Genes Associados a
Estresses Bióticos e
Abióticos em Plantas
Cultivadas
Drª Ana Maria Benko-Iseppon
Universidade Federal de Pernambuco
Depto. De Genética, Lab. de Genética e Biotecnologia Vegetal
Onde tudo começou...
Pós-Doutorado
CAPES
Frankfurt University
Johann Wolfgang Goethe Universität
Jan.-Dec. 1999
Resistência a Doenças
Plantas & Animais
Importância para o melhoramento
Tipos de Resistência
Sistêmica (genes PR)
• Conservados
• Herança quantitativa
Específica (genes R)
Benko-Iseppon AM
UFPE, Depto. de Genética
Genética e Biotecnologia
Vegetal
Principais Objetos de Estudo:
1. Cicer Arietinum (grão-de-bico)
2. Vigna unguiculata (feijão verde)




Culturas vegetais importantes para áreas
de semi-árido
Nível diplóide: 2n=16 e 2n=22
Auto-fecundação, gerações curtas, genoma
relativamente pequeno (0,5 x 109)
Colheitas podem ser afetadas severamente
(perdas de até 80%) pelo ataque de
patógenos (fungos e vírus )
Genoma Expresso (Transcriptoma):
SUCEST Sugarcane EST Project
Cana:
Desafio
&
Oportunidade
Genoma Expresso (Transcriptoma):
FOREST Eucalyptus EST Genome Project
Objetivo:
Ana
Identificar 15.000
genes através do
seqüenciamento de
cerca de 100.000
ESTs (20 labs.)
obtidas a partir de
bibliotecas de
diferentes tecidos,
incluindo plântulas,
folhas, raízes, caule
e madeira.
A Arquitetura da Resistência





Sequências similares conferem resistência a diversos
patógenos como vírus, bactérias, fungos and nematóides.
A maioria dos genes de resistência (genes R) pertence a
famílias multigênicas.
Genes R são altamente polimórficos e apresentam
diversas especificidades de reconhecimento.
Grupos vegetais diferentes apresentam genes R com
domínios e padrões (motifs) com significativa
conservação.
Clusters de genes R parecem evoluir mais rapidamente do
que outras regiões do genoma.
Modelo da Interação Gene-a-Gene
Patógeno
Interação
R & avr
Produto
avr
Elicitores
Gene R
HR
SA
JA
Genes PR
Etileno
Morte
Celular
Calosis
Etileno
Fitoalexinas
SA
Genes PR
Interação Hospedeiro-Patógeno
Avr & R
Nematóide
Fungo
Bactéria
After Bonas & Lahaye
Curr. Opn. Microbiol.
2002
Transferabilidade & Mudança
de Função
Diversas localizações
subcelulares
Estrutura de Genes R
A
Ser/Thre Kinase
B
LRR-Ser/Thre-Kinase
C
NBS-LRR
D
TIR NBSLRR
E
LRR
Nucleot. Binding Site
Domínios
conservados
de genes R
Toll-Interleukin Dom.
Transmembrane Dom.
Leucine Rich Repeats
Ser.-Threon. Kinase
TIR (Toll Interleukin)-Like Resistance Gene
Toll-like signalling in
Drosophila
Mammals
Plants
Semelhanças
entre plantas
e animais
After Takken &
Joosten Europ.
J. Plant Pathol.
2000
LRR
NBS
TIR
Kinase
Ankyrin repeats
Transcription Factor
Immunoglobulin domain
Arabidopsis thaliana
 Estima-se
que contenha
aproximadamente 220 genes que
codificam proteínas com o domínios NBS
(em  21 clusters genômicos e 14 loci)
 Seqüências TIR – ainda mais abundantes
 Cerca de 600 seqüências não-TIR
Estratégias de Amplificação Diferencial
(RGAs = Resistance Gene Analogs)
Isolamento de genes da classe NBS
Kinase-1a and Transmembrane Region: 550 Bp
H2N
COOH
Kinase-1a and Kinase-3a: 340 Bp
Nucleotide-binding Site (NBS)
(Kinase-1a, Kinase-2, and Kinase-3a Domain)
Putative Transmembrane Region
Leucine-rich Repeats
Obtenção e Identificação de RGAs
Amplificação por PCR
Clonagem dos Produtos de PCR
Mapeamento de Restrição
Seqüenciamento Automático
Análise de ORF (Open Reading Frame)
Anotação e Identificação do Gene
Isolamento de RGAs (Resistance Gene Analogs):
Domínio Kinase (1a) & Região Transmembrana
Questões em Aberto
sobre Genes R
Macroevolução
Evolução em plantas
silvestres
Comportamento em
lenhosas e grupos
primitivos
Isolamento de RGAs (Resistance Gene Analogs):
Domínio Kinase 1a & Kinase 3a
Técnica de AFLP e SSAP
Restriction of Genomic DNA
Ligation of Adaptors
Pre-Amplification with Adaptor Primer
AFLP
Selective Amplification
(Amplified Fragment Length Polymorphism)
32
P
Eco+2
32
P
(Sequence-specific Amplified Polymorphism)
Mse+3
Eco+2
SSAP
Mse+3
32
GRP1
Mse0
P
32
GRP2
P
Mse0
Mapeamento Genético
Cruzamento Interespecífico
Cicer arietinum
ICC4959
(Resistant)
X
C. reticulatum
PI489777
(Susceptible)

F7 to F8 Recombinant Inbred Lines
131 Individuals
Fusarium oxysporum fsp. ciceri
Resistance Loci

Linkage Group 2
Marcadores Moleculares Usados
•DAF - DNA Amplification Fingerprinting
•RAPD - Random Amplified Polymorphic DNA
•STMS - Sequence Tagged Microsatellite Markers
•AFLP - Amplification Fragment Length Polymorphism
•SCAR - Sequence Characterized Amplified Regions
•ISSR - Inter Simple Sequence Repeats
•RGA - Resistance Gene Analogs
•SSAP - Sequence-Specific Amplified Polymorphism
Mapa Genético Gerado
Características:
•412 marcadores em 8 grupos de ligação
•Tamanho total 2.330 cM
•Distância Média entre os marcadores: 6,7 cM
•Relação Média Kb / cM = 322 (genoma = 750 Mb)
•“Ilhas” ou “clusters” com acúmulo de marcadores
8 grandes + 8 pequenos
grupos de ligação
Mapeamento Fino
Análise Segregante de Bulks
“Caçando um Gene Específico”
Respectivamente 12 Linhagens:
Bulk Resistente:
R14, R18, R22, R29, R53, R56, R72, R74, R87, R88, R94, R96
Bulk Suscetível:
S11, S25, S32, S37, S40, S49, S55, S61, S63, S64, S65, S77
Primeira Seleção de Primers:
432 Primers Testados em 2 Semanas

174 Primers Polimórficos

Análise nos parentais e em sete indivíduos R e S
Última Seleção de Marcadores
PR
A
R1 – R7
S1 – S7
PS
PR=
Parental Resistente
PS=
Parental suscetível

500 kb
R=
indivíduo resistente
B

S=
indivíduo suscetível
500 kb
32 Primers testados
24 Ligados (no LG 2)
18 seqüenciados
Mapeamento Fino do Gene Foc 4
Região de
resistência
ao redor dos
genes
Foc 4 e Foc 5
Identidade de alguns Marcadores Seqüenciados






OP-P08-1 840 bp = N-Polyacetil-Benzoyltransferase (proteína
reguladora da síntese de fitoalexinas).
OP-M20-1/3  1103 bp = Disease resistance N (Nicotiana)-like
protein from Arabidopsis thaliana (E-value 0.0)
OP-P15-3/1 577 bp = Hypersensitivity response related gene
201 isolog from Arabidopsis thaliana (2e-28)
P-U17-1  1014 bp = Pathogenic related thaumatin-like
protein precursor from Prunus avium (1e-10)
OP-M20-1/2  1045 bp = MUTS2 DNA mismatch repair
protein from Arabidopsis thaliana (7e-09)
OP-P06-1 784 bp = Retrotransposon-like gag-protein
sequence from Nicotiana tabacum putatively linked to black
root rot resistance in tobacco (8e-04)
Sintenia e Colinearidade
Projeto Genoma da Cana
A Estratégia
Planejado:
Realizado:
100.000 ESTs (reads)
291.904 ESTs (reads)
30.000 clusters
43.141 clusters
25 Bibliotecas
26 Bibliotecas
25 grupos de
anotação
49 grupos de
anotação
Hierarquia de Seleção, Anotação e Análise de ESTs
Banco de Dados do
SUCEST
BLASTx, tBLASTn, etc.
Busca por homologia
e por palavras-chave
Seqüências Completas &
Melhores Alinhamentos
e-20 ou menos
Avaliação de Qualidade e
Fenotipagem
Alinhamentos
Múltiplos
Tradução/CodonUsage
Conteúdo AT-GC
Busca Domínios
CD-Search/RPS-BLAST
Clone Manager
Análise de ORFs
ORF-Finder
Localização Subcelular
Programa TargetP
Clustal W
Análises Filogenéticas e
Fenéticas
GenBank
Vias
Metabólicas
Análise de Expressão
“Clusterização Hierárquica”
Genes R em
Cana-deAçúcar
Onde os Genes de Resistência são
Expressos na Cana?
AAM
M
RTR T
7.1%
7,1%
Brotos
foliares (8 )
Raiz (3 )
111.1%
1,1 %
Meristema
Apical (2)
RRZ
Z
113.1%
3 ,1%
Raiz-Caule
(3)
LRL R
6.7%
6,7%
ADA D
,5 %
6.5 6%
Gluconacetobacter
ST S T
6.1%
6,1%
Internós (2 )
SD
Sementes
SD
5 ,5%
Germinantes 5.5%
(2 )
LBL B
Gema Lateral 5.3%
5 ,3 %
(2)
Colmo (1)
Flores (8 )
FL
2 7,1 %
27.1%
FL
NR
NR
CL
0 , 0.2%
2%
LV
SB S B
HRH R
LV
CL
1 ,8%
4 ,6%
2
,
2
%
2.6%
2.2%
1.8%
2,6 %
4.6%
Herbaspirilum Folhas adultas (1 )
Calo estresse
temp/luz (1)
Alinhamento Múltiplo com Clustal X
Gene CHS1
Seqüências de
aminoácidos
100
100
Arabidopsis thaliana3
Arabidopsis thaliana6
Oryza sativa3
Oryza sativa2
100
100
100
Arabidopsis thaliana8
Arabidopsis thaliana4
100
Plantas
Oryza sativa1
100
100
Diferentes
genes
Saccharum officinarum1
Arabidopsis thaliana1
99
Arabidopsis thaliana7
100
94
Arabidopsis thaliana5
Arabidopsis thaliana2
Schizosaccharomyces pombe1
100
Leveduras
Saccharomyces cerevisiae1
Dictyostelium discoideum4
100
100
Dictyostelium discoideum3
64
Dictyostelium discoideum2
Fungos
Dictyostelium discoideum1
100
84
Homo sapiens2
Alguns com poucas
seqüências
completas nos
bancos de dados
Macaca mulatta1
100
Canis familiaris1
100
Oryctolagus cuniculus1
Rattus norvegicus4
100
100
Rattus norvegicus2
89
Raja erinacea1
100
100
100
Drosophila melanogaster2
Drosophila melanogaster1
100
100
100
Geração de
Dendrogramas
Anopheles gambiae str
PEST2
Rattus norvegicus3
Rattus norvegicus1
Animais
Seqüências
Filogeneticamente
Informativas
Homo sapiens3
97
100
100
Mus musculus2
Mus musculus1
100
99
Bos taurus1
Homo sapiens1
Caenorhabditis elegans1
0.1
Níveis macro e
microevolutivo
Geração de
Dendrogramas
Pressão de
seleção do
patógeno
Evolução de
caráter
adaptativo
Variações
alélicas até
análogos na
própria cana
Leaf Roll
I
Root
Apical Meristem
II
III
IV
Root to
shoot
V
Flowers
Genes R Expressos em Eucalipto
210 clusters
FOREST
GMB, 2005 (Vol. Especial Genoma Eucalipto)
Salinidade & Seca
Solo Salino
Espaço
Intracelular
Pelo
radicular
Direção da
Água
Quais genes definem a
resistência à salinidade em
plantas?
Direção da
Água
Concentração
Relativa de Sais
Resistência à Salinidade
Herança  Multifatorial, Poligênica...
Evolução
Genes importantes diferem entre
entidades taxonômicas próximas
Convergência baseada em caracteres
adaptativos
AtNHX1
Grupo Trocadores
Na+/H+
Vacuolização
Tolerância definida por 1 gene?
super expressão do gene
DREB1A (Dehydration
Response Element-Binding
protein 1A)
Frio
Seca
53
277
7.000 genes
analisados
Pico de
ativação 2 a
2,5 h após
adição do
elicitor
8
21
128
22
2
119
51
Taji T, Seki M, Satou M, Sakurai T, Kobayashi
M, Ishiyama K, Narusaka Y, Narusaka M, Zhu
JK, Shinozaki K (2004) Comparative genomics
in salt tolerance between Arabidopsis and
Arabidopsis-related halophyte salt cress using
Arabidopsis microarray. Plant Physiol 135:
1697–1709.
Expressao
aumentada
5x ou mais
Salinidade
194
Seki, M. et al. (2002). Monitoring the
expression profiles of 7000 Arabidopsis genes
under drought, cold and high salinity stresses
using a full length cDNA microarray. The Plant
Journal. 31: 279-292
Salinidade e Seca – Principais Genes
Trocador H+/Ca2+
Plantas
Superiores
Fungos
1
1
Eu
c
19
TIP
c3
Vb
2
10
Eu
AtSI
P2
09
c1
c
Euc
08
Euc
uc
Vb
c1
Euc
Eu
Eu
E
Eu
Euc 35
AtSIP1
MIP (Proteínas Intrínsecas de Membrana) em Eucalyptus
E
PIP
uc
21
1
TIP
t
A
TIP
Rc
36
Euc
14
17
2
Euc 2
Euc 15
Euc 29
Euc 06
Euc 27
Euc 23
Euc 13
Euc
04
Euc
25
Eu
c2
6
IP1
AtP
1
c0
u
E
7
0
c0 2
RcP 5
IP
PtPIP
c
Euc 28
Eu
Eu
E
30
uc
03
0
c
4
Eu c 2
Eu c 34
Eu 32
1
Euc AtNLM
c
Eu
Eu
c1
Eu
8
c2
0
Euc 33
Proteínas intrínsecas de
membrana plasmática,
do tonoplasto, tipo
nodulina-26 e pequenas
proteínas básicas de
membrana
Atuam como facilitadoras
do transporte passivo de
pequenos solutos através
dos
sistemas
de
membranas.
Motivos NPA e domínios
transmembrana
variáveis
(4 a 8 repetições).
MIP Differential Display
Padrão de expressão das 36 seqüências analisadas: Alta expressão de EUC-04 em ST-2 e EUC-07 em RT-06. Clusters EUC28, EUC-33 e EUC-35 se expressam respectiva e exclusivamente nas bibliotecas RT6, LV2 e SL5 (tecidos são raízes
resistente a geada, folhas deficientes em fósforo e boro e plântulas estioladas).
Aquaporinas em Cana-de-Açúcar
Proteínas encontradas nas
membranas celulares desde
procariotos até eucariotos,
aumentando a
permeabilidade para água
e/ou glicerol.
100
64
100
100
100
100
66
98
100
62
96
98
60
96
100
79
100
99
96
100
70
94
100
100
95
100
97
100
100
96
100
74
70
81
87
91
87
100
100
100
100
81
Análise do padrão de expressão de aquaporinas: 47 clusters e 887 reads) de
cana-de-açúcar. Abreviações: RT= Raiz; FL= Flor.
100
97
97
100
100
100
89
100
100
99
99
96
100
66
99
100
80
96
100
100
100
65
86
96
100
100
100
99
100
77
100
92
100
100
90
100
93
100
100
100
95
76
69
100
98
100
100
Peso molecular e ponto isoelétrico para os representantes das diferentes subfamílias
de aquaporinas em A. thaliana, Z. mays, O. sativa e S. officinarum.
Subfamília SIP = área delimitada. Programa JvirGel.
95
100
100
100
100
99
100
100
100
97
100
0 .2
99
O sP IP 2
O sP IP 7
O sP IP 1 0
S oP IP 7
Z m P IP 2 6
O sP IP 1 1
O sP IP 3
O sP IP 8
S oP IP 8
Z m P IP 2 5
S oP IP 6
Z m P IP 2 3
Z m P IP 2 4
S oP IP 2
S oP IP 4
Z m P IP 2 1
Z m P IP 2 2
O sP IP 1
O sP IP 4
O sP IP 5
O sP IP 6
A tP IP 2 4
A tP IP 2 1
A tP IP 2 2
A tP IP 2 3
Z m P IP 2 7
A tP IP 2 7
A tP IP 2 8
A tP IP 2 5
A tP IP 2 6
Z m P IP 1 6
A tP IP 1 1
A tP IP 1 2
A tP IP 1 3
A tP IP 1 4
A tP IP 1 5
O sTIP 1 3
O sP IP 1 5
S oP IP 1
Z m P IP 1 5
O sP IP 1 4
Z m P IP 1 1
O sP IP 1 2
O sN IP 8
S oP IP 3
Z m P IP 1 2
S oP IP 5
Z m P IP 1 3
Z m P IP 1 4
O sP IP 9
O sP IP 1 3
Z m TIP 5 1
A tT IP 5 1
S oTIP 1
Z m TIP 4 4
O sTIP 3
O sTIP 5
Z m TIP 4 3
O sTIP 2
O sTIP 4
A tT IP 4 1
Z m TIP 4 1
S oTIP 3
Z m TIP 4 2
O sTIP 6
O sTIP 1 0
O sTIP 8
O sTIP 1 2
Z m TIP 3 1
Z m TIP 3 2
A tT IP 3 1
A tT IP 3 2
S oTIP 2
Z m TIP 2 1
Z m TIP 2 2
S oTIP 5
Z m TIP 2 3
A tT IP 2 2
A tT IP 2 3
S oTIP 4
A tT IP 2 1
A tT IP 1 3
O sTIP 1
O sTIP 7
O sTIP 9
Z m TIP 1 2
S oTIP 6
A tT IP 1 1
A tT IP 1 2
S oTIP 7
S oTIP 8
O sTIP 1 1
Z m TIP 1 1
O sN IP 4
O sN IP 6
O sN IP 5
A tN IP 7 1
S oN IP 3
Z m N IP 2 2
Z m N IP 2 3
Z m N IP 2 1
S oN IP 2
Z m N IP 3 1
A tN IP 5 1
A tN IP 6 1
A tN IP 2 1
A tN IP 3 1
A tN IP 4 1
A tN IP 4 2
A tN IP 1 1
A tN IP 1 2
O sN IP 3
S oN IP 1
Z m N IP 1 1
O sN IP 1
O sN IP 2
O sN IP 7
Z m S IP 2 1
A tS IP 2 1
A tS IP 1 1
A tS IP 1 2
Z m S IP 1 1
O sS IP 1
O sS IP 2
Z m S IP 1 2
S oS IP 1
S oS IP 2
PIP
TIP
NIP
SIP
Publicações
→SILVA, A. B., NOGUEIRA, A.C.B., SILVA, R.R.M., SILVA, L.C.B., SOARES-CAVALCANTI, N.M., BENKO-ISEPPON, A.M.
(2005). In silico survey of resistance (R) genes in Eucalyptus transcriptome. Genetics and Molecular Biology 28: 562-574.
→RAKSHIT, S., WINTER, P., BENKO-ISEPPON, A.M.; MUEHLBAUER, F.J., KAHL, G. (2003). DAF marker tightly linked to a
major locus for Aschochyta blight resistance in chickpea (Cicer arietinum L.). Euphytica 132: 23-30.
→BENKO-ISEPPON, A. M.; WINTER, P., HÜTTEL, B., MUEHLBAUER, F. J., KAHL, G. (2003). Molecular markers closely
linked to fusarium resistance genes in chickpea show significant alignments to pathogenesis-related genes located on
Arabidopsis chromosomes 5 and 1. Theoretical and Applied Genetics 107: 379-386.
→WINTER, P., BENKO-ISEPPON, A. M.; HÜTTEL, B., PFAFF, T., KAHL, G., MUEHLBAUER, F. J. (2000). A linkage map of the
chickpea (Cicer arietinum L.) genome based on recombinant inbred lines from a C. arietinum x C. reticulatum cross: localization
of resistance genes for Fusarium wilt races 4 and 5. Theoretical and Applied Genetics 101: 1155-1163.
→WINTER, P., STAGGINUS, C., HÜTTEL, B., PFAFF, T., BENKO-ISEPPON, A. M.; RAKSHIT, S., KAHL, G. (2004).
Architecture and Maps of the Chickpea Genome: A Basis for Understanding Plant-Rhizobium Interaction. In: Symbiotic
Nitrogen Fixation: Prospects for Enhanced Application in Tropical Agriculture.1st Ed., New Hamshire : Science Publishers USA,
1: 286-293.
→BENKO-ISEPPON, A.M.; SOARES-CAVALCANTI, N.M., NOGUEIRA, A.C.W., SILVA, L.C.B., SILVA, R.R.M., ALMEIDA,
P.M.L., BRUNELLI, K.R., KIDO, L.M.H., KIDO, E.A. (2005). Genes associados a estresses bióticos e abióticos em feijãocaupi [Vigna unguiculata (L.) Walp.] e outras angiospermas. In: Estresses Ambientais: danos e/ou benefícios para as
plantas. 1ª Ed. Recife: Sociedade Brasileira de Fisiologia Vegetal, v.1: 350-359.
Agradecimentos
CAPES/MEC
FACEPE
CNPq
FAPESP & SUCEST & FOREST
Johann Wolfgang Goethe Universität Frankfurt,
Germany (Günter Kahl / Peter Winter)
Volkswagen Foundation
RENORBIO/BNB
Universidade Federal de Pernambuco, Recife, PE.
Obrigada!