UNIVERSIDADE FEDERAL DO TRIÂNGULO MINEIRO
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO NÚMERO DE MASTÓCITOS NA
MUSCULAR CIRCULAR DO ESÔFAGO E DO CÓLON DE
CHAGÁSICOS CRÔNICOS COM E SEM MEGA
SIMONE WANDERLEY PINHEIRO
Uberaba, MG, 2006
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SIMONE WANDERLEY PINHEIRO
AVALIAÇÃO COMPARATIVA DO NÚMERO DE MASTÓCITOS NA
MUSCULAR CIRCULAR DO ESÔFAGO E DO CÓLON DE
CHAGÁSICOS CRÔNICOS COM E SEM MEGA
Tese apresentada ao Curso de PósGraduação em Patologia, área de
concentração:
Patologia
Geral,
da
Universidade Federal do Triângulo Mineiro,
como requisito parcial para obtenção do
Título de Doutora.
ORIENTADORA: Profa. Sheila Jorge Adad
Dezembro, 2006
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INTRODUÇÃO E LITERATURA
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A doença de Chagas é causada pelo protozoário flagelado, Trypanosoma cruzi,
prevalente na América do Sul, tendo como uma de suas lesões básicas a resposta
inflamatória (CHAGAS, 1909, 1916; CHAPADEIRO, 1967; PRATA, 1994; EKSI et al.,
1996; KIRCHHOFF, 1996; LOPES et al., 2000; PRATA, 2001; ENGMAN, LEON, 2002).
A fase aguda da doença ocorre na infância (CHAGAS, 1909) ou pode ser inaparente e, na
fase crônica, cardiopatia, megaesôfago e/ou megacólon podem aparecer 30 a 40 anos mais
tarde como manifestações da fase crônica da doença (CHAGAS, 1916).
Para AMORIM, MARIN-NETO (1995) a função patogenética da destruição dos
nervos intrínsecos do coração decorrente da doença é controversa, enquanto para
KÖBERLE (1968) e REZENDE, RASSI (1983) o envolvimento do sistema nervoso
entérico parece ser essencial na patogênese das desordens gastrointestinais. KÖBERLE
(1968a, 1968b) e KÖBERLE et al (1983) descrevem como fator imprescindível e
determinante para o aparecimento das manifestações digestivas na doença de Chagas a
redução quantitativa dos neurônios dos componentes parassimpático do sistema nervoso
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autônomo intramural (teoria parassimpaticopriva). Os plexos intramurais por estarem
localizados na parede das vísceras, são as estruturas mais atingidas, em virtude do
parasitismo das camadas musculares vizinhas (KÖBERLE, 1968a, 1968b; ADAD, 1996;
REZENDE, MOREIRA, 2000). Aparentemente todas as vísceras ocas podem ser afetadas
pelo processo de denervação (KÖBERLE, 1957), envolvendo os plexos submucoso e
mientérico (KÖBERLE, 1968a, b; ADAD 1989, 1996; ADAD et al. 1991, 1992, 1997a,
1997b, 2001).
TAFURI, MARIA e LOPES (1971) descrevem que a maioria dos autores
brasileiros admite que, à exceção de raros casos de doenças congênitas, o megaesôfago e o
megacólon são de etiologia chagásica e que as lesões do plexo mientérico constituem o
substrato da alteração da motilidade ou, mais precisamente, dos reflexos peristálticos
intrínsecos e extrínsecos, especialmente do esôfago e do cólon. As anormalidades
encontradas no sistema nervoso entérico são degenerações e redução no número de
neurônios intrínsecos (KÖBERLE, NADOR,1955; ADAD, 1989, 1996; ADAD et al.,
1991, 2001) .
Segundo KÖBERLE (1958, 1961); BETARELLO, PINOTTI, HABR-GAMA
(1983) o principal fator patogenético, senão exclusivo da esofagopatia chagásica, é a
denervação; todavia, há dados na literatura que parecem questionar esse ponto de vista,
pois esôfagos de calibre normal podem não apresentar um único neurônio (ANDRADE,
ANDRADE, 1979; ADAD et al., 1992). Entretanto, existem freqüentes alterações na
camada muscular, tais como miosite e fibrose, tanto no esôfago (TAFURI, RASO, 1983;
ADAD, 1989; ADAD et al., 1991) quanto no cólon (TAFURI, RASO, 1983; ADAD,
1996; PINHEIRO, 2000; PINHEIRO et al., 2003), que poderiam contribuir para a
patogênese dos megas chagásicos.
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A fase crônica da doença de Chagas caracteriza-se por alterações da secreção,
motilidade, absorção e nos casos mais grave pelos megas (TAFURI, 1987; REZENDE,
1979; REZENDE, LUQUETTI 1994; LOPES et al., 2000). Estes, relativamente freqüentes
no Brasil e em alguns da América Latina, constituem a única manifestação digestiva dessa
doença passível de diagnóstico anatomopatológico (LOPES et al., 2000).
Observa-se no tubo digestório, desde o esôfago até o reto, quatro camadas distintas:
mucosa, submucosa, muscular própria e serosa ou adventícia. As principais diferenças
entre os segmentos estão na mucosa, que apresenta epitélios de revestimento adequados às
funções (BAILEY, 1973; STERNBERG, 1997). A submucosa exibe variações ao longo do
trato gastrintestinal, especialmente quanto à presença de glândulas. A muscular externa ou
própria é composta por duas camadas: uma circular (interna) e outra longitudinal (externa)
(BAILEY, 1973; FURNESS, COSTA, 1980; GABELLA, 1990; STERNBERG, 1997).
ADAD (1989, 1996) e ETCHEBEHERE (2001) analisaram os gânglios do esôfago
e do cólon e concluiram que os gânglios do esôfago são vascularizados e, os do cólon,
avasculares, o que pode ter importância na patogênese das esofagopatias e colopatias que
cursam com ganglionite e denervação, como a doença de Chagas e a acalásia idiopática.
Ganglionite é freqüente no esôfago mesmo em não chagásicos, sem qualquer doença
manifesta no tubo digestório.
À macroscopia, o esôfago dos pacientes com a doença de Chagas, pode apresentar
diâmetro aumentado proporcionalmente ao grau evolutivo da afecção (REZENDE,
MOREIRA, 2000). O órgão mostra graus variados de dilatação, espessamento em virtude
da acentuada hipertrofia da túnica muscular (ADAD, 1989,1996) especialmente da camada
circular, que se torna mais espessa que a camada longitudinal (KOBERLE, 1960), a ponto
de alguns considerarem que há mesmo um componente de hiperplasia (PEREIRA,
GONÇALVES, 1958). Há espessamento também, por vezes considerável, da muscular da
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mucosa; o epitélio esofágico fica também espessado e mostra paraceratose, ou mesmo
ortoceratinização
(ADAD, 1989; ANDRADE, 2000). Para WYCHULIS, WOOLAM,
ANDERSEN (1971) essas alterações hiperplásicas, ou mesmo displásicas, do epitélio
esofágico assumem importância porque tem sido demonstrada uma freqüência aumentada
de até 7 vezes, de carcinoma do esôfago em portadores de megaesôfago idiopático.
REZENDE, ROSA, VAZ (1985) descrevem que o carcinoma do esôfago também tem sido
registrado com maior freqüência em portadores de megaesôfago chagásico. ADAD et al.
(1999) em revisão da literatura destacam que tratam-se em geral de carcinomas
epidermóides, porém, relatam ter tido um caso de paciente com megaesôfago chagásico
com leiomiosarcoma de esôfago.
Ao exame microscópico, encontram-se focos inflamatórios com predomínio de
linfócitos, menor número de macrófagos e raros plasmócitos que se associam com a
destruição das miocélulas (ADAD, 1989; ADAD et al., 1991). Em alguns casos são vistos
granulomas; porém, parasitas raramente são encontrados (KÖBERLE, 1968a, 1968b,
ADAD, 1989; ADAD et al., 1991).
Os estudos ultra-estruturais nos megas chagásicos (TAFURI et al., 1971; TAFURI,
1974) confirmaram as observações da microscopia de luz comum e acrescentaram outras.
Com relação às alterações nas células musculares e nos componentes do interstício no
megaesôfago chagásico, TAFURI et al. (1971) e TAFURI (1974), descreveram que, na
maioria das vezes, essas células estavam muito afastadas umas das outras por alargamento
do espaço intercelular, ocupado por substância amorfa eletrodensa e finamente granulosa,
contendo, eventualmente, fibrilas colágenas orientadas em diversos sentidos.
Segundo TAFURI, RASO (1983), no megaesôfago chagásico observa-se fibrose,
ora focal que poderia representar uma seqüela de miosite e estaria associada com infiltrado
de mastócitos, ora fibrose intersticial difusa que não mostraria relação topográfica com a
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inflamação. Admitem que a explicação desta fibrilopoiese difusa é difícil e levantam duas
hipóteses: 1) que resultaria da estruturação da substância fundamental por enzimas
circulantes, provenientes de fibroblastos distantes da área de fibrose ou 2) estaria
relacionada com a mastocitose presente na doença de Chagas experimental e humana.
ANDRADE, ANDRADE (1979), analisando a fibrose miocárdica, admitem,
também que a fibrose focal poderia decorrer de cicatrização dos focos inflamatórios
relacionados com a presença de mastócitos, todavia ressaltam que a patogenia da fibrose
intersticial difusa não está esclarecida. Esses autores levantam a possibilidade de que a
organização do edema intersticial crônico, a ação de um anticorpo que atue nas membranas
musculares, interstício e vasos, ou a liberação de linfocinas fibrosantes poderiam estar
envolvidas.
Do ponto de vista macroscópico, TAFURI, RASO (1983) e LOPES et al. (2000),
caracterizam o megacólon como uma dilatação permanente do cólon, acompanhada ou não
de espessamento da parede e alongamento da alça, não provocada por obstrução mecânica.
KOBERLE (1968a) e OKUMURA (1983) acrescentam a hipertrofia da parede, mas não
referem ser a dilatação permanente. ADAD (1996) propõe que os termos espessamento ou
hipertrofia da parede sejam substituídos por aumento da massa muscular.
Microscopicamente, as alterações mais características e constantes do megacólon
chagásico são as dos plexos nervosos intramurais e das musculares (KÖBERLE, 1968a;
KÖBERLE et al., 1983; TAFURI, RASO, 1983; NOGUEIRA, 1996; ADAD, 1996;
LOPES et al., 2000; ADAD et al., 2001). São representadas por ganglionite,
periganglionite, neurite, perineurite, denervação e fenômenos degenerativos dos
neurônios, ocorrendo, por vezes, destruição completa de alguns gânglios, mais
freqüentemente no plexo mientérico. Segundo KÖBERLE (1968a, 1968b) o grau de
denervação necessário para o aparecimento de megacólon seria em torno de 50-55%,
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enquanto que para o megaesôfago seria necessário 90-95%. Esses dados foram
confirmados por ADAD (1989, 1996), embora no caso do megacólon seja necessário
realizar correção da contagem devido à hipertrofia neuronal (ADAD, 1996; ADAD et al.,
2001). Observa-se, na túnica muscular do megacólon chagásico, miosite de intensidade
variável, com degeneração e necrose de miocélulas e ainda fibrose, focal ou difusa, direta
ou indiretamente relacionada com os focos de miosite (TAFURI, RASO, 1983).
KISS (1972) analisou as células musculares no megacólon "adquirido" e
descreveu aumento do número de pontos de íntimo contato entre as miocélulas,
vacuolização citoplasmática, dilatação do retículo endoplasmático e desorganização de
miofilamentos.
O infiltrado inflamatório é constituído predominantemente por linfócitos
(ROCHA et al., 1981; TAFURI, RASO, 1983; LOPES et al., 2000; ADAD, 1996), em
especial por linfócitos T (NOGUEIRA, 1996; ADAD, 1996). Em geral, há número
menor de linfócitos B, plasmócitos, eosinófilos, macrófagos, mastócitos e neutrófilos
(ROCHA et al., 1981; LOPES et al., 2000; ADAD, 1996). A população de linfócitos T é
representada tanto por células CD4+ quanto CD8+, que segundo ADAD (1996), não seria
possível estimar, sem estudo quantitativo, o tipo predominante. LEMOS (1998) realizou
análise quantitativa de subpopulações de linfócitos T no sangue periférico de portadores
de megacólon chagásico e mostrou um maior número de CD4+ em relação às células
CD8+, numa razão que variou de 1,1 a 1,2.
Focos de miosite foram identificados por ADAD (1996) no cólon em 100% dos
chagásicos com mega, quando analisados cortes subseriados de três regiões (transição
reto-sigmóide, porção média do sigmóide e transição descendente-sigmóide), assim como
fibrose, freqüentemente moderada ou intensa, na túnica muscular. No grupo sem
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megacólon detectou miosite, assim como fibrose discreta, somente em 20% dos casos.
Em nenhum controle (não chagásico), encontrou miosite e/ou fibrose (ADAD, 1996).
Segundo TAFURI, RASO (1983), excepcionalmente a miosite é do tipo
granulomatoso. Entretanto, no material de ADAD (1996), miosite granulomatosa foi vista
em até 52,9% dos casos de megacólon, talvez por avaliar 30 cortes subseriados de anéis
intestinais completos de 3 regiões. No grupo de chagásicos sem megacólon, esta autora
não identificou miosite granulomatosa.
ADAD (1996) refere que as alterações vistas no megacólon chagásico, tais
como focos de miosite, fibrose e aumento da área da muscular, foram freqüentes tanto na
porção média quanto na distal do sigmóide; todavia, a denervação foi mais intensa na
região distal (transição reto-sigmóide), em relação à porção média do sigmóide e, nesta,
em relação à parte proximal da alça (transição descendente-sigmóide). Essa autora
classificou a fibrose no megacólon como de substituição (em geral focal), quando a
neoformação conjuntiva parecia substituir miocélulas e denominou-a de endomisial
quando havia aumento do conjuntivo entre as miocélulas (freqüentemente difusa), a qual
fora chamada de intersticial por TAFURI, RASO (1983).
Os mastócitos são células residentes no tecido conjuntivo, particularmente
associadas aos vasos sanguíneos, nervos e ductos glandulares, nas proximidades de
superfícies com interface para o meio externo (METCALFE et al., 1997; BERTON et al.,
2000), que apresentam grânulos citoplasmáticos metacromáticos. São células capazes de
secretar numerosos mediadores inflamatórios em resposta à agressão do tecido e podem
estar envolvidos em processos fibróticos (BERTON et al., 2000) e imunológicos (GALLI
et al., 1984). Essas células possuem receptores de membrana de alta afinidade para
imunoglobulina E (DVORAK et al., 1983), através dos quais podem estabelecer, em
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presença de ligantes multivalentes, pontes que levam à sua ativação e à conseqüente
liberação do conteúdo dos grânulos.
Os mastócitos são derivados da “stem cell” da medula óssea (KITAMURA,
MIYOSHI, 1978; KITAMURA et al., 1981; SCHARADER et al., 1981; NAKAHATA et
al., 1982; KANAKURA et al., 1988) e para sobreviverem dependem de fatores sobre as
células tronco (METCALFE et al., 1997).
Os mastócitos contêm e liberam várias substâncias como histamina, proteases
neutras
(LEVI-SCHAFFER,
RUBINCHICK,
1995),
fatores
quimiotáticos
(SIRAGANIAN, 1988), heparina (uma glicosaminoglicana sulfatada responsável pela
metacromasia) (JORPES, 1937; HOLMGREN, WILANDER, 1937), serotonina, citocinas
como as interleucinas 4, 5, 6, fator de necrose tumoral-alfa (OKAYAMA et al., 1995),
interleucina 13 (KATZ et al., 1995) e mediadores inflamatórios: prostaglandina D2,
leucotrienos C, D, E e fator de ativação das plaquetas.
Os mastócitos quando ativados liberam um espectro de mediadores que iniciam
e modulam a reação de hipersensibilidade tipo-imediata. A expressão de proteases neutras
dos mastócitos, marcador específico dessas células, é regulada por vários fatores de
crescimento. Os mastócitos humanos, assim como em roedores, são conhecidos por
produzirem citocinas que modulam a produção de imunoglobulina E e inflamação
(SCHWARTZ, 1993).
Os mastócitos expressam uma variedade de aspectos fenotípicos nos tecidos,
determinados pelo ambiente local. Retirada dos fatores de crescimento necessários resulta
na apoptose
de mastócitos. Os mastócitos parecem ser altamente relacionados
com
múltiplas funções biológicas críticas. São ativados por diversos estímulos, tanto receptor de
classe dependente de imunoglobulina E, quanto independente de imunoglobulina E.
Ativação através de diversos receptores leva a distintas vias de sinalização. Ativação dos
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mastócitos pode também ser seguida pela síntese de quimiocinas e citocinas, cuja secreção,
que ocorre horas depois, pode contribuir para inflamação crônica. Funções biológicas dos
mastócitos parecem incluir um papel na imunidade natural, envolvimento em mecanismos
de defesa do hospedeiro contra manifestações por parasitos, imunomodulação do sistema
imune, tecido de reparação e angiogênese (METCALFE et al.,1997).
O aumento do número de mastócitos é visto em uma variedade de doenças
fibrosantes (STEAD et al., 1990), ou proliferativas como na fibrose pulmonar (HUNT et
al., 1992; PESCI et al., 1993; BJERMER et al., 1988), fibrose hepática (ARMBRUST et
al., 1997; MURATA et al., 1973), neurofibromatose e psoríase (SCHULMAN, 1993;
GRUBER, KAPLAN , 1993; ROTHER et al., 1990), esclerodermia (HAWSKINS et al.,
1985; NISHIOKA et al., 1987; CHANEZ et al., 1993), quelóide (CRAIG et al., 1986) e
em doenças associadas com neovascularização como artrite reumatóide (CRISP et al.,
1984; MALONE et al., 1987), diabete melito (NORRBY et al., 1990), hemangioma
(GLOWACKI et al., 1982) e outros tipos de tumores ( MENINGER, ZETTER, 1992).
Muitas substâncias produzidas pelos mastócitos tem o potencial de afetar o
tecido conjuntivo. A histamina tem demonstrado estímulo para crescimento de
fibroblastos e aumento da síntese de colágeno tanto in vivo (SANDBERG, 1962) quanto
in vitro (NORRBY, 1973). Heparina e histamina agem juntas podendo influenciar a
formação de cicatriz (CLAMAN, 1993). Heparina tem demonstrado também influência
no crescimento de fibroblastos e aumento da síntese de colágeno (FERRAO, MASON,
1993; YAMASHITA et al., 1992). A triptase dos mastócitos humanos induz proliferação
de fibroblastos in vitro (RUOSS et al., 1991) e também é um fator fibrogênico capaz de
estimular a síntese de RNA mensageiro e a quimiotaxia (GRUBER et al.,1997; CAIRNS,
WALLS, 1997). Diversas citocinas produzidas pelos mastócitos são conhecidas também
pela sua atividade fibrogenética como interleucina 4 (MONROE et al., 1988), Fator de
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Necrose Tumoral Alfa e Fator de Crescimento Tumoral Beta 1 (KOVACS, 1991).
Finalmente, os mastócitos podem contribuir diretamente para a fibrose através de sua
habilidade para produzir glicoproteínas da matriz extracelular
(THOMPSON et al.,
1991).
Muitos desses mediadores não são produzidos exclusivamente pela ativação
dos mastócitos, particularmente no contexto da inflamação crônica. Entretanto, evidências
sugerem uma causa direta no relacionamento entre ativação dos mastócitos e inibição da
fibrose e/ou ativação e proliferação dos fibroblastos (METCALFE et al.,1997).
Experimentalmente, tem sido demonstrado que os mastócitos do peritônio de
ratos aumentam a proliferação de fibroblastos 3T3 e a produção de colágeno em culturas
de monocamadas (LEVI-SCHAFFER, RUBINCHICK, 1994).
Estudos in vivo e in vitro sugerem que os mastócitos podem interagir com os
fibroblastos, induzindo fibrose. In vitro, os fibroblastos regulam a sobrevivência e
diferenciação dos mastócitos, enquanto estas células causam mudanças bioquímicas nos
fibroblastos, podendo induzir fibrose (LEVI-SCHAFFER, RUBINCHICK, 1994).
Nas inflamações crônicas em geral têm-se atribuído aos mastócitos participação
na colagenogênese do fenômeno produtivo-reparativo (BENSLEY, 1949; MORRIONE,
1952; FERNEX, 1960, 1961, 1963, 1968; ORFANOS, STTÜTGEN, 1963).
A indução de novos vasos sanguíneos, ou angiogênese, tem sido em parte
relacionada com os mastócitos (MENINGER, ZETTER, 1992). Primeiro, porque os
mastócitos do tecido conjuntivo estão topograficamente associados com pequenos vasos
(RAKUSAN et al., 1990; RHODIN, FUJITA, 1989). Segundo, porque os mastócitos
acumulam um número de situações angiogênese-dependente, incluindo ovulação
(KRISHNA et al., 1989), formação de hemangioma (DETHLEFSEN et al., 1986),
neoplasia (DE CIDRE, DE LUSTIG, 1990; DONHUIJSEN et al.,1992; HAFEZ,
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COSTLOW, 1988; LE QUERREC et al., 1993) e disfunção do miocárdio (OLIVETTI et
al., 1989; RAKUSAN, CAMPBELL, 1991).
Grânulos de mastócitos têm sido descritos dentro das células endoteliais
(ATKINS et al., 1985; DESCHRYVER-KECSKEMETI et al., 1992) e estimulam sua
proliferação (DUNCAN et al., 1992; MARKS et al., 1986; ROCHE, 1985).
Do ponto de vista funcional, é concebível que uma interação entre mastócitos e
sistema nervoso periférico exista e levaria a vários processos inflamatórios e fisiológicos.
Neuropeptídeos, como neurotensina e substância P, induzem degranulação dos
mastócitos.
Além disso, tem sido mostrado que a substância P estimula as células
endoteliais vasculares e induz infiltração granulocítica através da degranulação dos
mastócitos (GRONBECH, LACY, 1994; LIWAMOTO et al., 1992; MATSUDA et al.,
1989; YANO et al., 1989). De fato, mastócitos foram descritos em íntima associação com
nervos periféricos no trato gastrintestinal e em uma variedade de sítios anatômicos em
humanos e em outras espécies de mamíferos (BIENENSTOCK et al., 1993).
Com relação à fixação dos mastócitos, TAINSH e PEARSE (1992) usaram o
formol como fixador e distinguiram dois subtipos de mastócitos, os sensíveis e
insensíveis ao formol. Estudaram histoquimicamente 4 tipos de mastócitos: peritoniais, do
mesentério, da pele e do pulmão de rato. Essas células apresentaram diferentes respostas
à coloração pelo azul de alcian-safranina O após fixação pelo formol. Utilizando a
coloração seqüencial verificaram que mastócitos do mesentério e da pele foram
resistentes ao formol e exibiram características intermediárias de coloração.
BIANCHI e MUGNAI (1991) testaram as técnicas de coloração por Azul de
Toluidina e Astra Blue em língua de rato para análise histoquímica por imagem dos
mastócitos. A comparação entre essas duas colorações mostra que a preparação corada
pela técnica de Astra Blue captura mais pixels do que aquela corada pelo Azul de
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Toluidina. A escolha de Astra Blue como uma alternativa para Azul de Toluidina em
análises densidométricas de mastócitos é baseada na propriedade de restringir a coloração
aos grânulos dos mastócitos.
XAUBET et al. (1991) compararam diferentes fixadores e métodos de
coloração para identificar mastócitos obtidos no lavado broncoalveolar de pacientes com
doenças pulmonares intersticiais. As células foram fixadas com formaldeído e metanol e
identificadas pelas colorações metacromáticas com May Grunwald Giemsa, Azul de
Toluidina e Giemsa Galamina Azul. Depois da fixação pelo formaldeído poucas células
foram identificadas independente da coloração utilizada, enquanto que um maior número
de mastócitos foi observado depois da fixação com metanol. Usando esse fixador,
identificaram-se mais células pela técnica de Azul de Toluidina do que pelo May
Grunwald Giemsa; entretanto, não houve diferença entre Toluidina e Giemsa Galamina
Azul. A fácil identificação de mastócitos depois da coloração pelo Azul de Toluidina,
combinada com a fácil aplicação, sugerem que essa coloração depois da fixação pelo
metanol é o método mais útil para determinar mastócitos em fluidos.
RONAI et al. (1993) analisaram as colorações May Grunwald Giemsa e Azul
de Toluidina para detectarem mastócitos no fluido broncoalveolar e consideraram as duas
colorações adequadas.
Na doença de Chagas tem-se relatado aumento do número de mastócitos,
associado ou não ao processo inflamatório, tanto em humanos como experimentalmente.
ALMEIDA et al. (1975) estudando cardiopatas chagásicos verificaram, através
de estudo quantitativo, mastocitose
relacionada topograficamente com a miocardite.
Admitiram que um dos possíveis fatores responsáveis pelo caráter fibrosante da
miocardite chagásica crônica seria o aumento do número de mastócitos no miocárdio.
Para a contagem dos mastócitos os fragmentos foram cortados em micrótomo de
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congelação, cortes de 20μm de espessura, os quais foram corados com azul de toluidina a
0,5%, pH 4,5.
ROCHA (1986) descreveu aumento do número de mastócitos no nó sinusal de
chagásicos crônicos, porém, esse autor não estabeleceu relação com a fibrose.
TAFURI et al. (1971) e TAFURI (1974), em estudos ultra-estruturais,
ressaltaram mastocitose no megaesôfago e megacólon chagásico referindo que os
mastócitos localizavam-se na cápsula, no interior dos gânglios do plexo mientérico,
próximos ao interstício intermuscular e entre os feixes de células musculares.
TAFURI, RASO (1983) descreveram dois tipos de mastocitose nos megas
chagásicos: um focal, sempre relacionado com focos de inflamação e outro, difuso,
independente desses focos.
PEREIRA (1972) procedeu estudo quantitativo dos mastócitos da camada
muscular circular do esôfago de chagásicos crônicos sem mega e encontrou aumento do
número de mastócitos, em relação a não chagásicos. Descreveu que o aumento de
mastócitos era difuso, não havendo relação topográfica com os focos inflamatórios. A
contagem de mastócitos foi feita em cortes corados pelo azul de toluidina a 0,5% de pH
4.
ADAD (1989) descreveu que parecia haver maior número de mastócitos na
muscular circular do esôfago de chagásicos crônicos, distribuídos de modo difuso sem
relação topográfica com os focos inflamatórios. Entretanto, ao realizar análise
quantitativa de mastócitos na muscular do esôfago (ADAD et al., 1992) e do cólon
(ADAD et al, 1997c) de chagásicos crônicos, com e sem mega, não detectaram diferença
estatisticamente significante. Esses estudos foram feitos em cortes corados pela técnica de
Giemsa.
18
LOPES (1999), quantificou o colágeno no miocárdio de cardiopatas de
diferentes etiologias, inclusive chagásica, através de métodos bioquímicos, biofísicos e
morfométricos. Embora não tenha detalhado a análise segundo a etiologia da cardiopatia,
verificou que o método morfométrico utilizado (percentagem de pontos da ocular
integradora, coincidentes com área de fibrose) guardava relação com a concentração de
hidroxiprolina que permitia estimar o teor de colágeno.
PINHEIRO (2000) realizou estudo morfométrico na muscular circular do cólon
contando o número de mastócitos e medindo o tecido conjuntivo fibroso nessa camada,
em cortes histológicos corados pela técnica de Giemsa de anéis intestinais retirados da
transição reto-sigmóide de 26 chagásicos crônicos, 13 com megacólon e 13 sem
megacólon comparados a 13 não chagásicos. Demonstrou que havia maior número de
mastócitos e aumento evidente do conjuntivo fibroso nos chagásicos com mega em
relação aos chagásicos sem mega e aos não chagásicos. Entretanto, não foi possível
demonstrar se existia relação entre fibrose e o número de mastócitos, talvez devido ao
tamanho da amostra. Expandindo o estudo anterior, foram avaliados 30 casos de
chagásicos crônicos sendo 15 anéis da transição reto-sigmóide de chagásicos com
megacólon e 15 sem megacólon comparados a 15 não chagásicos, PINHEIRO et al.
(2003) concluíram que o número de mastócitos e a fibrose foram maiores no grupo com
megacólon em relação ao chagásico sem mega e ao não chagásico e, não houve diferença
significante entre os dois últimos grupos. Concluíram ser provável a relação entre
mastocitose e fibrose no megacólon chagásico, como já foi demonstrado em outras
doenças.
PEREIRA (2002) realizou estudo morfológico, histoquímico, imunohistoquímico, morfométrico e ultra-estrutural na língua de indivíduos chagásicos
crônicos autopsiados e concluiu que a densidade de tecido conjuntivo fibroso e de
19
mastócitos nos indivíduos chagásicos foi significamente maior, quando comparados aos
não-chagásicos.
Com relação à doença de Chagas experimental, MENEZES, ALCÂNTARA
(1965) observaram aumento do número de mastócitos em áreas de reinoculação de T.
cruzi na pele de camundongos. Segundo esses autores, a inflamação, determinada por
novo inóculo, seria a causa do aumento dessas células.
TAFURI, BRENER (1967) descreveram aumento do número de mastócitos na
submucosa e especialmente na muscular do intestino delgado e do intestino grosso de
camundongos cronicamente infectados com a cepa “ABC” do Trypanosoma cruzi.
CHAPADEIRO
et
al.
(1988)
em
ratos
albinos
Wistar,
infectados
experimentalmente por Trypanosoma cruzi, referiram que, na fase aguda, os mastócitos
estavam ausentes ou eram escassos nos animais infectados. Os autores não fizeram
referência ao comportamento dessas células na fase crônica da doença.
PINHEIRO et al. (1992) em ratos cronicamente infectados por Trypanosoma
cruzi, demonstraram aumento do número de mastócitos no miocárdio, porém, não
puderam demonstrar relação com a fibrose. Quantificaram também o número de
eosinófilos, que não diferiu estatisticamente dos ratos não chagásicos. A contagem das
células foi realizada em cortes corados pela técnica de Giemsa.
PIRES et al. (1992)
infectaram experimentalmente camundongos e
demonstraram aumento dos níveis de histamina no músculo esquelético e no trato
gastrointestinal. Esses autores sugeriram que haveria paralelismo entre o aumento dos
níveis de histamina e o aumento de mastócitos nos tecidos na doença de Chagas.
POSTAN et al. (1994) demonstraram proliferação in situ e migração de
mastócitos, obtidos através de cultura in vitro de corações de camundongos infectados
experimentalmente por Trypanosoma cruzi. As células foram identificadas como
20
mastócitos pelo microscópio eletrônico e pela positividade dos grânulos quando corados
pelas técnicas de Giemsa, Azul de Toluidina e Sulfato de Berberina.
CALIARI et al. (2002) através de análise morfométrica computadorizada
quantificaram as áreas ocupadas por músculo cardíaco, tecido conjuntivo fibroso e tecido
adiposo no átrio direito de cães experimentalmente infectados pelo Trypanosoma cruzi.
Todos os cães infectados apresentaram miocardite crônica fibrosante com graus variáveis
de redução de músculo cardíaco, aumento do tecido conjuntivo e substituição por tecido
adiposo.
ADAD estudou isoladamente esôfago (1989) e cólon (1996). Refere ter tido a
impressão de que na muscular do esôfago em geral existem muito mais mastócitos que no
cólon dos controles. Considerando que o mastócito pode ter relação com processo
inflamatório e fibrose, seria interessante avaliar quantitativamente essa célula nesses dois
órgãos. Além disso, não encontramos na literatura estudos comparativos entre número de
mastócitos na muscular do esôfago em relação ao cólon, seja em indivíduos normais ou
chagásicos. Por essas razões nos propusemos realizar análise quantitativa do número de
mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon de chagásicos crônicos, com e sem
mega, visando conhecer melhor a morfologia do megaesôfago e megacólon chagásicos.
21
OBJETIVOS
22
Geral
Avaliar comparativamente o número de mastócitos na muscular do esôfago e
do cólon normais e, verificar se existe aumento do número de mastócitos no esôfago e
cólon de chagásicos crônicos com e sem mega, visando contribuir para a patogênese das
lesões dos megas chagásicos.
23
Específicos
1. Comparar o número de mastócitos na muscular do esôfago entre os diferentes
grupos.
2. Comparar o número de mastócitos na muscular do cólon entre os diferentes grupos.
3. Comparar o número de mastócitos na muscular do esôfago em relação ao cólon dos
mesmos indivíduos, tanto não chagásicos quanto chagásicos.
4. Avaliar semi-quantitativamente a miosite e a fibrose na túnica muscular do esôfago
e do cólon de chagásicos crônicos com e sem mega.
24
MATERIAL E MÉTODO
25
1. Material
Foram estudados 28 casos de necrópsias realizadas no Serviço de Patologia do
Hospital Escola da Universidade Federal do Triângulo Mineiro, Uberaba, Minas Gerais.
Os 28 casos correspondem a 16 chagásicos crônicos e 12 não chagásicos sem
qualquer patologia gastrointestinal, que serviram de controle. O grupo dos 16 chagásicos
foi dividido em dois subgrupos:
 Chagásico sem mega - constituído por 10 chagásicos sem megacólon e sem
megaesôfago;
 Chagásico com mega - composto por 6 chagásicos com megaesôfago e megacólon.
O diagnóstico de infecção chagásica foi baseado na positividade de pelo menos
duas das três seguintes reações no sangue e/ou líquido pericárdico: ELISA (Enzime-linkedimmunosorbent-assay), hemaglutinação passsiva e imunofluorescência indireta para
26
Trypanosoma cruzi. Os indivíduos do grupo controle apresentaram as três reações
negativas.
O diagnóstico de megaesôfago foi feito através de dados clínicos (disfagia) e
radiológicos (radiografia contrastada de esôfago). O diagnóstico de megacólon também foi
feito a partir de dados clínicos (obstipação intestinal acompanhada freqüentemente de
complicações como fecaloma e volvo) e radiológicos (enema opaco mostrando dilatação e
perda das haustrações acompanhadas ou não de alongamento do cólon e/ou radiografia
simples de abdome, evidenciando fecaloma e dilatação intestinal). A análise dos dados
clínicos, exame físico, eletrocardiograma, radiografia de tórax e exame contrastado de
esôfago, constantes nas fichas hospitalares e/ou de dados das necrópsias, permitiu
classificar os chagásicos em portadores ou não de megaesôfago, bem como cardiopatas
(com ou sem insuficiência cardíaca) ou não cardiopatas. Os anexos 1, 2 e 3, relacionam os
dados de identificação dos pacientes e os principais achados anatomoclínicos nos grupos
não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com megaesôfago e megacólon,
respectivamente.
A idade variou de 25 a 85 (53 ± 17,26) anos no grupo não chagásico, 47 a 84 (59,5
± 14,67) anos no grupo chagásico sem mega e 43 a 67 (55,3 ± 12,04) anos no grupo
chagásico com mega.
Em relação ao sexo, 10 (83,3%) do grupo não chagásico, 6 (60%) do grupo
chagásico sem mega e 5 (83,3%) do grupo chagásico com mega, eram do sexo masculino.
Quanto à cor, foram separados em brancos e não brancos, sendo que 8 (66,7%) do
grupo não chagásico, 4 (40%) do grupo chagásico sem mega e 3 (50%) do grupo chagásico
com mega, eram brancos.
2. Método
27
2.1. Colheita e processamento do material
Retirou-se de cada caso, um anel com cerca de 0,5cm de “altura” na transição retosigmóide, ou seja, no sigmóide distal e no terço inferior do esôfago, a 5 cm da cárdia . Os
anéis do sigmóide distal e do esôfago foram fixados em formol a 4%, sendo os anéis
menores preenchidos com papel de filtro antes de serem colocados no formol para mantêlos com o formato anular. Para evitar que os anéis maiores fossem subdivididos, eram
abertos a fresco, enrolados sobre si mesmos com um papel de filtro justaposto à mucosa,
facilitando a fixação e moldando-os para posterior inclusão. Após a fixação, os anéis foram
submetidos à desidratação, diafanização e inclusão em parafina, confeccionando-se blocos
para microtomia, com até 5x5cm, obtendo-se cortes histológicos com 7µm de espessura.
Os cortes foram corados segundo as técnicas de hematoxilina-eosina, Tricrômico de
Masson e Giemsa. A seguir, procedeu-se à análise quantitativa dos mastócitos, nos cortes
corados pela técnica de Giemsa, e à análise semi-quantitativa da fibrose, nos cortes corados
pelo Tricrômico de Masson. Os cortes corados pala técnica de hematoxilina-eosina foram
utilizados para análise geral dos anéis e avaliação semi-quantitativa da miosite.
2.2. Análise quantitativa dos mastócitos
A contagem dos mastócitos foi feita na muscular circular do cólon e do esôfago, nos
cortes corados pela técnica de Giemsa, utilizando um microscópio de luz comum, da marca
LEICA, modelo DIASTAR.
Os cortes histológicos dos anéis eram marcados em 8 locais, criando subdivisões
aproximadamente eqüidistantes entre si, sendo os mastócitos contados em 8 campos
28
microscópicos consecutivos em cada subdivisão, totalizando 64 campos microscópicos,
com ocular de 10x milimetrada e objetiva de 40x, correspondendo a uma área total de
12,6mm². O número de mastócitos era anotado em cada campo e, ao final, obtinha-se a
soma do número de mastócitos em 64 campos para cada caso.
2.3. Análise semi-quantitativa da miosite e da fibrose.
Para a avaliação da miosite foram utilizados cortes histológicos corados pelas
técnicas de Hematoxilina-eosina e Giemsa observando-se a presença ou não dessas
alterações.
O processo inflamatório na túnica muscular do esôfago e do cólon foi
classificado em discreto, moderado ou intenso com base no tamanho e freqüência dos focos
de exsudato.
Para a análise semi-quantitativa da fibrose foram utilizados os cortes histológicos
corados segundo a técnica de Tricrômico de Masson, obtendo-se a fibrose em azul e o
músculo em vermelho. A análise da fibrose foi feita na muscular circular do cólon e do
esôfago tanto nos chagásicos sem mega quanto com mega comparados ao grupo não
chagásico. Analisou-se a fibrose de substituição (neoformação conjuntiva que parecia
interromper e substituir miocélulas) e a fibrose intersticial (endomisial/perimisial; aumento
do conjuntivo entre as miocélulas). A fibrose foi classificada quanto à intensidade, em
discreta, moderada ou intensa.
2.4. Análise estatística
29
O tamanho ideal da amostra do número de campos microscópicos a serem medidos
para a contagem dos mastócitos foi obtido após cálculo das médias acumuladas para
quantidades adequadas, nos casos controles (WILLIAMS,1981).
As variáveis analisadas não apresentaram distribuição normal, sendo comparadas
por meio da estatística de Kruskal-Wallis com relação aos três grupos de estudo e MannWhitney quando agrupados todos os chagásicos num mesmo grupo, através do programa
GraphPad InStat.
Para a comparação da miosite e da fibrose foi utilizado o Teste Exato de Fisher.
O nível de significância considerado para os testes foi de 5% (p < 0,05).
30
RESULTADOS
31
A análise estatística demonstrou homogeneidade entre os grupos não chagásico,
chagásico sem mega e chagásico com mega, com relação à idade, sexo e cor.
1. Análise quantitativa dos mastócitos
A avaliação preliminar global dos cortes corados pela técnica de Giemsa permitiu
observar que os mastócitos, em todos os grupos, encontravam-se dispersos em toda a túnica
muscular do cólon e do esôfago, em geral sem formar acúmulos (Figuras 1, 2, 3, 4, 5 e 6).
Nos chagásicos havia mastócitos tanto nos focos de miosite, quanto dispersos no restante
da muscular (Figuras 7 e 8).
32
33
34
35
O Quadro 1 mostra o resultado da contagem dos mastócitos em 64 campos
microscópicos de grande aumento (área total: 12,6mm²), na muscular circular do esôfago e
do cólon de cada caso.
Quadro 1 – Numero de mastócitos em 64 campos microscópicos (área total: 12,6mm²) na
muscular do esôfago e do cólon em cada caso, segundo os grupos de estudo.
Mastócitos
Mastócitos
Caso
Grupo
Esôfago
Cólon
1
NC
346
8
2
NC
160
0
3
NC
70
2
4
NC
18
0
5
NC
122
1
6
NC
62
1
7
NC
373
1
8
NC
59
0
9
NC
133
0
10
NC
241
20
11
NC
84
24
12
NC
108
1
13
CSM
182
3
14
CSM
474
5
15
CSM
185
0
16
CSM
74
1
17
CSM
196
0
18
CSM
114
42
19
CSM
27
1
20
CSM
43
0
21
CSM
44
111
22
CSM
1070
49
23
CCM
578
30
24
CCM
340
29
25
CCM
60
25
26
CCM
118
7
27
CCM
241
31
28
CCM
179
1
NC: não chagásico; CSM: chagásico sem mega; CCM: chagásico com mega
Nota-se, no quadro 1, grande variação no número de mastócitos nos diferentes
grupos sendo, em geral, maior no esôfago em comparação ao cólon, em todos os grupos.
A Tabela 1 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago
do grupo não chagásico e indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto.
36
Tabela 1 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago no grupo
não chagásico em relação aos indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto.
NÃO
CHAGÁSICO
148
114
115
373
18
12
MASTÓCITOS
Média
Desvio padrão
Mediana
Valor máximo
Valor mínimo
n° de casos
CHAGÁSICO
245
270
180
1070
27
16
Teste de Mann-Whitney p = 0,4499
Como observa-se na Tabela 1, embora os valores médios sejam maiores nos
chagásicos, talvez devido a grande variabilidade do número de mastócitos no esôfago, a
diferença não foi estatisticamente significante entre o grupo não chagásico e os indivíduos
chagásicos com e sem mega em conjunto (p = 0,4499).
A Tabela 2 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do
esôfago nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
Tabela 2 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago nos grupos
não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
MASTÓCITOS
Média
Desvio padrão
Mediana
Valor máximo
Valor mínimo
n° de casos
NÃO
CHAGÁSICO
148
114
115
373
18
12
CHAGÁSICO
sem megaesôfago
com megaesôfago
241
253
319
187
148
210
1070
578
27
60
10
6
Teste de Kruskal-Wallis p = 0,4980
Como observa-se na Tabela 2, os valores médios no grupo com mega tendem a
ser maiores que no chagásico sem mega e também maiores neste em relação ao não
chagásico; porém, não houve diferença estatisticamente significante entre os grupos (p =
37
0,4980), em relação à contagem de mastócitos na muscular do esôfago. Talvez isso se deva
a grande variabilidade individual, além do pequeno número de casos no grupo com mega.
A Tabela 3 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular circular
do cólon do grupo não chagásico e dos indivíduos chagásicos com e sem mega em
conjunto.
Tabela 3 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do cólon no grupo não
chagásico em relação aos indivíduos chagásicos com e sem mega em conjunto.
MASTÓCITOS
Média
Desvio padrão
Mediana
Valor máximo
Valor mínimo
n° de casos
NÃO CHAGÁSICO
5
8
1
24
0
12
CHAGÁSICO
21
29
6
111
0
16
Teste de Mann-Whitney p = 0,0735
Como observa-se na Tabela 3, embora os valores médios sejam maiores nos
chagásicos, talvez devido a grande variabilidade no número de mastócitos no cólon, a
diferença não foi estatisticamente significante entre os grupos não chagásico e indivíduos
chagásicos com e sem mega em conjunto (p = 0,0735).
A Tabela 4 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do
cólon entre os grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
Tabela 4 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do cólon, nos grupos
não chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
MASTÓCITOS
Média
Desvio padrão
Mediana
Valor máximo
Valor mínimo
n° de casos
NÃO
CHAGÁSICO
5
8
1
24
0
12
Teste de Kruskal-Wallis p = 0,0728
CHAGÁSICO
sem megacólon
com megacólon
21
20
37
13
2
27
111
31
0
1
10
6
38
Como observa-se na Tabela 4, apesar dos valores médios nos chagásicos com e
sem megacólon terem sido maiores que os do grupo não chagásico, talvez devido a grande
variabilidade no número de mastócitos no cólon, a diferença não foi estatisticamente
significante (p = 0,0728).
Comparamos também a contagem de mastócitos no esôfago em relação ao cólon
do mesmo indivíduo em cada grupo, pois nos impressionou a tendência geral de ter mais
mastócitos no esôfago.
A Tabela 5 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago
e do cólon, dos mesmos indivíduos, do grupo não chagásico.
Tabela 5 - Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon,
dos mesmos indivíduos, no grupo não chagásico.
MASTÓCITOS
Média
Desvio padrão
Mediana
Valor máximo
Valor mínimo
n° de casos
ESÔFAGO
148
114
115
373
18
12
CÓLON
5
8
1
24
0
12
Teste de Mann-Whitney p < 0,0001
Como nota-se na Tabela 5, quando se compara o número de mastócitos no
esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos do grupo não chagásico, observa-se diferença
estatisticamente significante (p < 0,0001), sendo maior no esôfago.
A Tabela 6 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago
e do cólon dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com e sem mega em conjunto.
39
Tabela 6 – Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon,
dos mesmos indivíduos, do grupo chagásico com e sem mega em conjunto.
MASTÓCITOS
Média
Desvio padrão
Mediana
Valor máximo
Valor mínimo
n° de casos
ESÔFAGO
245
270
180
1070
27
16
CÓLON
21
29
6
111
0
16
Teste de Mann-Whitney p < 0,0001
Como observa-se na Tabela 6, quando se compara o número de mastócitos no
esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos, do grupo chagásico com e sem mega em
conjunto, nota-se diferença estatisticamente significante ( p < 0,0001), sendo maior no
esôfago.
A Tabela 7 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago
e do cólon, dos mesmos indivíduos do grupo chagásico sem mega.
Tabela 7 – Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon,
dos mesmos indivíduos do grupo chagásico sem mega.
MASTÓCITOS
Média
Desvio padrão
Mediana
Valor máximo
Valor mínimo
n° de casos
ESÔFAGO
245
319
148
1070
27
10
CÓLON
21
37
2
111
0
10
Teste de Mann-Whitney p = 0,0021
Como nota-se na Tabela 7, quando se compara o número de mastócitos no
esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos do grupo sem mega, observa-se diferença
estatisticamente significante (p < 0,0021), sendo maior no esôfago.
A Tabela 8 mostra o resultado da contagem de mastócitos na muscular do esôfago
e do cólon, dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com megaesôfago e megacólon.
40
Tabela 8 – Resultado da contagem de mastócitos na muscular circular do esôfago e do cólon,
dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com megaesôfago e megacólon.
MASTÓCITOS
Média
Desvio padrão
Mediana
Valor máximo
Valor mínimo
n° de casos
MEGAESÔFAGO
253
187
210
578
60
6
MEGACÓLON
20
13
27
31
1
6
Teste de Mann-Whitney p = 0,0022
Como observa-se na Tabela 8, quando se compara o número de mastócitos no
esôfago e no cólon dos mesmos indivíduos do grupo chagásico com megaesôfago e
megacólon, nota-se diferença estatisticamente significante (p < 0,0022), sendo maior no
esôfago.
A análise global desses resultados permite concluir que o número de mastócitos
no esôfago é muito maior que no cólon em todos os grupos, o que indica uma diferença na
estrutura desses dois órgãos, o que pode ser importante na amplificação da resposta
inflamatória. Entretanto, com relação a possível mastocitose nos chagásicos, não foi
possível, com o número de casos estudados, estabelecer diferença.
2. Análise semi-quantitativa da miosite e da fibrose
Miosite, caracterizada por infiltrado celular associado a degeneração e/ou necrose
das miocélulas não foi observada nos esôfagos do grupo não chagásico (Figura 9). No
grupo chagásico sem mega detectou-se miosite em 6 (60%) dos 10 casos, enquanto nos
chagásicos com megaesôfago miosite esteve presente em todos os 6 (100%) casos. Em
todos os chagásicos os focos eram constituídos predominantemente por mononucleares,
ocasionalmente com eosinófilos de permeio (Figuras 10 e 11).
41
Com base na freqüência e tamanho dos focos de exsudato, classificou-se a
miosite em discreta, moderada ou intensa. De modo geral, quanto mais numerosos eram os
focos de miosite, mais intenso era o exsudato e o aspecto destrutivo da lesão.
42
43
O Quadro 2 mostra a
avaliação da miosite, da fibrose de substituição e
intersticial e o número de mastócitos na muscular circular do esôfago nos grupos não
chagásico, chagásico sem mega e chagásico com mega.
Quadro 2 - Miosite, fibrose de substituição e intersticial e número de mastócitos na muscular
circular do esôfago, em cada caso, nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e chagásico
com mega.
Caso
Grupo
Miosite
Fibrose
Fibrose
Número de
substituição
intersticial
mastócitos
1
NC
346
2
NC
160
3
NC
70
4
NC
18
5
NC
122
6
NC
62
7
NC
373
8
NC
59
9
NC
133
10
NC
241
11
NC
84
12
NC
108
13
CSM
++
+
182
14
CSM
474
15
CSM
185
16
CSM
+
74
17
CSM
++
+
196
18
CSM
++
+
114
19
CSM
27
20
CSM
+
+
43
21
CSM
44
22
CSM
++
1070
23
CCM
+
+
++
578
24
CCM
++
++
++
340
25
CCM
+
+++
+++
60
26
CCM
++
+
+
118
27
CCM
+
+++
++
241
28
CCM
+
++
+++
179
NC: não chagásico; CSM: chagásico sem mega; CCM: chagásico com mega; - : ausente; + : discreta; ++ :
moderada; +++: intensa.
Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou
ausência de miosite entre os grupos chagásico sem mega e chagásico com mega não
encontramos diferença estatisticamente significante (p = 0,2335).
44
Com relação à fibrose, avaliada nos cortes corados pelo Tricrômico de Masson,
observou-se que no grupo não chagásico havia, em geral, escasso tecido conjuntivo, na
túnica muscular do esôfago (Figura 15), correspondendo a delgadas faixas entre as
miocélulas (conjuntivo intersticial). Em nenhum caso deste grupo foi vista fibrose de
substituição e/ou intersticial.
No grupo chagásico sem megaesôfago, observou-se discreta fibrose de
substituição em apenas 1 (10%) dos 10 casos, representada por raros focos de fibrose
interrompendo miocélulas. Em outros 3 (30%) casos desse grupo havia fibrose intersticial
discreta (Figura 16).
Nos chagásicos com megaesôfago, havia aumento evidente do tecido conjuntivo
fibroso, com fibrose de substituição e intersticial em todos os 6 (100%) casos (Figura 17).
Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou
ausência de fibrose de substituição entre os grupos chagásico sem mega e chagásico com
mega, observamos
diferença estatisticamente significante (p = 0,0009), sendo mais
freqüente no grupo com megaesôfago. Essa fibrose poderia estar relacionada com antigos
focos de miosite, pela destruição das miocélulas. Quando comparamos a fibrose intersticial
nos grupo chagásico sem mega e chagásico com mega, também observamos diferença
estatisticamente significante (p = 0,0114), sendo mais freqüente nos esôfagos com mega.
45
46
Com relação à análise do cólon, não havia miosite em nenhum dos controles não
chagásicos (Figura 12); detectou-se miosite em 5 (50%) dos 10 casos do grupo chagásico
sem mega, sendo discreta em todos eles (Figura 13). Nos chagásicos com megacólon,
miosite esteve presente em 4 (66,7%) dos 6 casos, sendo discreta em 2 e moderada nos
outros 2 casos (Figura 14). O aspecto da miosite, do ponto de vista qualitativo, era
semelhante ao do esôfago.
47
48
O Quadro 3 mostra a avaliação da miosite, da fibrose de substituição e intersticial
e do número de mastócitos na muscular circular do cólon, nos grupos não chagásico,
chagásico sem mega e chagásico com mega.
Quadro 3 - Miosite, fibrose de substituição e intersticial e número de mastócitos na muscular
circular do cólon, em cada caso, nos grupos não chagásico, chagásico sem mega e com mega.
Caso Grupo
Miosite
Fibrose
Fibrose
Número de
substituição
intersticial
mastócitos
1
NC
8
2
NC
0
3
NC
2
4
NC
0
5
NC
1
6
NC
1
7
NC
1
8
NC
0
9
NC
0
10
NC
20
11
NC
24
12
NC
1
13
CSM
+
3
14
CSM
+
+
+
5
15
CSM
0
16
CSM
+
1
17
CSM
+
0
18
CSM
+
42
19
CSM
1
20
CSM
0
21
CSM
+
111
22
CSM
+
49
23
CCM
+
+
++
30
24
CCM
++
++
+++
29
25
CCM
++
+++
25
26
CCM
++
++
+
7
27
CCM
++
++
31
28
CCM
+
++
+++
1
NC: não chagásico; CSM: chagásico sem mega; CCM: chagásico com mega; - : ausente; + : discreta; ++ :
moderada; +++ : intensa.
Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou
ausência de miosite entre os grupos chagásico sem mega e chagásico com mega não
encontramos diferença estatisticamente significante (p = 1,0000).
Como observa-se no Quadro 3 não havia fibrose de substituição e/ou intersticial
na muscular circular do cólon em nenhum caso do grupo não chagásico (Figura 18).
49
No grupo chagásico sem mega observou-se fibrose de substituição (Figura 19) em
2 (20%) dos 10 casos e intersticial em outros 2 (20%) casos.
Nos chagásicos com megacólon, havia aumento evidente do tecido conjuntivo
fibroso em todos os 6 (100%) casos, com freqüentes focos de fibrose tanto de substituição
quanto intersticial (Figura 20).
50
51
Quando realizamos o Teste exato de Fisher para compararmos a presença ou
ausência de fibrose de substituição no cólon entre os grupos chagásico sem mega e
chagásico com mega, observamos que há diferença estatisticamente significante (p =
0,0070), sendo mais freqüente no megacólon. Essa fibrose poderia ter relação com antigos
focos de miosite, pela destruição das miocélulas. Quando comparamos a fibrose intersticial
nos mesmos grupos, observamos também diferença estatisticamente significante (p =
0,0070), sendo mais freqüente e intensa no megacólon.
52
DISCUSSÃO
53
Em nosso estudo comparamos o número de mastócitos no esôfago e cólon de
chagásicos crônicos com e sem megacólon em relação a não chagásicos; porém, não
conseguimos demonstrar diferença entre os grupos.
Não encontramos na literatura nenhum estudo feito simultaneamente nesses dois
órgãos. Existem estudos isolados do esôfago e do cólon.
Com relação ao estudo do esôfago nossos dados estão de acordo com os de
ADAD et al. (1992), que também não encontraram diferença significante entre chagásicos
com mega, sem mega e não chagásicos. Estão em desacordo com o estudo de PEREIRA et
al. (1992), que avaliaram 20 casos de chagásicos crônicos sem megaesôfago em relação aos
controles, encontrando maior número de mastócitos nos chagásicos. Talvez essa diferença
entre nosso estudo e o de PEREIRA et al. (1972) decorra do menor número de casos que
avaliamos, porque embora os valores médios da contagem de mastócitos tenham sido
maiores nos chagásicos com e sem mega em relação aos controles, a diferença não foi
estatisticamente significante. Infelizmente não conseguimos aumentar nosso número de
casos devido a dificuldade em obter chagásicos com megaesôfago e megacólon
54
simultaneamente, que tivessem sido submetidos à necrópsia. No início deste estudo
coletamos e avaliamos vários casos só com megacólon ou apenas com megaesôfago;
acabamos por excluí-los no final porque os grupos ficavam mistos, dificultando
entendimento e comparação do esôfago e cólon no mesmo indivíduo.
Na realidade até mesmo aumentar o número de casos de chagásicos sem
megas foi difícil porque necrópsias já realizadas anteriormente às vezes não tinham o anel
completo do esôfago e cólon nos locais padronizados para este estudo.
Quanto ao número de mastócitos no cólon, nossos dados concordam com os
de ADAD et al. (1997), que também não encontraram diferença significante entre
chagásicos com megacólon, sem megacólon e não chagásicos. Esses autores também
trabalharam com pequeno número de casos. Ao aumentar o número de casos, PINHEIRO
(2000) e PINHEIRO et al. (2003), conseguiram demonstrar maior número de mastócitos
nos chagásicos com megacólon. No presente estudo, assim como já referido para o esôfago,
notou-se uma tendência dos valores médios de mastócitos no cólon serem maiores nos
chagásicos em relação aos não chagásicos (p = 0,07), porém a diferença não foi
estatisticamente significante. Outro fator que deve ser lembrado como causa de dificuldade
neste presente estudo é que os casos foram todos de necrópsia, o que certamente implica
em maior grau de autólise que o ocorrido no material de PINHEIRO (2000) e PINHEIRO
et al. (2003), que tinham em seu material vários casos de megacólon obtidos por cirurgia. A
autólise pode interferir na afinidade tintorial das células. Entretanto, como queríamos
comparar esôfago e cólon dos mesmos indivíduos só foi possível trabalhar com material de
necrópsia.
O dado mais interessante deste estudo é sem dúvida a demonstração de que a
muscular do esôfago é muito mais rica em mastócitos do que a do cólon. Esse dado é
inédito. Não encontramos na literatura nenhum estudo comparativo entre o cólon e o
55
esôfago, seja em controles ou em chagásicos, com relação a mastócitos. Parece-nos
importante porque o mastócito é uma célula que pode contribuir para a amplificação do
processo inflamatório favorecendo maior inflamação no esôfago. Esse dado talvez possa ter
relação, pelo menos em parte, com o achado de ADAD et al. (2000) que encontraram maior
freqüência e intensidade de miosite no esôfago, em relação ao cólon de chagásicos
crônicos. Em nosso material também parece ter ocorrido essa tendência, embora o número
de casos de mega do presente estudo seja pequeno.
Acreditamos que diferença estruturais, histológicas, entre órgãos são
importantes para explicar aspectos patogenéticos. Foi demonstrado anteriormente, em
estudo do nosso grupo (ETCHEBEHERE, 2001), que o esôfago e o cólon diferem com
relação aos gânglios do sistema nervoso entérico. A vascularização dos gânglios esofágicos
pode favorecer ganglionite e denervação mais rápida e intensa e, de modo semelhante, a
maior quantidade de mastócitos poderia favorecer maior grau de miosite e talvez de
fibrose.
A fibrose na muscular circular do esôfago e do cólon é mais evidente e intensa
nos casos de chagásicos com megas, apresentando-se em parte, como de substituição e em
parte, intersticial. Acreditamos que a fibrose de substituição nos megas representaria uma
seqüela da miosite, como já foi demonstrado em estudos de megaesôfago (TAFURI et al.
1971; TAFURI, RASO, 1983; ADAD, 1989) e também de megacólon chagásico, sendo
que ADAD (1996) descreveu ter observado proliferação fibroblástica incipiente em focos
de miosite destrutiva.
Para TAFURI, RASO (1983) a fibrose intersticial não estaria relacionada
com a inflamação. Poderia ser decorrente da estruturação da substância fundamental por
enzimas circulantes provenientes de fibroblastos distantes da área de fibrose ou poderia
estar relacionada à mastocitose presente na doença de Chagas experimental e humana.
56
Todavia em nosso estudo, não foi possível demonstrar relação entre mastocitose e fibrose,
talvez devido ao pequeno número de casos. Acreditamos na possibilidade da fibrose
intersticial ser decorrente, pelo menos em parte, de um aumento inespecífico do conjuntivo
de sustentação, acompanhando a hipertrofia das miocélulas como é visto por exemplo na
cardiopatia hipertensiva. Essa possibilidade está sendo levantada também pelo fato de que
a fibrose intersticial no megacólon foi semelhante a encontrada no megaesôfago, apesar do
esôfago ser muito mais rico em mastócitos que o cólon.
Em conclusão, não encontramos na literatura estudos que comparem o número de
mastócitos na muscular circular do cólon e do esôfago, mas apenas estudos isolados. A
análise global desses resultados permite concluir que o número de mastócitos no esôfago é
muito maior que no cólon em todos os grupos, o que indica uma diferença estrutural entre
esses dois órgãos. Com relação à mastocitose em chagásicos, não foi possível, com o
número de casos estudados, estabelecer diferença.
57
CONCLUSÃO
58
1. Na muscular do esôfago, não houve diferença estatisticamente significante entre o
número de mastócitos nos chagásicos com megaesôfago em relação aos chagásicos
sem mega e aos não chagásicos.
2. Na muscular circular do cólon não houve diferença, estatisticamente significante,
entre o número de mastócitos nos chagásicos com megacólon em relação aos
chagásicos sem mega e aos não chagásicos.
3. O número de mastócitos no esôfago foi muito maior que no cólon em todos os
grupos, o que indica uma diferença estrutural entre esses dois órgãos.
4. Não houve diferença estatisticamente significante entre a freqüência de miosite no
grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.
5. Fibrose de substituição e fibrose intersticial foram vistas mais frequentemente no
grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.
59
RESUMO
60
Com o objetivo de avaliar comparativamente o número de mastócitos na
muscular do esôfago e do cólon normal e, verificar se existe aumento do número de
mastócitos no esôfago e cólon de chagásicos crônicos com e sem mega, contamos o
número de mastócitos e avaliamos semi-quantitativamente a miosite e a fibrose visando
contribuir para a patogênese das lesões dos megas chagásicos.
Foram estudados 28 casos de necrópsias sendo 12 controles não chagásicos, 10
chagásicos sem megas e 6 chagásicos com megaesôfago e megacólon. Foram retirados um
anel na transição reto-sigmóide e outro no terço inferior do esôfago, a 5 cm da cárdia de
todos os casos. Os anéis foram fixados em formol a 4% e processados para inclusão em
parafina. Os cortes histológicos foram corados pelas técnicas de Hematoxilina-Eosina,
Giemsa e Tricrômico de Masson.
Os mastócitos foram contados em 64 campos do microscópio de luz comum,
marca LEICA, modelo DIASTAR (área total: 12,6mm²), em cortes corados pela técnica de
Giemsa. Avaliou-se semi-quantitativamente a miosite e o tecido conjuntivo fibroso em
61
cortes corados pela técnica de Hematoxilina-Eosina e Tricrômico de Masson. Essas
alterações foram classificadas em discreta, moderada ou intensa.
As conclusões seguintes sintetizam nossa análise:
1. Na muscular do esôfago não houve diferença, estatisticamente significante,
entre o número de mastócitos nos chagásicos com megaesôfago em relação aos chagásicos
sem mega e aos não chagásicos.
2. Na muscular circular do cólon não houve diferença, estatisticamente
significante, entre o número de mastócitos nos chagásicos com megacólon em relação aos
chagásicos sem mega e aos não chagásicos.
3. O número de mastócitos no esôfago foi muito maior que no cólon em todos
os grupos, o que indica uma diferença estrutural entre esses dois órgãos.
4. Não houve diferença estatisticamente significante entre a freqüência de
miosite no grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.
5. Fibrose de substituição e fibrose intersticial foram vistas mais freqüentemente
no grupo chagásico com mega em relação aos chagásicos sem mega.
62
ABSTRACT
63
EVALUATION OF THE MAST CELLS IN THE CIRCULAR MUSCULATURE OF
THE ESOPHAGUS AND COLON OF CHRONIC CHAGA´S DISEASE WITH AND
WITHOUT MEGA
With the objective of comparatively evaluate the number of mast cells in the
circular musculature of the esophagus and the normal colon, and to verify if there is an
increase of the number of mast cells in the esophagus and colon of chronic chagasics with
and without mega, we counted the number of mast cells and evaluated semi-qualitatively
myositis and fibrosis aiming to contribute to the pathogenesis of the lesions of mega
chagasic ones.
28 cases of necropsy were studied, being 12 non-chagasic controls, 10 chagasic
without megas and 6 chagasic with megacolon and megaesophagus. A ring in the rectal
sigmoid transition was drawn and another one in the lower third of the esophagus, 5 cm of
the cardia of all the cases. The rings were fixed in formol 4% and processed for an
64
inclusion in paraffin. Histological cuts were stained by the hematoxylin-eosin, Giemsa and
Tricrômico of Masson techniques.
Mast cells were counted in 64 microscopic fields of common light, LEICADIASTAR model (total area: 12. 6mm², in cuts stained by Giemsa technique. Myositis was
semi-quantitatively evaluated and the fibrous connective tissue in cuts stained by
hematoxylin-eosin and Tricrômico of Masson techniques. These alterations were classified
in discrete, moderate or intense ones.
The following conclusions synthesize our analysis:
1. In the musculature of the esophagus there was no statistically significant difference
between the number of mast cells in the chagasic subjects with megaesophagus,
related to the chagasic ones without mega and to the non-chagasic ones.
2. In the musculature of the colon there was no statistically significant difference
between the number of the mast cells in the chagasic subjects with megacolon,
related to the chagasic ones without mega and to the non-chagasic ones.
3. The number of mast cells in the esophagus was much higher than in the colon in all
of the groups, what indicates a structural difference between these two organs.
4. There was not a statistically significant difference between the frequency of
myositis in the chagasic group with mega related to the chagasic ones without
mega.
5. Substitution fibrosis and interstitial fibrosis were seen more frequently in the
chagasic group with mega, related to the chagasic ones without mega.
65
NORMAS TÉCNICAS ADOTADAS
66
ASSOCIAÇÃO BRASILEIRA DE NORMAS E TÉCNICAS. Referências Bibliográficas:
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80
ANEXOS
81
Anexo 1- Idade, sexo, cor e principais dados anatomoclínicos do grupo não chagásico.
CASO IDADE SEXO
COR
OBSERVAÇÕES
(anos)
1
54
M
B
Doença hipertensiva; aneurisma dissecante de aorta
2
79
M
B
Cardiopatia isquêmica; aneurisma cerebral
3
85
M
NB
Pós-operatório de aneurisma de aorta; infarto agudo do
miocárdio
4
47
M
NB
Traumatismo crânio-encefálico
5
34
M
B
Infarto agudo do miocárdio
6
25
F
NB
Trombose venosa e infarto cerebral
7
48
M
NB
Cardiopatia hipertensiva
8
56
M
B
Epilepsia há 20 anos; empiema pleural
9
45
M
B
Etilismo crônico; pancreatite aguda
10
68
M
B
Aneurisma sacular roto de aorta; cardiopatia hipertensiva
11
45
F
B
Embolia pulmonar
12
50
M
B
Cardiopatia hipertensiva
M = masculino; F = feminino; B = branco; NB = não branco
82
Anexo 2 - Idade, sexo, cor e principais dados anatomoclínicos do grupo chagásico sem megas.
CASO IDADE SEXO
COR
OBSERVAÇÕES
(anos)
13
61
M
NB
Cardiopatia chagásica crônica
14
66
M
B
Cardiopatia chagásica crônica
15
47
F
NB
Cardiopatia chagásica crônica com ICC
16
70
M
B
Cardiopatia chagásica crônica com ICC
17
40
M
NB
Cardiopatia chagásica crônica com ICC
18
47
F
NB
Cardiopatia chagásica crônica
19
42
M
B
Cardiopatia chagásica crônica com ICC
20
70
M
NB
Cardiopatia chagásica crônica com ICC
21
84
F
B
Cardiopatia chagásica crônica e adenocarcinoma de ceco
22
68
F
NB
Pneumonia e Cardiopatia chagásica crônica com ICC
M = masculino; F = feminino; B = branco; NB = não branco; ICC = insuficiência cardíaca
congestiva. O diagnóstico de cardiopatia chagásica crônica nesse grupo foi feito com base
principalmente nos achados necroscópicos, associados à sorologia positiva para doença de Chagas
e, eventualmente, a dados clínicos, eletrocargiográficos, ou radiológicos, quando disponíveis.
83
Anexo 3 - Idade, sexo, cor e principais dados anatomoclínicos e radiológicos do grupo chagásico
com megaesôfago e megacólon
CASO IDADE
(anos)
23
43
24
54
25
53
26
72
27
67
SEXO
COR
M
M
M
M
M
B
NB
NB
B
NB
OBSERVAÇÕES
Cardiopatia chagásica crônica
Cardiopatia chagásica crônica
Cardiopatia chagásica crônica, fecaloma
Cardiopatia chagásica crônica, politraumatismo
Megaesôfago operado há 2 anos, desnutrição e
broncopneumonia
28
43
F
B
Cardiopatia chagásica crônica
M = masculino; F = feminino; B = branco; NB = não branco. O diagnóstico de cardiopatia chagásica
nesse grupo foi feito com base principalmente nas alterações eletrocargiográficas, associadas aos
dados do exame físico, radiológico e sorologia positiva para doença de Chagas.