidores de protease no tratamento da síndrome da
imunodeficiência adquirida (AIDS) foi iniciado entre 1995 e 1996 e é feito em
combinação com inibidores da transcriptase reversa, buscando reduzir a carga viral
em indivíduos HIV-positivos (FEAR; KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007; SCHWARCZ
et al., 2000). Atualmente existem 8 inibidores de protease sintéticos com aprovação
para tratamento do HIV, incluindo tipranavir, indinavir, saquinavir e lopinavir (FEAR;
KOMARNYTSKY; RASKIN, 2007).
Apesar dos benefícios observados na utilização de inibidores em pacientes
soropositivos para HIV, tais como, aumento da longevidade e redução da morbidade
(MARY-KRAUSE et al., 2003), estudos demonstram a associação deste tipo de
tratamento com o aparecimento de efeitos indesejados, incluindo aumento de
resistência à insulina (MURATA; HRUZ, 2000), anormalidades no metabolismo de
lipídios (CARR et al., 1999) e aumento de risco de infarto do miocárdio (MARYKRAUSE et al., 2003), tendo sido já descrito o surgimento de variantes de HIV-1
resistentes a diferentes inibidores de protease (CONDRA et al., 1995). Em paralelo,
estudos que utilizam extratos de plantas com atividade inibitória demonstraram
resultados promissores no combate ao HIV (MATSUSE et al., 1999; MODI et al.,
2013).
Além da utilização de inibidores de protease de plantas no controle de
infecções, sejam elas virais ou parasitárias, esta classe de proteínas tem se
destacado
em
estudos
focados
em
suas
aplicações
anticancerígenas,
principalmente as proteínas pertencentes à família dos inibidores de serinoproteinases, devido à importância da atividade de proteinases serínicas no processo
28
de metástase (KOBLINSKI; AHRAM; SLOANE, 2000). A tabela 3 resume os
diferentes tipos de inibidores e o tipo de célula tumoral sobre as quais seus efeitos
foram estudados.
Tabela 3. Inibidores de proteinases de plantas e seus efeitos contra células tumorais.
Enzimas alvo
Planta de
origem
Vigna
unguiculata
Linhagem celular
cancerígena
MSF-7 (Câncer de
mama)
Efeito
Referência
Indução de
apoptose e
permeabilização
de membrana
lisossomal
Joanitti; Azevedo;
Freitas, 2010
Proteinase
tipo Trispina
Phaseolus
acutifolius
3T3/v-mos
(Fibroplasto
transformado com
oncogene)
Antiproliferativo
e citotóxico
García-Gasca et al.,
2002
Tripsina
Glycine max
HRA (Câncer de
ovário)
Supressão do
ativador de
plasminogênio
tipo-uroquinase
Kobayashi et al.,
2004
Tripsina e
Fator Xa
Crataeva tapia
DU145 e PC3 (Câncer
de próstata)
Indução de
apoptose
Ferreira et al., 2013
Proteinases
serínicas e
cisteínicas
Bauhinia
bauhinioides
MKN-28 e Hs746T
(Câncer gástrico),
HCT116 e HT29
(Câncer colorretal),
SkBr-3 e MCF-7
(Câncer de mama,
THP-1 e K522
(Leucemia)
Redução de
viabilidade
celular
Nakahata et al., 2013
Bel-7402 (Hepatoma)
Redução da
proliferação
Wang et al., 2006
Proteases
Tripsina e
Quimotripsina
CCD18-Co (Câncer de
cólon)
Redução da
proliferação
Caccialupi et al.,
2010
Inibidores de proteinases vegetais ainda demonstraram possuir atividades
antifúngica (CARRILLO et al., 2011; LOPES et al., 2009; WANG et al., 2006),
anticoagulante e anti-inflamatória (OLIVA et al., 2000).
Inibidores de proteases serínicas vegetais dos tipos Kunitz e Bowman-Birk
têm sido utilizados visando o controle enzimático em diferentes sistemas, contudo os
principais processos estudados têm sido os das reações envolvidas na coagulação,
como observado para um inibidor descrito em Bauhinia ungulata, que inibe o fator de
29
coagulação Xa, calicreína de plasma humano e calicreína tecidual (OLIVA et al.,
1999). A atividade inibitória sobre trombina e aumento no tempo de coagulação
foram descritos para inibidores de quimotripsina obtidos a partir de folhas de
Moringa oleifera (BIJINA et al., 2011) e Maclura pomnifera (LAZZA et al., 2010),
respectivamente.
Muitos estudos evidenciam a relação entre os processos de coagulação e
inflamação (MACHADO et al., 2013; OLIVA et al., 2000). Oliva et al. (2000)
descreveram um efeito anti-inflamatório in vivo quando testaram a ação do inibidor
LITI (inibidor de tripsina de Leucaena leucocephala) em camundongos, utilizando o
modelo de edema de pata, e atribuíram este efeito devido à interferência no sistema
calicreína-cinina, que está relacionado com eventos pró-inflamatórios (MOREAU et
al., 2005). Este sistema em cascata é iniciado pela clivagem do cininogênio de alto
peso molecular (HMWK), que é essencial na via intrínseca da coagulação, pela
calicreína ativada pelo fator XIIa, formando bridicinina. A liberação desta molécula
está relacionada com a intensidade da reação de um organismo à inflamação aguda,
produzindo dois sinais cardinais da inflamação, rubor e calor (MOREAU et al., 2005).
1.4.
COAGULAÇÃO
A teoria clássica da coagulação, que direciona os estudos realizados até hoje,
só foi elucidada 1900 anos após as primeiras observações sobre coagulação
sanguínea feitas por Hipócrates (SCHOENMAKERS; REITSMA; SPEK, 2005).
Sabe-se hoje que o processo de coagulação é dividido em duas fases, a
primária e a secundária, tendo como base a atuação das plaquetas. A hemostase
primária ocorre rapidamente depois de dano vascular, havendo acúmulo de
plaquetas e vasoconstrição. A hemostase secundária ocorre após exposição do fator
tecidual (TF) por células danificadas e formação de fibrina em consequência da ação
dos fatores de coagulação, que são, em sua maioria, proteinases serínicas (BATTY,
2010).
Em 1964, McFarlane elucidou o processo de coagulação sugerindo que este
ocorria em “cascata” e o dividiu em 3 vias: intrínseca, extrínseca e comum,
sugerindo que as vias intrínseca e extrínseca atuariam de forma independente na
iniciação da coagulação (BATTY, 2010), entretanto, estudos invalidaram tal
afirmação após a confirmação de que deficiências no fator XII (exclusivo da via
30
intrínseca) não estão associadas com processos hemorrágicos. Além disso, a
ativação do fator IX pode ser feito por fatores de ambas as vias (NORRIS, 2003).
1.4.1. Via intrínseca
A via intrínseca, ou de contato, é iniciada pela autoativação do fator XII (fator
Hageman) em fator XIIa, após a ligação da forma inativa em uma superfície
carregada negativamente, como a superfície de células danificadas que expõem
colágeno. O fator XIIa promove a conversão de pré-calicreína em calicreína, a
ativação do fator XI e a clivagem de cininogênio de alto peso molecular (HMWK).
Estas mudanças culminam na formação do fator IXa. O fator IXa, auxiliado pelo
FVIIIa (que está, sem sua forma inativa, associado ao fator de von Willebrand)
participam da ativação do FX, iniciando a via comum (AUSTIN, 2013; NORRIS,
2003; SCHOENMAKERS; REITSMA; SPEK, 2005). Deficiências na ativação dos
fatores XI e IX levam ao desenvolvimento de hemofilia tipo C e hemofilia tipo B,
respectivamente (FRANCHINI; MANNUCCI, 2011). O fator IX também pode ser
ativado pela formação do complexo TF/VIIa (NORRIS, 2003).
Apesar de não haver modificações relevantes quando há deficiência em
alguma das proteínas da via intrínseca, estudos recentes têm sugerido que estas
moléculas apresentam variadas aplicações no sistema vascular, como o
envolvimento da pré-calicreína e HMWK na regulação da pressão sanguínea e
fibrinólise. Fator XII pode ativar neutrófilos e regular a liberação de citocinas por
monócitos e macrófagos (NORRIS, 2003).
1.4.2. Via extrínseca
Para o início do processo de coagulação pela via extrínseca, o contato dos
fatores de coagulação encontrados no sangue com células que expressam fator
tecidual (TF) na sua superfície é necessário (NORRIS, 2003), por sua vez, estes se
ligam ao fator VII ou VIIa circulantes no plasma (BUTENAS et al., 2007; JOBLING,
2013; NORRIS, 2003). Diferente de outros fatores da cascata de coagulação, o TF
está sempre em sua forma ativada, sendo somente expresso em células lesionadas,
além disso, monócitos e células musculares lisas podem estimular a produção de TF
por meio de citocinas e outros mediadores inflamatórios (CAMERER; KOLSTO;
31
PRYDZ, 1996). A formação do complexo TF/VII possui dois substratos, o fator de
coagulação IX que é convertido em fator IXa, e o fator X (NORRIS, 2003). Na fase
de amplificação, a trombina gerada durante a fase de iniciação se liga ao seu
receptor presente na superfície de plaquetas adjacentes. Isto causa clivagem da
proteína ativadora de protease 1 (PAR-1) resultando na ativação plaquetária e no
processo de degranulação. A trombina também ativa os fatores V, XI e VIII, sendo
este último, dissociado do vWF (BATTY, 2010).
O fator VII é reconhecidamente uma molécula essencial no processo de
iniciação da casca de coagulação. Isso tem levado estudos recentes a utilizarem
fator VIIa recombinante no controle de hemofilia e hemorragia severa (JOBLING,
2013).
1.4.3. Via comum
Na via comum, quando o fator IX é ativado, pela via intrínseca ou pela via
extrínseca, forma um complexo com o fator VIIa, cálcio e fosfolipídios, conhecido
como “complexo tenase”, o qual, por sua vez, converte fator X plaquetário em Xa
(NORRIS, 2003). O fator Xa ligado à membrana de plaquetas forma um complexo
com FVa e cálcio (complexo protrombinase), responsável pela conversão de
protrombina em trombina. Grandes quantidades de trombina clivam fibrinopeptídeos
A e B, provenientes do fibrinogênio, em fibrina. Este processo expõe sítios de
reconhecimento que permitem a polimerização de monômeros de fibrina com o fator
XIII ativado por trombina, tendo como consequência a estabilização do coágulo
(BATTY, 2010; FURIE; FURIE, 2012; MONROE; HOFFMAN, 2006). A figura 3
representa as duas vias envolvidas no processo de coagulação, assim como a via
comum e os testes in vitro (APTT e PT) que quantificam o tempo de coagulação de
cada via.
32
Figura 3: Vias da cascata de coagulação.
Fonte: Adaptado de Austin (2013).
Assim como a ausência dos fatores de coagulação XI e IX levam ao
desenvolvimento de hemofilias, interferências no processo de síntese do fator VIII
causa hemofilia tipo A (FRANCHINI; MANNUCCI, 2011; SCHOENMAKERS;
REITSMA; SPEK, 2005).
Os processos de coagulação sanguínea e de inflamação são respostas
universais para a infecção, estando inter-relacionados, podendo amplificar ou
atenuar os mecanismos envolvidos no sistema de defesa do hospedeiro. Após dano
tecidual, a cascata de coagulação e o sistema fibrinolítico são ativados resultando
em um aumento da permeabilidade vascular e consequente quimiotaxia de
leucócitos (KOZIK et al., 1998; OLIVA et al., 2000). Plaquetas também são
consideradas um elo entre inflamação e coagulação, além do sistema calicreínacinina (MOREAU et al., 2005), podendo ser inibidas por óxido nítrico (IBIZA;
SERRADOR, 2008). Esta mesma molécula ainda participa da homeostase
sanguínea e inibe adesão leucocitária à células endoteliais (IBIZA; SERRADOR,
2008). Mediadores da inflamação, como a citocina IL-6, induzem a produção de
plaquetas e estas células geradas são mais sensíveis à ação de trombinas (ESMON,
2004).
33
1.5.
INFLAMAÇÃO
A inflamação consiste em uma complexa interação molecular desencadeada
por injúrias, tais como patógenos e lesão celular (WU; CHEN, 2014). Em um
indivíduo saudável, este processo atua na remoção do estímulo e promove a
reabilitação do local da lesão. Entretanto, qualquer desequilíbrio na ativação da
inflamação, torna-se a causa do agravamento de diversas doenças, por exemplo,
artrite reumatoide, diabetes, mal de Alzheimer e alguns tipos de câncer (DIAO et al.,
2014; MIHALACHE; SIMON, 2012).
O processo de inflamação envolve aumento de permeabilidade vascular,
migração de células sanguíneas e passagem de constituintes do plasma para o
tecido lesionado (WU; CHEN, 2014), sendo iniciado pelo aumento na produção de
citocinas e quimiocinas por macrófagos locais que agem de diferentes formas: (1) no
recrutamento e ativação de macrófagos adicionais ao local do dano; (2) na produção
de fatores de crescimento que promovem proliferação celular e síntese proteica; (3)
na síntese de proteases e moléculas de matriz extracelular e (4) na liberação de
fatores que podem restaurar o tecido uma vez que o reparo está completo
(DIPIETRO, 1995; WU; CHEN, 2014). As citocinas e quimiocinas promovem
recrutamento de leucócitos, especialmente neutrófilos, para o local da infecção ou
dano. Tanto macrófagos quanto neutrófilos desempenham atividade fagocítica e
causam a morte de patógenos no ambiente intracelular (MIHALACHE; SIMON,
2012).
A produção de citocinas pró-inflamatórias pelos macrófagos, como o fator de
necrose tumoral α (TNF-α) e interleucina-1, podem levar à indução da expressão de
moléculas de adesão na superfície de células endoteliais vasculares, levando à
diapedese (CARMAN; SPRINGER, 2004), sendo os neutrófilos os primeiros a
atingirem o local da lesão, seguidos por monócitos e linfócitos. Os neutrófilos
produzem uma ampla variedade de proteinases e macrófagos sintetizam espécies
reativas de
oxigênio
como
uma
linha de
defesa
contra microrganismos
contaminantes, além destas células estarem envolvidas na fagocitose de debris
celulares, que é iniciada, aproximadamente, 24 horas após o dano e contribui para a
diminuição da infecção no local (WU; CHEN, 2014). Os neutrófilos só sobrevivem na
circulação por 7 -10 horas mas sua longevidade é estendida pela ação de citocinas
(IL-6, IL-8) e produtos bacterianos, como o LPS (ALESSANDRI et al., 2013).
34
O início da resposta inflamatória ocorre com a detecção por macrófagos
locais de padrões moleculares associados a patógenos (PAMPs) ou padrões
moleculares associados a danos (DAMPs). PAMPs são motivos conservados de
patógenos e têm papel essencial na biologia destes organismos, assim, não estando
sujeitos a altas taxas de mutações (ADEREM, 2001; JANEWAY; MEDZHITOV,
1998). O reconhecimento destas assinaturas moleculares por células específicas é
essencial para uma resposta imune efetiva, pois esta interação será a base para a
diferenciação entre próprio e não-próprio. Este processo de reconhecimento é feito
por receptores de reconhecimento padrão (PRRs) em macrófagos, como os
receptores tipo Toll (TLRs) (TSAI et al., 2014).
Um outro mecanismo que ativa a ação de células de defesa é feito pelo
reconhecimento de padrões moleculares associados a danos (DAMPs), que são
moléculas produzidas a partir de células danificadas ou mortas que irão
desencadear a indução da resposta inflamatória via ativação de PRRs, como visto
para PAMPs, como TLRs e receptores para produtos finais de glicação avançada
(RAGE) (POUWELS et al., 2013; TSAI et al., 2014). A liberação destas moléculas
pode não estar associada a patógenos, como é observado na resposta inflamatória
acionada por danos no miocárdio causando infarto (HAAN et al., 2013).
Receptores tipo Toll (TLRs) são moléculas de sinalização transmembrana que
ativam programas de expressão gênica que resultam na produção de citocinas próinflamatórias e quimiocinas, interferon tipo I e fatores antimicrobianos. Além disso, a
ativação de TLR facilita e orienta a ativação da resposta imune adaptativa por meio
da ativação das células dendríticas (CANADA; MEETING, 2006). Dois membros da
família TLR participam deste processo: TLR 4 que reconhece LPS de bactérias
Gram-negativas; e TLR 2 que ativa a resposta na presença de fungos, e bactérias
Gram-positivas (JONES et al., 2001; OZINSKY et al., 2000; ROCK et al., 1998). Nos
mamíferos, a estimulação de TLR resulta na secreção de citocinas pró-inflamatórias,
tais como TNF-α e interleucina-6 (IL-6), que iniciam uma resposta inflamatória para
eliminar o organismo invasor (PLOWDEN et al., 2004).
Após o reconhecimento de patógenos, ou de danos, os macrofágos atraem e
ativam outras células imunes pela liberação de citocinas e quimiocinas. Na resposta
inflamatória inicial os macrófagos participam ativamente promovendo a captação de
debris teciduais e de células imunes mortas (CHILDS et al., 2011; MOSSER;
EDWARDS, 2009; MARTIN; PETERS; BEHAR, 2014), além de atuar como ponte
35
entre a imunidade inata e adaptativa (SHAPIRO; LUTATY; ARIEL, 2011). Estas
células ainda atuam liberando proteases, como elastase (metaloproteinase 12), que
irão degradar matriz extracelular e ainda estão envolvidas no processo de
remodelagem tecidual (NÉNAN et al., 2005). De forma geral, a função principal dos
macrófagos é manter o ambiente intersticial livre de material celular estranho
(MOSSER; EDWARDS, 2009).
Macrófagos são usualmente classificados, de acordo com o método de
ativação, em classicamente ativados (M1) ou alternativamente ativados (M2).
Células M1 são consideradas pró-inflamatórias e são acionadas por interferon γ,
produzido por células T CD4+ auxiliares - Thelper 1 (Th1), células Natural killers
(NK) ou pelo reconhecimento de moléculas associadas a patógenos (PAMPs). Estas
células após ativadas liberam óxido nítrico (VARIN; GORDON, 2009), leucotrienos e
o fator ativador plaquetário (PAF), sendo os dois últimos ativos em células distantes
e amplificam a reação inflamatória (PEREIRA et al, 1998).
Macrófagos M2 são acionados por IL-4 e/ou IL-13, produzidas por células
Th2, e produzem IL-10 e TGF-β (fator de transformação do crescimento), os quais
possuem atividade anti-inflamatória (ALESSANDRI et al., 2013; VARIN; GORDON,
2009). Nos eventos finais da resposta inflamatória, macrófagos M1 podem ser
convertidos em macrófagos M2 que irão atuar inibindo a inflamação e promovendo
reparo tecidual (ALESSANDRI et al., 2013) por meio da resolução e regeneração
após o evento inflamatório. Estas células liberam citocinas anti-inflamatórias que irão
sinalizar para o início do reparo da lesão (NOACK; MIOSSEC, 2014), além de
poliaminas e prolinas, as quais induzem proliferação e produção de colágeno,
respectivamente (CLASSEN; LLOBERAS; CELADA; 2009; MOSSER, 2003; VARIN;
GORDON, 2009). Os macrófagos ainda removem restos celulares e neutrófilos
apoptóticos, assim como secretam fatores de crescimento angiogênicos e
fibrogênicos que reparam o tecido danificado finalizando a inflamação (Figura 4)
(PLOWDEN et al., 2004; WU; CHEN, 2014).
36
Figura 4: Diapedese e fagocitose de neutrófilos apoptóticos por macrófagos.
Fonte: SERHAN; CHIANG; DYKE (2008).
Assim como citocinas e quimiocinas, o óxido nítrico (NO) produzido e liberado
por macrófagos também tem uma importante participação no combate a patógenos
e no processo inflamatório. O NO é uma radical gasoso de vida curta, originado a
partir do aminoácido L-arginna (FANG; TORRES, 2002), que pode ser sintetizado
por três enzimas diferentes, NOS induzida (iNOS), NOS endotelial (eNOS) e NOS
neuronal (nNOS) (XU et al., 2002). Embora eNOS e nNOS sejam constitutivamente
expressas e dependentes de Ca2+, a NOS expressa pelos macrófagos (iNOS) é
independente de Ca2+ (CHANG; LIAO; KUO, 1998). O óxido nítrico produzido,
quando
em
contato
com
água,
reage
com
oxigênio
moderadamente estáveis, ânions estáveis, óxidos e
formando
ânions
superóxidos instáveis
(MACMICKING; XIE; NATHAN, 1997).
O óxido nítrico pode atuar em vários processos biológicos como
vasodilatação, imunidade mediada por macrófagos, atuando em mecanismos
microbicidas de fagócitos (CHI et al., 2003; XU et al., 2002), na regulação da
proliferação de linfócitos T e secreção de citocinas durante a resposta imune
adaptativa (IBIZA; SERRADOR, 2008).
37
Na presença de agentes microbianos o óxido nítrico pode agir de diferentes
formas. Esta molécula danifica enzimas contendo gupo heme, pode inibir a
replicação bacteriana ligando-se diretamente ao DNA de dupla fita causando
desaminação e quebra, assim como podem romper metaloproteínas envolvidas na
síntese de DNA. Frente à infecções virais, NO prejudica a replicação e ativação de
proteases envolvidas na entrada do vírus em células alvo (IBIZA; SERRADOR,
2008). As ações antimicrobiana e citotóxica de NO são reforçadas por outros
produtos dos macrófagos, tais como glutationa, cisteína, peróxido de hidrogénio ou
ânions superóxido (MACMICKING; XIE; NATHAN, 1997).
A ativação de macrófagos e consequente liberação de óxido nítrico envolve
diferentes vias, umas delas se baseia na formação de espécies reativas de oxigênio
(ROS) que desencadeia a ligação de NF-κB (fator nuclear kappa B) ao DNA
ativando a expressão de iNOS (DIAO et al., 2014), podendo também inibir a ligação
deste fator de transcrição ao DNA (IBIZA; SERRADOR, 2008)
Proteinases serínicas desempenham um papel fundamental na resposta
inflamatória, como as enzimas vasoativas, mediadoras na coagulação e fibrinólise e
intermediários no sistema complemento. Quando ocorre excesso na resposta
inflamatória, os inibidores de proteinases de plantas podem ser utilizados como uma
ferramenta
farmacológica
KOMARNYTSKY;
RASKIN,
no
restabelecimento
2007),
considerando
da
a
homeostase
diversidade
(FEAR;
observada
relacionada à aplicação de inibidores de proteinase de plantas em estudos voltados
para uma aplicação biotecnológica, em especial, farmacológica (CARRILLO et al.,
2011; HARTL et al., 2011; KOBAYASHI et al., 2004; LAZZA et al., 2010).
Considerando o aumento mundial na utilização de fitoterápicos, e que 25%
dos fármacos utilizados em alguns países são de origem natural, os países que
possuem em seu território uma grande biodiversidade têm a oportunidade de
explorar este potencial e aplicar na produção de medicamentos. A descoberta de
novas moléculas vegetais que demonstrem atividades relacionadas ao controle de
alguma doença ainda não é bem estabelecida no Brasil, ao contrário do visto em
outros países como China, Estados Unidos e Alemanha (FUNARI; FERRO, 2005).
Entretanto, o governo brasileiro está buscando reverter este fato, estabelecendo
programas de apoio às pesquisas que foquem neste aspecto, o que é corroborado
pela fabricação nacional do anti-inflamatório Acheflan, feito a partir de folhas de
Cordia verbenácea (BARREIRO; BOLZANI, 2009).
38
1.6.
JUSTIFICATIVA
Embora seja errôneo acreditar que medicamentos à base de plantas sejam
completamente seguros e livres de efeitos colaterais, efeitos adversos de
fitoterápicos são observados em menor escala quando comparados às drogas
comuns (LUIZE et al., 2005). Diversos estudos corroboram estes dados, como
comprovado na utilização de diferentes anticoagulantes em humanos e roedores
(heparina e varfarina) (MORISHIMA et al., 2013; WALENGA; BICK, 1998) e também
no tratamento com anti-inflamatórios (inibidores da COX - ciclooxigenases 1 e 2), os
quais podem causar problemas gastrointestinais, problemas renais e afetar o
processo de coagulação (DINARELLO, 2010; MORISHIMA et al., 2013). Dessa
forma, estudos se concentraram na descoberta de moléculas vegetais visando uma
alternativa segura no controle de doenças.
Plantas do gênero Erythrina se destacaram neste contexto devido à utilização
de extratos com aplicações calmante, anticonvulsivante e anti-inflamatória
conhecidas na medicina popular (DANTAS et al., 2004; VASCONCELOS et al.,
2011), além de proteínas purificadas de sementes também apresentarem
citotoxicidade contra células cancerígenas e atividades anticoagulante e antiinflamatória. Esta planta é amplamente distribuída nas regiões Nordeste e CentroOeste podendo ser encontradas nos mais diversificados biomas, desde a mata
atlântica até a caatinga (RAMALHO, 2008).
A utilização de plantas no tratamento de doenças, apesar de ser uma prática
popular comum, ainda não contava com o apoio do Ministério da Saúde, até a
criação do Programa de Pesquisas de Plantas Medicinais em 1982, tendo sido
precedido pela Portaria 212 (11 de setembro de 1981) que define o estudo das
plantas medicinais com uma das prioridades da investigação clínica, e finalmente
consolidado pela criação da Política Nacional de Plantas Medicinais e Fitoterápicos,
de 22 de junho de 2006 (AMARAL et al., 2006). A partir deste evento, a utilização de
fitoterápicos pelo Sistema Único de Saúde (SUS) foi iniciada unindo o conhecimento
popular de fitoterápicos com experimentos científicos, levando à amplificação do
conhecimento popular e valorização da flora nacional.
As moléculas envolvidas na ação farmacológica das plantas são de diferentes
origens, podendo ser metabólitos secundários (como alcalóides) e proteínas. A
extração e utilização de tais plantas na medicina são regidas por normas
39
estabelecidas pelo Ministério da Saúde (AMARAL et al., 2006), sendo, dessa forma,
extremamente útil a síntese destas moléculas de formas alternativas, as quais
evitariam a degradação do ecossistema e poderiam aumentar a obtenção das
moléculas em sua forma purificada.
Os sistemas de produção tradicionais de proteínas recombinantes, uma
alternativa na produção destas moléculas de maneira heteróloga à sua síntese
natural, que utilizam culturas celulares de mamíferos enfrentam inconvenientes
relacionados ao custo e demanda, e novos sistemas de produção, como culturas
celulares de insetos ou animais transgênicos, são susceptíveis a problemas
relacionados à segurança e autenticidade do produto (BAUR et al., 2005).
Inegavelmente, Escherichia coli tem sido o organismo mais utilizado em estudos de
expressão por apresentar diversas vantagens quando comparado a outros sistemas,
como rápido crescimento, fácil manipulação, expressar proteínas recombinantes em
larga escala, dentre outras vantagens (CHOI et al, 2006; YOON et al, 2010).
Inibidores de proteases provenientes de plantas do gênero Erythrina foram
previamente clonados e expressos em E. coli (KOUSUMA, YAMASAKI e KIMURA,
1997; HUNG et al., 2007; STEFAN et al., 2009), destacando a produção de
inibidores de quimotripsina recombinantes, e foi verificado o seu efeito contra
proteases alvo (KURAMITSU et al., 1996), indicando que a proteína recombinante
preserva as mesmas propriedades da proteína nativa, como também observado no
presente trabalho, no qual, o gene do inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina
(EvCI) foi clonado e expresso em E. coli. Em estudo previamente realizado, este
inibidor possui atividade anticoagulante, atuando sobre a via intrínseca da
coagulação, e atividade anti-inflamatória em modelo de sepse (MONTEIRO, 2011).
O inibidor recombinante, recEvCI, manteve a atividade contra quimotripsina,
além de demonstrar atividade anticoagulante sobre a via intrínseca, de maneira
semelhante ao observado para EvCI, adicionalmente a proteína possui atividade
pró-inflamatória sobre macrófagos, o que não foi testado para o inibidor natural. Com
base nestes resultados, recEvCI pode ser aplicada biotecnologicamente como uma
nova ferramenta na produção de fitoterápicos visando uma ação farmacológica
baseada nos resultados sobre os processos de coagulação e inflamação obtidos
neste estudo, considerando que os atuais meios de tratamento de doenças
relacionados a estes processos são causadores de diversos efeitos colaterais.
40
2. OBJETIVOS
2.1.
OBJETIVO GERAL:

Avaliar a atividade bioquímica e o potencial farmacológico do inibidor
de quimotripsina Erythrina velutina recombinante.
2.2.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

Clonar e expressar o inibidor de quimotripsina em Escherichia coli a
partir de cDNA produzido de mRNA de sementes prematuras de E. velutina;

Purificar, determinar a massa molecular e estrutura primária do inibidor
de quimotripsina recombinante;

Identificar a atividade inibitória contra diferentes proteinases alvo;

Caracterizar a proteína quanto à sua estabilidade em condições
desnaturantes (pH, temperatura e tratamento com DTT);

Determinar possível citotoxicidade do inibidor recombinante sobre
linhagens celulares;

Avaliar o efeito e a via de atuação do inibidor purificado sobre a
coagulação sanguínea in vitro;

Identificar a ação microbicida in vitro, através da produção de óxido
nítrico por macrófagos ativados;

Avaliar o potencial de recEvCI no processo inflamatório por meio da
quantificação de TNF-α e IL-6.
41
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1.
MATERIAIS BIOLÓGICOS
3.1.1. Sementes de Erythrina velutina
Sementes imaturas de Erythrina velutina foram cedidas pela Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária – EMBRAPA (CENARGEN – Centro Nacional
de Recursos Genéticos). Estas sementes foram utilizadas por possuírem uma maior
quantidade de mRNA, visto que os inibidores são expressos durante a germinação.
3.2.
REAGENTES
Albumina sérica bovina, azocaseína, dimetilsulfóxido (DMSO), ditiotreitol
(DTT), dodecil sulfato e sódio (SDS), quimotripsina pancreática bovina, tripsina
pancreática bovina, trombina do plasma humano, sepharose-4B, TEMED (N, N, Ntetrametiletilenodiamino),
triton
X-100,
álcool
isopropílico,
EDTA
(Ácido
etilenodiamino tetraacético), azul de bromofenol, coomassie brilliant blue R-250,
ácido trifluoroacético, imidazol e acetonitrila foram obtidos da Sigma-Aldrich. RNAse,
reagentes para a reação de PCR e Trizol. foram adquiridos da Life Technologies e
da Thermo Scientific, respectivamente. Acrilamida, bis-acrilamida e persulfato de
amônio foram obtidos da GE Healthcare.
Ácido tricloroacético foi obtido da VETEC Química Fina Ltda, Rio de Janeiro,
Brasil.
Padrão de massa molecular, Coomassie Brilliant Blue G-250 e pepsina de
estômago suíno imobilizada foram obtidos da Fermentas Life Sciences, Bio Agency
Biotecnologia Ltda e Thermo Scientific, respectivamente.
Para os ensaios de avaliação de atividade anticoagulante, foi utilizado kit
fabricado por Wiener Lab Group.
Todos os outros reagentes utilizados neste trabalho foram de grau analítico e
manuseados segundo as recomendações do fabricante.
42
3.3.
MÉTODOS
3.3.1. Extração de RNA total de sementes de E. velutina
A extração de RNA total foi feita seguindo a metodologia descrita por
Chomczynski e Sacchi (1987). Semente de E. velutina foi macerada e pulverizada
mecanicamente em nitrogênio líquido em almofariz e pistilo, mantendo-a sempre
congelada. O pó foi transferido para microtubos de 1,5 mL previamente congelados
em nitrogênio líquido e pesados para uma massa final de 100 mg. Aos tubos foi
adicionado Trizol (Guanidínio tiocianato-fenol-clorofórmio) os quais foram misturados
lentamente por inversão e mantidos por 5 min à temperatura ambiente. O material foi
centrifugado a 12.000 x g por 10 min à temperatura ambiente e o sobrenadante
contendo o RNA total foi transferido para microtubos novos. Em seguida foram
adicionados 200 µL de clorofórmio e as amostras foram homogeneizadas
vigorosamente em vórtex por aproximadamente 1 min, sendo, em seguida,
incubados à temperatura ambiente por 3 min. O material foi centrifugado a 12.000 x
g por 15 min, a fase aquosa foi transferida para novos eppendorfs e foram
adicionados 500 µL de álcool isopropílico sendo misturado por inversão. A mistura
foi incubada 10 minutos à temperatura ambiente, centrifugada 12.000 x g por 10 min,
o sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com 1 mL de etanol a 75%,
centrifugado novamente a 7500 x g por 10 min. O sobrenadante foi descartado e o
precipitado seco a temperatura ambiente até ficar translúcido. O RNA total foi
ressuspenso cuidadosamente em aproximadamente 100 µL de água ultra pura. A
integridade do RNA foi verificada em gel de agarose 1%.
3.3.2. Síntese de cDNA – RT-PCR e 3’ RACE (Rapid Amplification of
cDNA Ends)
Para a síntese do cDNA correspondente ao mRNA de E. velutina, 1 µg de
RNA total (2 µL), 2 µL de oligonucleotídeo nv_dT e água ultra pura em uma
quantidade suficiente para 11 µL foram incubados a 70 °C por 3 minutos em
termociclador (BioRad) sendo, em seguida, transferidos para gelo por 3 minutos.
Após este período de incubação foram adicionados tampão de reação (Tris-HCl
43
50mM pH 8,3), ditiotreitol 0,1M, inibidor de RNAse e desoxirribonucleotídeos
fosfatados (dNTP) e o material foi incubado a 42 °C por 2 minutos em termociclador.
Em seguida 1 µL de transcriptase reversa do vírus da leucemia murina de Moloney
(M-MLV - Invitrogen) foi adicionado e incubado a 42 °C por 1 hora em termociclador,
então RNAse H foi adicionada e incubado a 37 °C por 15 minutos, sendo o material
congelado a -20 °C. O iniciador utilizado, nv_dT, é composto por repetições de
Timina, que irão reconhecer a cauda poli-A na região 3’ de mRNAs. A amplificação
do cDNA foi feita por PCR, como descrito no item 4.3.4.
3.3.3. Desenho dos iniciadores (primers)
Amplificação e clonagem: Os iniciadores utilizados para amplificação do
cDNA do inibidor de quimotripsina de E. velutina foram desenhados utilizando-se a
sequência completa do inibidor de quimotripsina de E. variegata depositada no
banco de dados “GenBank” do “National Center for Biotechnology Information” –
NCBI, código de acesso AAB25433.1 (Figura 6) e foram nomeados da seguinte
forma:
I-
Iniciador
degenerado
senso
(Inib_Quimtrp_Fw)
-
antisenso
(Inib_Quimtrp_Rv1)
–
antisenso
(Inib_QuimTrp_Rv2)
-
CARCCNYTNGTNGAYYTNGARGG;
II-
Iniciador
degenerado
ACNAGYTCNARNGGRTTRTC
III-
Iniciador
degenerado
RTCRTCYTCNCGYTGRCARTA
Onde: Y – Representa a adição de qualquer pirimidina; R – adição de qualquer
purina e N – qualquer nucleotídeo.
Figura 5. Sequência do inibidor de quimotripsina de E. variegata
EPLVDLEGNLVENGGTYYLLPHIWALGGGIEAARTGKETCPLTVVQSPFEVSNG
EPIRIASQFLSTFIPDGSPYAIGFANPPSCAASPWWTVVETSEGLAVKLLEHKTP
EEDDTKFKFQKVSSPNRYVYNLSYCQREDDDLKCDQYIGIRRDAKGYRRLVVT
NDNPLELVLVKANSPSQ
Sequência de ECI depositada no GenBank com código de acesso AAB25433.1. Em lilás: Molde para
iniciador senso. Em amarelo: Molde para iniciador antisenso 2. Em verde: Molde para iniciador
antisenso 1.
44
Para a clonagem foram utilizadas duas metodologias. Na primeira foram feitas
2 reações consecutivas: Reação 1 teve como molde o cDNA produzido
anteriormente e os iniciadores foram Inib_Quimtrp_Fw e Inib_Quimtrp_Rv1; Reação
2 teve como molde os produtos da reação 2 e os iniciadores foram Ev_AP e
Inib_QuimTrp_Rv2, onde Ev_AP foi utilizado como sequência âncora para o
iniciador Inib_Quimtr_Fw. As reações de PCR foram feitas como descrito
posteriormente no item 4.3.4.
A segunda metodologia foi feita a partir dos resultados obtidos e confirmação
por sequenciamento de que o gene não estava íntegro, foi desenhado um novo
iniciador visando obter a sequência do gene do inibidor de interesse. Dessa forma, o
seguinte
iniciador
para
EvCI
foi
produzido:
Fw2_InibQuimo
–
CAGCCGCAGTCGACCTTGAGG e a reação de PCR foi feita utilizando como molde
cDNA. O iniciador antisenso foi nv_dT, conseguindo, assim, o segmento de DNA. A
mesma reação foi feita para confirmação do sucesso na clonagem. As condições de
PCR foram as mesmas dos passos anteriores.
Expressão de recEvCI: Para a etapa de expressão, os seguintes iniciadores
foram desenvolvidos:
I-
Iniciador
senso
(EvCI_Fw_expr)
GCTAGCATGCAGCCGCTGGTCGACCTTGAGGGCAAC;
onde
a
:
sequência
GCTAGC corresponde à endonuclease NheI e ATG corresponde à Metionina.
II-
Iniciador
antisenso
(EvCI_Rv_expr):
GAATTCTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTTGAGATGGTGAATTAGC;
onde
a
sequência GTGGTGGTGGTGGTGGTG corresponde a seis resíduos de Histidina
(HisTag), TTA codifica para o códon de parada em E. coli e GAATTC é a região que
codifica para o sítio da enzima EcoRI.
3.3.4. Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Para a amplificação do cDNA as reações de PCR foram realizadas em 2
etapas. Na primeira foi utilizado como molde cDNA sintetizado a partir do RNA total
de sementes de E. velutina. Para a segunda etapa os produtos da primeira reação
foram utilizados como molde. A amplificação na primeira etapa seguiu as seguintes
condições de PCR: 9 4°C por 2 minutos, 94 °C por 45 segundos, 55 °C por 45
45
segundos, 68 °C por 45 segundos (30 ciclos), 4 ºC sem limite de tempo. A
amplificação na segunda etapa seguiu as seguintes condições: 94 °C por 2 minutos,
94 °C por 45 segundos, 55 °C por 45 segundos, 72 °C por 45 segundos (30 ciclos), 4
ºC sem limite de tempo.
Os eventos das reações de PCR realizadas para confirmação da clonagem e
expressão foram as mesmas descritas para a segunda etapa.
3.3.5. Ligação dos insertos ao vetor de clonagem pCR 2.1
Após realização de PCR para aumentar a quantidade de cDNA, confirmação
da presença do gene de interesse e posterior purificação utilizando Kit de
Purificação de Produtos de PCR (QIAGEN), foi feita ligação ao vetor pCR 2.1
(Invitrogen) (Figura 7), seguindo o protocolo do fabricante, gerando a construção
EvCI/pCR2.1.
Figura 6. Vetor de clonagem pCR 2.1 – Invitrogen
46
3.3.6. Transformação de células de E. coli por choque térmico para
clonagem
Células de E. coli competentes da linhagem OMNIMAX (Life Technologies)
foram utilizadas. Foram incubados 10 µL da construção EvCI/pCR2.1 com 50 µL de
células por 30 minutos em gelo. Em seguida o material foi transferido para banhomaria a 42 °C por 1 minuto e colocados em gelo por, no mínimo, 5 minutos. Após, foi
adicionado LB para um volume final de 500 µL e homogeneizado lentamente, logo
após, 100 µL foram plaqueados em meio LB-ágar adicionado de ampicilina (0,1
mg/mL) e IPTG (Isopropil β-D-1-tiogalactopiranosídeo)/X-GAL(5-bromo-4-cloro-3indolil-beta-D-galacto-piranosídeo) com o auxílio de alça de Drigalsky, colocados em
estufa a 37 °C por 16 horas para crescimento das colônias transformadas.
As colônias brancas foram repicadas em placas contendo LB-ágar e
incubadas a 37 °C por 16 horas. Após esse período foi feita PCR de colônia para
confirmar a transformação.
3.3.7. Extração de DNA plasmidial
Para a extração do DNA plasmidial das células de interesse transformadas,
foi feito um inóculo, no qual, uma amostra da colônia foi coletada com o auxílio de
uma ponteira e solubilizada em 5 mL de meio LB líquido, colocados sob agitação de
10000 x g a 37 ºC durante 16 horas. Após esse período o material foi centrifugado a
10000 x g, em temperatura ambiente por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e
o precipitado ressuspenso em 300 µL de solução P1 (Tris 150 mM e EDTA 10 mM
pH 8,0) e agitado vigorosamente em vórtex. Em seguida, foi adicionada 300 µL de
solução P2 (NaOH 200 mM e SDS 1%) para provocar a lise das células, sendo, em
seguida, misturados por inversão (10 vezes) e deixados 5 minutos à temperatura
ambiente. Posteriormente, 300 uL de solução P3 (Acetato de potássio 3 M pH 5,0)
foi adicionada e deixada por 30 minutos em gelo. O material foi então centrifugado
por 30 minutos a 10000 x g à temperatura ambiente, o sobrenadante foi coletado e
transferido para um novo tubo de microcentrífuga (BioRad). Foi adicionada uma
solução de clorofórmio e álcool isoamílico na proporção de 24:1, agitado
vigorosamente por 1 minuto e centrifugado (5 minutos, 10000 x g à temperatura
47
ambiente). Este passo foi repetido mais uma vez. Em seguida, o sobrenadante foi
coletado e adicionado 1 volume de álcool isopropílico, sendo então centrifugado nas
mesmas condições anteriores, o sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado
com 500 µL de álcool etílico a 70% e agitado vigorosamente, centrifugado por 5
minutos a 10000 x g à temperatura ambiente e o sobrenadante foi descartado. O
precipitado foi seco em concentrador a vácuo e, em seguida, ressuspenso em 100
µL de água ultra pura autoclavada. Para a retirada de qualquer traço de RNA da
amostra, foi adicionado 3 µL de RNAse (10 mg/mL) e incubado por 1 hora a 37 ºC. O
material foi então quantificado por espectrofotometria (NanoDrop 2000 – Thermo
Scientific) e armazenado a -20 °C até o uso.
3.3.8. Sequenciamento completo do gene de inibidor de E. velutina
O sequenciamento dos plasmídeos foi feito utilizando o aparelho ABI 3130xl
da Applied Biosystems para confirmação saequência de recEvCI. Os iniciadores
utilizados foram M13 Fw e M13 Rv (Life Technologies).
3.3.9. Clonagem e Expressão do inibidor de quimotripsina em E. coli
3.3.9.1.
Clonagem do gene em pCR2.1
Para a expressão do gene de EvCI foi necessária a adição de caudas de
histidina e sítios para endonucleases aos insertos a serem analisados. Isso foi feito
por meio de uma Reação em Cadeia da Polimerase, utilizando como molde o cDNA
produzido e os iniciadores descritos no item 4.3, e o inserto obtido por PCR foi ligado
ao vetor de clonagem. O produto desta reação foi então purificado utilizando Kit de
Purificação de produtos de PCR (QIAGEN). Os insertos purificados foram ligados ao
vetor de clonagem pCR 2.1 e, em seguida, a linhagem de E. coli OMNIMAX foi
utilizada na transformação por choque térmico como descrito no item 4.9. A nova
clonagem
foi
confirmada
por
PCR
utilizando
os
iniciadores
específicos
EvCI_Fw_expr e EvCI_Rv_expr . Foi feita digestão da construção EvCI/pCR2.1-2
pelas enzimas EcoRV e Hind III, como descrito pelo fabricante (Invitrogen) e a
purificação do gene foi feita por eletroeluição (item 4.3.9.2).
48
3.3.9.2.
Eletroeluição de DNA a partir de fragmentos de gel de agarose
Os passos seguidos para eluição de bandas do DNA de interesse a partir de
excisão de gel de agarose foram feitos como estabelecido por Sambrook et al.
(1989) com adaptações.
O fragmento do gel de agarose foi colocado em uma membrana de diálise
(cut off 3,5 kDa) com uma quantidade de tampão TBE (Tris-HCl 89 mM, Ácido bórico
89 mM e EDTA 89 mM pH 8,3) suficiente para submergir o gel. A membrana foi
colocada em cuba de eletroforese horizontal e a saída das amostras de DNA do gel
para o tampão foi acompanhada pela visualização do brometo de etídio ligado ao
DNA. Em seguida, o líquido foi transferido para microtubos de 1,5 mL, foi adicionada
uma solução de Fenol:Clorofórmio:Álcool Isoamílico (25:24:1), a mistura foi agitada
vigorosamente e centrifugada a 10000 x g por 15 segundos à temperatura ambiente.
A fase aquosa foi removida e o procedimento repetido 2 vezes. Em seguida, foi
adicionado 1/10 do volume total de Tampão acetato de Sódio 3 M pH 5 e o material
foi agitado. Foram adicionados 2,5 volumes de Etanol a 4 °C, novamente agitado e
incubado à -20 °C por 16 horas. O material foi centrifugado a 16000 x g por 30
minutos a 4 ºC, o sobrenadante foi descartado e etanol a 70% foi adicionado e uma
nova etapa de centrifugação foi realizada. O sobrenadante foi completamente
removido e descartado e após evaporação o DNA foi ressuspenso em água ultrapura estéril.
3.3.9.3.
Ligação do inserto ao vetor de expressão pET32a
Após a liberação do fragmento correspondente à recEvCI do vetor de
clonagem, foi feita ligação ao vetor de expressão pET 32a (Figura 6), que também
foi submetido à digestão pelas endonucleases EcoRV e Hind III. A construção
EvCI/pET32a foi inserida na linhagem de E. coli BL21 DE3 pLyss (Promega)
utilizando a técnica de eletroporação (eletroporador - BioRad) e foi observado
crescimento de células transformadas. O DNA plasmidial das colônias foi extraído,
como descrito no item 4.7, foi feita PCR (Item 4.4) e a confirmação da transformação
foi realizada por sequenciamento, sendo a proteína denominada recEvCI. A
expressão neste vetor permite a fusão da proteína de interesse com a tiorredoxina,
49
uma proteína que possui atividades antioxidativa e redutora, além de aumentar a
solubilidade no meio citoplasmático bacteriano.
Figura 7: Vetor de expressão pEt 32a.
3.3.9.4.
Expressão do inibidor de quimotripsina em pET32a
A expressão da proteína de interesse foi feita em meio Luria-Bertani estéril
(LB) (Extrato de levedura 0,5%, triptona 1% e Cloreto de Sódio 0,5%) com adição
dos antibióticos Ampicilina (Amp) e Cloranfenicol (CAT), com concentrações finais
de 0,1 mg/mL e 0,025 mg/mL, respectivamente. Previamente à expressão, foi
preparado um pré-inóculo com 30 mL de meio LB adicionado de células de E. coli
transformadas com a construção EvCI/pEt32a; este material foi incubado por 16
horas a 37 ºC sob agitação constante (150 rpm). Decorrido o tempo de incubação, o
pré-inóculo foi adicionado ao meio LB para expressão, deixado sob agitação em
temperatura
igual
ao
passo
anterior,
até
atingir
uma
absorbância
em
espectrofotômetro entre 0.6 e 0.7, à densidade óptica de 600 nm, sendo então uma
alíquota retirada e denominada de não-induzido, Em seguida, foi adicionado
isopropil β-D-1-tiogalactopiranoídeo (IPTG – concentração final de 1 mM) para
50
induzir a expressão por meio da ativação do promotor lac, e, após 4 horas sob
temperatura e agitação constantes, o volume total de meio foi centrifugado a 10000
x g durante 10 minutos a 4 ºC. O sobrenadante foi descartado e o precipitado
solubilizado em Tampão Fosfato de Sódio 20 mM e Cloreto de Sódio 500 mM pH
7,4, em seguida, foi submetido à digestão por Lisozima (concentração final 0,1
mg/mL) por 1 hora a 37 ºC, sonicação e, por último, centrifugação durante 5 minutos
a 4ºC em rotação de 10000 x g. O precipitado foi descartado e o sobrenadante
utilizado nos passos posteriores de purificação do inibidor de quimotripsina
recombinante.
Para verificação da atividade da proteína, ensaios com o material expresso
foram feitos, de acordo com a metodologia descrita no item 4.14.1.
3.3.9.5.
Cromatografia de afinidade de Níquel HisTrap FF crude
Após a expressão, o sobrenadante (fração solúvel) proveniente do material
submetido à sonicação foi aplicado em coluna HisTrap FF crude (GE Healthcare) de
5 mL. As moléculas não aderidas à coluna foram eluídas com Tampão Fosfato de
Sódio 20 mM e Cloreto de Sódio 500 mM pH 7,4, o material retido, mas inespecífico,
foi retirado com uma solução de Imidazol a 100 mM e as frações que obtiveram
inibição foram eluídas com Imidazol a 200 mM. O material retido foi dialisado contra
Tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 e submetido a ensaios de inibição como descrito
posteriormente, para confirmação da presença do inibidor.
3.3.9.6.
Liberação da proteína de fusão Tiorredoxina
A proteína de fusão Tiorredoxina (Trx) foi separada da proteína de interesse
por digestão utilizando Trombina, uma protease que apresenta apenas um sítio de
clivagem (ExPASY – PeptideCutter) na estrutura do inibidor fusionado à Tiorredoxina
(EvCI+Trx), deduzida a partir da sequência nucleotídica. O protocolo seguido foi de
acordo com as instruções do fabricante, com modificações. O material foi incubado
em diferentes concentrações de trombina e EvCI+Trx, obtendo uma proporção de
1:20 w/w (trombina:recEvCI). Após o estabelecimento destas condições, a
temperatura do ensaio também foi estabelecida, 37 ºC, por 30 minutos. Os
resultados foram acompanhados por SDS-PAGE.
51
3.3.9.7.
Purificação de recEvCI
Após o estabelecimento das condições de clivagem para a retirada da
tiorredoxina, o produto foi aplicado em coluna de afinidade Quimotripsina/Sepharose
4B (GE Healthcare). As frações retidas foram eluídas com HCl 5 mM e submetido a
ensaio de inibição, como descrito posteriormente, para confirmação da atividade
inibitória, obtendo o inibidor de quimotripsina recombinante purificado, sendo
nomeado recEvCI.
3.3.10.
Quantificação de proteínas
As proteínas foram quantificadas pelo método do ácido bicinconínico (BCA),
seguindo as instruções do fabricante (Thermo-Scientific), utilizando albumina sérica
bovina (Sigma Aldrich) como padrão.
3.3.11.
Análise do inibidor recombinante
3.3.11.1.
Eletroforese em Gel de Poliacrilamida (SDS-PAGE)
A metodologia desenvolvida por Laemmli (1970) foi utilizada para caracterizar
o perfil eletroforético das amostras em todos os passos de purificação do inibidor. O
gel de separação a 15% foi preparado com 3,75 ml de acrilamida-bisacrilamida
30%; 1,950 ml de tampão Tris-HCl 1,5M pH 8,8; água destilada (1,8 ml), 75 l de
SDS 10%; 3,75 l de TEMED concentrado e 37,5 l de solução de persulfato de
amônio 30%. O gel de concentração continha 0,495 ml de acrilamida-bisacrilamida
30%; 938 l de tampão Tris-HCl 0,5 M pH 6,8; 2.250 ml de água destilada; 37,5 l de
SDS 10%; 3,75 l de TEMED concentrado e 18,75 l de persulfato de amônio 30%.
A corrida foi feita em sistema de eletroforese vertical miniVE (GE Healthcare). As
amostras foram misturadas com tampão de amostra (azul de bromofenol 0,002%,
SDS 2% e sacarose 10%). A solução corante foi preparada contendo Azul de
Coomassie R-250 (Sigma-Aldrich) a 1%, metanol 40%, ácido acético 10% em água
destilada.
52
3.3.11.2.
Sequenciamento de recEvCI
Para obtenção da sequência do inibidor, uma solução deste foi submetida à
tripsinização em gel. A hidrólise foi realizada em gel de poliacrilamida a 12% de
acordo com protocolo estabelecido por Shevchenko (1996). As bandas proteicas do
gel após processo de coloração com azul de coomassie foram excisadas e
transferidas para tubo de microcentrifuga (BioRad). O corante foi retirado do gel
após três lavagens com solução de etanol a 30% até descorar completamente,
seguida de mais uma lavagem com solução de acetonitrila 50% e 25 mM de
bicarbonato de amônio por 15 minutos, sendo retirados e acetonitrila foi adicionada e
o gel foi incubado por 10 min sob agitação vigorosa. Após esta etapa o gel foi seco
em concentrador a vácuo por 20 min, sendo, em seguida, adicionada solução de
tripsina (33 ng/µL) em volume suficiente para cobrir o gel e foi mantido em banho de
gelo por 30 min. Um volume de 40µL de solução de bicarbonato de amônio a 50 mM
foi adicionado e depois o material foi incubado por 19 horas a 37 ºC.
Os peptídeos gerados por hidrólise enzimática foram liofilizados e misturados
com uma solução de matriz de ácido α-ciano-4-hidroxicinâmico (5 mg em 250 µL de
acetonitrila, 200 µL de água ultrapura e 50 µL de solução aquosa de ácido
trifluoroacético a 3%) em proporção de 1/3 (v/v), depositadas em uma placa do tipo
Anchorchip (Bruker Daltonics, Bilerica, EUA) e cristalizadas à temperatura ambiente.
Os fragmentos foram analisados e sequenciados por espectrometria de massa do
tipo MALDI-TOF/TOF em espectrômetro Ultraflex III (Bruker Daltonics, Billerica,
EUA). A estrutura primária dos peptídeos foi interpretada por sequenciamento de
novo dos espectros obtidos nas análises de MS/MS, com fragmentação conduzida
pela metodologia LIFT-TM (SUCKAU et al., 2003).
As sequências obtidas foram analisadas e comparadas com sequências de
inibidores de quimotripsina depositadas no banco de dados do NCBI (National
Center for Biotechnology Information, www.ncbi.nlm.nih.gov), usando BLASTp
(ALTSCHUL et al., 1997). Em seguida, as que apresentaram maior identidade com o
recEvCI foram alinhadas com outros inibidores no programa computacional BioEdit
v. 7.0.9.0, por meio da ferramenta ClustalW (THOMPSON et al., 1994).
53
3.3.11.3.
Preparo da solução de azocaseína 1% - Substrato
Azocaseína a 1% foi preparada pesando-se 1 g de azocaseína que foi
dissolvido em 100 mL de tampão Tris-HCl 50 mM, pH 7,5 e fervido até completa
solubilização. Após resfriamento, o volume foi completado com água destilada. A
solução foi conservada no congelador até sua utilização.
3.3.11.4.
Atividade anti-quimotripsina
Para determinar a atividade do inibidor de quimotripsina recombinante
ensaios de inibição de quimotripsina foram feitos. A atividade inibitória das amostras
foi determinada pré-incubando em tubos de hemólise alíquotas de 5 µL de uma
solução de quimotripsina (0,5 mg/mL em Tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 – Sigma
Aldrich) com 50 µL da amostra e tampão Tris-HCI 50 mM CaCl2 20 mM, pH 7,5 para
completar um volume de 500 µL, a 37 °C por 15 minutos. Em seguida, foram
adicionadas alíquotas de 200 µL de solução de azocaseína como substrato a 1%.
Após 30 minutos da adição de azocaseína, a reação foi interrompida pela adição de
300 µL de solução de ácido tricloroacético (TCA - Vetec) a 20%. Decorridos 5
minutos à temperatura ambiente, as amostras foram centrifugadas a 12.000 x g por
10 minutos. Dos sobrenadantes obtidos após centrifugação, foram retiradas alíquota
de 500 µL e adicionados 500 µL de Hidróxido de Sódio 2 N. A atividade
azocaseinolítica foi medida pela absorbância dos peptídeos diazotizados produzida
a 440 nm. Os ensaios foram realizados em triplicata e provas em branco foram
feitas. Uma unidade de atividade inibitória (UI) foi definida como a quantidade de
inibidor que diminui a atividade do substrato em 0,01 (Xavier-Filho, 1989).
3.3.11.5.
Atividade anti-tripsina
A atividade anti-tríptica foi determinada utilizando BApNA como substrato.
Alíquotas de 8 µL de solução de tripsina bovina (0,3 mg/mL em tampão Tris-HCl 50
mM, pH 7,5 – Sigma Aldrich) foram pré-incubadas, por 10 minutos a 37 ºC, com 120
µL de HCl 2,5 mM, 375 µL de tampão Tris-HCl, 50 mM, pH 7,5 e 50 µL das amostras
(20 µg). Após esse período a reação foi iniciada adicionando-se 500 µL do substrato
– BapNA (N-α-benzoil-arginina-p-nitroanilida. A reação prosseguiu por mais 15
54
minutos nas mesmas condições de incubação, sendo interrompida adicionando-se
120 µL de ácido acético 30%. A formação de p-nitroanilida foi monitorada em
espectrofotômetro a 405 nm. Controles foram realizados e os ensaios foram feitos
em triplicata. Os resultados foram expressos em UI (unidades de inibição) por
miligrama de proteína (Xavier-Filho, 1989).
3.3.11.6.
Atividade anti-elastase
A atividade inibitória para elastase foi avaliada pela pré-incubação de 60 µL
dessa enzima, com de 735 µL de PBS, pH 7,4 e 20 µL contendo 20 µg de inibidor
por 10 minutos a 37 ºC. A reação foi iniciada após adição de 50 µL de solução de
susbtrato de N-metoxi-succinil-Ala-Ala-ProVal-4-nitroanilida - SAAVNA a 5mM
(STEIN, 1983). O tempo de reação do ensaio foi de 1 hora, a 37 ºC. A reação foi
interrompida com a adição de 120 µL de solução aquosa de ácido acético 30%. A
formação de 4-nitroanilida foi monitorada a 405 nm. Os ensaios foram realizados em
triplicata, foram conduzidos três experimentos independentes e provas em branco
foram realizadas como controle.
3.3.11.7.
Estabilidade térmica
A avaliação da manutenção da atividade inibitória de recEvCI em diferentes
temperaturas foi feita após alíquotas do inibidor, contendo 20 µg, serem incubadas
durante 30 minutos em diferentes temperaturas: 20 ºC, 37 ºC e 100 ºC. Decorrido o
tempo de incubação, as amostras foram resfriadas a 4 °C até o uso. Provas em
branco foram realizadas. Os ensaios foram feitos em triplicata de acordo com o item
4.3.11.4.
3.3.11.8.
Estabilidade em diferentes pHs
A estabilidade estrutural de recEvCI após tratamento em diferentes pHs foi
feita como descrito a seguir. Alíquotas do inibidor (20 µg) foram incubadas em
diferentes tampões com valores de pH diferentes, durante 16 horas. Os tampões
utilizados no ensaio foram Glicina-HCl 100 mM pH 2, Acetato de Sódio 50 mM pH 5,
55
Tris-HCl 50 mM pH 7,5 e pH 9 e Glicina-NaOH 100 mM pH 12. Após esse período,
as amostras foram transferidas para tampão de ensaio Tris-HCl 50 mM CaCl2 20 mM
pH 7,5 durante 16 horas. Alíquotas do inibidor foram utilizadas nos ensaios de
inibição contra quimotripsina, como descrito no item 4.3.11.4.
3.3.11.9.
Estabilidade na presença do agente redutor DTT
Para avaliar a estabilidade do inibidor de quimotripsina recombinante de
sementes de E. veluntina (recEvCI) na presença de agente redutor seguiu-se a
metodologia adaptada por CRUZ et al. (2013), onde alíquotas de inibidor (20 µg)
foram incubadas a 37 °C em solução de DTT em uma concentração final de 100 mM
por 60 minutos. A reação foi parada pela adição de iodoacetamida, na quantidade
duas vezes superior à concentração final de DTT. Após o período de incubação, a
mistura foi submetida ao ensaio de atividade anti-quimotríptica. Os estudos para
avaliação da estabilidade de recEvCI na presença de DTT foram realizados em
triplicata (item 4.3.11.4.), com provas em branco e acompanhados por controle sem
DTT.
3.3.12.
Ensaios Biológicos
A análise da ação de recEvCI sobre células foi feita por meio de avaliação de
ensaios de viabilidade celular.
3.3.12.1.
Cultura de células
Linhagem 3T3 (Fibroblasto de camundongo): As células foram cultivadas em
meio de cultura DMEM suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, a 37 ºC, em
atmosfera úmida de 5% de CO2. Em seguida foram semeadas em microplacas de
cultivo de 96 poços (5 x 103 células/mL por poço), incubadas por um período de 72
horas com concentrações de recEvCI que variaram de 0,03 a 30 μg/mL.
Linhagem de Macrófagos: Os macrófagos da linhagem RAW 264.7 foram utilizados
em ensaios de avaliação de atividade microbicida. Foram mantidas em meio DMEM
suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino, nas mesmas condições da linhagem
3T3. O número de células por poço foi de 2,4x104 alocadas em uma placa de 96
56
poços por 24 horas para sedimentação das células. Os testes foram feitos utilizando
diferentes concentrações de recEvCI (0,1; 0,3; 1; 3 e 10 μg/mL), por 24 horas, na
ausência e na presença de Lipopolissacarídeo (adicionado após 1 hora do início do
teste) a uma concentração final de 100 ng/mL (Sigma).
3.3.12.2.
Ensaio de viabilidade celular - MTT
A viabilidade de células 3T3 e macrófagos foi determinada pelo teste de
redução enzimática do brometo de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-yl)-2,5-difenil brometo de
tetrazolina (MTT) em formazam, pela ação de desidrogenases mitocondriais. Após o
período de tratamento de 72 horas com as diferentes concentrações das amostras,
as células foram incubadas em meio de cultura contendo 1mg/mL de MTT por 3
horas e posteriormente lavadas com etanol por 5 minutos para solubilização do
formazan. A determinação da viabilidade celular foi obtida pela leitura das
absorbâncias das amostras a 570 nm (MOSMANN, 1983).
3.3.12.3.
Atividade anticoagulante in vitro
O plasma utilizado nos testes de atividade anticoagulante foi obtido a partir de
doação de voluntários saudáveis. O sangue após a coleta foi misturado com citrato
de sódio a 3,8%, na proporção de 9:1 de citrato de sódio (v/v), em seguida o material
foi centrifugado por 3000 rpm por 10 minutos à temperatura ambiente. O plasma foi
removido e congelado até o momento de utilização. Para os testes de APTT e PT foi
utilizado kit e foram seguidas as instruções do fabricante (Wiener Lab Group). Os
ensaios foram realizados em tubos fornecidos pelo fabricante.
APTT (Tempo de Tromboplastina Parcial Ativada): Este ensaio avalia o
tempo de formação do coágulo pela via intrínseca. Para isso, diferentes quantidades
de recEvCI (0; 0,125; 0,25; 0,5; 1,5; 3,0 e 6,0 µg) foram diluídas em tampão PBS
150 mM, pH 7,4. Plasma humano citratado (90 µL) foi misturado com 10 µL de cada
solução de recEvCI. Heparina, nas mesmas condições do inibidor, foi usada como
controle positivo. Para controle negativo, tampão PBS 150 mM, pH 7,4 foi
adicionado ao plasma. Posteriormente, adicionou-se 100 µL de cefalina (substituta
dos fosfolipídios plaquetários – necessários para a formação do coágulo) à mistura e
incubado por 3 minutos a 37ºC, decorrido este tempo adicionou-se cloreto de cálcio
57
(CaCl2) 0,025 M e o tempo de coagulação foi determinado em coagulômetro
CLOTimer (MedLab). Todos os pontos foram realizados em triplicata.
PT (Tempo de Protrombina): Este teste mede o tempo de coagulação pela
via extrínseca. Foram utilizadas as mesmas concentrações de recEvCI e heparina
do APTT, assim como também foram aplicados os mesmo controles positivo e
negativo. Decorrido o tempo de incubação de 3 minutos a 37 ºC adicionou-se 200 µL
de tromboplastina cálcica de cérebro de coelho (ativadora do fator VII) pré-aquecida
a 37 ºC e o tempo necessário para a coagulação foi determinado em coagulômetro
automático CLOTimer (MedLab). Todos os pontos foram realizados em triplicata.
3.3.12.4.
Avaliação da produção de óxido nítrico por macrófagos
A dosagem indireta de óxido nítrico foi feita pela relação de nitrito e nitrato em
solução. Os ensaios foram feitos em placas de 96 poços utilizando o kit
Nitrate/Nitrite colorimetric assay (Cayman Chemical Company) e foram seguidas as
instruções do fabricante. Foram adicionados 80 µL de amostra, juntamente com 200
µL de tampão de reação, 10 µL de cofator e 10 µL da enzima Nitrato redutase. A
mistura foi incubada por 1 hora à temperatura ambiente. Após este período, o
reagente de Griess foi adicionado, o material foi novamente incubado por 10 minutos
e em seguida lido a 540 nm. O ensaio foi feito em triplicata.
3.3.12.5.
Avaliação da produção de TNF-α e IL-6 por macrófagos
A quantificação das citocinas foi feito por ELISA (Enzyme Linked Immuno
Sorbent Assay) utilizando o kit produzido por BD Bioscience e foram seguidas as
instruções do fabricante.
3.3.13.Análises Estatísticas
Todos os dados representam pelo menos três experimentos independentes e
foram expressos com média ± DP (Desvio Padrão). As diferenças entre os grupos
foram comparadas pelo teste ANOVA e pelo teste de Tukey. Foram consideradas
diferenças significativas quando o valor de p foi inferior a 0,05.
58
4.
RESULTADOS
4.1.
EXTRAÇÃO DE RNA TOTAL, SÍNTESE DE cDNA, CLONAGEM E
EXPRESSÃO DE UM INIBIDOR DE QUIMOTRIPSINA DE E. velutina
4.1.1. Extração de RNA total de semente de mulungu
A figura 8 mostra o gel de agarose a 1% referente à extração de RNA total de
semente de E. velutina. Na linha 2 podem ser observadas 3 bandas referentes às
subunidades 28S, 18S e 5S de RNA ribossômico de eucariotos.
Figura 8: Extração de RNA total de semente de E. velutina.
28S
18S
3S
2
1
6S
5S
5
S
Gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio. RNA total extraído de sementes imaturas
de E. velutina pelo método Fenol-Clorofórmio.
4.1.2. Reação da Polimerase em Cadeia para amplificação do gene de
interesse, Clonagem e Sequenciamento
4.1.2.1.
Amplificação do gene de interesse por PCR
A figura 9 corresponde ao gel dos produtos de PCR para amplificação do
gene de interese. Na linha 2 da são observados os produtos de PCR quando o
molde da reação foi cDNA (reação 1), enquanto que na linha 3, a banda em
destaque corresponde ao produto da segunda reação, que teve como molde os
produtos da reação 1. O numero de nucleotídeos da banda na linha 2,
aproximadamente 500 bp, corresponde ao gene de EvCI.
59
Figura 9: Produtos de PCR das reações para amplificação do gene de interesse.
1
2
3
2000bp
1650bp
1000bp
850bp
650bp
500bp
400bp
300bp
200bp
100bp
Gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio. Linha 1: Marcador 1kb Plus DNA Ladder
Invitrogen. Linha 2: Produto de PCR da reação 1 - Inib_Quimtrp_Fw X Inib_Quimtrp_Rv1. Linha 3:
Produto de PCR da reação 2 - Ev_AP X Inib_QuimTrp_Rv2.
4.1.2.2.
Ligação do inserto EvCI ao vetor pCR2.1 e clonagem de células
de E. coli OMNIMAX
O processo de ligação do inserto ao vetor de clonagem foi confirmado por
PCR e por sequenciamento da construção EvCI/pCR2.1. Após a PCR, foram
verificadas no gel bandas em todas as colônias com tamanhos correspondentes ao
inserto (Figura 10).
Figura 10: Produtos de PCR das reações feitas a partir de colônias de E. coli transformadas com
EvCI/pCR2.1.
1
2 ----------------------------------------------------- 11
2000bp
1650bp
650bp
500bp
100bp
Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. PCR de colônias de E. coli transformadas com o
vetor de clonagem pCR2.1, utilizando os primers Ev_AP X Inib_QuimTrp_Rv2. Linha 1: Marcador 1kb
Plus DNA Ladder Invitrogen. Linhas 2 a 11: Colônias de E. coli transformadas com EvCI/pCR2.1.
60
O resultado do sequenciamento mostrou que o inserto correspondia a um
inibidor de quimotripsina, pois foi estabelecida uma relação de 96% de identidade
com o inibidor de quimotripsina de Erythrina variegata (ECI), depositada no banco de
dados “GenBank” do “National Center for Biotechnology Information” – NCBI, código
de acesso P34952.1 GI:462388, quando analisado pela ferramente BLASTx. Os
aminoácidos que não coincidiram foram destacados (Figura 11), foi observada
susbtituição de 11 aminoácidos. Na figura 11, em amarelo ocorreu susbstituição por
aminoácidos de classes diferentes e em verde a substituição ocorreu com
aminoácidos de uma mesma classe.
Figura 11: Análise de sequenciamento por BLASTx para o Inibidor de Quimotripsina recombinante de
E. velutina (EvCI)
recEvCI 1 QPLVDLEGNLVENGGTYYLLPHIWALGGGIEAARTGKETCPLTVVQSPFEVSNGEPIRIA
180
ECI
60
1 QPLVDLEGNLVENGGTYYLLPHIWALGGGIEAARTGKETCPLTVVQSPFEVSNGEPIRIA
recEvCI 181 SQFLSTVIPDGSTVALGFANPPSCAASPWWTVVETSEGLAVKLLEHKTPEEDDMKFKFQK
360
ECI
120
61 SQFLSTFIPDGSPYAIGFANPPSCAASPWWTVVETSEGLAVKLLEHKTPEEDDTKFKFQK
recEvCI 361 VSSSNRYVYNLSYCQREDDDLKCDQYIGIHRDARGNRRLVVTNNNPLQLVLVKANSPSQ
537
ECI
179
121 VSSPNRYVYNLSYCQREDDDLKCDQYIGIRRDAKGYRRLVVTNDNPLELVLVKANSPSQ
Comparação da sequêncoa de recEvCI com a sequência depositada do Inibidor de Quimotripsina de
Erythrina variegata (ECI). Aminoácidos diferentes foram destacados: em amarelo- susbstituição por
aminoácidos de classes diferentes. Em verde- substituição por aminoácidos de uma mesma classe.
4.1.3. Clonagem e Expressão de recEvCI em Escherichia coli
4.1.3.1.
Ligação do gene de EvCI ao vetor de clonagem pCR2.1.
Para a segunda etapa de clonagem foram utilizados os iniciadores
EvCI_Fw_expr e EvCI_Rv_expr, que foram desenhados tendo como base o
resultado obtido no sequenciamento (fig 11). A construção EvCI/pCr2.1-2 foi
submetida à digestão pelas endonucleases EcoRV e HindIII, que flanqueavam a
região do inserto obtendo-se uma banda correspondente ao vetor linearizado e a
segunda banda correspondente ao inserto liberado, com tamanho aproximado de
600bp (Figura 12). Este aumento no tamanho do gene EvCI, quando comparado à
banda obtida observada na figura 10 é referente à adição dos sítios das
61
endonucleases e à cauda de histidina. A digestão do vetor de expressão pET32a foi
feita com as mesmas endonucleases utilizadas previamente. Em seguida foi feita a
ligação do gene de EvCI ao vetor pET 32a utilizando a metodologia indicada pelo
fabricante.
Figura 12: Digestão da construção EvCI/pCR2.1-2
1
2
pCR2.1
600bp
Gene de EvCI
100bp
Digestão da construção EvCI/pCR2.1-2 com as endonuceases EcoRV e HindIII durante 16 horas a 37
ºC, em banho-maria. Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio.. Linha 1: Marcador 100bp
DNA Ladder Invitrogen. Linha 2: EvCI/pCR2.1-2 digeridos com as endonucleases EcoRV e HindIII
para liberação do gene de EvCI.
4.1.3.2.
Transformação de células de E. coli BL21 DE3 pLyss
O DNA plasmidial das colônias transformadas com EvCI/pET32a resistentes
(antibióticos Amp/CAT) foram submetidas à PCR. Dentre as 16 colônias obtidas, 11
possuíam sequências que amplificaram em PCR, quando utilizados os iniciadores
EvCI_Fw_expr e EvCI_Rv_expr, e tamanho das bandas foi de aproximadamente
550bp, como apresentado na Figura 13
Figura 13: Produto de PCR de DNA plasmidial de células transformadas com EvCI/pEt32a
1
600bp
100bp
Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio. PCR feita utilizando os iniciadores EvCI_Fw_expr
e EvCI_Rv_expr. Linha 1: Marcador 1kb Plus DNA Ladder Invitrogen. Linhas: 2 a 16: DNA plasmidial
de colônias de E. coli transformadas. As bandas em destaque indicam a presença da banda
correspondente ao gene do inibidor de quimotripsina de mulungu.
62
4.1.3.3.
Expressão do inibidor de quimotripsina recombinante – recEvCI
A figura 14 mostra o perfil de eluição do sobrenadante da expressão pós-lise
celular utilizando diferentes concentrações de imidazol (50, 100, 200, 300 e 400
mM). Foi aplicado na coluna uma quantidade total de proteínas de 213 mg. A
liberação do inibidor foi acompanhada por leitura em espectrofotômetro a 280nm e
confirmada por meio de ensaios de inibição contra quimotripsina utilizando
azocaseína 1% como substrato. As frações correspondentes ao pico eluído com 200
mM de imidazol mostraram inibição de 71%. As setas indicam o momento onde
houve troca das soluções de lavagem.
Figura 14: Perfil de eluição de recEvCI, de coluna de afinidade de Níquel Histrap FF crude.
Aplicado na coluna de afinidade de Níquel 213 mg de proteínas totais após lise celular bacteriana. O
perfil de eluição foi determinando utilizando diferentes concentrações de Imidazol (50 mM, 100 mM,
200 mM, 300 mM e 400 mM). Em azul: Perfil cromatógráfico acompanhado a uma leitura de 280 nm
em espectrofotômetro. Em vermelho: Taxa de inibição de quimotripsina avaliado por ensaio in vitro.
Estabelecidas as condições eluição, tendi sido aplicado na coluna 198 mg de
proteínas totais, as repetições posteriores desta metodologia foram feitas com a
retirada de proteínas contaminantes com Imidazol 100 mM, seguida pela retirada da
proteína de interesse com 200 mM de Imidazol em solução aquosa as quais
obtiveram inibição de 68% de quimotripsina (Figura 15).
63
Figura 15: Coluna de afinidade de Níquel Histrap FF crude.
Eluição de proteínas ligadas à coluna de afinidade de níquel Histrap FF crude. Foi aplicado uma
quantidade de proteínas de aproximadamente 198 mg. A eluição do material retido foi feita com
soluções de Imidazol - 100mM e 200mM. Em azul: Perfil cromatógráfico acompanhado a uma leitura
de 280 nm em espectrofotômetro. Em vermelho: Taxa de inibição de quimotripsina avaliado por
ensaio in vitro.
4.1.3.4.
Purificação do inibidor de quimotripsina recombinante – recEvCI
As frações retidas na coluna de Níquel que apresentaram atividade inibitória
foram dialisadas, concentradas e submetidas à digestão com trombina. Este
procedimento de clivagem por trombina permite a separação do inibidor
recombinante da tiorredoxina, que foi expressa fusionada à proteína de intresse. O
produto deste evento foi aplicado em coluna de afinidade de quimotripsinasepharose (7,3 mg de proteínas retidas em coluna de níquel)
para captura do
inibidor recombinante. A figura 16 representa o perfil cromatográfico do material
digerido. O pico obtido após lavagem da coluna com solução aquosa de HCl 5mM
mostrou de 100% atividade inibitória contra quimotripsina nas frações 13 a 17.
64
Figura 16: Perfil de eluição de recEvCI em coluna de quimotripsina-sepharose 4B CnBr- ativada.
HCl 5mM
Foi Aplicado na coluna 7,3 mg de proteínas provenientes das frações retidas e eluídas com 200 mM
de imidazol da coluna de Níquel. A eluição foi feita com HCl 5 mM. Em vermelho: Perfil
cromatógráfico acompanhado a uma leitura de 280 nm em espectrofotômetro. Em azul: Taxa de
inibição de quimotripsina avaliado por ensaio in vitro.
A confirmação da purificação de recEvCI foi feita por SDS-PAGE (figura 17),
que mostra os passos que levaram ao completo isolamento do inibidor, como
tamanho aproximado de 17 kDa.
Figura 17: SDS-PAGE 15% revelado com nitrato de prata.
1
2
3
4
5
35kDa
recEvCI
15kDa
Foi aplicado 15 µg de proteínas, aproximadamente, para todas as amostras. Linha 1: Não Induzido.
Linha 2: Induzido após 4 horas. Linha 3: Retido em coluna de níquel. Linha 4: retido em coluna de
quimotripsina. Linha 5: Marcador de massa molecular – 10 kDa, 15 kDa, 25 kDa, 35 kDa, 40 kDa, 55
kDa, 70 kDa, 100 kDa, 130 kDa, 170 kDa (PageRuler Prestained Protein Ladder – ThermoScientific).
65
4.1.3.5.
Sequeciamento de recEvCI
Foram identificados 19 resíduos de aminoácido após o sequenciamento de
recEvCI, destacados na figura 18. Quando comparada com a sequência do inibidor
de quimotripsina de E. variegata, todos os resíduos identificados coincidem.
Figura 18. Sequência proteica de recEvCI.
recEvCI 1 QPLVDLEGNLVENGGTYYLLPHIWALGGGIEAARTGKETCPLTVVQSPFEVSNGEPIRIA 180
ECI
1 QPLVDLEGNLVENGGTYYLLPHIWALGGGIEAARTGKETCPLTVVQSPFEVSNGEPIRIA 60
recEvCI 181 SQFLSTVIPDGSTVALGFANPPSCAASPWWTVVETSEGLAVKLLEHKTPEEDDMKFKFQK 360
ECI
61 SQFLSTFIPDGSPYAIGFANPPSCAASPWWTVVETSEGLAVKLLEHKTPEEDDTKFKFQK 120
recEvCI 361 VSSSNRYVYNLSYCQREDDDLKCDQYIGIHRDARGNRRLVVTNNNPLQLVLVKANSPSQ 537
ECI
121 VSSPNRYVYNLSYCQREDDDLKCDQYIGIRRDAKGYRRLVVTNDNPLELVLVKANSPSQ 179
Análise do sequenciamento de recEvCI e comparação com a sequÇencia de ECI depositada em
banco de dados
5.1.3.6. Atividade de recEvCI contra diferentes proteases serínicas
Para determinar a atividade de recEvCI contra tripsina e elastase ensaios de
inibição
foram
feitos
utilizando
BapNA
e
SAAVNA
como
substratos,
respectivamente. Não foi detectada inibição de recEvCI quando testado com tripsina,
e o inibido reduziu a atividade de elastase em 81% (Tabela 4).
Tabela 4: Atividade inibitória de recEvCI contra proteases serínicas
Protease
Inibição em %
Tripsina
ND*
Elastase
81%
* Não detectada
4.2.
AVALIAÇÃO
DA
ESTABILIDADE
DE
recEvCI
EM
DIFERENTES
CONDIÇÕES DESNATURANTES.
4.2.1. Estabilidades térmica de recEvCI em diferentes pHs e após
tratamento com DTT
Para avaliar a estabilidade da atividade inibitória em condições desnaturantes,
alíquotas de recEvCI foram submetidas a tratamentos com diferentes pHs,
66
temperaturas e incubação com DTT. Para análise de estabilidade em variados pHs
alíquotas do inibidor foram incubadas nos seguintes tampões: Glicina-HCl 100 mM
pH 2, Acetato de Sódio 50 mM pH 5 e pH 9 e Glicina-NaOH 100 mM pH 12, a qual
foi comprovada seguidas de ensaios de inibição contra quimotripsina, onde não
verificou-se redução na ação do inibidor, comprovando sua alta estabilidade em
diferentes pHs. O tampão Tris-HCl 50 mM pH 7,5 foi utilizado como controle (Figura
19A).
Não foi observada alteração na atividade inibitória de recEvCI contra
quimotripsina quando submetido a tratamento prévio com 100 mM de DTT. O
controle foi feito sem adição de DTT (Figura 19B).
A estabilidade térmica de recEvCI foi observada após prévia incubação do
inibidor a 20°C e 100°C durante 30 minutos. Houve redução da atividade inibitória
em ambas as temperaturas testadas, obtendo-se 12% e 2%, respectivamente
(Figura 19C).
Figura 19. Estabilidade de recEvCI em condições desnaturantes, testados contra quimotripsina
A
B
C
Estabilidade de recEvCI avaliada após ensaios de inibição contra quimotripsina utilizando azocaseína
1% como substrato. A: Estabilidade após incubação por 16 horas em diferentes pHs. B: Estabilidade
após incubação com 100mM de DTT por 30 min. C: Estabilidade térmica de recEvCI após incubação
por 30 min nas temperaturas testadas.
67
4.3.
ENSAIOS BIOLÓGICOS
4.3.1. Atividade anticoagulante
O efeito anticoagulante do inibidor recombinante de quimotripsina, recEvCI,
foi avaliado buscando elucidar qual via de ativação da coagulação poderia ser
afetada pela ação de revEvCI. Para isso foram realizados os testes APTT e PT que
são específicos para as vias intrínseca e extrínseca, respectivamente. Como
observado na figura 20 A, recEvCI foi capaz de aumentar em aproximadamente 2,5
vezes o tempo de coagulação para APTT, de maneira dose-dependente, quando
comparado ao controle negativo feito com PBS, atingindo tempo máximo de 80
segundos. Entretanto, o mesmo efeito não foi observado para a via extrínseca da
coagulação (Figura 20 B).
Figura 20: Efeito de recEvCI no prolongamento do tempo de formação de coágulo pelos testes ApTT
(via intrínseca) e PT (via extrínseca).
A
B
Os testes foram feitos utilizando kit para avaliação do tempo de coagulação fabricado por Wienr Lab.
A: Efeito de recEvCI na via intrínseca – APTT. B: Efeito de recEvCI na via extrínseca – PT.
4.3.2. Avaliação de citotoxicidade para linhagem de células normais –
3T3
Atividade citotóxica de recEvCI foi avaliada em diferentes concentrações do
inibidor e testada em células 3T3 de fibroblasto de camundongo e macrófagos RAW
264.7. A influência de LPS foi avaliada para macrófagos. Para a linhagem normal
3T3 foi observado que não há efeito negativo exercido pelo inibidor em nenhuma
das concentrações testadas, havendo, um aumento na atividade mitocondrial
68
detectada por MTT, indicando um possível efeito mitogênico em células normais,
independente da dose (Figura 21).
Figura 21: Efeito de recEvCI sobre a viabilidade de células normais (3T3)
As células foram incubadas com diferentes concentrações de recEvCI por 72 horas de incubação e
avaliadas por MTT.
Quando diferentes concentrações de recEvCI foram incubadas com
macrófagos, tanto na ausência quanto na presença de LPS (ativador de
macrófagos), não houve redução na viabilidade das células, como pode ser
observado nas figura 22. Foi observado um aumento da viabilidade na ausência de
LPS em todas as concentrações de recEvCI, exceto com 0,1 µg/mL, que não teve
diferença significativa em relação ao controle positivo feito com PBS. Na presença
de LPS, em comparação ao resultado anterior, foi detectada redução, mas que ainda
não diferiu do controle positivo.
69
Figura 22: Efeito de recEvCI sobre a viabilidade de macrófagos
Viabilidade de macrófagos da linhagem RAW 264.7, avaliada por MTT, quando as células foram
incubadas com recEvCI em diferentes concentrações na ausência e presença de LPS, durante 24
horas. C: Controle PBS. Testes contendo * ou ** diferem estatisticamente do Controle positivo pelo
teste de Tukey a 5% de probabilidade.
4.3.3. Avaliação do efeito de recEvCI na produção de óxido nítrico por
macrófagos
A produção de NO induzida por recEvCI foi avaliada pela quantificação de
nitrito/nitrato produzidos pelos macrófagos incubados com diferentes concentrações
da proteína recombinante. Na ausência de LPS, em todas as concentrações, houve
aumento na produção de NO, indicando a ativação dos macrófagos (Figura 23A). Na
presença de LPS, as concentrações de 0,1; 0,3; 1 e 3 µg/mL reduziram sutilmente,
mas de maneira significativa, a liberação de NO, entretanto este mesmo efeito não
foi observado para a concentração de 10 µg/mL (Figura 23B).
70
Figura 23: Quantificação da produção de nitrito/nitrato em macrófagos RAW 264.7 induzida por
diferentes concentrações de recEvCI.
A
B
A – Quantificação da produção de Nitrito/nitrato em macrófagos na ausência de LPS quando
submetido por 24 horas à incubação com recEvCi em diferentes concentrações. B - Quantificação da
produção de Nitrito/nitrato em macrófagos na presença de LPS. Testes contendo * diferem
estatisticamente do Controle positivo referente ao LPS 100ng/mL pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
4.3.4. Avaliação do efeito de recEvCI na produção de TNF-α e IL-6
Quando recEvCi foi testado para avaliação da liberação de TNF-α e IL-6 foi
visto que a proteína recombinante não teve efeito relacionado à IL-6 enquanto
aumentou a produção de TNF-α, tanto na ausência de LPS quanto na presença. No
ensaio sem adição de LPS foi observado um aumento dependente da dose (Figura
24A), enquanto que na presença de LPS as concentrações de 0,3 µg, 1 µg e 3 µg
potencializaram o efeito do lipopolissacarídeo bacteriano (Figura 24 B).
71
Figura 24. Produção de TNF-α por macrófagos
A
B
Quantificação por ELISA de citocinas produzidas por macrófagos quando LPS não foi adicionado ao
ensaio (A) e após adição de LPS (B).
72
5. DISCUSSÃO
As
proteinases
serínicas
são
enzimas
amplamente
distribuídas
e
desempenham importantes funções em diferentes organismos, tanto na manutenção
da homeostase quanto no desenvolvimento de diversas patologias, como fibrose
cística (GIFFORD; CHALMERS, 2014), metástase (KOBLINSKI; AHRAM E
SLOANE, 2000), crescimento tumoral (KOOP et al., 1994) e na infecção por
protozoários (SIBLEY, 2013). Dessa forma, inibidores de proteases poderiam agir
como ferramentas alternativas no tratamento destas doenças, como vem sendo
estudado (BIJINA et al., 2011), além de suas já estabelecidas atividades inseticidas
(MACEDO; FREIRE, 2011) e, mais recentemente, como conservante para alimentos
de origem marinha (BIJINA et al., 2011). Entretanto, o baixo rendimento na
purificação de inibidores diretamente da planta é um fator limitante na utilização
heteróloga destas proteínas, portanto, a expressão é uma ferramenta útil pois
produz uma quantidade maior de proteínas, e mesmo estas sendo recombinantes,
mantêm as mesmas funções da proteína natural (CHOI et al., 2006).
Inibidores de quimotripsina vêm sendo estudados e apresentaram uma ampla
variedade de aplicações, seja inseticida, adaptativa em plantas ou farmacológica. A
ação inseticida de inibidores se baseia na redução da assimilação de nutrientes por
meio da redução da atividade proteolítica podendo causar a morte do inseto, como
observado nos resultados obtidos por Pereira et al. (2007) quando testaram um
inibidor de quimotripsina contra H. hampei, enquanto Soares et al. (2013)
identificaram um inibidor de quimotripsina com atividade negativa sobre Aedes
aegypti e Bhattacharyya et al. (2007) que purificaram um inibidor bifuncional (tripsina
e quimotripsina) com atividade contra enzimas digestivas de S. litura in vitro. Por
outro lado, na planta, foi detectada a intervenção de um inibidor de quimotripsina
como resposta adaptativa a diferentes tipos de estresses abióticos (MOSOLOV;
VALUEVA, 2011) como, por exemplo, à seca (HUANG; XIAO; XIONG, 2007).
No presente estudo, um inibidor de quimotripsina de E. velutina (recEvCI) foi
clonado e sua expressão heteróloga foi induzida em E. coli. Após sua purificação,
recEvCI inibiu quimotripsina em 100% e elastase neutrofílica em 81%, testes de
avaliação de atividade anticoagulante e ação no processo microbicida foram feitos,
indicando que o inibidor recombinante aumenta o tempo de formação de coágulo
73
atuando especificamente na via extrínseca, e exerce influência no processo de
ativação de macrófagos.
A clonagem do inibidor foi feita tendo como molde a sequência do inibidor de
quimotripsina de E. variegata, o que se mostrou eficaz, sendo comprovada a
semelhança após o sequenciamento do vetor de clonagem, que indicou 96% de
identidade entre as proteínas. Segundo a literatura há ampla conservação entre as
classes de inibidores do tipo Kunitz, principalmente na região P1 envolvida na
ligação com a enzima alvo (IWANAGA et al., 2005; KHAMRUI et al., 2005), havendo
também conservação entre inibidores do gênero Erythrina (IWANAGA; YAMASAKI;
KIMURA, 1998; SONG; SUH, 1998).
A expressão de revEvCI foi feita no vetor pET32a, que conecta a expressão
da proteína de interesse com uma proteína que possui atividade redutora, a
tiorredoxina (Trx). Para a retirada da Trx fusionada foi feita digestão da proteína
expressa com trombina, obtendo-se o inibidor de quimotripsina de E. velutina
recombinante, recEvCI. A tiorredoxina é encontrada em diferentes organismos,
desde bactérias (LILLIG et al., 1999) a plantas e mamíferos. Em plantas, a
tiorredoxina atua na regulação da fotossíntese (BUCHANAN, 1991), enquanto que
em mamíferos desempenha diferentes funções como a ativação de fatores de
transcrição (SCHENK et al., 1994), impedindo a apoptose (SAITOH et al., 1998) e
atuando de forma semelhante à citocinas (NAKAMURA; NAKAMURA; YODOI, 1997)
e quimioatraentes de neutrófilos no processo inflamatório (BERTINI et al., 1999).
Uma das principais funções desta enzima é impedir a formação de agregados
causados por interações dissulfeto entre proteínas citosólicas (LILLIG et al., 1999).
A estrutura primária de recEvCI e a confirmação da sua integridade após
digestão por trombina foi determinada por MALDI-TOF/TOF, que é uma técnica
amplamente utilizada no sequenciamento de proteínas (HARDOUIN, 2007; CANTÚ
et al., 2008). Este resultado mostrou que o inibidor de quimotripsina recombinante de
E. velutina, mesmo após digestão enzimática, mantém tanto a integridade de sua
sequência primária quanto as características do inibidor de quimotripsina natural,
EvCI, que foi caracterizado por Monteiro (2011). Além de apresentar grande taxa de
similaridade com a sequência proteica de ECI (KIMURA; KOUZUMA; YAMASAKI,
1993).
A verificação da especificidade de recEvCI por outras proteases serínicas foi
feita por meio de ensaios de inibição utilizando tripsina e elastase como enzimas-
74
alvo. recEvCI não reduziu a atividade proteolítica de tripsina, quando avaliada a
degradação de azocaseína, enquanto obteve uma taxa de inibição de 81% contra
elastase neutrofílica, utilizando o substrato sintético específico. Uma importante
característica de inibidores do tipo Kunitz é a capacidade destas proteínas de
possuírem mais de uma enzima-alvo, como foi observado em Cajanus cajan
(inibição de tripsina e quimotripsina) (HAQ; KHAN, 2003), para CbTI (inibidor de
tripsina e quimotripsina de Caesalpinia bonduc) (BHATTACHARYYA; RAI; BABU,
2007), para PmTKI (inibidor de tripsina, quimotripsina e papaína de Piptadenia
moniliformis) (CRUZ et al., 2013), PdKI-4 (inibidor de tripsina e quimotripsina de P.
dumosum) (RUFINO et al., 2013), para rusvikunin (proteína de Daboia russelii
russelii que inibe tripsina e plasmina) (MUKHERJEE; MACKESSY; DUTTA, 2014).
A inibição de elastase neutrofílica também já foi observada para outros
inibidores como EvCI e EvTI que inibiram HNE in vitro e também reduziram a
resposta inflamatória em modelo de sepse (MONTEIRO, 2011; MACHADO et al.,
2013), assim como um inibidor do tipo Bowman-Birk que reduziu drasticamente a
atividade desta enzima (ROCCO et al., 2011) e CeEI, proveniente de Caesalpinia
echinata, que inibiu a atividade elastásica in vitro e reduziu os efeitos inflamatórios
de zymosan quando administrado em pulmões de ratos (CRUZ-SILVA et al., 2013)
Inibidores de protease do tipo Kunitz são descritos na literatura como
proteínas resistentes quando submetidas a condições desnaturantes como variação
de temperatura, de pH e tratamento com agentes redutores, como ditiotreitol (DTT)
ou 2-mercaptoetanol, sendo, provavelmente, a presença de pontes dissulfeto a
responsável por esta estabilidade (MELLO et al., 2001).
Quando submetido a variações de pH e incubação com o agente redutor DTT,
recEvCI manteve sua atividade inibitória, não diferindo do controle. A estabilidade
conformacional da proteína recombinante após incubação em diferentes pHs foi em
concordância com outros inibidores de quimotripsina descritos (BHATTACHARYYA;
BABU, 2009; LAM; NG, 2010; PRASAD; DUTTA-GUPTA; PADMASREE, 2010). Os
resultados obtidos após o tratamento de recEvCI com 100 mM de DTT por 30
minutos indicam que o inibidor não é dependente de
pontes dissulfeto, para
realização de sua atividade, apesar da presença de 4 resíduos de cisteína em sua
sequência, o que corrobora os resultados do mesmo teste realizado com o inibidor
natural (VARELA, 2010), assim como para o inibidor de quimotripsina de
Schizolobium parahyba (SOUZA et al., 2000), enquanto que o inibidor PFTI teve sua
75
atividade reduzida em 50% quando tratado com 1mM de DTT por 15 minutos
(RAMOS et al., 2008). Estes resultados indicam que recEvCI é uma proteína estável
quando submetida a condições desfavoráveis à sua atividade ótima.
Em relação à estabilidade térmica, recEvCI teve sua atividade reduzida, a
20ºC (12%) e 100ºC (2%), em relação ao controle, 37ºC. Os inibidores de tripsina de
Dimorphandra mollis (DMTI-II) (MELLO et al., 2001) e de Inga laurina (ILTI)
(MACEDO et al., 2007) também sofreram redução em sua atividade inibitória quando
testada a estabilidade térmica, divergindo do observado para o inibidor de
quimotripsina de Vigna mungo, que se manteve estável até 80ºC (PRASAD; DUTTAGUPTA; PADMASREE, 2010).
Após a purificação e determinação das características físico-químicas de
recEvCI, foram avaliadas possíveis aplicações farmacológicas da proteína, como
uma atividade anticoagulante e efeito microbicida.
A cascata de coagulação é um processo que envolve a ativação de diversos
zimogênios, em sua grande parte, serinoproteases, que levam à formação do
coágulo e fim da hemorragia, e é dividido em três vias, a via intrínseca, ou via de
contato, a via extrínseca e a via comum. Disfunções em algum ponto das vias de
coagulação podem levar ao surgimento de diversas doenças, especialmente as
hemofilias e trombofilias. Diversas proteínas vegetais têm sido estudadas devido ao
efeito anticoagulante ou indutor da formação de coágulo, como o inibidor LITI que
atua sobre tripsina, quimotripsina, plasmina e calicreína (OLIVA et al., 2000); CTI
que inibe fatores da via intrínseca (Fator XIIa) (YAU et al., 2012); cMol, uma lectina
de Moringa oleifera, que atua tanto sobre a via intrínseca quanto a via extrínseca
(ANDRADE et al., 2013). Sampaio et al. (1996) investigou a ação de inibidores das
famílias Kunitz e Bowman-Birk e observou que todos os inibidores tipo Kunitz
testados exerceram atividade inibitória contra calicreína plasmática. recEvCI, que
pertence a esta família de inibidores, aumentou o tempo de formação de coágulo
quando utilizando o teste APTT, que avalia a via intrínseca, e não teve efeito sobre a
via extrínseca. Resultados semelhantes foram encontrados para o inibidor natural,
EvCI (MONTEIRO, 2011) e para outros inibidores de quimotripsina de plantas
(LAZZA et al., 2010; SAMPAIO et al., 1996), e apresentou um tempo maior do que o
observado para LITI, que foi de 60 seg utilizando o dobro da quantidade de proteína
(OLIVA et al., 2000) e AaTI que foi de 50 seg (WATANABE et al., 2010).
76
Estudos demonstraram que a inativação do fator XII não impede a formação
do coágulo (FURIE; FURIE, 2012), indicando que a principal função da via intrínseca
é amplificar os processos de formação do coágulo (NORRIS, 2003). Inibidores de
tripsina e quimotripsina de E. variegata foram testados para as vias intrínseca e
extrínseca e apenas os inibidores de tripsina prolongaram a coagulação em ambas
as vias, diferente do inibidor de quimotripsina, que não teve efeito neste processo
(NAKAGAKI et al., 1996). Apesar da semelhança estrutural observada no
sequenciamento de recEvCI e ECI, estas proteínas mostraram resultados opostos
para APTT, onde recEvCI aumentou o tempo de coagulação, podendo ser utilizado
em estudos que avaliem o seu efeito em doenças relacionadas à via intrínseca de
coagulação, como regulação da pressão sanguínea e fibrinólise (NORRIS, 2003).
A heparina de origem suína e bovina, um importante carboidrato
anticoagulante,
é
amplamente
utilizada
na
inibição
da
formação
de
tromboembolismo venoso apesar de resultados comprovarem que esta molécula
causa diversos efeitos colaterais como processos hemorrágicos, reações alérgicas e
problemas ósseos, este último também observado no tratamento com varfarina em
ratos (MORISHIMA et al., 2013; WALENGA; BICK, 1998), portanto, a descoberta de
moléculas alternativas que possam substituir esta atual abordagem é de grande
importância.
Os processos de coagulação e inflamação estão relacionados por diferentes
eventos (HARTMAN; FRISHMAN, 2014), por meio do fator XII, por exemplo, que
ativa neutrófilos e regula a liberação de citocinas (NORRIS, 2003), ou após dano
tecidual que ativa a cascata de coagulação para a formação do coágulo e promove a
diapedese (KOZIK et al., 1998) assim como células endoteliais ativadas e plaquetas,
que estão ativamente envolvidas na inflamação aguda e crônica. Estas células
podem liberar mediadores pró-inflamatórios, expor moléculas de adesão e
receptores, produzir fatores de coagulação e recrutar leucócitos (WU; CHEN, 2014).
Os sinais cardiais da inflamação, calor, dor, edema e vermelhidão, estão
intrinsicamente associados com vasodilatação e migração de leucócitos para o local
de origem da inflamação (ALESSANDRI et al., 2013). Se não for controlada pode
levar a danos teciduais e agravar doenças crônicas, como fibrose cística (GIFFORD;
CHALMERS, 2014), asma (CHUNG, 2012), câncer, doenças degenerativas e
autoimunes (NATHAN; DING, 2010).
77
Neste trabalho, o efeito de recEvCI foi avaliado em relação ao processo de
ativação de macrófagos in vitro por meio de dosagem de metabólitos de óxido nítrico
e a viabilidade das células foi verificada por MTT. Quando recEvCi foi incubado em
diferentes concentrações com células de fibroblasto de camundongos (3T3) não foi
observado efeito citotóxico em nenhum concentração testada, pelo contrário, foi
visto um aumento na viabilidade das células. A avaliação da viabilidade de
macrófagos na presença de recEvCI, assim como, com de LPS, indicou que, na
ausência do ativador (LPS) as células apresentaram um aumento na conversão de
MTT em formazan, em relação aos controle positivo nas concentrações de 1, 3 e 10
µg/mL, não havendo efeito citotóxico em qualquer concentração testada. Também
não foi observado citotoxicidade quando LPS foi adicionado. A quantificação da
viabilidade celular de macrófagos feita por MTT foi primeiramente verificada por
Ferrari, Fornasiero e Isetta (1990).
A avaliação do efeito de recEvCI sobre a ativação de macrófagos, produção
de óxido nítrico, TNF-α e IL-6 foi feito e foi visto que na ausência de LPS houve uma
significativa ativação de macrófagos em todas as concentrações testadas, quando
comparado ao controle negativo. Por outro lado, na presença do lipopolissacarídeo,
as concentrações 0,1; 0,3; 1 e 3 µg/mL, reduziram significativamente a conversão de
MTT, quando comparado ao controle com LPS, indicando que atuam na inibição da
produção de óxido nítrico, consequentemente, na ativação de macrófagos.
O aumento na ativação de macrófagos e, por sua vez, aumento na liberação
de óxido nítrico, é umas das vias que ativam o sistema imunológico (LI et al., 2012).
A produção de óxido nítrico é feita após ativação do fator de transcrição NF-κB na
presença de LPS, que irá induzir a síntese de iNOS (DIAO et al., 2014). Em trabalho
realizado por Xiong et al. (2013), a presença de um polissacarídeo de
Cipangopaludina chinensis atua como imunoestimulador, podendo ser utilizado em
indivíduos imunossuprimidos, como em tratamento quimioterápicos. A mesma ação
ativadora poderia ser útil em conjunto com vacinas anti-virais, como por exemplo,
uma vacina anti-HIV, aumentando a possibilidade de reconhecimento do agente viral
pelos receptores Toll de macrófagos (PERDIGUERO et al., 2013). Entretanto, Sinha
et al., (2013) observaram que a interação de NO liberado com um receptor celular,
aumenta a resistência de células cancerígenas ao tratamento quimioterápico de
células provenientes de melanoma. Esses resultados indicam que a aplicação de
78
diferentes moléculas ativadoras do sistema imunológico deve ser estudada visando
uma aplicação específica.
A ação microbicida, quantificada pela dosagem de metabólitos de NO,
observada para recEvCI na presença de LPS pode ser atribuída a diferentes
mecanismos. Diao et al. (2014) propuseram duas vias alternativas, ambas ativadas
pela ligação do antígeno EPS ao receptor TLR 4, que culminam na ativação de
iNOS. Lee et al. (2009) investigaram o efeito de uma lignana que inibe a síntese de
NO e TNF-α inibindo a ação de NF-κB na ativação gênica. Uma outra via de ativação
de iNOS foi observada pela produção de glutationa, um importante agente
antioxidante, na presença de LPS (BUCHMULLER-ROUILLER et al., 1995).
Foi observado que recEvCI potencializa a liberação d TNF- α, e não interfere
na produção de IL-6. A indução da ativação de macrófagos e monócitos por LPS
envolve a produção de mediadores pró-inflamatórios incluindo TNF- α, interleucina1β (IL-1β), IL-6 e óxido nítrico. A regulação da liberação destes mediadores é um
importante alvo para o tratamento de várias doenças inflamatórias (DIAO et al.,
2014).
O tratamento com anti-inflamatórios está associado à ocorrência de efeitos
colaterais. Um dos mais utilizados inibidores da inflamação é o inibidor de
ciclooxigenases (1 e 2), enzimas associadas à síntese de prostaglandinas
(DINARELLO, 2010). Apesar de ser um efetivo anti-inflamatório, os inibidores destas
enzimas podem causar problemas gastrointestinais e renais (SÜLEYMAN;
DEMIRCAN; KARAGÖZ, 2007), assim como podem inibir a ativação de plaquetas na
coagulação (DINARELLO, 2010). Tem sido descrito na literatura o efeito de diversas
proteínas vegetais na modulação do processo inflamatório (AKLA; PRATT; ANNABI,
2012; ALENCAR et al., 2010; BATISTA et al., 2012; LEE et al., 2009), podendo
recEvCI ser uma abordagem alternativa no combate a patógenos ou na modulação
da inflamação.
Em resumo, o inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina recombinante,
recEvCI, reduziu as atividades enzimáticas de quimotripsina e elastase neutrofílica,
demonstrou alta estabilidade quando submetido a condições desnaturantes e
redutoras, aumentou o tempo de coagulação pela via intrínseca e não demonstrou
citotoxicidade para células normais, assim como também não afetou a viabilidade de
macrófagos, tendo demonstrado uma possível ação microbicida, ativando estas
células, ou protetora, reduzindo a produção de óxido nítrico por macrófagos
79
ativados. Portanto, recEvCI pode ser utilizado como uma nova ferramenta na
biotecnologia, para isso, experimentos adicionais precisam ser feitos.
80
6. CONCLUSÃO
Um inibidor de quimotripsina de Erythrina velutina, denominado recEvCI, foi
clonado
e
expresso
em
Escherichia
coli.
recEvCI
teve
suas
atividades
multifuncionais avaliadas. O inibidor recombinante se mostrou ativo contra
quimotripsina e elastase neutrofílica, demonstrando alta estabilidade estrutural em
relação ao pH e desnaturação de pontes dissulfeto, preservando as atividades
apresentadas pelo inibidor natural de quimotripsina de E. velutina – EvCI. recEvCI
também apresentou massa molecular semelhante ao inibidor natural EvCI de
aproximadamente 17 kDa. Não foi observada citotoxicidade (para células normais
3T3 e macrófagos) e possui atividades anticoagulante e pró-inflamatória em modelos
in vitro. Portanto, a obtenção do inibidor recombinante representa um importante
passo para torná-lo um candidato no desenvolvimento de fármacos que atuem em
doenças relacionadas aos processos de coagulação e inflamação.
81
7.
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