Concurso BD Biosciences Pesquisador SBI
Projeto Finalista 2013
Revisitando o mecanismo de ação micobactericida da isoniazida em modelo de
granuloma humano
Lívia Harumi Yamashiro
ABSTRACT
Following exposure to Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the main causative agent of
tuberculosis (TB), infected individuals develop the granuloma, a cellular structure involved in
controlling bacterial proliferation. Currently, several anti-Mtb drugs are available and the most
important is isoniazid (INH), which inhibits bacteria’s cell wall formation through the mycolic
acids synthesis inhibition. Clinical studies have demonstrated that 2 days of INH treatment are
sufficient to significantly decrease lung bacterial loads in TB patients, although only low doses
are found within the granuloma. In contrast, such low doses do not directly inhibit Mtb growth in
vitro. Using a human in vitro granuloma model, we intend to investigate fundamental questions
of the effects of INH on cellular dynamics: 1) What lymphocyte populations in granuloma are
affected by isoniazid treatment? and 2) How do such cells influence adaptive immune
responses? Therefore, we aim to complete missing dots on the INH mechanism of action and
its effects on granuloma.
A tuberculose (TB) foi classificada como doença de emergência global pela Organização
Mundial da Saúde (OMS) em 1993 e, ainda hoje, permanece como a responsável pelo maior
número de mortes causado por um único agente infeccioso (Pealing et al., 2013), o bacilo
Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Dados da OMS calculam que em 2011 cerca de um milhão
e meio de pessoas morreram em consequência da infecção pelo bacilo (WHO, 2012). A
tuberculose possui um importante significado para a saúde pública por conta da sua elevada
frequência na população, especialmente em países em desenvolvimento, e pela facilidade de
propagação através das vias aéreas.
Após a inalação de gotículas contendo bacilos viáveis, uma alteração patológica característica
é a formação de granulomas nas cavidades pulmonares, estruturas que se formam devido à
intensa resposta imune celular diante da infecção com o bacilo. Esse agregado celular
característico é responsável por restringir a infecção e manter a bactéria em estado latente, em
baixo estado de replicação. No entanto, em caso de reativação da doença o granuloma perde
sua estabilidade, as células que o compõem entram em necrose e há intensa divisão
bacteriana. (Ramakrishnan, 2012).
Atualmente, a terapia anti-TB dispõe de diversos antibióticos e a isoniazida
(INH) permanece como principal fármaco utilizado. Sua ação in vitro baseia-se na inibição da
síntese de ácidos micólicos (componentes da parede celular bacteriana) (Rozwarski et al.,
1998) e a eficiência do fármaco é alcançada apenas após concentrações definidas
(McDermott, 1960). Interessantemente, estudos clínicos demonstraram que em 2 dias de
tratamento com INH há diminuição de 95% da carga bacteriana presente no escarro de
pacientes (Donald et al., 1997), apesar de serem encontradas baixas concentrações no interior
dos granulomas - concentrações que não afetam o crescimento bacteriano in vitro (Kjellsson et
R. Alexandre Dumas, 1976 - São Paulo, SP 04717-004 Brazil | 0800 771 71 57 | [email protected] | bdbiosciences.com/br
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al., 2012). Portanto, esses dados sugerem que a INH possui mecanismos de ação in vivo
ainda desconhecidos.
Na fase de proliferação do bacilo dentro do granuloma necrótico, é possível que a INH interaja
com as células do sistema imune conseguindo matar a micobactéria mesmo em concentrações
abaixo da efetiva, impactando assim a regulação da resposta celular e o curso da infecção.
Utilizando um modelo de agregado celular semelhante ao granuloma humano (fig. 1) (Birkness
et al., 2007; Puissegur et al., 2004), mimetizamos a infecção causada pelo bacilo Mtb com o
intuito de investigar os mecanismos de controle do crescimento bacteriano observado pelo
tratamento com as baixas doses de INH.
Figura 1. Fotomicrografia do agregado celular. Células mononucleares do
sangue periférico de adultos saudáveis foram infectadas com Mtb (MOI
10), cultivadas em placas com RPMI-agarose 1.5% por 3 dias e tratadas
com INH (0,01 µM) nos dias 4 e 5. Foto representativa do 6°dia pós
infecção (24h pós tratamento).
Dados preliminares demonstraram que granulomas de doadores PPD positivos (que possuem
linfócitos T primados para antígenos anti-micobactérias) têm menor capacidade de controlar a
infecção quando comparados com os granulomas de doadores PPD negativos. Além disso, o
tratamento com baixas concentrações de INH não apresentou efeito anti-micobacteriano nos
granulomas de indivíduos PPD positivos, sugerindo que estas células são menos susceptíveis
ao fármaco (fig. 2).
Além disso, granulomas de doadores PPD positivos infectados com Mtb não apresentaram
alteração na frequência das células T CD4+ e CD8+ clássicas (CD3+/CD4+ ou CD8+) ao longo
da infecção (dados não demonstrados). No entanto, a população de células T !" (CD3+CD4CD8-TCR!"+) estava diminuída após o 6o dia de infecção. O tratamento com INH não
modificou a frequência dessas células, sugerindo que elas não estão envolvidas no controle da
infecção por INH em granulomas de indivíduos PPD positivos (fig. 3).
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Com a finalidade de investigar se os linfócitos T primados estão envolvidos no controle da
infecção em granulomas expostos a baixas doses de INH, granulomas de doadores PPD
negativos foram expostos a linfócitos T primados, utilizando um protocolo de in vitro priming
(Brodskyn et al., 2000). Observamos que estes granulomas controlam melhor a infecção
quando comparados com granulomas de doadores PPD positivos, sugerindo a existência de
uma população de células T detrimental para o controle da infecção em indivíduos PPD
positivos (dados não demonstrados). Dessa forma, sugere-se a influência diferencial da INH
em populações linfocitárias distintas, capazes de atuar no controle da infecção por Mtb de
maneira dirigida. Nossa hipótese é que a INH in vivo atue em uma população específica de
células T, aumentando a eficiência do fármaco no killing de Mtb.
Brevemente, após a realização dos experimentos que envolvem a formação
de granuloma infectado com células de doadores saudáveis, será feita uma análise de
populações celulares alvo da ação da INH que será facilitada com o emprego da citometria
multi-color. Marcações específicas (linfócitos, monócitos/macrófagos, neutrófilos) serão
realizadas através do uso dos seguintes anticorpos monoclonais: CD45, CD3, CD4, CD8,
CD19, CD11b, CD11c, CD16, CD14, FoxP3, TCR- αβ, TCR- γδ, CD69, CD56, CD62L, CD25,
HLA-DR, CD127, CD181, CD206, CD66. Células serão marcadas com um painel de anticorpos
e adquiridas em um citômetro de fluxo (FACS Verse, BD).
Dessa forma, a presente proposta tem o intuito de responder questões fundamentais, como: 1)
Quais as populações linfocitárias no granuloma são afetadas pelo tratamento com isoniazida?
e 2) Como elas influenciam a manutenção de uma resposta imunoprotetora? Pretende-se
portanto, revelar um novo mecanismo de ação da isoniazida implicado no controle do
crescimento bacteriano no granuloma.
O concurso BD Biosciences Pesquisador SBI visa o reconhecimento e apoio aos
pesquisadores que promovem o constante avanço científico através do incentivo à técnica
de Citometria de Fluxo com Múltipla Marcação no Brasil.
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