Listeria monocytogenes
Um patogénico emergente
Tipagem Molecular
de
Listeria monocytogenes
Carla Maia
Departamento de Alimentação e Nutrição – Laboratório de Microbiologia
6 de Novembro de 2009
Instituto Nacional de Saúde
Doutor Ricardo Jorge
Laboratório de Microbiologia
Departamento de Alimentação
e Nutrição
I. Perspectivas laboratoriais:
-
A decisão de implementar uma técnica de tipagem
molecular para L. monocytogenes
A escolha do método de tipagem
II. Método de tipagem molecular de L.
monocytogenes:
-
Implementação da técnica
Interpretação de resultados
I. Perspectivas laboratoriais
Consumo de alimentos contaminados
com L. monocytogenes
Imunocomprometidos
Grávidas
Listeriose
Fetos e
recém-nascidos
Idosos
Laboratório de Microbiologia
Actividades na área da Segurança Alimentar
Vigilância da contaminação
microbiológica dos
alimentos prontos a
consumir
Análise de amostras
suspeitas em casos de
toxinfecções
alimentares
Prática do laboratório perante uma suspeita de toxinfecção:
Pesquisa de microrganismos tendo em atenção:
. tipo de alimento
. sintomas apresentados pelos doentes.
Queijos de
pasta mole,
patês,
fatiados,
saladas
Diarreia,
febre, cólicas
abdominais
Para se proceder à investigação de casos e surtos de
toxinfecções alimentares é importante isolar os microrganismos:
• dos alimentos implicados na toxinfecção e
• dos produtos biológicos dos doentes expostos ao
alimento implicado.
Perante a suspeita de toxinfecção causada por L.monocytogenes:
Contagem de L. monocytogenes baseada
na sementeira em meio selectivo, com
posterior identificação.
Pesquisa de L. monocytogenes pelo método imunoenzimático
VIDAS e a posterior confirmação da espécie através da
caracterização bioquímica (Api Listeria).
Para identificar a relação epidemiológica entre os isolados
de origem alimentar e clínica não basta conhecer a
espécie, é necessário um método de subtipagem que
permita a discriminação do microrganismo ao nível da subespécie ou da estirpe.
Preocupação do Laboratório de Microbiologia em identificar
e implementar uma técnica para caracterizar e relacionar
estirpes de L. monocytogenes encontradas nos alimentos
com as de origem clínica.
Métodos de tipagem de microrganismos
permitem a diferenciação entre indivíduos da
mesma espécie.
• Métodos Fenotípicos:
- Serotipagem
- Fagotipagem
• Métodos de tipagem molecular ou Genotípicos:
- RAPD (Random Amplifield Polyphormic DNA )
- PFGE (Pulse Field Gel Electrophoresis )
- AFLP (Amplifield Fragment Length Polymorphism)
-…
• A escolha do método de tipagem depende dos
seguintes factores:
•
•
•
•
•
•
•
desempenho do método aplicado;
capacidade de tipagem das estirpes;
poder de discriminação das estirpes;
reprodutibilidade;
rapidez;
facilidade de utilização;
objectivo da tipagem.
Serotipagem
É um dos métodos fenotípicos mais comuns e mais utilizados.
É utilizado como uma ferramenta clássica na subtipagem de
L.monocytogenes.
13 serovares de L.monocytogenes:
Serovares +
frequentemente
associados a casos
de doença
1/2a
1/2b
1/2c
3a
3b
3c
4a
4ab
4b
4c
4d
4e
7
baseados nos antigénios somático (O) e flagelar (H)
Serotipagem
• Vantagens:
Método válido para identificação e diferenciação de
estirpes;
– Baixo custo e maior facilidade de realização (em relação
aos métodos de genotipagem);
– Mais reprodutível e discriminante que outros métodos de
fenotipagem.
–
• Inconveniente:
• Pode ser considerado pouco discriminatório por
predominarem apenas 3 serovares (1/2a, 1/2b, 4 b)
• É importante associar outros métodos a fim
de obter infomação mais detalhada.
Métodos de Tipagem Molecular
Baseados nas diferenças existentes nas sequências de
DNA de cada organismo.
Permitem a diferenciação entre sub-grupos ou estirpes
pertencentes à mesma espécie.
• De entre as técnicas mais usadas para tipagem
molecular de L. monocytogenes encontram-se as
técnicas AFLP e PFGE.
A escolha do método
AFLP
24 horas
PFGE
24 – 36 horas
Reprodutibilidade
Média a elevada
Média a elevada
Poder discriminatório
Moderado a elevado
Elevado
Capacidade de tipar
todas as estirpes
Elevada
Elevada
Custo
Médio
Médio
Tempo envolvido na
análise
• Método escolhido:
AFLP
•
•
•
•
•
Tempo envolvido na análise completa
Boa reprodutibilidade
Obtenção de informação mais detalhada que por serotipagem
Facilidade de implementação da técnica
Todos os equipamentos necessários à sua implementação
estavam disponíveis no DAN e INSA:
•
•
•
•
Termociclador
Fonte de Alimentação e Tinas de Electroforese
Transiluminador para revelação do gel
Software bioinformático para análise de resultados
II. Tipagem molecular de L. monocytogenes
por AFLP
AFLP
Amplifield Fragment Length Polymorphism
ou
“polimorfismo de fragmentos de restrição amplificados”
Técnica molecular fingerprinting –
“impressão digital” do DNA da estirpe
Baseada na amplificação de fragmentos
de DNA gerados pela digestão com uma
enzima de restrição.
Vantagem: não é necessária muita
quantidade de DNA
AFLP-Princípio do método
Prévio isolamento da L.monocytogenes e
Extracção de DNA puro com kit de extracção
1- Reacção de digestão / ligação
1. Digestão com enzima de restrição EcoRI
5’-G↓AATTC-3’ e 3’-CTTA↓G-5’
- Obtenção do Fragmento de restrição
2. Ligação aos adaptadores
2- Amplificação PCR
1. Desnaturação (abertura da cadeia dupla de DNA)
2. Hibridação (ligação do primer)
3. Extensão (amplificação do DNA)
3- Electroforese em gel de agarose
4- Interpretação do gel de agarose
4- Interpretação do gel de agarose
Serovar 1/2b
1500 bp
600 bp
100 bp
Marcadores de 100bp
4- Interpretação do gel de agarose
• Dendograma
75%
1/2a
Referências bibliográficas
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