Rev. bras. zootec., 29(6):2157-2161, 2000 (Suplemento 2)
Criopreservação de Material Genético do Camarão-de-Água-Doce Macrobrachium
rosenbergii 1
Rubens Sterental Goldberg2, Flamarion Tenório de Albuquerque 3, Lídia Miyako Yoshii Oshiro4
RESUMO - O objetivo deste trabalho foi a avaliação da criopreservação do material genético de camarões de água doce
Macrobrachium rosenbergii, por meio de dois tratamentos: a estocagem do espermatóforo (obtido por eletroejaculação) em nitrogênio
líquido, diluído em solução à base de gema de ovo, citrato de sódio e dimetilsulfóxido (DHSO), durante 60 dias, e a estocagem dos camarões,
recém despescados, em congelador (-13oC), durante os períodos de uma, três, cinco, sete e doze semanas, usando o corpo do animal na
proteção das células espermáticas contra o choque térmico. Como controle, foram utilizados espermatóforos recém ejaculados. A média
percentual das freqüências de espermatozóides viáveis, obtida com o congelamento em nitrogênio líquido, em congelador, e as do controle
foram, respectivamente, 64,8; 79,2; e 90,8%, que apresentaram diferenças entre si. Para o tratamento de estocagem dos camarões em
congelador, não foi observada correlação entre os períodos testados e as viabilidades espermáticas resultantes. A viabilidade espermática
obtida por meio da manutenção dos animais em congelador foi mais elevada que a resultante da conservação dos espermatóforos em
nitrogênio líquido. Ambas as técnicas estudadas proporcionaram a manutenção de estoques de células espermáticas destes animais viáveis
por, no mínimo, doze semanas, haja vista manejos de inseminação artificial.
Palavras-chave: criopreservação, espermatóforo, inseminação, Macrobrachium rosenbergii, reprodução
Freshwater Prawn Macrobrachium rosenbergii Genetic Material Cryopreservation
ABSTRACT - The aim of this work was to evaluate cryopreservation of the genetic material of the freshwater prawnMacrobrachium
rosenbergii through two techniques: spermatophore storage (attained through eletroejaculation) in liquid nitrogen, diluted in egg yolk
solution added with sodium citrate and dimethyl sulfoxide (DHSO) during 60 days and stocking newly pond-reared prawns in freezer
(-13o C) during periods of one, three, five, seven and twelve weeks, using the animal body to prevent sperm cells against freezing effects.
Newly extruded spermatophores were used as control. The percentage average of viable spermatozoa obtained through freezing in liquid
nitrogen, freezer and the unfrozen control group were 64.8, 79.2 and 90.8%, respectively, that showed difference among themselves.
The animal’s storage in freezer technique showed no correlation between the tested periods and the resulting spermatic viabilities. Sperm
viability attained by animal storage in freezer was higher than the one through stocking spermatophores in liquid nitrogen. Both techniques
provided the maintenance of viable spermatozoa stock during at least twelve weeks viewing artificial insemination handlings.
Key Words: cryopreservation, insemination, Macrobrachium rosenbergii, reproduction, spermatophore
Introdução
As técnicas de inseminação artificial têm se
destacado nos manejos reprodutivos, em aqüicultura,
por viabilizar a estocagem do material genético para
posterior inseminação e o transporte de material
genético, facilitando o acasalamento entre indivíduos
distantes, permitir a fertilização no caso de rejeição
entre o macho e a fêmea da mesma espécie, ou
mesmo em hibridizações, além de proporcionar facilidade na manipulação genética.
No caso dos camarões de água doce
Macrobrachium rosenbergii, esses métodos podem
1
também viabilizar a reprodução destes animais durante
o inverno, permitindo a produção de larvas ao longo de
todo o ano.
O uso do congelamento para a conservação
espermática tem como princípio a redução do metabolismo celular e, conseqüentemente, o prolongamento da vida útil das células. A eficiência desta
técnica baseia-se em evitar a exposição dos
espermatozóides aos efeitos do choque térmico.
Para tanto, a solução conservadora deve possuir
elementos crioprotetores e os ritmos de
congelamento e descongelamento bem controlados
(MIES FILHO, 1982).
Parte da dissertação de mestrado do primeiro autor, apresentada ao Instituto de Zootecnia da Universidade Federal Rural do Rio de JaneiroKm 47 da antiga Rodovia Rio-São Paulo, Seropédica-RJ- CEP: 23.851-970.
2 Biólogo, mestre em Zootecnia. E.mail: [email protected]
3 Professor Adjunto da Universidade Federal de Lavras- MG. E.mail: [email protected]
4 Professor Adjunto do Instituto de Zootecnia da UFRRJ. E.mail: [email protected]
2158
GOLDBERG et al.
CHOW (1982) foi o primeiro autor a relatar esta
em nitrogênio líquido e em congelador a -13oC, durante
técnica em M. rosenbergii pela obtenção de fêmeas
os períodos de uma, três, cinco, sete e doze semanas,
inseminadas com espermatóforos previamente diluívisando a sua utilização em programas de inseminação
dos em solução salina, conservados sob temperatura
artificial.
ambiente e de refrigeração (2oC) durante até 17 e 95
horas, respectivamente.
Material e Métodos
CHOW et al. (1985) obtiveram sucesso na
inseminação de M. rosenbergii com espermatóforos
Os animais utlizados neste trabalho foram captumantidos sob congelamento, por até 30 dias, em
rados nos viveiros de engorda do Posto de Aqüicultura
nitrogênio líquido, previamente diluídos em solução
da Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro
de água doce, acrescida de glicerol como crioprotetor.
(UFRRJ), com idade de oito meses, comprimento
A avaliação das técnicas de criopreservação,
entre 12 e 17 cm e peso entre 40 e 55 g.
verificando-se a qualidade dos espermatóforos e
O material genético utilizado na criopreservação
espermatozóides, assume importância, à medida que
foi obtido e processado de maneiras distintas, de
o sucesso da inseminação pode estar condicionado
acordo com os tratamentos utilizados: congelamento
também à viabilidade espermática.
de espermatóforos em nitrogênio líquido ou a conserLEUNG-TRUJILLO e LAWRENCE (1987)
vação dos camarões em congelador (-13oC).
investigaram a proporção de células vivas e a quanO grupo controle de espermatóforos, que não foi
tidade por espermatóforo em camarões marinhos
submetido à criopreservação, e os destinados aos
Penaeus setiferus, em função do tempo de manutestes de criopreservação em nitrogênio líquido foram
tenção dos machos em laboratório. Para tanto,
compostos por seis unidades, cada, tendo sido obtidos
obtiveram a solução espermática pela trituração do
mediante eletroejaculação, por meio de estímulos de
espermatóforo utilizando homogeneizador de teci9V aplicados por eletrodos nas proximidades dos
dos ("potter"), tendo verificado a viabilidade celular
poros genitais dos machos, conforme GOLDBERG
com auxílio de corante pós-vital.
(1998), e imediatamente colocados em frascos conANCHORDOGUY et al. (1988) compararam
tendo solução composta de 20% de gema de ovo,
diferentes fórmulas de soluções conservadoras para
2,94% de citrato de sódio como tampão da solução e
espermatóforos e ritmos de congelamento e des0,01% de ampicilina, denominada solução padrão.
congelamento em camarões marinhos Sicyonia
Em seguida, os espermatóforos destinados à técnica
ingentis, verificando a viabilidade espermática, por
de criopreservação em nitrogênio líquido foram arintermédio da técnica de observção da "reação
mazenados em refrigerador a 5oC, por 24 horas,
acrossômica" dos espermatozóides, que confere às
denominado período de equilíbrio, que antecede o
células espermáticas mortas um dimorfismo caraccongelamento, o qual foi definido por testes preliminaterístico, processo típico dos invertebrados
res a este trabalho, em que não se detectaram perdas
(GRIFFIN et al, 1987). BHAVANISHANKAR e
significativas da viabilidade celular sob refrigeração.
SUBRAMONIAM (1997) utilizaram esta mesma
Antes de se proceder ao congelamento, as solutécnica para avaliar a viabilidade espermática em
ções conservadoras, contendo seus respectivos
espermatóforos de caranguejos da espécie
espermatóforos, foram acrescidas de dimetilsulfóxido
Scylla serrata submetidos à criopreservação em
(DMSO), na proporção de 5%, conforme recomennitrogênio líquido.
dado por ANCHORDOGUY et al (1988) para camaAlém da inseminação de fêmeas com o uso de
rões marinhos Sicyonia ingentis e, em seguida,
espermatóforos, novas formas de utilização do macongelados em nitrogênio líquido.
terial genético foram empregadas por LIN e
Conforme metodologia utilizada por CHOW (1985)
HANYU (1990) , em camarões marinhos Penaeus
em M. rosenbergii, a primeira etapa foi a de prépenicillatus , com a obtenção de eclosão de larvas,
congelamento, quando os frascos foram fixos em
através do uso de solução líquida contendo
suportes de metal ("racks"), dispostos 3 cm acima do
espermatozóides (fluido copulatório artificial) ou de
nível de nitrogênio líquido em uma caixa de isopor
fragmentos de canal deferente.
durante dez minutos, tempo necessário para as soluO objetivo do presente trabalho foi avaliar a
ções atingirem a temperatura de - 110oC; após este
eficiência de duas formas para criopreservação
procedimento, os frascos foram mergulhados
espermática de M. rosenbergii , por congelamento
diretamente no nitrogênio, a -196o C, e, em seguida,
Rev. bras. zootec.
2159
acondicionados em botijões de sêmen por 60 dias.
O descongelamento foi realizado em água a
o
37 C durante um minuto. Após este procedimento,
o material foi homogeneizado, por maceração na
solução padrão, utilizando-se um homogeneizador
de tecidos ("potter"), promovendo a liberação das
células espermáticas no meio líquido, de modo a permitir
a realização de observação sob microscopia óptica.
Para o congelamento dos camarões, foram capturados trinta exemplares, machos, colocados no
congelador para serem dissecados, para posterior
utilização de suas vias espermáticas. Os animais
congelados foram distribuídos em cinco grupos com
seis exemplares; cada qual estocado por períodos de
uma, três, cinco, sete e doze semanas, após os quais
foram descongelados sob água corrente, para
observação da viabilidade espermática. Para tanto,
fragmentos dos canais deferentes foram isolados,
homogeneizados e analisados.
Os espermatóforos destinados à análise a fresco,
após a inclusão na solução padrão, foram imediatamente homogeneizados e, em seguida, submetidos à
análise microscópica.
A visualização dos espermatozóides foi feita
por intermédio de microscópio óptico (400X) com
auxílio de corante pós-vital de eosina-citrato, na
proporção 1:1, que possui a propriedade de atravessar
membranas de células mortas, distinguindo-as das vivas.
Foram considerados viáveis não apenas os
espermatozóides vivos, de acordo com o critério da
coloração, como também aqueles que não apresentassem deformidades aparentemente capazes
de comprometer a penetração nos óvulos.
Como critério de avaliação dos tratamentos,
considerou-se a freqüência percentual de células
viáveis dentre o total examinado. As comparações entre as freqüências de espermatozóides
viáveis obtidos, por meio da criopreservação em
nitrogênio líquido, congelador e a fresco, foram
feitas por análise de variância e teste de médias
(Tuckey P<0,05).
A interdependência entre o tempo de estocagem
do material genético em congelador e a viabilidade
espermática resultante foi testada pelo coeficiente de
correlação linear de Pearson; a equação de melhor
ajuste entre estes dois parâmetros, para o período
entre uma e doze semanas, foi estabelecida por
intermédio de análise de variância da regressão.
Resultados e Discussão
O resultado do teste de média a partir da análise
de variância das viabilidades espermáticas, para os
tratamentos de estocagem do material genético,
indicou a ocorrência de três níveis de significância
atribuídos para o material genético conservado em
nitrogênio líquido, em congelador, e o grupo controle
de espermatóforos a fresco (Tabela 1).
O teste de correlação não demonstrou qualquer
influência do tempo de conservação dos camarões
em congelador na viabilidade espermática de seus
materiais genéticos. A equação de melhor ajuste para
a relação entre estes dois parâmetros está demonstrada na Figura 1.
Pode-se observar que a maior viabilidade média
entre os tratamentos foi de 90,8% para o grupo
Tabela 1- Média do percentual (± desvio-padrão) de espermatozóides viáveis de exemplares do
camarão-de-água-doce Macrobrachium rosenbergii submetidos a diferentes técnicas
de criopreservação
Table 1 -
Average percentage (± standard deviation) of viable spermatozoa of the fresh water prawn
Macrobrachium rosenbergii submitted to different cryopreservation techniques
Tratamento
Treatment
Técnica
Temperatura (o C)
Espermatozóides viáveis
Technique
Temperature (oC)
Viable spermatozoa
Nitrogênio líquido
-196
64,8% (± 3,77)a
-13
79,2% (± 5,87)b
25
90,8% (± 2,77)c
Liquid nitrogen
Congelador
Freezer
Espermatóforo a fresco (controle)
Newly ejaculated sperm (control)
CV
6,83
Em cada coluna, médias seguidas pelas mesmas letras não diferem pelo teste Tukey, a 5% de probabilidade.
Means, within a column, followed by the same letters do not differ by Tukey test at 5% of probability.
2160
GOLDBERG et al.
espermatóforos são diluídos, tem por finalidade contribuir para a sobrevivência das células espermáticas
90
durante o processo de congelamento; sua fórmula
85
deve levar em conta, além do pH e concentração
80
osmótica semelhantes à do meio natural dos
75
espermatozóides, a presença de substâncias
70
crioprotetoras que servem especificamente para proy=68,69+10,08x-2,06x +0,107x
65
teger os espermatozóides contra o mecanismo de
R =0,249
60
choque térmico.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
semana
De acordo com CHOW et al (1985), a preservação
Semana
do sêmen na forma de espermatóforos deve considerar
Week
a capacidade de absorção dos componentes da solução conservadora por parte do tecido espermático.
Figura 1 - Efeito dos períodos de estocagem dos camarões
o
O uso de solução padrão à base de gema de ovo
em congelador (-13 C) na viabilidade espermática
do camarão-de-água-doce Macrobrachium
foi escolhido neste trabalho, por se tratar de um
rosenbergii.
componente de baixo custo, fácil obtenção e possuir
Figure 1 - Effect of prawns stocking periods on the spermatic
viability of the fresh water prawn Macrobrachium
eficácia na proteção dos espermatozóides, durante o
rosenbergii.
período de equilíbrio, por meio de suas propriedades
nutritivas, mantendo o metabolismo celular, assim
como durante o congelamento, uma vez que as proteínas
auxiliam na proteção das membranas celulares (lecitina
e cefalina). As soluções à base de ovo são amplacontrole de espermatóforos recém-ejaculados, tendo
mente usadas em outras espécies (MIES FILHO,
havido declínio a partir dos manejos de criopreservação
1982). Quanto ao uso deste componente, não há
para 64,8 e 79,2%, médias de viabilidades espermáticas
parâmetro de comparação com outros trabalhos reaobtidas pelos congelamentos em nitrogênio líquido e
lizados em crustáceos, uma vez que a literatura relata
em congelador, respectivamente.
apenas o uso de água ou soluções salinas (CHOW,
As viabilidades espermáticas proporcionadas pelas
1982; CHOW et al., 1985; e ANCHORDOGUY et
técnicas de estocagem no presente trabalho foram
al., 1988).
mais elevadas em relação aos valores máximos enO DMSO foi adicionado como solução
contrados por ANCHORDOGUY et al (1988), quando
crioprotetora, esta substância age em concomitância
trabalharam com camarões marinhos Sicyonia
com os efeitos causados pelo ritmo de congelamento,
ingentis, utilizando estocagem de espermatóforos
diminuindo a concentração osmótica da solução conem nitrogênio líquido e obtiveram 56% de viabilidade.
servadora e, então, reduzindo seu efeito tóxico (desiEsta diferença pode estar relacionada à diferença da
dratação do líquido intracelular) e permitindo, consecapacidade de resistência das células espermáticas
qüentemente, congelamento relativamente mais lento
para cada espécie, fatores ligados à capacidade
ao material genético, de modo a prevenir o surgimento
crioprotetora da solução conservadora ou ao ritmo de
de cristais de gelo intracelulares (HAFEZ, 1995).
congelamento utilizado (MIES FILHO, 1982).
De acordo com JACOB et al. (1964), o DMSO
O efeito do choque térmico imposto às células
possui a propriedade de aumentar a permeabilidade
pelo processo de congelamento, ocasionando perda
das membranas celulares; portanto, é plausível admitir
da viabilidade espermática, pode ocorrer por intermédio
que este crioprotetor tenha facilitado a ação dos
de três processos: deformidades na membrana por
componentes protéicos da gema de ovo no auxílio à
ação dos cristais de gelo extracelulares; gradativa
criopreservação espermática.
perda de líquido pelo meio conservador, que passa
A comparação do uso de diferentes soluções
para o estado sólido, causando aumento da concencrioprotetoras em camarões (ANCHORDOGUY et
tração do soluto até que esta atinja níveis tóxicos para
al., 1988) apontou o uso de DMSO a 5% como o mais
a célula; e danos associados aos ritmos de
vantajoso, entretanto, manejos de inseminação feitos
congelamento e descongelamento empregados
especificamente com a espécie M . rosenbergii com
(MIES FILHO, 1982).
o uso de glicerol a 10% foram eficazes na fertilização
A solução conservadora, na qual os
de fêmeas (CHOW et al., 1985).
Sperm viability (%)
Viabilidade espermática (%)
95
2
2
3
Rev. bras. zootec.
2161
O ritmo de congelamento rápido empregado neste
trabalho priorizou a redução do tempo de exposição
dos espermatozóides às condições tóxicas causadas
pela alta concentração do soluto.
O processo de descongelamento pode acarretar a
recristalização da solução espermática (MAZUR,
1970). A ocorrência de células deformadas após este
procedimento foi também verificada por
ANCHORDOGUY et al. (1988) em camarões marinhos S.ingentis, devido ao ritmo rápido de congelamento empregado. Entretanto, esses autores não
detectaram diferença entre os resultados dos ritmos
de descongelamento empregados.
A estocagem do camarão inteiro para a conservação de seu material genético partiu do princípio de
que, uma vez no interior do canal deferente, os
espermatozóides permanecem sob condições as mais
próximas possíveis das encontradas na natureza
(MIES FILHO, 1982).
A taxa de viabilidade celular atingida com a conservação do material genético, utilizando o próprio
corpo dos animais em congelador, pode estar associada
à tendência das células espermáticas tornarem-se
mais resistentes ao choque térmico quanto mais próximas estiverem de suas condições naturais (MIES
FILHO, 1982) e à presença de uma matriz gelatinosa
ao longo do canal deferente (CHOW et al., 1982).
As técnicas de manejo de criopreservação em
M.rosenbergii podem ser testadas em outras
espécies de crustáceos na busca da viabilização de
novas espécies para a aqüicultura.
Conclusões
Entre as técnicas de criopreservação espermática
estudadas, o congelamento de camarões proporcionou
menor perda de viabilidade espermática em relação ao
congelamento de espermatóforos em nitrogênio líquido.
Foram obtidas soluções espermáticas, por intermédio
da trituração de fragmentos do canal deferente, indicando
a possibilidade de seu uso em futuros estudos sobre
manejos de inseminação artificial com esta espécie.
As técnicas empregadas proporcionaram viabilidade espermática média de pelo menos 64,8%, entretanto, estudos futuros são necessários para comprovar suas eficácias.
A gema de ovo demonstrou eficiência como componente da solução conservadora.
O uso de congelador para a criopreservação
espermática destes animais constitui nova alternativa
para o emprego desta técnica.
Referências Bibliográficas
ANCHORDOGUY, D.E., CROWE, J.H., GRIFFIN, F.J. et al.
1988. Cryopreservation of sperm from the marine shrimp
Sicyonia ingentis. Cryobiology, 25(3):238-243.
BHAVANISHANKAR, S., SUBRAMINIAN,T. 1997.
Cryopreservation of spermatozoa of the edible mud crab
Scylla serrata (Forskal). J. Exp. Zoology, 277:326-336.
CHOW, S. 1982. Artificial insemination using preserved
spermatophores in the palaemonid shrimp Macrobrachium
rosenbergii. Bulletin of the Japanese Society of Scientific
Fisheries, 48(12):1693-1695.
CHOW, S., TAKI, Y., OGASAWARA,Y. 1985. Cryopreservation
of the spermatophore of the fresh water shrimp
Macrobrachium rosenbergii. Biol Bull., 168:471-475.
GOLDBERG, R.S. Comparação da eficiência da eletroejaculação
entre tipos morfológicos de macho e manejos de
criopreservação espermática do camarão de água doce
Macrobrachium rosenbergii. Seropédica - RJ: Instituto de
Zootecnia da UFRRJ, 1998 . 61p . Dissertação (Mestrado em
Zootecnia) - Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro, 1998.
GRIFFIN, F.J., CLARK JR., W.H., CROWE, J.H. et al. 1987.
Intracellular pH decreases during the in vitro induction of the
acrossome reaction in the sperm of sicyonia ingentis.
Biol. Bull., 173:311-323.
HAFEZ, E.S.E. 1995. Reprodução animal. 6.ed. São Paulo:
Ed.Manole. 582p.
JACOB, S.W., BISCHEL, M., HERSCHLER, R.J. 1964.
Dymethyl sulfoxide: effects on the permeability of biological
membranes. Curr. Ther. Res., 6:193-198.
LEUNG-TRUJILLO, J.R., LAWRENCE, A.L. 1987. Observations
on the decline in sperm quality of Penaeus setiferus under
laboratory conditions. Aquaculture, 65:363-370.
LIN, M.N., HANYU, I. Improvements on artificial insemination
in gravid females of close thelycum Penaeus penicillatus.
In: ASIAN FISHERIES FORUM, 1989, Tokyo, 2, Japan.
Proceedings... Tokyo, 1990. p.627-630.
MAZUR, P. 1970. Cryobiology: the freezing of biological
systems. Science, 168:939-949 .
MIES FILHO, A . 1982. Reprodução dos animais e inseminação
artificial. 5.ed . Porto Alegre: Sulina , 2V.V2.
Recebido em: 30/03/99
Aceito em: 11/04/00