UNIVERSIDADE ESTADUAL DO CEARÁ
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS VETERINÁRIAS
RAFAEL ROSSETTO DE SOUSA
EFEITO DO FATOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA
1 (IGF-I), MEIO DE BASE, DA INSULINA E FSH SOBRE O
DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS
PRÉ-ANTRAIS BOVINOS ISOLADOS
FORTALEZA
2013
RAFAEL ROSSETTO DE SOUSA
EFEITO DO FATOR DE CRESCIMENTO SEMELHANTE À INSULINA 1
(IGF-I), MEIO DE BASE, DA INSULINA E FSH SOBRE O
DESENVOLVIMENTO IN VITRO DE FOLÍCULOS
PRÉ-ANTRAIS BOVINOS ISOLADOS
Tese apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias da Faculdade de Veterinária da
Universidade Estadual do Ceará, como requisito parcial
para obtenção do título de Doutor em Ciências Veterinárias.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Linha de pesquisa: Reprodução e sanidade de carnívoros,
onívoros, herbívoros e aves.
Orientador: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.
FORTALEZA
2013
Dados Internacionais de Catalogação na Publicação
Universidade Estadual do Ceará
Biblioteca Central Prof. Antônio Martins Filho
Bibliotecário Responsável – Francisco Welton Silva Rios – CRB-3/919
S725e
Sousa, Rafael Rossetto de
Efeito do fator de crescimento semelhante à insulina 1 (IGF-I),
meio de base, da insulina e FSH sobre o desenvolvimento in vitro
de folículos pré-antrais bovinos isolados / Rafael Rossetto de
Sousa . -- 2013.
CD-ROM. 121 f. : il. (algumas color.) ; 4 ¾ pol.
“CD-ROM contendo o arquivo no formato PDF do trabalho
acadêmico, acondicionado em caixa de DVD Slim (19 x 14 cm x 7
mm)”.
Tese (doutorado) – Universidade Estadual do Ceará,
Faculdade de Veterinária, Programa de Pós-Graduação em
Ciências Veterinárias, Curso de Doutorado em Ciências
Veterinárias, Fortaleza, 2013.
Área de Concentração: Reprodução e Sanidade Animal.
Orientação: Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo.
Co-orientação: Profa. Dra. Márcia Viviane Alves Saraiva.
1. Bovino. 2. Cultivo in vitro. 3. Folículo pré-antral. I. Título.
CDD: 633
A minha íntima família
Elvio, Nívia, Júnior, Andressa e Gerlane
por tudo que representam em minha vida.
Com amor, dedico.
AGRADECIMENTOS
Agradeço inicialmente à Universidade Estadual do Ceará, à Faculdade de Veterinária e
ao Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias (PPGCV) pela oportunidade de
adquirir conhecimento e qualificação profissional e pela estrutura fornecida para realização
dos trabalhos de tese.
Ao Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-Antrais
(LAMOFOPA) da Universidade Estadual do Ceará, pela acolhida e todo suporte técnico
estrutural que permitiram a execução do presente trabalho com eficiência e eficácia,
garantindo inovação e tecnologia.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concepção de bolsa de estudo, indispensável para a realização desse trabalho.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), à Rede
Nordeste de Biotecnologia (RENORBIO), à Financiadora de Estudos e Projetos (FINEP), à
Fundação Cearense de Apoio ao Desenvolvimento Científico e Tecnológico (FUNCAP) pelo
suporte financeiro à todos os projetos do laboratório.
Aos meus pilares e principais incentivadores do meu sucesso, Elvio, Nívia, Júnior,
pelo apoio por toda a vida, que foram, são, e serão o meu maior e melhor exemplo de vida.
Aos meus familiares que incentivaram e me apoiaram nessa longa jornada, agradeço a
Andressa, Fábio, Diana, Felipe e Daniel pela força e otimismo que me transmitem, pelo
companheirismo, admiração e principalmente pelo enorme carinho.
Ao amor da minha vida Gerlane com sua família, Liduína, Fernandes, Fernando e
Rachel, que se fizeram presentes nessa jornada, agradeço pelo imensurável carinho, amor,
dedicação e pela força de sempre.
As minhas amigas que se tornaram irmãs, Viviane e Tamara, por toda a amizade,
conselhos e auxílio emocional durante o doutorado, transmitindo-me a confiança necessária
para realização dos meus sonhos, além dos ótimos momentos compartilhados.
Aos meus amigos Luciana e Pedro pelos eternos momentos vividos juntos.
As minhas amigas Isadora, Ivina e Giovanna por compartilharem momentos de lazer e
projetos de doutorado, somado as brincadeiras e angústias acrescentando tempero de bons
sentimentos à nossa amizade.
Ao meu amigo Cleidson Manoel, pelo exemplo de profissionalismo e superação, por
tudo que aprendi com seus questionamentos e indagações.
Ao orientador Prof. Dr. José Ricardo de Figueiredo e Profa. Dra. Ana Paula Ribeiro
Rodrigues, pela oportunidade de execução deste projeto. Especialmente pelo incentivo,
paciência e orientação durante todos os anos de convivência.
Ao Prof. Dr. Cláudio Cabral Campello, um dos professores mais incríveis que tive a
honra de conhecer, agradeço pelos sábios conselhos e orientações, pelo exemplo de ética e
respeito ao próximo e compromisso com a ciência em sua total essência.
Ao Prof. Dr. Marcelo Bertolini, que acompanhou esta caminhada desde o início se
mostrando sempre disposto a me ajudar e a contribuir com o meu aprendizado.
Ao Prof. Dr. Helio Blume, um dos grandes incentivadores dessa minha longa jornada
de doutorado. Acima de tudo, pela amizade e exemplo de profissional competente.
A todos os colegas que fizeram ou ainda fazem parte do LAMOFOPA, Mororó, Vitor
Galindo, Leonardo Pinto, Marcella Melo Pinto, Juliana Celestino, Jamily Bruno, Fabrício
Martins, Roberta Chaves, Valdevane Araújo, Ana Beatriz Duarte, Debora Sales, Johanna,
Deborah Padilha, Anderson Almeida, Hiédely Luz, Lívia Wanderley, Rebeca Rocha, Laritza
Lima, Anelise Alves, Patrícia, Allana Pessoa, Francisco Leo, Emmanuel, Aglailson, Renato,
Luana, Marcelo, Lindemara, pela amizade, apoio, incentivo e bons momentos convividos ao
longo desses anos.
Aos co-autores do meu projeto de doutorado, Márcia Viviane Alves Saraiva, Isabel
Bezerra Lima-Verde, Isadora Machado Teixeira Lima, Luciana Rocha Faustino, Giovanna
Quintino Rodrigues, Ivina Rocha Brito, sem vocês não seria possível executar este trabalho,
muito obrigado pela amizade e auxílio durante o doutorado.
Ao amigo e companheiro Antônio César Camelo, por toda a sua presença e alegria
distribuída em todos os momentos desta longa caminhada.
À dedicação e competência de Adriana Maria Sales Albuquerque que sempre se
mostrou solícita em atender às minhas dificuldades prontamente.
À banca examinadora, em especial ao Dr. Mário e Dra. Juliana, por terem aceito
prontamente o convite e, sobretudo pela sua prestimosa colaboração ao corrigir o presente
trabalho.
Há muito mais a quem agradecer... A todos aqueles que, embora não nomeados, me
brindaram com seus inestimáveis apoios em distintos momentos e por suas presenças afetivas
em inesquecíveis momentos...
Enfim, agradeço a DEUS, por ter me concedido a vida e sempre iluminar meus passos.
RESUMO
Os objetivos do estudo da presente tese foram: 1) Verificar a eficiência do protocolo
experimental de cultivo in vitro de folículos pré-antrais (FOPA) utilizado na espécie caprina
para a espécie bovina tanto na ausência como na presença do fator de crescimento semelhante
à Insulina 1 (IGF-I) (Experimento 1); 2) Investigar o efeito de três diferentes meios de base
comercial (α-MEM®, McCoy® ou TCM199®) sobre a viabilidade, formação de antro,
crescimento e manutenção da ultraestrutura de FOPA bovinos (Experimento 2); 3) Avaliar os
efeitos da adição de diferentes concentrações de insulina (5 ng/mL, 10 ng/mL, 5 µg/mL e 10
µg/mL) sobre a viabilidade, formação de antro e crescimento de FOPA bovinos (Experimento
3); 4) Verificar a influência do modo de adição de FSH, isto é, de forma fixa (FSH 100
ng/mL) ou em concentrações crescentes (D0-6: 1ng/mL; D6-12: 10 ng/mL; D12-18: 100
ng/mL - FSH Seq) sobre a viabilidade, morfologia, formação de antro, crescimento,
ultraestrutura e produção de estradiol a partir de FOPA bovinos isolados e cultivados in vitro
(Experimento 4). Folículos secundários caprinos (Experimento 1) e bovinos (Experimento 1,
2, 3 e 4) foram isolados por microdissecção e cultivados in vitro por 16 (Experimento 2) ou
18 dias (Experimento 1, 3 e 4) com regime de troca de meio a cada 2 (Experimento 1, 3 e 4)
ou 4 dias (Experimento 2). No Experimento 1, a adição de IGF-I não afetou a sobrevivência
folicular e formação de antro nas espécies caprina e bovina, no entanto, a extrusão folicular e
a maturação oocitária foram obtidas apenas em caprinos. No Experimento 2, o meio de base
TCM199 foi mais eficiente em preservar a viabilidade (P<0,05) e ultraestrutura folicular,
resultando em maiores taxas de formação de antro (P<0,05) justificando a escolha do
TCM199 como meio de base para o Experimento 3. Neste Experimento 3, a adição de 5 e 10
ng/mL de insulina promoveu um maior crescimento folicular quando comparados ao controle
e aos demais tratamentos (P<0,05). Além disso, após 18 dias de cultivo, a adição de insulina
em todas as concentrações testadas promoveu aumento significativo nas taxas de
sobrevivência folicular quando comparadas ao controle, enquanto que o tratamento 10 ng/mL
de insulina apresentou taxas significativamente superiores a todos os demais tratamentos
avaliados. No Experimento 4, utilizando da melhor concentração de insulina obtida no
Experimento 3 (insulina 10 ng/mL), a adição de FSH 100 ng/mL apresentou percentagem
significativamente superior de viabilidade folicular quando comparado ao controle após 18
dias de cultivo. Os folículos cultivados na presença de FSH 100 ng/mL apresentaram
diâmetros foliculares significativamente superiores ao controle e FSH Seq. Em conclusão, a
utilização do meio de base TCM199 é eficiente em promover o desenvolvimento de FOPA
bovinos, os quais se comportam de forma diferenciada dos caprinos no cultivo in vitro. Além
disso, a utilização de baixas concentrações de insulina (5 e 10 ng/mL) permite um maior
crescimento folicular e a associação de insulina (10 ng/mL) e FSH (100 ng/mL) proporciona
elevadas taxas de sobrevivência e de crescimento de FOPA bovinos.
Palavras-chave: Insulina; FSH; FOPA; Bovinos; Caprinos.
ABSTRACT
The objectives of present study were: 1) To verify the efficiency of the experimental protocol
from goat preantral follicles (PF) in vitro culture to bovine specie, either in the absence or
presence of the Insulin-like growth factor 1 (IGF-I) (Experiment 1); 2) To investigate the effect of
three different commercial medium (α-MEM®, McCoy® or TCM199®) on viability, antrum
formation, growth and maintenance of the ultrastructure of the bovine PF (Experiment 2); 3) To
evaluate effects of adding different concentrations of insulin (5ng/mL, 10 ng/mL, 5 µg/mL and 10
µg/mL) on viability, antrum formation and growth of bovine PF (Experiment 3); 4) To investigate
the influence of FSH addition mode, fixedly (FSH 100 ng/mL) or with increasing concentrations
(D0-6: 1ng/mL; D6-12: 10 ng/mL; D12-18: 100 ng/mL - FSH Seq), on viability, morphology,
antrum formation, growth, ultrastructure and estradiol production from bovine PF isolated and in
vitro cultured (Experiment 4). Goat (Experiment 1) and bovine (Experiment 1, 2, 3 and 4)
secondary follicles were isolated by microdissection and cultured in vitro for 16 (Experiment 2) or
18 days (Experiment 1, 3 and 4) with medium exchange every 2 (Experiment 1, 3 and 4) or 4 days
(Experiment 2). On Experiment 1, the addition of IGF-I did not affect the follicular survival and
the antral formation on bovine and caprine species, however, the follicular extrusion and oocyte
maturation were hardly observed in goats. On Experiment 2 the TCM199 base medium was more
efficient in preserving the viability (P<0.05) and the follicular ultrastructure, resulting in higher
rates of antrum formation (P<0.05) witch justify the choice of TCM199 base medium for the
Experiment 3. In this Experiment 3, the addition of 5 and 10 ng/mL insulin promoted a greater
follicular growth when compared to control and other treatments (P <0.05). Moreover, after 18
days of cultivation, the addition of insulin at all concentrations tested caused a significant increase
in the follicular survival rates compared to the control, whereas the treatment with 10 ng/ml of
insulin present rates significantly higher than all other treatments. On Experiment 4, using the best
insulin concentration obtained on Experiment 3 (insulin 10 ng/ml), the adding FSH 100 ng/mL
showed a significantly higher percentage of follicle viability compared to control after 18 days of
the culture. Follicles cultured in the presence of FSH 100 ng/mL showed follicular diameters
significantly higher than the control and FSH Seq. In conclusion, the use of the basic medium
TCM199 was effective to promote the development of bovine PF, which behave differently from
goats cultured in vitro. Furthermore, the use of low insulin concentrations (5 and 10 ng/ml)
allowed a greater follicular growth, and the addition of insulin (10 ng/ml) and FSH (100 ng/ml)
provided higher rates of survival and growth of bovine PF.
Keywords: Insulin; FSH; PF; Bovine; Goat.
LISTA DE FIGURAS
Revisão Bibliográfica
Figura 1: Desenho esquemático do ovário em mamífero representando vasos sanguíneos
na região medular e folículos ovarianos (primordial, primário, secundário, terciário e
pré-ovulatório), corpo lúteo e álbicans na região cortical................................................... 22
Figura 2 – Desenho esquemático dos processos de oogênese e foliculogênese.................. 24
Figura 3 - Ovário Artificial: obtenção de embriões a partir de folículos pré-antrais.......... 27
Figura 4 – Ilustração dos sistemas empregados para cultivo in vitro de folículos préantrais...........................................................................................................................
29
Figura 5 – Cascata de ativação das vias de sinalização MAPK e Pi3K sob ação do IGFI. 1 – IGF-I e IGFBP disponível para conjugação; 2 – Conjugação IGF-I e IGFBP; 3 –
Transporte do complexo IGFI/IGFBP até IGFR-I; 4 – Liberação da IGFBP; 5 –
Ativação da via Pi3K e MAPK; 6 – Mediação dos processos de proliferação e
sobrevivência folicular pelas vias Pi3K e MAPK e diferenciação folicular pela MAPK... 33
Figura 6: Esquema ilustrativo da atuação do FSH via receptor. Adaptado de SARAIVA
et al., 2010a.......................................................................................................................... 37
Capítulo 1
Figura 1. Etapas do processo de ativação e desenvolvimento folicular.............................. 50
Figura 2. Principais equipamentos utilizados no isolamento mecânico de folículos préantrais. A: Tissue chopper; B: Míxer; C: Tesoura cirúrgica; D: Fórceps; E: Agulhas
dissecantes........................................................................................................................... 53
Figura 3. Quadro ilustrativo dos principais avanços obtidos com o cultivo in vitro de
folículos pré-antrais em diferentes espécies nos últimos 12 anos....................................... 55
Capítulo 2
Figure 1. Photomicrography showing antrum formation during IVC of caprine (panels
A1-A4) and bovine (panels B1-B4) preantral follicles. Mean increase in follicular
diameter is presented in panel C………………………………………………………….. 62
Figure 2. A: Meiosis resumption and oocyte morphology after 18 days IVC; only
caprine COCs reached sufficient diameter to be submitted to IVM. B: Cumulus
expansion (B1), MII oocyte (B2), morphologically normal mature oocyte (B3) and
chromatin configuration of a caprine mature oocyte (B4)………………………………... 62
Capítulo 3
Figure 1- (A) Percentages of viable pre-antral follicles before (control) and after 16 days
of in vitro culture (IVC) in McCoy, TCM199 or α-minimum essential medium (αMEM). (B–E) Light microscopic images of normal (B) and degenerating (D) follicles as
confirmed by epifluorescence microscopy of viable calcein-AM stained (C) and nonviable ethidium stained (E) follicles. (F–I) Transmission electron microscopy revealed
normal pre-antral follicles after IVC in the presence of α-MEM (F) and TCM199 (G),
whereas McCoy medium lead to granulosa cells detachment from oocyte (H) and
follicles exhibited signals of vacuolization in the ooplasm (I). (J) Increase in follicular
diameter at days 0, 8 and 16 of IVC. (K–M) Follicular antrum formation during IVC in
the presence of TCM199. (N) Percentage of follicles presenting antrum formation after
IVC in the presence of McCoy, TCM199 and α-MEM……………………………..……. 68
Capítulo 4
Figure 1: Evaluation of follicular viability after 18 days using fluorescent markers
analyzed in serial sections by Confocal Microscopy, demonstrating both non-viable (A)
and viable (B) isolated follicles cultured in either the absence (control) or the presence
of 10 ng/mL insulin, respectively. Note: areas labeled in green and red indicate viable
and non-viable cells, respectively………………………….……………………………... 79
Figure 2: Percentages of viability (A) and antrum formation (B) of bovine follicles
cultured in vitro for 18 days in either the absence or presence of insulin………………... 80
Figure 3 – Evaluation of follicular viability after an in vitro culture for 18 days as
characterized by non-viable and viable follicles in the control medium (A1), with FSH
100 (B1) and with FSH Seq (C1) using fluorescent markers (A2, B2 and C2). Note:
areas labeled in green and red indicate viable and non-viable cells, respectively………... 81
Figure 4 – Percentage of viability (A) and antrum formation (B) of bovine follicles
cultured in vitro for 18 days in the absence (Control) or the presence of FSH added at a
fixed (FSH 100) or increasing (FSH Seq) concentrations...…...…………………………. 81
Figure 5 – Morphological analyses by stereomicroscope (1) and optical microscope
(classical histology; 2) after 18 days of in vitro culture using Control medium (A), FSH
with fixed (B) and increasing (C) concentrations. ..........………………………………… 82
Figure 6 – Ultrastructural analyses of preantral follicles cultured in vitro for 18 days
characterizing degenerated follicles in the Control (A) and normal follicles in the
presence of FSH 100 (B) or FSH Seq (C) in the culture medium. ………………………. 83
Figure 7 – Mean values of estradiol secretion measured in the follicular culture medium,
collected on days 6, 12 and 18 in the Control group, FSH 100 and FSH Seq…………… 84
LISTA DE TABELAS
Revisão Bibliográfica
Tabela 1 – Principais substâncias testadas no cultivo in situ pela equipe do
LAMOFOPA....................................................................................................................... 30
Tabela 2 – Principais resultados obtidos com a adição de FSH ao meio de cultivo in
vitro de folículos pré-antrais de ruminantes domésticos..................................................... 39
Capítulo 1
Tabela 1. Quantidade de FOPAS isolados por ovário em diferentes métodos de
isolamento e espécies........................................................................................................... 54
Capítulo 2
Table 1. Mean percentage (± SEM) of follicular survival, antrum formation and
follicular extrusion in bovine and caprine preantral follicles during 18-days IVC………. 61
Capítulo 4
Table 1: Progression of follicular diameter and the rate of daily growth in the insulin
treatments during the 18 days of the in vitro culture. …………….……………………… 80
Table 2: Progression of follicular diameter and the rate of daily growth in the different
treatments during 18 days of in vitro culture. ……………………………………………. 82
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
%:
Percentage (Porcentagem)
~:
aproximadamente
<:
Menor
=:
Igual
>:
Maior
±:
Mais ou menos
≤:
Menor ou igual
≥:
Maior ou igual
®:
Registro
°C:
Graus Celsius
µg:
Microgramas
µL:
Microlitros
µm:
Micrômetros
3D:
three-dimensional (tridimensional)
BMP:
Bone morphogenetic protein (Proteína morfogenética óssea)
BSA:
Bovine serum albumin (Albumina sérica bovina)
CAPES:
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior
CE:
Ceará
CG:
Células da granulosa
CGP:
Células germinativas primordiais
CIV:
Cultivo in vitro
CO2:
Dióxido de carbono
COCs:
Cumulus-oocyte complexes (Complexos cúmulus oócito)
DF:
Distrito Federal
DNA:
Deoxyribonucleic acid (Ácido desoxirribonucléico)
Dr.:
Doutor
E2:
Estradiol
EGF:
Epidermal growth factor (Fator de crescimento epidermal)
FAVET:
Faculdade de Veterinária
FGF:
Fibroblast growth fator (Fator de crescimento fibroblástico)
Fig.:
Figure (Figura)
FINEP:
Financiadora de Estudos e Projetos
FIV:
Fecundação in vitro
FOPA:
Folículos ovarianos pré-antrais
FSH 100:
Follicle stimulating hormone added at a fixed
FSH Seq:
Follicle stimulating hormone added increasing concentration
FSH:
Follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante)
FSHr:
Recombinant follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante
recombinante)
FSH-R:
Follicle stimulating hormone receptor (Receptor do hormônio folículo
estimulante)
GC:
Granulosa cells
GDF-9:
Growth diferentiation fator -9 (Fator de crescimento e diferenciação-9)
GFP:
Green Fluorescent protein (Proteína fluorescente verde)
GH:
Growth hormone (Hormônio do crescimento)
GLM:
General linear models
GLUT:
Proteína transportadora de glicose
GnRH:
Gonadotropin-releasing hormone (Hormônio liberador de gonadrotofina)
GV:
Germinal vesicle (Vesícula germinativa)
GVBD:
Germinal vesicle break down (Quebra da vesícula germinativa)
h:
Hours (horas)
IETS:
International Embryo Transfer Society
IGFBP:
Insulin-like growth factor binding protein (proteínas transportadoas de IGF)
IGF-I:
Insulin-like growth factor-I (Fator de crescimento semelhante à insulina-I)
IGFR-I e II
Receptor do fator de crescimento semelhante à insulina tipo I e II
ITP:
Instituto de Tecnologia e Pesquisa
ITS:
Insulin, tranferrin and selenium (Insulina, transferrina e selênio)
IVC:
in vitro culture
IVM:
in vitro maturation (Maturação in vitro)
KGF:
Keratinocyte growth factor (Fator de crescimento keratinócito)
KL:
Kit ligand
kV:
Kilovolt
L:
Litro
LAMOFOPA: Laboratório de Manipulação de Oócitos e Folículos Ovarianos Pré-Antrais
LH:
Luteinizing hormone (Hormônio luteinizante)
LIF:
Leukemia inhibitory factor (Fator inibidor de leucemia)
MEM:
Minimal essential medium (Meio essencial mínimo)
MEM+:
Supplemented
minimal
essential
medium
(Meio
essencial
mínimo
suplementado)
MET:
Microscopia Eletrônica de Transmissão
mg:
miligramas
min:
Minutos
mL:
Mililitros
ml:
Mililitros
mm:
Milímetro
MOIFOPA:
Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais
ng:
nanograma
NGF
Nerve growth factor (Fator de crescimento do nervo)
nm:
Nanômetro
OPU:
ovum pickup
P<0.05:
Probabilidade de erro menor do que 5%
P4:
Progesterone
PCR:
Polimerase chain reaction (Reação em cadeia polimerase)
PDGF:
Platelet derived growth factor (Fator de crescimento derivado de plaquetas)
PE:
Pernambuco
PF:
Preantral follicles
pFSH:
Porcine follicle stimulating hormone (Hormônio folículo estimulante porcino)
pg:
Picograma
pH:
potencial hidrogeniônico
PPGCV:
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias
Prof.:
Professor
qPCR:
Quantitative Polymerase chain reaction (Reação em cadeia polimerase
quantitativa)
RENORBIO: Rede Nordeste de Biotecnologia
RIA:
Radioimmunoassay
RNAm:
Ribonucleic acid messenger (Ácido ribonucléico mensageiro)
s:
Segundos
SAS:
Statistical analysis system
SE:
Sergipe
SEM:
Standart error of the mean (Erro padrão médio)
SNK:
Student-Newman-Keuls
SP:
São Paulo
ST:
Somatotrofina
STAR:
Steroidogenic acute regulatory protein (Proteína de regulação aguda da
esteroidogênese)
TCM-199:
Tissue Culture Medium - 199 (Meio de cultivo de tecido - 199)
TEM:
Transmission electronic microscopy (Microscopia eletrônica de transmissão)
TGF-α:
Transforming growth factor alfa (Fator de crescimento transformante alfa)
TGF-β:
Transforming growth factor beta (Fator de crescimento transformante beta)
UECE:
Universidade Estadual do Ceará
UNIT:
Universidade Tiradentes
USA:
United States of America (Estados Unidos da América)
VEGF:
Vascular endothelial growth factor (Fator de crescimento do endotélio
vascular)
VIP:
Vasoactive intestinal peptide (Peptídeo intestinal vasoativo)
ZP:
Zona pellucida (Zona pelúcida)
α-MEM
Alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa)
α-MEM+:
Supplemented alpha minimal essential medium (Meio essencial mínimo alfa
suplementado)
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 20
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA .................................................................................... 22
2.1. Caracterização dos Ovários em Mamíferos........................................................ 22
2.2. Oogênese e Foliculogênese Ovariana................................................................... 23
2.2.1 Folículos Pré-antrais ...................................................................................... 24
2.2.2 Folículos Antrais ............................................................................................ 25
2.3. Neo-oogênese...................................................................................................
26
2.4. A Biotécnica de MOIFOPA e suas Aplicações................................................... 27
2.5. Cultivo in vitro de Folículos Pré-antrais ............................................................. 28
2.6. Importância da Composição do Meio de Cultivo in vitro Folicular.................. 31
2.7. Fator de Crescimento Semelhante à Insulina 1 (IGF-I) .................................... 32
2.8. Insulina .................................................................................................................. 35
2.9. Hormônio Folículo Estimulante (FSH) ............................................................... 36
2.10. Técnicas de Avaliação da Viabilidade e Crescimento Folicular in vitro......... 40
2.10.1. Histologia Clássica ..................................................................................... 40
2.10.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET) ......................................... 40
2.10.3. Microscopia de Fluorescência .................................................................... 41
2.10.4. Dosagem Hormonal .................................................................................... 41
3. JUSTIFICATIVA ......................................................................................................... 43
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA ........................................................................................... 45
5. OBJETIVO .................................................................................................................... 46
5.1. Objetivo Geral ....................................................................................................... 46
5.2. Objetivos Específicos ............................................................................................ 46
6. CAPÍTULO 1 ................................................................................................................ 47
7. CAPÍTULO 2 ................................................................................................................ 58
8. CAPÍTULO 3 ................................................................................................................ 64
9. CAPÍTULO 4 ................................................................................................................ 70
10. CONCLUSÕES ........................................................................................................... 94
11. PERSPECTIVAS ........................................................................................................ 95
12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ..................................................................... 96
20
1. INTRODUÇÃO
O desenvolvimento de biotécnicas reprodutivas, tais como a sincronização de estro,
superovulação, fecundação in vitro (FIV) e transferência de embriões têm criado
oportunidades extraordinárias para a reprodução animal proporcionando uma grande evolução
na multiplicação de animais de elevado potencial econômico. Na espécie bovina, a técnica de
produção in vitro de embriões, provenientes da ovum pickup (OPU), tem sido utilizada como
instrumento importante para diminuir o intervalo entre gerações e acelerar o melhoramento
genético animal. No Brasil, esta técnica resultou na produção e transferência de mais de
318.000 embriões bovinos, ou seja, 85% dos 340.000 embriões produzidos in vitro em todo o
mundo no ano de 2011 (EMBRYOTRANSFER NEWSLETTER - IETS, 2012). Contudo, a
produção de embriões a partir de fêmeas de alto valor genético pode ser ainda mais eficiente,
especialmente quando se considera que ovário bovino contém milhares de oócitos inclusos em
folículos pré-antrais (FOPA). Sabendo-se que é possível, através da biotécnica de
Manipulação de Oócitos Inclusos em Folículos Ovarianos Pré-antrais (MOIFOPA), isolar
cerca de 70.000 FOPA de um ovário bovino (BEM et al., 1997), o desenvolvimento de
sistemas de cultivo in vitro que possibilitem o crescimento destes folículos poderia
revolucionar a produção in vitro de embriões nesta espécie.
Em detrimento aos avanços obtidos com a manipulação dos folículos antrais, na
espécie bovina, poucos esforços são concentrados no estudo do desenvolvimento folicular
inicial. Excelentes resultados têm sido obtidos em outras espécies domésticas com a produção
de embriões a partir de FOPA (SARAIVA et al., 2010b; ARUNAKUMARI;
SHANMUGASUNDARAM; RAO, 2010; GUPTA et al., 2008). O estudo comparativo entre
espécies pode acelerar o avanço nas pesquisas uma vez que protocolos bem sucedidos em
caprinos podem ser testados em bovinos lançando mão de substâncias que possibilitem o
desenvolvimento folicular pré-antral em ambas as espécies. O passo inicial para estabelecer
um sistema de cultivo eficiente é definir a composição ideal do meio de base para a
suplementação com hormônios e fatores de crescimento. Nesse contexto, inúmeras pesquisas
vêm sendo desenvolvidas a fim de aprimorar as técnicas de cultivo in vitro de FOPA em
bovinos, além de melhor compreender a foliculogênese ovariana nesta espécie, ainda pouco
elucidada. Com base nessas pesquisas, tem sido demonstrado o envolvimento de diferentes
substâncias na regulação do desenvolvimento de FOPA durante o cultivo in vitro. Dentre
essas substâncias, destacam-se o fator de crescimento semelhante à insulina-1 (IGF-I), a
21
Insulina e o hormônio folículo estimulante (FSH), as quais exercem um papel bem definido
no controle e na regulação da foliculogênese em diversas espécies (FORTUNE, 2003).
Para uma melhor compreensão da presente tese, serão abordados, na revisão
bibliográfica, aspectos relacionados ao ovário dos mamíferos, oogênese e foliculogênese,
neofoliculogênese, biotécnica de MOIFOPA e suas aplicações, importância do cultivo in vitro
de FOPA, com destaque para o IGF-I, Insulina e FSH
22
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Caracterização dos Ovários em Mamíferos
O principal órgão do sistema reprodutor das fêmeas mamíferas é o ovário que se
divide em duas regiões: medular e cortical. A região medular é constituída de vasos
sanguíneos, linfáticos e nervos, os quais são responsáveis pela nutrição e sustentação do
ovário (CORMACK, 1991). A região cortical é composta principalmente por folículos
ovarianos e corpos lúteos em diferentes estágios de desenvolvimento e regressão (Figura 1)
(SILVA, 2005).
Figura 1: Desenho esquemático do ovário em mamífero representando vasos sanguíneos na
região medular e folículos ovarianos (primordial, primário, secundário, terciário e préovulatório), corpo lúteo e álbicans na região cortical.
O folículo ovariano é a unidade funcional do ovário e é constituído por uma célula
germinativa (oócito), circundado por células somáticas (células da granulosa e tecais). Os
folículos ovarianos desempenham duas funções principais: uma endócrina e outra exócrina ou
gametogênica. A primeira refere-se à síntese e secreção de hormônios e outros peptídeos
23
essenciais para o desenvolvimento folicular, ciclicidade estral/menstrual, bem como pela
manutenção do trato reprodutivo (HIRSHFIELD, 1991).
A segunda resulta no
desenvolvimento do oócito imaturo até a sua maturação e consequente ovulação
(SAUMANDE, 1991). O folículo ovariano é responsável por proporcionar um ambiente ideal
para o crescimento e maturação oocitária (CORTVRINDT; SMITZ, 2001).
2.2. Oogênese e Foliculogênese Ovariana
A oogênese pode ser definida como o conjunto de processos que compreende o
desenvolvimento e a diferenciação das células germinativas primordiais da fêmea até a
formação do oócito haploide fecundado (Figura 2) (RUSSE, 1983). Durante o período
embrionário, as células germinativas primordiais de origem extragonadal migram para o
ovário primitivo, multiplicam-se ativamente e se diferenciam em oogônias (PEPLING, 2006).
As oogônias, que sofreram sucessivas mitoses, posteriormente entrarão na primeira divisão
meiótica (estágio de prófase I) e passarão a ser denominadas oócitos primários (SUH;
SONNTAG; ERICKSON, 2002). Na maioria dos cordados, todas as divisões das oogônias
completam-se e elas entram em prófase meiótica durante a vida embrionária (ruminantes,
roedores, suínos, humanos) ou logo após (carnívoros, coelhos e lebres) (DE LOS REYES et
al., 2005). O processo meiótico é interrompido no estádio de diplóteno da prófase da primeira
divisão da meiose também denominado de vesícula germinativa (SAUMANDE, 1991). Esta é
a primeira parada da meiose, o núcleo permanecerá nesse estádio pelo menos até a puberdade.
Na puberdade, em razão de liberações pré-ovulatórias do LH algumas horas antes da
ovulação, a meiose é retomada e o núcleo oocitário entra em diacinese (ADASHI, 1994).
Nesse momento, a meiose progride finalizando a prófase I, metáfase I, anáfase I e telófase I
ocorrendo a expulsão do primeiro corpúsculo polar resultando na formação do oócito
secundário, assim denominado por estar na segunda divisão da meiose (SAUMANDE, 1991).
Ocorrerá então a segunda parada da meiose e o núcleo do oócito ficará em metáfase II e só
retomará a meiose se for fecundado pelo espermatozoide. Após a ovulação, caso seja
fecundado, o oócito completará a segunda divisão da meiose, expulsará o segundo corpúsculo
polar culminando com a formação do oócito haplóide fecundado, marcando assim o fim da
meiose (RUSSE, 1983).
A foliculogênese pode ser definida como o processo de formação, crescimento e
maturação folicular, iniciando-se com a formação do folículo primordial e culminando com a
24
obtenção do folículo pré-ovulatório (Figura 2) (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005). Durante o
seu desenvolvimento o folículo ovariano sofre constantes modificações em sua morfologia,
tendo como principais características o crescimento do oócito, a proliferação e a diferenciação
das células da granulosa e da teca, bem como o aparecimento da cavidade antral (BRISTOLGOULD; WOODRUFF, 2006). Diante dessas mudanças morfológicas pode-se verificar que a
população folicular nos ovários é bastante heterogênea variando entre as espécies
(SAUMANDE, 1991). Dessa forma, é possível classificar os folículos ovarianos de acordo
com o estádio de desenvolvimento em pré-antrais (primordiais, primários e secundários) ou
antrais (terciários e pré-ovulatórios) (HULSHOF et al., 1994a).
Figura 2 – Desenho esquemático dos processos de oogênese e foliculogênese
2.2.1. Folículos Pré-antrais
Os folículos primordiais constituem o pool de reserva folicular, compreendendo
cerca de 95% de toda população folicular presente nos ovários dos mamíferos e possuem
oócitos primários circundados por uma camada de 4-8 células da pré-granulosa, de formato
pavimentoso. Na maioria destes folículos, as células da pré-granulosa param de se multiplicar
e entram em um período de quiescência até receberem sinais para entrar no pool de folículos
em crescimento, porém, alguns podem ser estimulados a crescer imediatamente (MCGEE;
HSUE, 2000). O processo pelo qual o folículo primordial sai do pool de reserva e inicia a fase
de crescimento é denominado de ativação folicular, caracterizado por diversas mudanças
morfológicas que incluem o aumento do diâmetro oocitário, a proliferação das células da
granulosa, bem como a mudança de formato destas células de pavimentosas para cúbicas
25
(RUSSE, 1983). O controle da ativação de folículos primordiais envolve uma comunicação
bidirecional entre o oócito e suas células somáticas circundantes (EPPIG, 2001).
Os folículos são denominados de primários quando o oócito primário passa a ser
circundado por uma camada completa de células da granulosa de formato cúbico
(GOUGEON; BUSSO, 2000). Em fetos de caprinos, ovinos e bovinos, o aparecimento de
folículos primários, ocorre aos 71, 100 e 140 dias de gestação, respectivamente (BEZERRA et
al., 1998; McNATTY et al., 1999; RUSSE, 1983). Durante o crescimento destes folículos, as
células da granulosa se proliferam e há um aumento do oócito em tamanho e conteúdo
protéico (PICTON; BRIGGS; GOSDEN, 1998). Nesta fase, os folículos iniciam a expressão
das proteínas, que irão formar a zona pelúcida (LEE, 2000), a qual se encontra localizada
entre o oócito e as células da granulosa (BECKERS et al., 1996).
Os folículos secundários são caracterizados pela presença de duas ou mais camadas
de células da granulosa de formato cúbico ao redor do oócito primário. A presença destes
folículos pode ser observada em fetos caprinos, ovinos e bovinos aos 80, 120 e 210 dias de
gestação, respectivamente (BEZERRA et al., 1998; McNATTY et al., 1999; RUSSE, 1983).
Nesta fase, o núcleo do oócito começa a assumir uma posição excêntrica e as organelas
começam a se mover para a periferia. A zona pelúcida é claramente identificada e o oócito
entra em fase de crescimento intensivo aumentando seu volume como resultado do acúmulo
de água, íons, carboidratos, proteínas e lipídeos (FAIR et al., 1997). Em seguida, as células da
teca, recrutadas a partir do estroma intersticial, formam uma camada em torno das células da
granulosa (PETERS, 1979). Essa progressão parece ser controlada por hormônios, peptídeos e
fatores de crescimento intraovarianos (FORTUNE, 2003; VAN DEN HURK; ZHAO, 2005).
2.2.2. Folículos Antrais
Com o crescimento dos folículos secundários e organização das células da granulosa
em várias camadas, ocorre a formação de uma cavidade repleta de líquido denominada antro.
(DRIANCOURT, 2001). A partir deste estádio, os folículos passam a ser denominados
terciários e, com o desenvolvimento folicular, a produção de fluido antral é intensificada pelo
aumento da vascularização e permeabilidade dos vasos sanguíneos e produção de substâncias
de alto peso molecular pelas células da granulosa que resulta no acúmulo de líquido e
consequente aumento do tamanho folicular (CLARKE et al., 2006; SCHOENFELDER;
EINSPANIER, 2003). Dentre as várias substâncias presentes no fuído folicular, destacam-se
26
as gonadotrofinas, hormônios esteroides, enzimas, lipoproteínas, bem como fatores de
crescimento intraovarianos (WU; TIAN, 2007).
Após a formação do antro, os folículos terciários avançados passam a ser
dependentes de gonadotrofinas e ainda possuem um oócito primário. Ao atingirem 2-3 mm de
diâmetro, são recrutados a se desenvolverem, o que caracteriza a emergência da onda folicular
(ADAMS et al., 2008) que pode variar de duas a três ondas de crescimento folicular para a
espécie bovina (GINTHER et al., 1989). Durante o desenvolvimento dos folículos antrais
ocorre as fases de recrutamento, seleção e dominância (VAN DEN HURK; ZHAO, 2005).
Acredita-se que a dominância folicular inicia-se quando os folículos maiores passam a
produzir altos níveis do IGF-I, estradiol e inibina, responsáveis por modular a liberação de
FSH pela adenohipófise (DRIANCOURT, 2001). Após o completo estabelecimento da
dominância folicular, os folículos crescem rapidamente e em poucos dias atingem o diâmetro
médio de 15-10 mm nas vacas e, em seguida, ocorre a ovulação do complexo cumulus-oócito
em resposta ao pico de LH, propiciando a manutenção da fertilidade das fêmeas mamíferas
(DRUMMOND, 2006). O folículo pré-ovulatório, na maioria das espécies domésticas, possui
um oócito secundário o qual completará sua meiose após a fusão com o espermatozóide e
expulsão do segundo corpúsculo polar como citado no tópico 2.2 (DE LOS REYES et al.,
2005).
2.3. Neo-oogênese
O conhecimento de que a população folicular é estabelecida ainda na vida fetal em
primatas e ruminantes (BETTERIDGE et al., 1989), ou logo após o nascimento em roedores
(HIRSHFIELD, 1991) como mencionado no tópico 2.2, tem sido questionado nos últimos
anos. De acordo com Oktem e Urman (2010), durante a vida de fêmeas mamíferas não há o
aumento do número de oócitos além do estabelecido inicialmente durante a formação dos
ovários. No entanto, uma série de estudos recentes têm desafiado esta afirmação, mostrando a
formação de novas células germinativas em mulheres (BUKOVSKI et al., 2004) e em
camundongos fêmea adultas (JOHNSON et al., 2004). Recentemente, Zou et al. (2009)
produziram descendentes saudáveis proveniente de oócitos fecundados in vitro derivados de
células tronco germinativas femininas em pequenos roedores. Estes resultados fornecem
evidências convincentes para a existência de células tronco germinativas em fêmeas
mamíferas adultas, que em condições experimentais, são plenamente capazes de gerar oócitos
27
que podem ser fertilizados e produzir descendentes viáveis (OKTEM; URMAN, 2010).
O paradigma de que a população folicular é pré-estabelecida na vida fetal ou logo após
o nascimento é mutável, uma vez que são necessárias comprovações científicas para a teoria
da neo-oogênese em mamíferos. Entretanto, independente da neo-oogênese, a população
folicular pode variar entre espécies e indivíduos de aproximadamente 1.500 na camundonga
(SHAW; ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000) até 2.000.000 na mulher (ERICKSON,
1986). Além disso, durante a vida reprodutiva das fêmeas, ocorre uma redução gradativa no
número de FOPA devido ao processo de ovulação ou morte folicular, uma vez que estes
representam
a
grande
totalidade
da
população
folicular
ovariana
(SHAW;
ORANRATNACHAI; TROUNSON, 2000).
2.4. A Biotécnica de MOIFOPA e suas Aplicações
A MOIFOPA, também conhecida como “Ovário artificial”, consiste no isolamento
ou resgate de FOPA a partir de ovários antes que estes entrem em atresia, visando à
criopreservação e/ou cultivo folicular na tentativa de promover o crescimento, a maturação e a
fecundação in vitro de oócitos derivados de FOPA crescidos in vitro (Figura 3)
(FIGUEIREDO et al., 2007). Esta biotécnica apresenta-se como uma excelente ferramenta
que permite acompanhar o crescimento de folículos ovarianos desde a fase pré-antral até a
fase antral, contribuindo dessa forma para um melhor entendimento acerca do funcionamento
do ovário (FIGUEIREDO et al., 2008).
Figura 3 - Ovário Artificial: obtenção de embriões a partir de folículos pré-antrais.
28
Atualmente a biotécnica de MOIFOPA tem auxiliado no desenvolvimento de
pesquisas fundamentais contribuindo para elucidação da foliculogênese inicial, através de
estudos que buscam testar o efeito de diferentes substâncias (matriz extracelular, hormônios e
fatores de crescimento), cujo efeito individual ou associado tem sido avaliado e/ou controlado
em diversos experimentos. Além disso, a MOIFOPA é de grande interesse para a reprodução
humana assistida, pois, além de evitar a utilização de intensas estimulações ovarianas em
programas de fecundação in vitro (HAIDARI; SALEHNIA; VALOJERDI, 2008) poderá ser
utilizada como alternativa para mulheres com riscos de falha ovariana precoce ou submetidas
a tratamentos que levem à infertilidade. O desenvolvimento de sistemas de cultivo in vitro de
FOPA poderá ser usado ainda para testes de toxicidade de substâncias que possam interferir
nos processos reprodutivos em mamíferos (FIGUEIREDO et al., 2008).
Em animais, apesar desta biotécnica ainda não ter aplicabilidade comercial, poderá
contribuir futuramente para o aumento da produtividade de animais de alto valor genético, ou
mesmo auxiliar na preservação de espécies ameaçadas de extinção. Somado a isso, contribuirá
significativamente para o bem-estar animal, por se tratar de um modelo exclusivamente in
vitro, pois representará uma alternativa aos procedimentos que fazem o uso de animais vivos
para experimentação (FIGUEIREDO et al., 2008).
2.5. Cultivo in vitro de Folículos Pré-Antrais
O desenvolvimento de sistemas de cultivo in vitro de FOPA que possibilitem a
obtenção de oócitos maduros fertilizáveis poderia revolucionar as diferentes biotécnicas
envolvidas com a reprodução assistida, pois a disponibilidade de oócitos ainda representa um
grande empecilho para o sucesso destas (TELFER et al., 2008). Em adição, oócitos obtidos a
partir do cultivo in vitro de FOPA podem ser utilizados para melhorar o potencial reprodutivo
de animais geneticamente superiores ou em vias de extinção, bem como auxiliar no
tratamento de infertilidade em humanos. Os sistemas de cultivo in vitro disponíveis para
FOPA incluem o cultivo de ovário inteiro (EPPIG; O'BRIEN, 1996), fragmentos do córtex
ovariano (SILVA et al., 2004a) e cultivo de folículos isolados (SARAIVA et al., 2010b)
conforme ilustrado na figura 4.
29
Figura 4 – Ilustração dos sistemas empregados para cultivo in vitro de folículos pré-antrais.
Através do cultivo in vitro de ovários inteiros, foi possível a obtenção de crias de
camundongos a partir de folículos primordiais desenvolvidos in vitro (O´BRIEN et al., 2003).
Apesar destes resultados satisfatórios em animais de laboratório, em animais domésticos não é
possível realizar o cultivo in vitro de ovários inteiros, devido às suas dimensões. Diante disso,
os sistemas de cultivo rotineiramente adotados são: o cultivo de FOPA inclusos no fragmento
ovariano (cultivo in situ) ou na forma isolada (cultivo isolado). Em adição, pode ainda ser
realizado um cultivo em dois passos, no qual é realizado primeiramente o cultivo in situ,
permitindo a ativação e desenvolvimento do folículo primordial até estágio de secundário,
para posteriormente ser isolado e cultivado até o estágio antral (TELFER et al., 2008).
O cultivo in vitro de pequenos fragmentos de córtex ovariano (cultivo in situ) onde
estão presentes principalmente folículos primordiais, tem por objetivo estudar a ativação
folicular, bem como o crescimento de folículos primários (SILVA et al., 2004a). Além da
praticidade, o cultivo de fragmentos de córtex ovariano tem a vantagem de manter o contato
celular e a integridade tridimensional dos folículos (ABIR et al., 1999, 2006). Utilizando o
cultivo in situ, nossa equipe testou os efeitos da adição e da concentração de diferentes
substâncias ao meio de cultivo conforme demonstrado na tabela 1.
30
Tabela 1 – Principais substâncias testadas no cultivo in situ pela equipe do LAMOFOPA.
SUBSTÂNCIA
AUTORES / ANO DE PUBLICAÇÃO
Ácido ascórbico
Ácido indol acético
Água de coco
Androstenediona
Ativina-A e Folistatina
BMP-15
BMP-6
BMP-7
EGF
Estradiol
FGF-10
FGF-2
FSH
GDF-9
KGF
KL
LH
Melatonina
NGF
Soro Fetal Bovino
VEGF
VIP
α-tocoferol
ROSSETTO et al., 2009
MATOS et al., 2006
SILVA et al., 2004b; MARTINS et al., 2005
LIMA-VERDE et al., 2010b
SILVA et al., 2006
CELESTINO et al., 2011a
ARAÚJO et al., 2010a
ARAÚJO et al., 2010b
SILVA et al., 2004a
LIMA-VERDE et al., 2010a
CHAVES et al., 2010a
MATOS et al., 2007b
MATOS et al., 2007a; MAGALHÃES et al., 2009a, 2009b
MARTINS et al., 2010
FAUSTINO et al., 2011
CELESTINO et al., 2010
SARAIVA et al., 2008
ROCHA et al., 2013
CHAVES et al., 2010b
BRUNO et al., 2008
BRUNO et al., 2009
BRUNO et al., 2010
LIMA-VERDE et al., 2009
Através de métodos mecânicos e/ou enzimáticos é possível isolar um grande número
de folículos pré-antrais intactos de diferentes espécies (vacas: FIGUEIREDO et al., 1993;
cabras: LUCCI et al., 1999; ovelhas: CECCONI et al., 1999; ratas: ZHAO, 2000;
camundongos fêmeas: PESTY et al., 2007) visando o cultivo in vitro de folículos isolados. Os
folículos isolados por sua vez podem ser cultivados em modelo bidimensional, no qual são
cultivados diretamente sobre a placa de cultivo ou sobre uma matriz, ou ainda em modelo
tridimensional (DEMEESTERE et al., 2005), no qual os folículos são totalmente inclusos em
uma matriz extracelular.
Utilizando o sistema de cultivo in vitro de FOPA isolados, nossa equipe de pesquisa
pôde verificar o efeito de diferentes tensões de oxigênio (SILVA et al., 2010), regime de troca
de meio (MAGALHÃES et al., 2011a), diferentes formas de cultivo in vitro de folículos
isolados (individual ou em grupo) (DUARTE et al., 2011), bem como o efeito da adição de
diferentes suplementos ao meio de cultivo, como albumina sérica bovina - BSA
(RODRIGUES et al., 2010) e ácido ascórbico (SILVA et al., 2011a). Além disso, foi avaliado
o efeito de hormônios como o FSH (SARAIVA et al., 2011), hormônio do crescimento - GH
(MAGALHÃES et al., 2011b) e LH (SILVA et al., 2011b), bem como de fatores de
31
crescimento tais como: o EGF (CELESTINO et al., 2011b), IGF-I (MAGALHÃESPADILHA et al., 2012), fator inibidor da leucemia - LIF (LUZ et al., 2012), KL (LIMA et al.,
2011), dentre outros.
Além dos resultados obtidos por nossa equipe, um notável progresso tem sido
observado no cultivo in vitro de FOPA em diferentes espécies nas ultimas décadas (ver
Capítulo I).
2.6. Importância da Composição do Meio de Cultivo in vitro Folicular
Para o cultivo in vitro de FOPA são utilizados diferentes meios comerciais, os quais
podem influenciar o desenvolvimento dos folículos ovarianos, estimulando a sobrevivência e
o crescimento folicular. Dentre os meios de cultivo de base comumente utilizados para FOPA,
destacam-se o Meio Essencial Mínimo (MEM) simples (ROSSETTO et al., 2009) ou alfamodificado (α-MEM – SARAIVA et al., 2010b), o Meio de Cultivo Tecidual 199 (TCM199 –
ITOH et al., 2002), e os meios Waymouth (MURUVI et al., 2005) e McCoy´s
(MCLAUGHLIN; TELFER, 2010). A composição do meio de base é fundamental para o
sucesso do cultivo in vitro de folículos ovarianos, e pode ser influenciada pela adição de
diferentes substâncias, tais como hormônios e fatores de crescimento (PICTON et al., 2008).
Dentre as substâncias adicionadas ao meio de cultivo in vitro de FOPA destaca-se o
soro, o qual é composto por proteínas, aminoácidos, carboidratos, hormônios, fatores de
crescimento e componentes da matriz extracelular (DEMEESTERE et al., 2005). Para suprir
as necessidades proteicas na ausência de soro, opta-se pela suplementação com albuminas
séricas purificadas, como a albumina sérica bovina (BSA), ao meio de cultivo in vitro
(PICTON et al., 2008), uma vez que a composição indefinida do soro pode mascarar efeitos
de outras substâncias adicionados ao mesmo.
O efeito estimulante de diversas substâncias presentes no meio de cultivo in vitro
pode acelerar o crescimento folicular além de gerar espécies reativas de oxigênio (EROs)
provenientes do metabolismo celular (THOMAS et al., 2001). O incremento de substâncias
antioxidantes ao meio de cultivo in vitro, como o ácido ascórbico, pode controlar a ação das
EROs e atuar sobre a foliculogênese, promovendo a redução da apoptose em FOPA
(MURRAY et al., 2001) e consequentemente manter a viabilidade folicular após cultivo de
longa duração (ROSSETTO et al., 2009; SILVA et al., 2011a). Além disso, a adição de
piruvato, glutamina, hipoxantina, insulina, transferrina e selênio tem proporcionado o
32
aumento no percentual de folículos morfologicamente normais cultivados in vitro e
estimulado o seu crescimento (DEMEESTERE et al., 2005).
A utilização de hormônios e fatores de crescimento no meio de cultivo folicular tem
proporcionado o desenvolvimento in vitro dos FOPA. Entretanto, os requerimentos
nutricionais destes folículos podem variar ao longo do seu desenvolvimento, necessitando de
diferentes substâncias em quantidades e momentos específicos. Tais substâncias podem ser
adicionadas ao cultivo isoladamente ou associadas, originando meios de cultivo nãodinâmicos (quando as substâncias são adicionadas simultaneamente em concentrações fixas)
ou dinâmicos (quando cada substância, ou combinação de substâncias, ou ainda,
concentrações distintas são adicionadas em momentos diferentes do cultivo para suprir as
necessidades específicas dos diferentes estágios foliculares). Nesse contexto, diversos autores
têm investigado os efeitos da concentração, momento de adição e associação ou não destas
substâncias (hormônios e fatores de crescimento), no cultivo in vitro de FOPA tanto de
animais de laboratório como em animais domésticos. Dentre estes fatores que atuam no
desenvolvimento dos folículos ovarianos, destacam-se o IGF-I, Insulina e FSH.
2.7. Fator de Crescimento Semelhante à Insulina 1 (IGF-I)
A regulação do funcionamento ovariano em mamíferos envolve a participação de
diferentes elementos que compõem o sistema de fatores de crescimento semelhantes à
insulina (IGF). Dentre estes elementos podem-se incluir os fatores I e II (IGF-I e IGF-II), os
receptores do tipo I e II (IGFR-I e IGFR-II) para os IGFs e uma superfamília de proteínas
transportadoras (IGFBPs) para esses fatores de crescimento (GIUDICE, 1992; LEROITH et
al., 1995). A biodisponibilidade e consequente ação dos IGF são reguladas em parte pelas
IGFBP, que se ligam aos IGF com grande afinidade, designadas de IGFBP-1 até IGFBP-6
(RAJARAM; BAYLINK; MOHAN, 1997). O IGF-I é um polipeptídeo composto por 70
aminoácidos, estruturalmente e funcionalmente relacionado à insulina, conhecido por sua
capacidade em promover o crescimento e a diferenciação celular podendo ser sintetizado em
diversos tecidos, nos quais exerce importantes funções autócrinas e parácrinas
(DAUGHADAY; ROTWEIN, 1989).
Os IGF (I e II) possuem dois tipos de receptores, IGFR-1 e IGFR-2. Esses receptores
são do tipo tirosina quinase transmembrana e possuem uma elevada homologia com o
receptor de insulina. O IGFR-1 é composto por duas subunidades extracelulares α e duas
33
subunidades β. A subunidade β é constituída por uma parte extracelular, um segmento
transmembranário e um domínio citoplasmático e, uma vez que esta subunidade é ativada, ela
promove a fosforilação de resíduos de tirosina do próprio receptor e de proteínas-substrato
associadas (IZADYAR et al., 1998).
Nos fluidos biológicos, as IGFBP estão presentes e atuam inibindo ou
potencializando a ação dos dois tipos de IGF nas células-alvo. A biodisponibilidade de IGF
pode ser aumentada por meio da atividade de enzimas específicas, as IGFBP proteases. Os
níveis de IGFBP no líquido folicular alteram-se drasticamente durante a foliculogênese
(MONGET et al., 1996). Essas proteínas intrafoliculares desempenham uma função-chave na
regulação do desenvolvimento folicular por modularem os IGF e, portanto, as ações das
gonadotrofinas (MONGET; MONNIAUX; DURAND, 1989). De forma geral, as IGFBP
possuem quatro funções essenciais na regulação das atividades dos IGF: 1) atuar como
proteínas de transporte no plasma; 2) prolongar a meia-vida dos IGF por regular sua
depuração metabólica; 3) modular diretamente a interação dos IGF com seus receptores e,
assim, indiretamente, controlar a sua biorreatividade conforme ilustrado na figura 5.
Figura 5 – Cascata de ativação das vias de sinalização MAPK e Pi3K sob ação do IGF-I.
1 – IGF-I e IGFBP disponível para conjugação; 2 – Conjugação IGF-I e IGFBP; 3 –
Transporte do complexo IGFI/IGFBP até IGFR-I; 4 – Liberação da IGFBP; 5 – Ativação da
via Pi3K e MAPK; 6 – Mediação dos processos de proliferação e sobrevivência folicular
pelas vias Pi3K e MAPK e diferenciação folicular pela MAPK.
Em um experimento realizado in vivo, Velazquez et al. (2009) observaram que o
IGF-I exerce importante função no desenvolvimento folicular, na qualidade oocitária, e no
34
posterior desenvolvimento embrionário em novilhas não superovuladas. O IGF-I desempenha
um papel essencial na reprodução de mamíferos, uma vez que foram observadas falhas na
atividade ovariana e no desenvolvimento embrionário em modelos de camundongos com
nocaute do gene para este fator (ELVIN; MATZUK, 1998). Em ovários de suínos e roedores,
o IGF-I tem sido localizado nas células da granulosa de folículos antrais saudáveis enquanto
que o IGF-II foi encontrado nas células da granulosa de folículos saudáveis e atrésicos
(ZHOU et al., 1996). Em ovinos, ambos os receptores de IGF estão presentes em células da
granulosa de folículos primários, secundários e antrais (MONGET; MONNIAUX; DURAND,
1989).
No cultivo in vitro de FOPA, o IGF-I estimulou o crescimento folicular em humanos
(LOUHIO et al., 2000), bovinos (GUTIERREZ et al., 2000), caprinos (MAGALHÃESPADILHA et al., 2012), ratos (ZHAO et al., 2001) e camundongos (LIU et al., 1998) em
sinergia com o FSH. Experimentos de Zhou e Zhang (2005) mostraram que o IGF-I na
concentração de 100 ng/mL proporcionou o crescimento e a viabilidade de oócitos inclusos
em FOPA caprinos. Na espécie bovina, a utilização de 50 ng/ml de IGF-I no cultivo de FOPA
por 6 dias promoveu o aumento do diâmetro folicular, bem como a produção de estradiol
(THOMAS et al., 2007). Nesta mesma espécie, o IGF-I na concentração de 10 ng/mL
promoveu o crescimento de pequenos folículos antrais in vitro e aumentou a viabilidade de
oócitos (WALTERS et al., 2006), além de ter estimulado a proliferação e a sobrevivência das
células da granulosa, prevenindo a apoptose (QUIRK et al., 2004). Em suínos, a utilização de
IGF-I (50 ng/mL) resultou no crescimento folicular, no estímulo da proliferação das células
da granulosa e na prevenção da apoptose de FOPA cultivados por 4 dias na presença de soro
(GUTHRIE; GARRETT; COOPER, 1998). Em camundongos, o IGF-I (10, 50 e 100 ng/mL)
aumentou a esteroidogênese de FOPA cultivados in vitro por 6, 10 e 12 dias (DEMEESTERE
et al., 2004). Melhores resultados foram obtidos com a utilização de IGF-I quando FOPA
caprinos foram cultivados in vitro na presença de FSH adicionado de insulina,
proporcionando melhorias significativas no desenvolvimento folicular e nas taxas de
recuperação oocitária além de aumentar a retomada da meiose (MAGALHÃES-PADILHA et
al., 2012).
35
2.8. Insulina
A insulina é um hormônio essencialmente envolvido na regulação da concentração
da glicose na circulação, além de promover o crescimento celular e o desenvolvimento de
uma ampla variedade de tipos celulares (FOULADI-NASHTA; CAMPBELL, 2006). Este
hormônio é produzido pelas células β das ilhotas de Langerhans no pâncreas em resposta aos
níveis plasmáticos de nutrientes, especialmente a glicose (SHULDINER et al., 1998). A
insulina pode ainda atuar sobre uma grande variedade de tecidos corporais, tais como fígado,
músculos, glândulas mamárias e ovário (SASAKI, 2002). Seu precursor é homólogo aos IGFI e IGF-II, podendo este se ligar aos receptores de insulina (SHULDINER et al., 1998). Desta
forma, a insulina pode atuar por meio dos receptores específicos de insulina, que estão
amplamente distribuídos nos ovários, pelos receptores do IGF-I ou ainda por receptores
híbridos, que contêm combinação das subunidades α e β dos receptores de insulina e IGF-I
(YARAK et al., 2005).
Apesar do desenvolvimento e crescimento folicular serem controlados por
gonadotrofinas hipofisárias (LH e FSH) e por fatores locais, como hormônios esteroides e
fatores de crescimento, a insulina também é crucial para o desenvolvimento folicular no
ovário de mamífero (SHIMIZU et al., 2008). Na foliculogênese inicial, a insulina tem ação na
manutenção da viabilidade e crescimento dos folículos primordiais e primários, e em baixas
concentrações pode aumentar os índices de formação de folículos primários (LOUHIO et al.,
2000). Este efeito pode ser devido ao papel da insulina em estimular o fator inibidor de
leucemia e Kit Ligand podendo, portanto, ser um corregulador no padrão de sinalização
controlando a transição de folículos primordiais para primários (VAN DEN HURK; ZHAO,
2005). Confirmando a atuação da insulina nesta transição, estudos in vitro têm mostrado que
este hormônio estimulou a formação de folículos primários em tecido ovariano cultivado em
diferentes espécies como humanos (LOUHIO et al., 2000), bovinos (YANG; FORTUNE,
2007) e murinos neonatais (KEZELE; NILSSON; SKINNER, 2002).
Na espécie bovina, concentrações fisiológicas (10 ng/mL) ou próximas à fisiológica
(20 ng/mL) de insulina estimularam o crescimento folicular e oocitário em FOPA isolados e
induziram uma alta porcentagem de formação de antro (> 60%) após 13 dias de cultivo
(MCLAUGHLIN et al., 2010; ITOH et al., 2002). Similarmente em ovinos, a insulina (10
ng/mL) suportou o desenvolvimento dos folículos secundários (ARUNAKUMARI;
SHANMUGASUNDARAM; RAO, 2010). Em caprinos, FOPA cultivados in situ ou isolados
36
mecanicamente apresentaram maior crescimento e sobrevivência com a utilização de 10
ng/mL de insulina (CHAVES et al., 2011). Jewgenow et al. (1998) mostraram também que a
adição de insulina como componente do ITS (Insulina-Transferrina-Selênio) ao meio de
cultivo, bem como de outras substâncias como piruvato, glutamina e hipoxantina foi essencial
para o crescimento de FOPA felinos in vitro. Recentes estudos em bovinos revelaram que a
utilização de ITS como componente do meio de base estimulou a ativação folicular já no
segundo dia de cultivo, enquanto que em meios sem insulina os folículos permaneceram no
estágio primordial por 10 dias de cultivo (SMITZ et al., 2010). Além disso, em suínos e
bovinos, a insulina aumentou o recrutamento de folículos responsivos às gonadotrofinas,
reduziu a atresia folicular e atuou como um sinalizador metabólico, influenciando a liberação
de LH pela hipófise (MONGET; MARTIN, 1997).
A insulina tem efeito direto em células ovarianas cultivadas, exercendo uma ação
específica em células da granulosa não luteinizadas através do aumento da estimulação do
FSH para produção de estrógeno e progesterona (BHATIA; PRICE, 2001). Além disso, a
insulina e o LH sistêmicos estimularam a formação de andrógenos tecais em folículos
secundários que induzem a formação de receptores para FSH na granulosa (VAN DEN
HURK; ZHAO, 2005).
2.9. Hormônio Folículo Estimulante (FSH)
O FSH é uma glicoproteína sintetizada e secretada pelas células gonadotróficas na
hipófise anterior (BROWN; MCNEILLY, 1999) regulada pelo hormônio liberador de
gonadotrofinas (GnRH), bem como por substâncias esteroidais e não-esteroidais produzidas
nas gônadas (BERNARD et al., 2010). No ovário, o FSH atua via receptor de FSH (FSH-R),
localizados no oócito (MÉDURI et al., 2002), bem como nas células da granulosa
(GUDERMANN; NURNBERG; SCHULTZ, 1995). A interação do FSH com o seu receptor
(FSH-R) ativa a proteína-G, promovendo a conversão de guanosina difosfato (GDP) em
guanosina trifosfato (GTP), que se liga à subunidade α da proteína G, estimulando a
adenilciclase (AC) a gerar AMP cíclico (cAMP) conforme demonstrado na figura 6
(HILLIER; KITCHNER; NEILSON, 1996). Este evento gera uma cascata de reações
intracelulares que pode desencadear diversas respostas celulares, tais como a regulação do
crescimento e diferenciação gonadal, da esteroidogênese e gametogênese, regulando, por
conseguinte, o ciclo estral ou menstrual em fêmeas mamíferas (HUNZICKER-DUNN;
37
MAIZELS, 2006) além de estimular a expressão de diversos fatores de crescimento (VAN
DEN HURK; ZHAO, 2005). Estudos recentes demonstraram que a adição de FSH ao meio de
cultivo in vitro tem a capacidade de estimular a expressão de RNAm para recepetores de IGFI em FOPA caprinos (MAGALHÃES-PADILHA et al., 2012).
Figura 6: Esquema ilustrativo da atuação do FSH via receptor. Adaptado de SARAIVA et al.,
2010a.
Em bovinos, a adição de FSH ao meio de cultivo in vitro de FOPA proporcionou o
aumento do diâmetro folicular (HULSHOF et al., 1995) e aumento dos níveis de progesterona
e estradiol (WANDJI; EPPIG; FORTUNE, 1996) melhorando as taxas de sobrevivência
folicular. Nesta mesma espécie, Gutierrez et al. (2000), observaram que o FSH promoveu o
crescimento de folículos secundários e aumentou as taxas de formação de antro após 28 dias
de cultivo. Além disso, Itoh et al. (2002) verificaram que o FSH estimulou o crescimento de
oócitos de FOPA bovinos cultivados in vitro.
Em caprinos, a adição de FSH ao meio de cultivo de FOPA inclusos em tecido
ovariano foi responsável pela preservação da viabilidade folicular, aumento do diâmetro
folicular, bem como pela manutenção da integridade ultraestrutural dos folículos após 7 dias
de cultivo (MATOS et al., 2007a). Quanda avaliado a origem do FSH (pituitário ou
recombinante) verificou-se que o FSH recombinante (FSHr) foi mais eficiente do que FSH
porcino na concentração de 50 ng/mL em promover a ativação e crescimento dos folículos
primordiais mantendo a integridade ultraestrutural após 7 dias de cultivo in vitro
(MAGALHÃES et al., 2009b).
38
No que se refere à utilização do FSH no cultivo in vitro de FOPA isolados,
Rodrigues et al. (2010) verificaram que o FSH, na presença de 10% de soro fetal bovino, teve
um importante papel no crescimento de FOPA de caprinos e ovinos, após 18 dias de cultivo.
Além disso, Saraiva et al. (2011) demonstraram que a utilização de concentrações crescentes
de FSH (100 ng/mL até o dia 6, 500 ng/mL até o dia 12 e 1000 ng/mL até o dia 18 de cultivo)
melhorou o desenvolvimento in vitro de FOPA caprinos. A partir deste estudo, nossa equipe
de pesquisa do LAMOFOPA, incorporou o FSH sequencial como um dos componentes do
meio de base para o cultivo in vitro de FOPA caprinos isolados. Na presente tese, a forma de
adição do FSH (fixa ou sequencial) ao cultivo in vitro de FOPA bovinos foi testada e
adaptada as concentrações comumente utilizadas para a espécie bovina conforme
demonstrado na tabela 2.
39
40
2.10. Técnicas de Avaliação da Viabilidade e Crescimento Folicular in vitro
Diferentes técnicas são empregadas visando avaliar os sistemas de cultivo in vitro de
FOPA uma vez que podem monitorar as alterações ocorridas na estrutura e funcionalidade
folicular durante o cultivo. Dentre elas, destacam-se a histologia clássica, a microscopia
eletrônica de transmissão, a microscopia de fluorescência e dosagem de hormônios esteroides.
2.10.1. Histologia Clássica
A histologia clássica compreende as etapas de fixação, desidratação, diafanização ou
clarificação, infiltração, inclusão, microtomia e coloração das lâminas. Ao término desse
processo é possível observar sob microscópio óptico tanto folículos isolados como aqueles
inclusos no córtex ovariano. Essa técnica constitui, portanto, uma importante ferramenta para
avaliar a morfologia de FOPA frescos, criopreservados e/ou cultivados in vitro. Através da
análise das lâminas obtidas é possível identificar o processo de ativação folicular, observar o
crescimento folicular e oocitário e a manutenção da morfologia folicular normal de forma
quantitativa (MATOS et al., 2007c). No entanto, quando se deseja avaliar a qualidade do
folículo, recomenda-se utilizar a histologia clássica associada a outras técnicas mais
sofisticadas, como por exemplo, a microscopia eletrônica de transmissão, que permite avaliar
com precisão a integridade das membranas celulares, bem como as características de
importantes organelas citoplasmáticas.
2.10.2. Microscopia Eletrônica de Transmissão (MET)
Outra ferramenta essencial para determinar a qualidade folicular é a MET que
permite o estudo detalhado da ultraestrutura do folículo ovariano (NOTTOLA et al., 2011). A
MET possibilita a avaliação das organelas celulares e das mudanças ultraestruturais
(SALEHNIA; MOGHADAM; VELOJERDI, 2002) ocorridas nas células foliculares durante o
cultivo in vitro, sendo um método preciso e eficiente para avaliar a viabilidade de FOPA.
Utilizando a MET, importantes organelas, como mitocôndrias, retículo endoplasmático,
membranas plasmática e nuclear, podem ser avaliadas com sucesso em diferentes tipos
celulares dos FOPA (CASTRO et al., 2011; CELESTINO et al., 2011a).
41
2.10.3. Microscopia de Fluorescência
A avaliação da viabilidade celular, através da microscopia de fluorescência, pode ser
realizada utilizando marcadores específicos, como a calceína AM e etídio homodímero-1.
Esses marcadores conferem uma marcação dupla, identificando simultaneamente células
viáveis (marcadas em verde) e não viáveis (marcadas em vermelho), respectivamente (LOPES
et al., 2009). O marcador fluorescente etídio homodímero-1 é utilizado para verificar a
integridade da membrana plasmática (SANTOS et al., 2007), enquanto a calceína-AM resulta
em um produto fluorescente após ser clivada por enzimas esterases em células vivas (DE
CLERCK et al., 1994). Após confecção da amostra, os sinais fluorescentes para calceína-AM
e etídio homodímero-1 são coletados a 488 e 568 nm, respectivamente. Além disso, a
microscopia de fluorescência tem sido amplamente empregada para avaliar a configuração da
cromatina de oócitos crescidos in vivo e in vitro através do marcador Hoescht 33342 (KIM et
al., 2005; SILVA et al., 2011b). O sinal fluorescente para este marcador é coletado a 568 nm,
após penetrar em células vivas e se intercalar entre as bases nitrogenadas do DNA.
A análise por microscopia de fluorescência tem sido empregada com sucesso para
avaliar a viabilidade folicular e/ou oocitária após criopreservação (CARVALHO et al., 2011),
bem como após o cultivo in vitro de FOPA em diferentes espécies (felinos: JEWGENOW;
STOLTE, 1996; caninos: SERAFIM et al., 2010; caprinos: SILVA et al., 2011b; bovinos:
GUTIERREZ et al., 2000; ovinos: LUZ et al., 2012).
2.10.4. Dosagem Hormonal
A dosagem de hormônios esteroides também tem sido uma ferramenta importante para
analisar a funcionalidade das células foliculares. De acordo com Walters, Allan e Handelsma
(2008), alterações nos níveis de esteroides intrafoliculares podem ser importantes para
determinar o destino folicular, bem como a resposta individual de folículos ovarianos em
diferentes fases de desenvolvimento. Em bovinos, a atresia folicular tem sido comumente
associada a baixos níveis de estradiol e elevados níveis de progesterona no fluido folicular
(JOLLY et al., 1994).
De acordo com Logan, Juengel e McNatty (2002), as células foliculares são capazes
de produzir os primeiros esteroides imediatamente antes da formação de antro, momento em
que aparece a expressão da proteína STAR, das enzimas esteroidogênicas, 17α-hidroxilase, 3-
42
β-hidroxiesteroidedesidrogenase e aromatase P450, bem como de receptores para LH. Neste
momento, os folículos, além de apresentar o RNAm para enzimas esteroidogênicas,
expressam a proteína correspondente, que pode estar localizada nas células da teca e/ou da
granulosa (SCARAMUZZI et al., 1993). Acredita-se que após a expressão das enzimas
esteroidogênicas, os andrógenos sintetizados nas células da teca são transportados para as
células da granulosa, onde são convertidos em estradiol (E2) através da enzima aromatase
P450 (YOUNG; MCNEILLY, 2010).
Em pequenos FOPA já foi relatada a produção de E2, porém nesta fase de
desenvolvimento folicular a quantidade de substratos para síntese de andrógenos ainda é
reduzida, o que limita a aromatização do E2 (DRUMMOND; FINDLAY, 1999). No entanto,
em FOPA avançados (secundários) cultivados in vitro, tem sido verificada a produção de
estradiol em diversas espécies (ovinos: CECCONI et al., 1999; humanos: TELFER et al.,
2008; bovinos: MCLAUGHLIN et al., 2010).
Na fase antral, os folículos sintetizam estradiol em grandes quantidades, sendo este
evento essencial para a manutenção da sobrevivência folicular (DRIANCOURT, 2001). Além
disso, na maioria das espécies de mamíferos, o E2 está envolvido no processo de maturação
do oócito (KIM et al., 2005). Em estudos prévios, foi demonstrado que as células do cumulus
podem secretar estradiol durante o cultivo em meio livre de hormônios esteroides em suínos
(DODE; GRAVES, 2002), humanos (CHIAN et al., 1999) e bovinos (MINGOTI; GARCIA;
ROSA-E-SILVA, 2002). Estes resultados suportam a hipótese de que o estradiol exerce um
efeito positivo sobre a maturação do oócito, podendo atuar indiretamente, através das células
do cumulus, ou diretamente sobre o oócito (DODE; GRAVES, 2003).
43
3. JUSTIFICATIVA
Sabendo que o ovário dos mamíferos contém milhares de oócitos inclusos em FOPA
e que poucos destes desenvolvem-se até o estádio de folículo pré-ovulatório, seria de grande
importância o melhor aproveitamento do potencial ovariano, sobretudo de animais de
produção, como os bovinos. Neste contexto, a biotécnica de MOIFOPA surge como uma
valiosa alternativa para recuperar, preservar e cultivar in vitro um grande número de FOPA,
promovendo o desenvolvimento oocitário até estarem aptos a serem maturados e fecundados
in vitro. Grandes avanços no cultivo in vitro de FOPA têm sido conquistados nos últimos
anos, em diversas espécies, resultando no aumento da disponibilidade oocitária e consequente
incremento da produção embrionária. No entanto, os melhores resultados utilizando FOPA se
restringem a animais de laboratório, com o nascimento de crias viáveis (O'BRIEN et al.
2003). Em ruminantes domésticos como caprinos, por exemplo, melhorias significativas têm
sido obtidas por nossa equipe, a qual conseguiu pela primeira vez no mundo a produção de
embriões a partir de oócitos oriundos de FOPA crescidos in vitro (SARAIVA et al., 2010b).
Diante dos bons resultados obtidos em caprinos, a realização de um estudo
comparativo, que permita a aplicação de um protocolo bem sucedido nesta espécie em
bovinos, com a adição de substâncias de efeito estimulatório em ambas as espécies como o
IGF-I, poderá acelerar o avanço nas pesquisas, uma vez que em bovinos os resultados
alcançados ainda são discretos, restringindo-se à formação de antro. Considerando a grande
relevância econômica que a espécie bovina representa para várias regiões do mundo,
especialmente para o Brasil que detém a maior produtividade de animais provenientes
embriões FIV, é de extrema importância o desenvolvimento de um sistema de cultivo in vitro
capaz de manter a viabilidade e o crescimento de FOPA, otimizando a utilização do potencial
oocitário destes animais e incrementando a sua eficiência reprodutiva. Assim, oócitos
oriundos destes folículos poderiam ser destinados à produção in vitro de embriões e a
clonagem, contribuindo para a multiplicação de animais de alto valor zootécnico e/ou em vias
de extinção, e ainda para constituição de bancos de germoplasma animal.
Somado a isto, o desenvolvimento de um sistema de cultivo in vitro eficiente
também poderá fornecer subsídios para uma melhor compreensão da foliculogênese na fase
pré-antral, importante para garantir a sobrevivência e o crescimento folicular. Na busca por
um eficiente sistema cultivo de FOPA, diversos pesquisadores têm utilizado diferentes meios
de base para investigar o efeito de hormônios e fatores de crescimento. Entretanto, até o
44
momento da idealização do projeto de tese, não havia sido testada a influência da composição
do meio de base em uma mesma condição experimental para obtenção de um meio
padronizado e eficiente. Além disso, substâncias comumente utilizadas no cultivo de FOPA
bovinos, como a insulina e o FSH, sofrem variações em suas concentrações entre diferentes
equipes de pesquisa não havendo uma definição para a concentração ideal de insulina nem da
forma de adição de FSH, isto é, fixa ou em concentrações crescentes que, sozinhas ou
associadas, estimulem o desenvolvimento folicular.
Dessa forma, na presente tese, foram utilizadas as técnicas de dosagem hormonal,
microscopia eletrônica de transmissão e microscopia de fluorescência, a fim de determinar a
qualidade dos FOPA bovinos cultivados in vitro e, consequentemente, melhor avaliar a
eficiência dos meios de cultivo testados. Assim, foi possível estabelecer estratégias para
melhorar o desenvolvimento folicular in vitro, através da adição de componentes específicos
em momentos ideais do cultivo.
45
4. HIPÓTESE CIENTÍFICA
 O meio de cultivo de FOPA desenvolvido para caprinos pode ser utilizado com sucesso
para FOPA bovinos isolados.
 A adição de IGF-I melhora o desenvolvimento in vitro de FOPA caprinos e bovinos
 O tipo de meio de cultivo de base (α-MEM, McCoy ou TCM199) afeta positivamente o
desenvolvimento in vitro de FOPA bovinos isolados cultivados in vitro.
 A concentração de insulina bem como a forma de adição de FSH (forma fixa ou em
concentrações crescentes), influenciam positivamente o desenvolvimento in vitro de FOPA
bovinos isolados.
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5. OBJETIVO
5.1. Objetivo Geral
 Avaliar o efeito do protocolo experimental desenvolvido para caprino, do meio de cultivo
de base, da concentração de Insulina e do modo de adição de FSH sobre o desenvolvimento in
vitro de FOPA bovinos isolados.
5.2. Objetivos Específicos
 Aplicar na espécie bovina um protocolo experimental desenvolvido para caprinos,
verificando sua eficácia em manter a sobrevivência folicular, estimular a formação de antro e
o crescimento de FOPA após 18 dias de cultivo.
 Avaliar os efeitos de diferentes meios de cultivo de base (α-MEM, McCoy e TCM199)
sobre a viabilidade, formação de antro, crescimento folicular e manutenção da ultraestrutura
de FOPA bovinos isolados e cultivados in vitro por 16 dias.
 Investigar os efeitos da adição de diferentes concentrações de insulina (5 ng/mL, 10
ng/mL, 5 µg/mL e 10 µg/mL) sobre a viabilidade, formação de antro e crescimento folicular
de FOPA bovinos isolados e cultivados in vitro por 18 dias.
 Verificar a influência do FSH, adicionado de forma fixa (100 ng/mL) ou em concentrações
crescentes (D0-D6: 1 ng/mL; D6-D12: 10 ng/mL; D12-D18: 100 ng/mL) sobre a viabilidade,
morfologia, formação de antro, crescimento, ultraestrutura e secreção hormonal em FOPA
bovinos isolados e cultivados in vitro por 18 dias.
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6. CAPÍTULO 1
Avanços no isolamento e sistemas de cultivo de folículos pré-antrais
Advances in isolation and culture systems of preantral follicles
Periódico: Acta Veterinaria Brasilica, v.5, n.1, p.15-23, 2011.
48
Resumo
Os folículos pré-antrais presentes no córtex ovariano representam cerca de 95% de toda a
população folicular e podem ser crescidos e maturados in vitro, visando a obtenção posterior
de oócitos maturos e competentes, os quais poderão ser utilizados nas diversas biotécnicas da
reprodução aplicadas aos animais domésticos. Os estudos relacionados com a foliculogênese
podem ser feitos in vivo, através da análise de expressão de genes ou proteínas que estão
presentes no ovário, e ainda in vitro com a utilização de diferentes sistemas, onde os folículos
podem ser cultivados in situ ou isolados. Deste modo, neste trabalho foram abordados os
diferentes métodos de isolamento e sistemas de cultivo in vitro empregados para a
manutenção da integridade estrutural e desenvolvimento de folículos pré-antrais.
Palavras-Chave: Biotécnicas, desenvolvimento, foliculogênese.
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7. CAPÍTULO 2
Estudo comparativo do desenvolvimento in vitro de folículos
pré-antrais caprinos e bovinos
Comparative study on the in vitro development of caprine and bovine preantral follicles
Periódico: Small Ruminant Research (in press)
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Resumo
O objetivo deste estudo foi verificar se o meio de cultivo in vitro (CIV) de folículos préantrais (≥ 150 µm de diâmetro) caprinos é eficiente para bovinos. Folículos pré-antrais de
caprinos e bovinos foram cultivados durante 18 dias na ausência ou presença de 50 ng/ml de
IGF-I. Os folículos foram classificados de acordo com características morfológicas, e aqueles
que apresentavam sinais de degeneração tais como o escurecimento do oócito e das células do
cumulus ou com oócitos disformes foram classificados como degenerados. Os diâmetros
oocitário e folicular foram mensurados apenas nos folículos saudáveis e a formação de
cavidade antral foi definida como uma cavidade visível translúcida no interior das camadas de
células da granulosa. Em relação ao crescimento folicular, o aumento diário do diâmetro
folicular foi calculado, e a extrusão do oócito foi determinada pelo cálculo das taxas de
ruptura da membrana basal com a saída dos complexos cumulus oócito (COCs). Após CIV, os
oócitos foram submetidos à maturação in vitro (MIV) e análise de viabilidade utilizando
marcadores fluorescentes. O IGF-I não afetou a sobrevivência folicular e formação de antro
em ambas as espécies. No entanto, a extrusão folicular e maturação oocitária foram obtidas
apenas em caprinos. Assim, pode-se dizer que, apesar de folículos pré-antrais bovinos e
caprinos reagirem de forma diferente às mesmas condições de cultivo, este estudo mostrou
que foi obtido sucesso no desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais caprinos.
Sugerimos também o enriquecimento do meio de CIV e o aumento do período de CIV para
folículos pré-antrais bovinos.
Palavras-chave: cultivo in vitro, bovinos, caprinos, folículos ovarianos
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8. CAPÍTULO 3
Efeito da composição do meio sobre o cultivo in vitro de folículos pré-antrais bovinos:
morfologia e viabilidade não garante funcionalidade
Effect of medium composition on the in vitro culture of bovine pre-antral follicles:
morphology and viability do not guarantee functionality
Periódico: Zygote, p.1-4, 2012.
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Resumo
Este estudo investigou o efeito de três diferentes meios de cultivo de base (α-MEM, McCoy
ou TCM199) durante o cultivo in vitro (CIV) de folículos pré-antrais bovinos isolados.
Folículos pré-antrais superiores a 150 µm foram isolados e cultivados por 0 (controle), 8 ou
16 dias, em um dos meios de cultivo acima mencionados. Os folículos foram avaliados quanto
à sobrevivência, crescimento e formação de antro nos dias 8 e 16. Os resultados mostraram
que TCM199 foi o meio mais adequado para preservar viabilidade folicular e ultra-estrutura,
resultando em maiores taxas de formação de antro. Em conclusão, o TCM199 promoveu o
desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais isolados, sem prejudicar a funcionalidade
folicular, sustentando o crescimento in vitro e a formação de antro.
Palavras-Chave: Antro, CIV, Folículo pré-antral ovariano, Ultraestrutura e Viabilidade
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9. CAPÍTULO 4
Influência da concentração de insulina e do modo de adição de FSH sobre a sobrevivência e
desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais isolados de bovinos
Influence of insulin concentration and mode of FSH addition on the in vitro survival and
development of isolated bovine preantral follicles
Periódico: Research in Veterinary Science (artigo submetido)
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Resumo
Os efeitos da concentração de insulina (experimento 1) e do modo de adição de FSH, fixo ou
em concentrações crescentes (experimento 2) sobre a sobrevivência e o desenvolvimento in
vitro de folículos pré-antrais bovinos foram investigados neste estudo. Para ambos os
experimentos, folículos pré-antrais isolados de bovinos foram cultivados por 18 dias, quer
sobre uma superfície plástica (sistema bidimensional - experimento 1) ou encapsulado numa
matriz de alginato (sistema tridimensional - experimento 2). No experimento 1, os folículos
pré-antrais foram cultivados na ausência ou presença de insulina (5 ng/ml, 10 ng/mL, 5
µg/mL ou 10 µg/mL). No experimento 2, a melhor concentração de insulina (10 ng/mL)
obtida no experimento 1 foi usada em associação com o FSH adicionado de forma fixa (100
ng/mL - FSH 100) ou em concentrações crescentes (D0-D6: 1 ng/mL; D6-D12: 10 ng/mL;
D12-D18: 100 ng/mL - FSH Seq). No dia 18, a adição de insulina em todas as concentrações
testadas promoveu um aumento significativo nas taxas de sobrevivência folicular quando
comparadas ao controle, com o tratamento 10 ng/mL de insulina mostrando valores
significativamente mais elevados do que os outros tratamentos. A adição de 5 e 10 ng/mL de
insulina promoveu um maior crescimento folicular quando comparados ao controle e aos
demais tratamentos. O tratamento FSH 100 apresentou percentagem significativamente
superior de viabilidade folicular quando comparado ao controle e ainda apresentou folículos
com diâmetros significativamente superiores ao controle e ao FSH Seq. Os níveis de estradiol
na presença de FSH (concentração fixa) foram significativamente mais elevados do que os
demais tratamentos. Em conclusão, a associação de insulina (10 ng/mL) e FSH (100 ng/mL)
proporcionou elevadas taxas de sobrevivência e de crescimento de folículos pré-antrais
bovinos.
Palavras-chave: cultivo in vitro, bovino, folículo pré-antral, insulina, FSH
72
INFLUENCE OF INSULIN CONCENTRATION AND MODE OF FSH ADDITION
ON THE IN VITRO SURVIVAL AND DEVELOPMENT OF ISOLATED BOVINE
PREANTRAL FOLLICLES
[Influência da concentração de insulina e do modo de adição de FSH sobre a sobrevivência e
desenvolvimento in vitro de folículos pré-antrais isolados de bovinos]
Rafael Rossetto1*, Márcia Viviane Alves Saraiva2, Marcelo Picinin Bernuci3, Gerlane
Modesto Silva1, Isadora Machado Teixeira Lima1, Ivina Rocha Brito1, Anelise Maria
Costa Vasconcelos Alves1, Cláudio Afonso Pinho Lopes1, Janete Aparecida AnselmoFranci4, Marcos Felipe Silva Sá4, Sônia Nair Báo5, Cláudio Cabral Campello1, Ana
Paula Ribeiro Rodrigues1, José Ricardo Figueiredo1
1
Laboratory of Manipulation of Oocytes and Preantral Follicles, Faculty of Veterinary
Medicine, State University of Ceara, Fortaleza, CE, Brazil; 2Biotechnology Nucleus of
Sobral, Federal University of Ceara, Sobral, CE, Brazil; 3Department of Gynecology and
Obstetrics, Faculty of Medicine of Ribeirao Preto, University of São Paulo, Ribeirao Preto,
SP, Brazil; 4Department of Morphology, Stomatology and Physiology, Faculty of Dentistry of
Ribeirao Preto, University of Sao Paulo, Ribeirao Preto, SP, Brazil; 5Laboratory of Electron
Microscopy, Department of Cell Biology, University of Brasilia, Brasilia, DF, Brazil
ABSTRACT
The effects of insulin concentration (experiment 1) and the influence of both fixed and
increasing concentrations of FSH (experiment 2) on the in vitro survival and development of
bovine preantral follicles were investigated in this study. For both experiments, isolated
bovine preantral follicles were cultured for 18 days either on a plastic surface (twodimensional culture system – experiment 1) or encapsulated in an alginate-based matrix
(three-dimensional culture system – experiment 2). In experiment I, preantral follicles were
cultured in the absence or the presence of insulin (5 ng/mL, 10 ng/mL, 5 µg/mL or 10
µg/mL). In experiment 2, the optimal insulin concentration (10 ng/mL) from experiment 1
was used in association with FSH at fixed (100 ng/mL – FSH 100) or increasing
concentrations (D0-D6: 1 ng/mL; D6-D12: 10 ng/mL; D12-D18: 100 ng/mL – FSH Seq). At
73
day 18, the addition of insulin at all concentrations promoted follicular survival rates
significantly higher than that of the control, with 10 ng/mL insulin treatment showing values
significantly higher than the other treatments. The addition of 5 and 10 ng/mL insulin
promoted higher follicular growth than the control and other treatments. Compared to the
control, FSH 100 had a higher percentage of follicular viability. FSH 100 produced follicle
diameters significantly higher than those of the control and FSH Seq. Estradiol levels in the
presence of FSH (fixed concentration) were significantly higher than the other treatments. In
conclusion, the association of insulin (10 ng/mL) and FSH (100 ng/mL) provides high rates of
survival and growth for bovine preantral follicles.
Key Words: in vitro culture, bovine, preantral follicle, insulin, FSH
1. Introduction
The process of early follicular development is mainly regulated by the interaction of
factors produced in the ovaries and gonadotropins (Gougeon, 1996). In recent years, the role
of FSH in preantral folliculogenesis has been widely studied, characterizing the effects of
FSH on follicular survival and growth in vitro (Matos et al., 2007; Magalhães et al., 2009).
Studies have suggested that hormones related to cell metabolism, such as insulin, are also
essential during ovarian folliculogenesis in mammals (Shimizu et al., 2008).
Insulin is a common constituent of the culture medium for isolated bovine preantral
follicles, with concentrations varying among authors (10 ng/mL-Fiona et al., 2000; Gutierrez
et al., 2000; Thomas et al., 2001; Thomas et al., 2007; McLaughlin and Telfer, 2010;
Rossetto et al., 2012; 20 ng/mL - Itoh et al., 2002; 5 µg/mL-Wandji et al., 1996; 6.25 µg/mLHulshof et al., 1995; Saha et al., 2000; Yang and Fortune 2007; 6.7 mg/mL-Van Den Hurk et
al., 1998). The interaction between various concentrations of insulin and FSH has been
examined, achieving satisfactory results. Combined with insulin, increasing concentrations of
FSH added during an in vitro culture were essential to the development of preantral follicles
obtained from embryos in goats (Saraiva et al., 2010). In cattle, Gutierrez et al. (2000)
showed that media containing insulin and FSH enabled the growth and antrum formation of
isolated preantral follicles in a long-term culture. To support the in vitro development and
maintain the follicle viability, three-dimensional cultures (3D systems) have been developed
(Xu et al., 2009). The 3D system provides a valuable in vitro model for studying the
74
regulation of the folliculogenesis process involving complex interactions among the growth
factors and hormones, assuring the maintenance of the architecture and preserving the
interactions between the cells. In the mouse, Xu et al. (2006) reported the production of viable
offspring after the in vitro growth, maturation and fertilization of oocytes that included the
preantral follicle embedded into an alginate matrix (3D system).
Even with the known importance of FSH and insulin for both in vivo and in vitro
folliculogenesis (at least for the in vitro culture of bovine preantral follicles), little attention
has been paid to the selection of appropriate insulin concentrations and the mode of FSH
addition. The aim of the present study was to determine, for the first time, the effect of insulin
concentrations on the in vitro culture of isolated bovine preantral follicles and to evaluate the
influence of the mode of FSH addition (fixed and increasing FSH concentrations) on the
survival, growth and hormone production of isolated bovine preantral follicles cultured in a
three-dimensional system.
2. Materials and methods
2.1. Source of ovaries
Ovaries (n=44) were collected from adult cross-bred cows from a local
slaughterhouse to perform the experiments. Some of the ovaries (n=26) were used in
Experiment 1, with the remaining (n=18) used in Experiment 2. Immediately after slaughter,
the ovaries were washed with 70% alcohol for 10 s, followed by two washes in Minimum
Essential Medium - MEM (Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA) buffered with HEPES
(MEM–HEPES) and supplemented with penicillin (100 µg/mL) and streptomycin (100
µg/mL). The ovaries were then transported at 4°C to the laboratory within one hour.
2.2. Preantral follicle isolation and selection
For the follicle isolation, the ovaries were subjected to a microdissection procedure,
as previously described by Silva et al. (2010). Briefly, fine fragments of the ovarian cortex
(1–2 mm thick) were obtained using a sterile scalpel blade. The ovarian cortex slices were
placed in a fragmentation medium consisting of HEPES-buffered MEM. Bovine preantral
follicles exceeding 150 µm in diameter were visualized under a stereomicroscope (SMZ 645
75
Nikon, Tokyo, Japan) and manually dissected from strips of the ovarian cortex using 26gauge (26 G) needles. After isolation, follicles were transferred to 100 µL drops containing
fresh medium under mineral oil to further evaluate the follicular quality. Follicles with a
visible oocyte that were surrounded by granulosa cells with an intact basement membrane and
without an antral cavity were selected for culture.
2.3. Morphological evaluation of follicular development
On days 0, 6, 12 and 18 of culture, the follicles were evaluated and classified
according to the presence or the absence of an antral cavity, which was defined as a visible
translucent cavity within the granulosa cell layers. Follicular diameters were measured only in
healthy follicles using the mean of two perpendicular measurements of each follicle with an
ocular micrometer (100x magnification) inserted into a stereomicroscope (SMZ 645 Nikon,
Tokyo, Japan).
2.4. Experiment 1: Two-dimensional in vitro culture of bovine preantral follicles using
multiple concentrations of insulin
The selected follicles were individually cultured in 96-well plates (Corning Life
Sciences - California, USA) containing 150 µL of medium per well for 18 days at 38.5°C
with 5% CO2 in air. The base medium consisted of TCM199 supplemented with HEPES, 1%
bovine serum albumin (BSA, MP Biomedicals, Solon - USA), 3 mM glutamine (Sigma
Chemical Co., St Louis, MO, USA), 2.5 µg/mL transferrin (Sigma Chemical Co., St Louis,
MO, USA), 4 ng/mL selenium (MP Biomedicals, Solon - USA), 50 µg/mL ascorbic acid
(Sigma Chemical Co., St Louis, MO, USA), 100 ng/mL activin-A (Cell Science - USA) and
antibiotics (0.1 mg/L penicillin and 0.1 mg/L streptomycin) (Sigma Chemical Co., St Louis,
MO, USA). The base medium was used as a control or supplemented with insulin (Sigma
Chemical Co., St Louis, MO, USA) at concentrations of 5 ng/mL, 10 ng/mL, 5 µg/mL and 10
µg/mL.
2.4.1. Assessment of follicular viability by confocal microscopy
76
At the end of the culture period (day 18), the follicles were incubated in 100 µL DPBS containing 4 µmol/L calcein-AM and 2 µmol/L ethidium homodimer-1 (Molecular
Probes, Invitrogen, Karlsruhe, Germany) for 15 min at 37°C (Saraiva et al., 2010). After the
exposure to the fluorescent markers, the follicles were washed in D-PBS and mounted on
slides with coverslips for observation by laser confocal microscope using a LSM 710
microscope (Zeiss, Oberkochen, Germany). The emitted fluorescent signals of calcein-AM
and ethidium homodimer-1 were collected at 514 and 617 nm, respectively. Oocytes and
granulosa cells were considered to be alive with the cytoplasm stained positively for calceinAM (green) and without chromatin labeled with ethidium homodimer-1 (red). The images
were obtained and analyzed using the ZEN 2008 software.
2.5. Experiment 2: Three-dimensional in vitro culture of bovine preantral follicles using fixed
and increasing FSH concentrations.
For experiment 2, the optimal treatment determined from experiment 1 was used as
the basic medium, and the follicles were cultured in an alginate matrix.
2.5.1. Encapsulation in alginate hydrogels and culture of preantral follicles
Sodium alginate (60% glucuronic acid - Sigma Chemical Co., St. Louis, MO, USA)
was dissolved in sterile 1X PBS free of calcium (Invitrogen, Gibco Laboratories Life
Technologies Inc., Grand Island, NY, USA) to a concentration of 0.5% (w/v). The selected
follicles were transferred to 5 µL drops of alginate and immersed in an encapsulation solution
(50 mM CaCl2, 140 mM NaCl) for 2 min. The encapsulated follicles were washed in a culture
medium and individually cultured in 48-well plates (Corning Life Sciences - California, USA)
containing 300 µL of medium/well for 18 days at 38.5°C with 5% CO 2 in air. The basic
medium was previously defined in experiment 1 (as described above) using 10 ng/mL insulin
in both the absence (Control) and the presence of FSH at a fixed (100 ng/mL – FSH 100) or
increasing concentrations (D0-D6: 1 ng/mL; D6-D12: 10 ng/mL; D12-D18: 100 ng/mL)
corresponding to a sequential medium (FSH Seq). Every 2 days, 150 µL of medium were
replaced, except on days 6 and 12 for the FSH seq treatment, in which the medium was
completely replaced. On days 6, 12 and 18, the removed medium was stored at -80°C for
subsequent hormonal analyses.
77
2.5.2 Assessment of follicular viability by epifluorescence microscopy
After the in vitro culture period (day 18), the follicle viability was determined using
calcein-AM and ethidium homodimer-1 markers, as described in experiment 1. The follicles
were evaluated by an epifluorescence microscope (Nikon Eclipse 80i). The images were
obtained and analyzed using the NIS-Elements 3.0 2008 software.
2.5.3. Assessment of follicular morphology by histology
Follicles encapsulated
in alginate (0.5%) were
fixed overnight
in 4%
paraformaldehyde at 4°C, washed twice in PBS and stained with Alcian blue to identify the
alginate drop during processing. The follicles were dehydrated with increasing concentrations
of ethanol (50%, 70%, 80%, 90% and 100%), diaphonized in xylene and embedded in
paraffin to produce serial sections with thicknesses of 7 µm. The mounted slides were stained
with PAS-hematoxylin and examined by a light microscope (Nikon, Japan) with a 400X
magnification for an evaluation of the follicular morphology, including the organization of the
granulosa cells and the antral cavity as well as the maintenance of the basal membrane and
oocyte integrity.
2.5.4. Ultrastructural analysis
For an improved understanding of the follicular morphology, transmission electron
microscopy (TEM) was performed to analyze the ultrastructure of preantral follicles both
uncultured and cultured for 18 days. Isolated follicles were fixed in Karnovsky solution (4%
paraformaldehyde and 2.5% glutaraldehyde in 0.1 M sodium cacodylate buffer, pH 7.2) for at
least 3 h at room temperature (RT, approximately 25°C) and then embedded in drops of 4%
low melting agarose. After three washes in sodium cacodylate buffer, specimens were postfixed in 1% osmium tetroxide, 0.8% potassium ferricyanide and 5 mM calcium chloride in 0.1
M sodium cacodylate buffer for 1 h at RT. The samples were then dehydrated through a
gradient of acetone solutions and embedded in SPIN-PON resin (Sigma Company, St Louis,
MO). Semi-thin sections (3 µm) were cut, stained with toluidine blue and analyzed by light
microscopy at a 400X magnification. Ultra-thin sections (60–70 nm) were obtained from the
semi-thin sections of preantral follicles classified as morphologically normal. The ultra-thin
78
sections were treated with the contrast agents uranyl acetate and lead citrate and examined
with a Jeol 1011 transmission electron microscope (Jeol, Tokyo) operating at 80 kV.
2.5.5. Hormone assays
Estradiol (E2) and progesterone (P4) secretions were determined by double antibody
radioimmunoassay (RIA) analyses using commercial kits (MP Biomedicals, Solon, USA).
The detection limits and the intra-assay coefficients of variation were 5 pg/mL and 2.5%,
respectively, for E2 and 0.02 ng/mL and 3.7%, respectively, for P4. To prevent inter-assay
variations, all samples were assayed in the same RIA.
2.6. Statistical analysis
With the variable number of follicles obtained from each female, all collected
follicles were pooled and considered as the experimental unit. For discrete variables (viability
and antrum formation), data were analyzed by a dispersion of frequency with the Chi-square
test, and the results were expressed as percentages. For continuous variables (diameters and
growth rates), data were initially evaluated for homoscedasticity and normal distribution of
the residues by the Bartlett’s and Shapiro-Wilk tests, respectively. With confirmation for both
requirements underlying the analysis of variance, the effects of treatment, time and treatment
by time interaction were analyzed using PROC MIXED of SAS (2002), including repeated
statements to account for the autocorrelation between the sequential measurements. The
model was Yijk=µ+Ri+Fj+Tk+(RT)ik+eijk, where Yijk is the observation of the jth follicle in the
ith
treatment at the kth time of culture, µ is the overall mean, Ri is the ith treatment, Fj is the
random effect of the jth follicle within the ith treatment, Tk is the kth time of culture, (RT)ik is
the treatment by time interaction term and eijk is the random residual effect. Comparisons
between treatments or times were further analyzed by the LSD test. A probability of P<0.05
indicated a significant difference, and the results were expressed as the mean±S.E.M.
79
3. Results
3.1. Experiment 1: Two-dimensional in vitro culture of bovine preantral follicles using
multiple concentrations of insulin
Both non-viable (Figure 1A) and viable (Figure 1B) follicles after the in vitro culture
in either the absence or the presence of insulin, respectively, are presented in Figure 1. The
percentages of viable follicles and antrum formation after 18 days of culture in the multiple
concentrations of insulin are described in Figure 2. The addition of insulin to the culture
medium promoted the follicle survival rate significantly more than the control group. The
follicle survival rate observed with the 10 ng/mL insulin medium had values that were
significantly higher than the other treatments (Figure 2A) (P<0.05). After analyzing the
percentage of antrum formation at day 18 of culture, no significant differences were observed
among the treatments (Figure 2B) (P>0.05).
Figure 1: Evaluation of follicular viability after 18 days using fluorescent markers analyzed in serial sections by
Confocal Microscopy, demonstrating both non-viable (A) and viable (B) isolated follicles cultured in either the
absence (control) or the presence of 10 ng/mL insulin, respectively. Note: areas labeled in green and red indicate
viable and non-viable cells, respectively.
80
Figure 2: Percentages of viability (A) and antrum formation (B) of bovine follicles cultured in vitro for 18 days
in either the absence or presence of insulin. a, b, c – significant differences observed among treatments (P<0.05).
For the follicular diameter after day 6 of culture, the treatments containing low
concentrations of insulin (5 and 10 ng/mL) promoted follicular growth rates that were
significantly higher than the control and other treatments, demonstrating a progressive and
significant increase in the follicular diameter from day 0 to day 12 of culture with no
significant changes in this parameter until the end of the culture period. At the end of the
culture period (18 days), the addition of insulin at all tested concentrations promoted follicular
diameters at levels that were significantly higher than the control values. High rates of daily
follicular growth were observed only for the two low insulin concentrations (5 and 10 ng/mL)
as compared with the other treatments (Table 1 – P<0.05).
Table 1: Progression of follicular diameter and the rate of daily growth in the insulin treatments during the 18
days of the in vitro culture. A,B,C – significant differences observed among treatments on the same day (between
columns; P<0.05); a,b,c – significant differences observed among days of culture in a same treatment (between lines;
P<0.05). β,α – significant differences among treatments regarding the daily growth (P<0.05).
3.2. Experiment 2: Three-dimensional in vitro culture of bovine preantral follicles using fixed
and increasing FSH concentrations.
As in experiment 1 (Figure 1), both viable and non-viable follicles were found in
experiment 2 (Figure 3) after the in vitro cultures in the absence (Figure 3A) or the presence
of variations in the mode of FSH addition (fixed (Figure 3B) or increasing concentrations
(Figure 3C)). Although the antrum formations did not differ among the treatments (Figure
4B), FSH addition to the culture media resulted in the percentage of follicular viability
81
increased relative to the control, with this difference being significant only in the presence of
FSH 100 (Figure 4A). Histological analyses of the isolated follicles suggested that follicles
cultured for 18 days in the absence of FSH showed oocyte retraction (Figure 5A). For follicles
cultured in the presence of FSH (Figures 5B and 5C), the maintenance of both oocyte
integrity and granulosa cell organization were observed, confirming the maintenance of
follicular viability in these treatments.
Figure 3 – Evaluation of follicular viability after an in vitro culture for 18 days as characterized by non-viable
and viable follicles in the control medium (A1), with FSH 100 (B1) and with FSH Seq (C1) using fluorescent
markers (A2, B2 and C2). Note: areas labeled in green and red indicate viable and non-viable cells, respectively.
Figure 4 – Percentage of viability (A) and antrum formation (B) of bovine follicles cultured in vitro for 18 days
in the absence (Control) or the presence of FSH added at a fixed (FSH 100) or increasing (FSH Seq)
concentrations. a, b – significant differences observed among treatments (P<0.05).
82
Figure 5 – Morphological analyses by stereomicroscope (1) and optical microscope (classical histology; 2) after
18 days of in vitro culture using Control medium (A), FSH with fixed (B) and increasing (C) concentrations.
White arrow: oocyte; Black arrow: antrum; gc: granulosa cells; * Oocyte retraction.
Table 2 shows the follicular diameter and the rate of daily growth in the absence or
the presence of FSH added at either fixed or increasing concentrations. A significant increase
from day 0 to day 6 was observed in all treatments, with only FSH 100 promoting an increase
in follicular diameters from day 6 to day 18 of culture. The follicular diameters and the rates
of follicular growth in the media containing FSH were significantly higher than the control
values, with FSH 100 higher than FSH Seq (P<0.05).
Table 2: Progression of follicular diameter and the rate of daily growth in the different treatments during 18
days of in vitro culture. A, B, C – significant differences observed among the treatments on the same day (between
columns; P<0.05); a, b – significant differences observed among the days of culture in the same treatment (between lines;
P<0.05); β, α, Ω – significant differences among treatments regarding daily growth (P<0.05).
3.2.1. Ultrastructural analysis
To support the follicular viability observed in experiment 2, transmission electron
microscopy was used to evaluate the ultrastructure of viable follicles after culture in the
different treatments. At least five follicles per group were analyzed. Follicles from the control
83
(Figure 6A) showed signs of degeneration, as indicated with high levels of cytoplasmic
vacuolization, an absence of integrity in the basal membrane, a disorganization of granulosa
cells and a very low density of organelles. Normal follicles contained an oocyte displaying a
homogenous cytoplasm with numerous round mitochondria, continuous membranes and few
peripheral cristae. Several elongated forms with parallel cristae could also be observed.
Smooth endoplasmic reticula were present, either as isolated aggregations or as complex
associations with mitochondria. The nuclei of oocytes could be observed only in a few of the
ultrathin sections with the large diameter of the studied follicles that were usually round and
characterized by an intact nuclear envelope. A nucleolus could also sometimes be identified.
Oocytes were surrounded by a well-developed zona pellucida, which contained a vast number
of transzonal processes (cytoplasmic projections) arising from both granulosa cells and the
oocyte. Many microvilli could also be observed in all analyzed follicles emerging from the
oolemma, whose integrity was always verified. Granulosa cells were small with a high
nucleus-to-cytoplasm ratio. Their irregularly shaped nuclei contained loose chromatin in the
inner part and small peripheral aggregates of condensed chromatin, which were also often
observed centrally in the nuclear matrix. The cytoplasm exhibited a great number of
mitochondria with well-developed smooth endoplasmic reticulum. Several vesicles were
observed as well. The ultrastructural pattern described above was observed only in follicles
cultured with FSH 100 (Figure 6B) or FSH Seq (Figure 6C).
Figure 6 – Ultrastructural analyses of preantral follicles cultured in vitro for 18 days characterizing degenerated
follicles in the Control (A) and normal follicles in the presence of FSH 100 (B) or FSH Seq (C) in the culture
medium. zp: zona pellucida; m: mitochondria; gc: granulosa cells; ser: smooth endoplasmic reticulum; O:
oocyte; white arrow: cell and nuclear membrane; black arrow: cytoplasmic projections; *: microvilli.
3.2.2. Hormone assays
The measurements of the production of estradiol and progesterone during the in vitro
culture indicated that all growing follicles were active in steroid production. Estradiol levels
84
in the presence of FSH 100 were significantly higher compared to the other treatments at day
18 of culture (Figure 7), with the concentrations of estradiol significantly increasing from day
6 to day 18. The concentrations of progesterone had high individual variations and were
unaffected by either treatment or day of culture, with values ranging from 0.12 ng/mL to
150.98 ng/mL.
Figure 7 - Mean values of estradiol secretion measured in the follicular culture medium, collected on days 6, 12
and 18 in the Control group, FSH 100 and FSH Seq. A, B – significant differences observed among the
treatments; a, b – significant differences among the days of culture for the same treatment. (P<0.05).
85
4. Discussion
Previous studies have suggested that insulin regulates both growth and
steroidogenesis in ovarian tissue as well as the effects of FSH on follicular development. The
effect of insulin concentrations on the viability, growth, steroidogenic activity, morphological
and ultrastructural integrity, as well as the interactions of insulin with different modes of FSH
addition had not been previously characterized using the in vitro culture of isolated bovine
preantral follicles.
In this experiment, the optimal concentration of insulin (10 ng/mL) in the culture
medium of bovine preantral follicles was defined, as concentration curves of this hormone for
this species had not been determined. Insulin is an important modulator of follicular
development in cattle, stimulating steroidogenesis, oocyte maturation and the subsequent
embryo development (Yaseen et al., 2001). A recent study in cattle suggested that the use of
insulin (5 µg/mL) as a component of the basic medium promoted the follicle activation on the
second day of culture. In a medium without insulin, the primordial follicles remained at a
primordial stage for 10 days of in situ culture, indicating that this hormone acts on the
activation of primordial follicles in this species (Smitz et al., 2010).
In the present study, the addition of 10 ng/mL insulin to the culture medium of
bovine preantral follicles in a two-dimensional system resulted in improved rates of follicular
survival and growth, without influencing the antrum formation. In this same species, a culture
medium containing either a physiologic concentration (10 ng/mL) of insulin associated with
FSH and activin or a concentration close to physiologic (20 ng/mL) values associated with
FSH, LH and IGF-I enabled both follicle and oocyte growth in isolated preantral follicles and
induced a high percentage of antrum formation (> 60%) after 8 (McLaughlin et al., 2010) and
13 days of culture (Itoh et al., 2002), respectively. In a recent study in goats using the same
concentration curve of insulin evaluated in our study, isolated preantral follicles cultured in
vitro in the presence of 10 ng/mL insulin demonstrated improved rates of survival and growth
compared to the follicles from the control group without insulin. In contrast with our results,
this treatment (10 ng/mL insulin) did not differ from the other reported treatments (Chaves et
al., 2012). In sheep, the addition of insulin (10 ng/mL) to the culture medium supported the
development of secondary follicles for concentrations of 2.5, 5, 10 and 15 ng/mL
(Arunakumari et al., 2010). The ideal concentration of insulin may be species-specific. In
contrast with the results obtained in our work, a study involving the culture of isolated canine
86
preantral follicles demonstrated that an addition of insulin to the control medium promoted a
significant increase in the diameter and viability at all concentrations tested (5 ng/mL, 10
ng/mL and 10 µg/mL), with improved rates of follicular viability obtained in the presence of
10 µg/mL insulin (Serafim et al., 2012). Insulin is an important regulator of intracellular
processes, such as the transport of amino acids, glucose, lipid metabolism, gene transcription
and protein synthesis (Cheatham and Chan, 1995). At high concentrations, insulin appears to
have a toxic effect on follicle cells. This hypothesis was supported by recent studies that
demonstrate that a basic culture medium containing 10 µg/mL insulin (ITS) was not able to
maintain the ultrastructural integrity and the viability of caprine preantral follicles during the
early stages of a 7-day in situ culture (Chaves et al., 2010). For secondary caprine preantral
follicles cultured in the isolated form, this hormone was able to maintain a normal
ultrastructural integrity after 18 days (Chaves et al., 2012). With a capacity to remove
proapoptotic molecules, insulin is also used in the culture of cells and tissues to assure
viability (LeRoith et al., 1995). The presence of insulin was capable of assuring improved
percentages of follicular viability and growth. In this study, the concentration of this hormone
(5 ng/mL) may have been insufficient to ensure the efficient removal of those undesirable
factors that would ensure the follicular viability during the in vitro culture that had been
observed with concentrations of 10 ng/mL.
The optimal insulin concentration determined from experiment 1 was used in
experiment 2 to establish the best mode of FSH addition (fixed or increasing concentrations)
in a three-dimensional culture system (alginate) that can support the growth of bovine
secondary follicles. Recent research has shown that a three-dimensional culture can provide
an environment that mimics physiological conditions, as the matrix allows the preservation of
the follicular architecture found in the ovary (Benton et al., 2009).
In
this
three-
dimensional system, satisfactory results were obtained using encapsulated preantral follicles
in an alginate matrix, allowing follicular development to produce mature and fertilizable
oocytes and resulting in healthy mice offspring after embryo transfer (Xu et al., 2006). In
humans, follicles have survived, developed and produced satisfactory levels of steroid
hormones during a 30-day culture experiment in a three-dimensional matrix (Xu et al., 2009).
In this present study, in all tested treatments, the culturing of follicles in alginate
enabled high rates of follicle survival (higher than 72%), as evaluated by fluorescence
microscopy. Considered to be a safe and reliable method of analysis, this technique allows the
identification of esterases, which are active only in viable cells. The histological analysis
87
demonstrated that, in a medium without FSH, the oocyte integrity was compromised during
the in vitro culture. McLaughlin et al. (2010) also showed that, even in the presence of FSH
during 8 days of culture, a significant decrease in the oocyte integrity was observed. The
difference in these results may have resulted from the three-dimensional culture system used
in our studies that ensured the ultrastructural integrity in the presence of FSH, demonstrating
normal characteristics to the secondary follicles from cattle that were cultured in vitro (Van
den Hurk et al., 1998). In this work, we verified that the addition of FSH was capable of
maintaining the morphology and ultrastructure of both oocytes and granulosa cells in a longterm culture. On the other hand, follicles cultured in the control group exhibited signs of
atresia, clearly demonstrating the influence of FSH in the maintenance of follicular survival.
Although the FSH used in our study did not influence antrum formation, the
additions of this hormone at either fixed or increasing concentrations stimulated follicular
growth compared with the control. The absence of a significant effect of FSH on antrum
formation may have resulted from the presence of activin in the basic medium, as this factor
promoted follicular (cattle) growth during the entire in vitro culture and also stimulated the
formation of the antral cavity in secondary follicles in either the absence or the presence of
FSH (McLaughlin and Telfer, 2010; McLaughlin et al., 2010). FSH has been associated with
the in vitro growth of preantral follicles in multiple species. For samples from cattle, twodimensional systems have been used since 2000 (Gutierrez et al., 2000), producing
satisfactory results after 21 days. In the present work, the use of this hormone at a fixed
concentration in the three-dimensional culture system achieved a mean follicular diameter of
316.01 µm after 6 days of in vitro culture, exceeding the largest diameter (300 µm) reported
in the literature by McLaughlin et al. (2010) at 8 days of culture of preantral follicles for this
species. This growth may have resulted from the mitogenic activity of insulin associated with
FSH, as described by West et al., 2007, producing an increase in granulosa cell proliferation
in bovine (Saha et al., 2000), pigs (Hirao et al., 1994), sheep (Cecconi et al., 1999) and
humans (Roy and Treacy et al., 1993) samples. The number of FSH receptors increases with
follicular development, making the follicular stages increasingly sensitive to this hormone
(Cunningham, 2004). The increasing concentrations of FSH (FSH Seq) used in this study
mimic this process in vivo, considering that there may be an increase in the number of
receptors that will support the increased concentrations during the final stages of follicular
growth. Compared with FSH added at a fixed concentration, Sequential FSH had lower rates
of follicular growth and estradiol production, indicating that bovine secondary preantral
88
follicles require increased concentrations of FSH to optimize growth in the early stages of
development.
FSH is known to stimulate steroidogenesis, acting on granulosa cells, which in turn,
interacts with the theca cells (Campbell et al., 1995; Wandji et al., 1996; Thomas et al.,
2003). The secretions of estradiol and progesterone found in this study suggested that the
physiological functions of the different follicular cell types and the interactions between
oocyte, granulosa cells and theca cells were maintained. In this work, the granulosa cells were
highly responsive to FSH at 100 ng/mL with an increasing production of estradiol during the
culture, suggesting that this hormone concentration was able to efficiently stimulate estradiol
production. McLaughlin et al. (2010) reported that FSH in association with activin had levels
of estradiol production that were significantly higher than the control on day 4 of culture. This
production may be associated with increased levels of CYP19A1 expression, an enzyme
responsible for the conversion of estrogen from androgen in the ovaries (Kandiel et al., 2010)
stimulated by FSH in ruminants (Campbell et al., 1996; Gutierrez et al., 1997). The
combination of FSH and insulin increased levels of CYP19A1 mRNA in goats, inducing
increased estradiol production (Chaves et al., 2012).
In conclusion, insulin and FSH affected, in a concentration-dependent manner, the in
vitro survival and development of isolated bovine secondary follicles. Improved culture
efficiencies may be obtained from low concentrations of insulin using an addition of FSH at a
fixed concentration throughout the culture.
Acknowledgements
This research was supported by grants from CNPQ (RENORBIO: grant number
554812/2006-1), FINEP and Pronex – Brazil. Rafael Rossetto de Sousa is a recipient of a
grant from CAPES (Brazil).
89
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94
10. CONCLUSÕES
 O protocolo experimental utilizado com sucesso no cultivo in vitro de FOPA na espécie
caprina não é eficiente para promover o desenvolvimento de folículos pré-antrais na
espécie bovina. Além disso, a adição de IGF-I aumenta as taxas de crescimento diário
apenas na espécie caprina, porém não aumenta a taxa de maturação oocitária.
 Recomenda-se o TCM199 como meio de cultivo para FOPA bovinos isolados, pois
promove o desenvolvimento e crescimento folicular e a formação de antro.
 A adição de 10 ng/mL de insulina no meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais
bovinos mantém a viabilidade e o crescimento folicular.
 A associação de insulina (10 ng/mL) e FSH adicionado em concentração fixa (100 ng/mL)
ao meio de cultivo in vitro de folículos pré-antrais bovinos isolados mantém a viabilidade,
morfologia e ultraestrutura folicular além de estimular o crescimento e a produção de
estradiol.
95
11. PERSPECTIVAS
Para a maximização do potencial reprodutivo, especialmente de fêmeas domésticas, é
importante estudar a foliculogênese a fim de compreender os mecanismos e fatores
envolvidos nesse processo. Até os dias atuais, muitos esforços têm sido concentrados nesse
sentido, visando a busca por sistemas de cultivo in vitro eficientes, capazes de permitir o
adequado e completo desenvolvimento folicular. Apesar do estabelecimento de meios e
condições de cultivo promissores, ainda é limitado o conhecimento acerca da foliculogênese
em bovinos. Além disso, a obtenção de oócitos maturos oriundos de folículos pré-antrais,
principal alvo da biotécnica de MOIFOPA, ainda não foi conquistado para esta espécie.
Visando contribuir para o aprimoramento dos sistemas de cultivo in vitro em
bovinos, foi desenvolvido na presente tese uma formulação eficiente de meio de cultivo in
vitro utilizando TCM199 capaz de permitir o desenvolvimento folicular com a utilização de
baixas concentrações de Insulina e a adição de FSH em concentração fixa. Os resultados
obtidos neste estudo poderão servir de base para o aperfeiçoamento e elaboração de meios de
cultivos dinâmicos capazes de propiciar condições ótimas de desenvolvimento folicular in
vitro. A obtenção de oócitos maturos a partir do cultivo in vitro de folículos pré-antrais
avançados em animais domésticos, como bovinos, podem contribuir para a produção em larga
escala de embriões. O contínuo aperfeiçoamento dos sistemas de cultivo e das técnicas de
isolamento folicular possibilitarão a utilização de um grande número de oócitos oriundos de
folículos pré-antrais em estádios precoces de desenvolvimento crescidos in vitro em
programas de reprodução assistida, contribuindo para a multiplicação de animais de alto valor
zootécnico ou mesmo em vias de extinção.
96
12. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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