Cadernos de
Informação
Científica
Ano 7 • nº 10 • 2012
Diagnóstico
Molecular
Cadernos de Informação Científica
diagnóstico molecular
O conhecimento em Biologia Molecular vem crescendo de forma exponencial nos últimos anos
à medida que as doenças continuam a desafiar a medicina.
Com isso a biologia molecular vem ocupando um espaço de destaque no perfil de exames
laboratoriais, permitindo a obtenção de resultados mais precisos e rápidos em relação aos
disponíveis atualmente.
Ciente da rapidez com que a medicina evolui e das novidades a cerca do diagnóstico laboratorial,
o Quaglia Laboratório de Análises Clínicas desenvolve esse caderno informativo para contribuir
e esclarecer quanto aos conhecimentos referentes aos exames biomoleculares realizados.
biologia molecular: o que é?
Há poucas décadas os estudos dos organismos
baseavam-se em observações de natureza morfológica,
de modo que a análise das alterações nos tecidos
vivos limitava-se a efeitos sobre a estrutura. Com o
desenvolvimento da tecnologia, estes mesmos tecidos
vivos passaram a ser analisados possibilitando a
identificação das moléculas que os constituem. Desde
então, ocorreu uma sequência de descobertas
demonstrando ser o DNA a molécula primordial, a
partir da qual as principais características poderiam
ser compreendidas. Desenvolveu-se assim a biologia
molecular.
1865
1665
Os primeiros
desenhos de células
são observados ao
microscópio por
Robert Hook.
Gregor Mendel demontra
a existência dos
elementos responsáveis
pela manifestação das
características
hereditárias, hoje
conhecidos por genes.
Descoberta do
núcleo celular.
1831
1953
1977
Francis Crick e James
Watson descrevem a
estrutura da molécula
do DNA, constituida por
uma dupla hélice.
Uma nova substância
orgânica, denominada
Nucleína, é descoberta por
Friedrich Miescher. Substância
esta que, 20 anos mais tarde,
passou a ser conhecida como
Ácido Nucléico.
1869
Descoberto, por
Frederick Sanger, um
mecanismo para
sequenciar os pares de
bases do DNA.
O Código genético
é decifrado.
1966
2000
Sequencimento do
genoma da bactéria
Xylella fastidiosa.
Nasce o primeiro clone
de um mamífero
adulto, a ovelha Dolly.
1996
Mapeamento do
genoma humano.
2001
Diagnótico Molecular
técnicas moleculares
Técnicas laboratoriais, como microscopia e sorologia,
são rotineiramente utilizadas para diagnóstico de diversas doenças que envolvem a pesquisa e detecção de
antígenos e anticorpos específicos, porém, são pouco
específicas. Com o advento da biologia molecular e
a constante evolução da mesma, os métodos de pesquisas moleculares, altamente sensíveis e específicos, contribuíram não só para o aprimoramento de
abordagens que detectam a presença do patógeno
(identificação de sequências específicas de ácidos
nucléicos) como também, de abordagens que indicam
a exposição ao agente infeccioso no hospedeiro
(detecção de anticorpos a partir de antígenos recombinantes específicos).
Dentre os métodos moleculares utilizados no diagnóstico laboratorial, destaca-se a técnica de PCR,
em especial PCR Tempo Real. Esta que com a
progressão da biologia molecular tornou-se mais
acessível e eficiente, possibilitando informações
importantes para o diagnóstico clínico.
Reação de Polimerase em Cadeia (PCR)
Técnica que permite replicação in vitro do DNA de
forma rápida, possibilitando que quantidades mínimas de material genético sejam amplificadas milhões
de vezes em poucas horas, gerando um grande número
de cópias de um determinado fragmento gênico.
A modificação dessa técnica levou ao desenvolvimento de diversas outras, cada qual com suas
particularidades, sendo no geral mais sensíveis e
específicas que a técnica tradicional.
Nos últimos tempos, a metodologia PCR Tempo Real
vem substituindo a técnica de PCR convencional,
pois combina amplificação e detecção simultaneamente, otimizando os resultados, permitindo o
monitoramento constante e a detecção antecipada
de possíveis problemas ocorridos durante o processo, bem como possibilitando ações corretivas
rapidamente. Além disso, é considerado um método
mais sensível, específico e reprodutível para detecção e quantificação de DNA e RNA.
diagnóstico molecular
As técnicas de diagnóstico molecular são aplicadas
em diversas áreas da medicina laboratorial, avaliando,
por exemplo, doenças infecciosas e alterações
genéticas.
No que se refere às doenças infecciosas, a detecção
rápida de micro-organismos, seja de crescimento lento
ou aqueles não cultiváveis, se torna possível através
das técnicas moleculares. Técnicas essas que também
podem ser empregadas na determinação de resistência antimicrobiana, no monitoramento de doenças
através da quantificação da infecção e em estudos
epidemiológicos.
Considerando o amplo quadro de doenças infecciosas
diagnosticadas pela biologia molecular, merecem
destaque algumas das mais comumente detectadas
na rotina laboratorial.
PAPILOMAVÍRUS HUMANO (HPV)
A infecção genital pelo HPV é uma das principais
doenças transmitidas sexualmente, podendo causar
uma variedade de manifestações clínicas, levando até
mesmo ao desenvolvimento de carcinoma cervical.
Estudos recentes mostram inclusive uma relação do
HPV com câncer oral e de orofaringe, assim como
com câncer retal, em especial no sexo masculino.
Existem mais de 100 tipos de HPV, identificados com
base em suas diferenças genéticas, subdivididos
conforme seu potencial carcinogênico, em alto e baixo
risco. Dessa forma, a determinação do tipo de HPV
se faz de grande relevância.
No grupo considerado de alto risco, o tipo 16 está
fortemente associado com o surgimento do carcinoma
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de células escamosas do colo uterino e o tipo 18
apresenta alto potencial maligno. Um estudo realizado
com mulheres testadas para genótipos de HPV, indicou o risco crescente de câncer cervical para aquelas
infectadas com o tipo 16 e o tipo 18, quando comparado com todos os outros tipos oncogênicos de HPV.
20
17% HPV 16+
Porcentagem
15
A Sociedade Americana de Colposcopia e Patologia
Cervical (ASCCP) recomenda a triagem adjunta do
Pap (exame visual de uma amostra de células cervicais)
e teste de HPV para mulheres com resultados de
citologia ASC-US.
Triagem
ASC-US
Pap
HPV
Colposcopia
1 ano
14% HPV 18+
10
5
3% outro HPV+
1% outro HPV–
0
0
15
39
63
87 119.5
Tempo de acompanhamento (em meses)
Embora a infecção pelo HPV possa ser verificada por
exames de citologia, histologia e colposcopia, o diagnóstico específico requer a detecção do DNA viral,
que por estar associado à célula confere à coleta
grande importância para o bom diagnóstico.
Os métodos moleculares, Captura Híbrida e PCR,
representam uma evolução no diagnóstico e na triagem do câncer cervical. A aplicação dessas metodologias permite maior acurácia no diagnóstico,
rapidez, sensibilidade e especificidade.
A Captura Híbrida para HPV é um teste com excelente reprodutibilidade laboratorial, capaz de detectar
com exatidão a presença ou não de DNA viral dos
mais frequentes tipos de HPV. No entanto, distingue
os tipos de HPV em dois grupos, alto e baixo potencial
oncogênico, não especificando o genótipo em questão.
A triagem Pap somente, não detecta cerca de metade
dos casos de câncer cervical, logo somando o teste
HPV com determinação do genótipo 16/18 como parte
da triagem de rotina aumenta-se a capacidade de
identificação da doença.
Triagem
Adjunta
Pap/
HPV
Colposcopia
1 ano
3 anos
Dessa forma, o teste HPV por PCR Tempo Real atende
as necessidades para triagem de câncer cervical,
permitindo a estratificação de risco dos pacientes com
maior chance de evolução da doença, contribuindo
para a tomada de decisões por parte dos médicos e
para o tratamento daqueles.
HEPATITES VIRAIS
A reação por PCR, método de screening com alta sensibilidade analítica, apresenta uma vantagem sobre o
exame de Captura Híbrida, pois possibilita a
genotipagem dos HPV 16 e HPV 18 em um único ensaio, além de informar o resultado combinado para os
outros tipos de alto risco. Outro diferencial do teste é
o controle, a partir de moléculas de ß-globina, da
presença ou ausência de células cervicais na amostra,
garantindo a efetividade da coleta e evitando resultados falso-negativos.
No mesmo estudo referido, observou-se que 1:10 mulheres com citologia negativa para HPV, apresentavam
lesão de alto grau para HPV 16 e HPV 18 no exame
PCR Tempo Real, o que mostra a relevância da técnica
de PCR, uma vez que detecta mulheres com grande
chance de lesões de alto risco, e da complementação
dos exames diagnósticos.
As hepatites virais são um grave problema de saúde
pública no mundo e no Brasil. Segundo estimativas,
bilhões de pessoas já tiveram contato com o vírus das
hepatites e milhões são portadores crônicos.
As hepatites virais são doenças provocadas por
diferentes agentes etiológicos, com tropismo primário
pelo tecido hepático, que apresentam características
epidemiológicas, clínicas e laboratoriais semelhantes,
porém, com importantes particularidades.
Quanto mais cedo a infecção for detectada, maior as
chances de cura e de progressão da doença. Logo, é
importante realizar o teste para o diagnóstico da
hepatite, em caso de exposição ao vírus, ou mesmo
o acompanhamento clínico e laboratorial para monitorar
o tratamento.
Diagnótico Molecular
• HEPATITE B
Estima-se que atualmente mais da metade da população mundial já tenha sido contaminada pelo vírus
da Hepatite B, agente este, que diferentemente dos
demais vírus da hepatite, é um vírus DNA, classificado
Vírus da
em 8 genótipos, designados de A a H, e pelo
Hepatite B
menos 24 subgenótipos, com distintas
distribuições geográficas e propriedades
virais.
DNA
O diagnóstico da hepatite B é classicamente baseado em métodos
sorológicos, mas atualmente existem
métodos moleculares disponíveis para
acompanhar a infecção, uma vez que
o diagnóstico molecular é considerado
mais adequado na avaliação para fins
de tratamento e acompanhamento da
replicação viral na corrente sanguínea.
A reação em cadeia da polimerase, método qualitativo, tem sido utilizada na confirmação da replicação
viral em indivíduos com sorologia positiva, sendo também uma alternativa no monitoramento do tratamento.
Previamente ao tratamento, a quantificação do vírus
da hepatite B circulante pode ser utilizada como
prognóstico de resposta ao tratamento, sendo importante no acompanhamento dos pacientes submetidos ao tratamento antiviral e na detecção do nível
de replicação viral em pacientes HBsAg positivos com
mutação pré-core (HBeAg negativos) e com persistência da viremia. Além da determinação da carga
viral, a genotipagem do vírus B da hepatite também
é possível e tem sido solicitada para identificar a
resistência aos antivirais, através da detecção de
mutações relacionadas à diminuição de suscetibilidade aos medicamentos.
• HEPATITE C
A hepatite C é considerada hoje a maior epidemia da
humanidade, apresentando no mundo cerca de 200
milhões
de pessoas infectadas pelo vírus. No Brasil,
Vírus da
o
Ministério
da Saúde estima que 15% da popuHepatite C
lação encontra-se infectada, porém, 95%
desconhece a ocorrência da infecção.
O vírus da hepatite C foi o primeiro patógeno infeccioso a ser identificado
exclusivamente através de metodologias laboratoriais moleculares. O PCR
qualitativo tem sido comumente utilizado na confirmação do diagnóstico de
pessoas com sorologia positiva. Os
RNA Viral
exames Carga Viral e Genotipagem tem
sua importância conferida no que se
refere ao acompanhamento terapêutico.
A dosagem da carga viral é relevante para o monitoramento do tratamento e como valor prognóstico do
sucesso deste, determinando a duração do mesmo e
a possibilidade de recidiva do vírus. Diferente do que
é observado na genotipagem viral, que determina a
correta estratégia terapêutica, partindo do pressuposto que a efetividade do tratamento depende do
genótipo viral.
Existem 11 genótipos conhecidos, sendo 6 os principais. Os genótipos 1 (mais comum) e 4 (raro) apresentam pior resposta ao tratamento, de modo que a
duração deste deve ser maior caso o HCV infectante
seja dos genótipos mencionados. Indivíduos podem
ser infectados por mais de um tipo de genótipo, nestes
casos, a resposta ao tratamento pode ser menor, pois
um tipo pode responder ao tratamento e outro não.
Ao abordar a infecção pelo vírus da hepatite C, é importante mencionar as variações genéticas próximas
ao gene IL28B, que surgiu como grande contribuição
farmacogenômica para o diagnóstico molecular,
relacionando-se diretamente com a hepatite C.
GENE IL28B
Uma pequena parcela de indivíduos elimina espontaneamente os vírus da hepatite C do organismo, ao
passo que a maioria deles, aproximadamente 85%
dos infectados, evoluem para o estado de infecção
crônica.
Alguns hospedeiros eliminam o vírus, e outros não,
devido as variações genéticas próximas ao gene IL28B,
que codifica a interleucina 28, mensageiro químico
das reações imunológicas e com atividade antiviral
relacionada ao interferon, medicamento empregado
na terapêutica da infecção, junto à ribavirina.
Próximo a esse gene foram encontrados alguns
polimorfismos que constituem a troca de uma base
em pontos bem localizados do DNA (polimorfismos de nucleotídeos únicos - SNP) e estão relacionados a diferenças interpessoais, no que diz respeito a
diferentes aspectos de fenótipos, atuando fundamentalmente no entendimento a resposta terapêutica da
infecção pelo HCV e na depuração espontânea de
pacientes que se curam sem tratamento.
Os estudos dos SNP relacionados à cura espontânea
e a resposta ao tratamento são muito recentes, porém,
muito promissores no auxílio aos pacientes cronicamente infectados pelo HCV. Assim, o Quaglia Labo-
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TIPOS DE “SNP”
rs12979860
Maior chance de
clareamento viral
espontâneo e de
resposta ao
tratamento
rs8099917
(“alelo de risco”)
Indivíduos com genótipo C/C
• apresenta maior chance de depuração espontânea do vírus que indivíduos C/T e T/T;
• possuem maior chance de resposta ao tratamento da infecção pelo HCV com interferon
e ribavirina;
• são mais comuns nas populações de origem européia quando comparadas as populações
de descendência africana.
Indivíduos com pelo menos uma das versões de G (guanina) deste SNP é o suficiente
para aumentar o risco de não responder a terapia combinada.
ratório vem por meio desta abordagem tentar contribuir
para uma melhor condução no atendimento aos pacientes infectados (quadro acima).
HIV
O Quaglia Laboratório oferece um grande número de
exames laboratoriais relacionados às doenças
infecciosas, e no que diz respeito à infecção recente
pelo HIV ou a um diagnóstico recente, a reação em
cadeia pela polimerase para DNA proviral do HIV-1 e
a carga viral para o RNA pelo HIV-1 são os mais comumente realizados.
O PCR para HIV é recomendado para diagnóstico de
infecção no período pré-soroconversão, período este
também conhecido como janela imunológica. A
produção de anticorpos costuma ser detectada a partir de 1 a 6 meses após exposição que leve à contaminação pelo HIV. O PCR para DNA proviral do HIV
fica positivo a partir de 20 dias da exposição, assim
um teste que utilize a detecção de ácidos nucléicos
do vírus é de extrema relevância para um diagnóstico
precoce e certeiro.
Considerando o que foi colocado com relação à aplicação do PCR para DNA proviral, a carga viral para o
RNA do HIV-1 também pode ser utilizada para
diagnóstico no período de janela imunológica, pois a
presença do RNA pode ser detectada a partir do 14º
dia de exposição. Uma importante vantagem da realização da carga viral sobre a sorologia é que, por se
tratar de um teste quantitativo, existe a possibilidade
Em se tratando de genética humana, a biologia molecular tornou-se ferramenta fundamental no diagnóstico
das doenças, permitindo não só a identificação do
gene afetado, mas também da mutação responsável
pela patologia. A disponibilidade dos métodos
diagnósticos tem possibilitado também o diagnóstico
pré-natal e a triagem populacional para as doenças.
Embora a maioria dos testes genéticos ainda seja
de diferenciar os resultados verdadeiramente positivos
das interferências laboratoriais.
Chlamydia trachomatis
A Chlamydia trachomatis é considerada a bactéria
sexualmente transmissível mais frequente em países
desenvolvidos e de grande impacto no sistema reprodutivo das mulheres. A Organização Mundial da Saúde
estima que ocorram mais de 90 milhões de casos novos de infecção, anualmente, em todo o mundo.
O diagnóstico da infecção pela Chlamydia trachomatis
ainda é crítico, devido à frequência de infecções assintomáticas, mas o advento da biologia molecular permitiu uma melhor garantia diagnóstica. Os métodos
mais completos em termos de sensibilidade e
especificidade são os de detecção de ácidos nucléicos, dos quais PCR é o mais difundido. Os benefícios
da amplificação relacionam-se com a maior sensibilidade quando comparada a cultura e aos testes
mais utilizados, como imunofluorescência direta,
imunocromatográfico e enzimaimunoensaio.
Utilizando-se a técnica de PCR é possível a detecção
com rapidez de pequenas quantidades de ácidos
nucléicos em amostras clínicas, especificando gênero
e grupo. Uma das vantagens do emprego do método
PCR é exatamente a realização da genotipagem, que
pode ser realizada por restriction fragment length
polymorphism (RFLP) ou por sequenciamento de
nucleotídeos direto da amostra clínica submetida a
reações de amplificação.
destinada ao diagnóstico e prevenção de doenças
raras, os avanços tecnológicos têm permitido o uso
destes para a avaliação de risco, uma vez que a
correlação entre mutações gênicas e suscetibilidade
a doenças é particularmente importante.
Atualmente, alguns dos principais testes genéticos
são realizados para avaliação de doenças hema-
Diagnótico Molecular
tológicas e no diagnóstico preventivo de distúrbios
hemostáticos, devendo-se aqui destacar as trombofilias, decorrente de condições multigênicas e multifatoriais (idade avançada, gravidez/puerpério, uso de
contraceptivos, cirurgia, imobilização prolongada). As
condições genéticas mais citadas quando se trata de
trombofilias se referem ao Fator V de Leiden, mutação
do gene da protrombina e do gene da enzima
metilenotetrahidrofolato redutase (MTHFR).
MUTAÇÕES GENÉTICAS
• indivíduos homozigóticos tem 50 vezes
mais chances de desenvolver trombose;
Fator V de Leiden
• gestantes portadoras da mutação em
homozigose possuem 32 vezes mais
risco de apresentar doença trombótica.
A frequência de casos observados dessas mutações
genéticas é pequena, sendo de 2 a 7% para o Fator
V de Leiden, o mais comum, o que de certa forma não
justificaria uma grande preocupação com o rastreamento dessas alterações. Todavia, esses exames
tornam-se mais relevantes por serem alterações genéticas facilmente exploradas pela biologia molecular,
a praticidade diagnóstica contribui muito para a investigação por parte do clínico. Como todo teste
genético, o perfil para trombose é realizado apenas
uma vez, mas se positivo implica em cuidados ao
longo da vida (quadro ao lado).
Considerando ainda a genética humana, o conjunto
de informações herdadas dos pais biológicos, permite
a identificação humana e aplicada nas investigações
de paternidade. Os testes de paternidade são realizados comparando marcadores genéticos em amostras da mãe, do filho e do suposto pai. As características
do filho que não forem compatíveis com as da mãe
devem ser provenientes do pai. Caso não sejam
coincidentes com o suposto pai examinado, concluise pela exclusão de paternidade. Porém, se houver
• mulheres em uso de contraceptivo oral
ou submetidas à terapia de reposição
hormonal têm risco 13 a 15 vezes maior
de apresentar fenômeno trombótico;
Mutação do gene
da protrombina
Mutação do gene
da enzima MTHFR
• gestantes portadoras da mutação tem
risco aumentado de aborto precoce e
aborto recorrente.
• pacientes homozigóticos podem
apresentar elevação dos níveis
plasmáticos de homocisteína em até
25%;
• pacientes com hiperhomocisteinemia
apresentam risco 6,5 vezes maior de ter
aborto precoce.
compartilhamento do material genético entre o suposto pai e a criança, a paternidade não pode ser excluída
e a partir de cálculos estatísticos considera-se a
probabilidade de ele ser realmente o pai.
Atualmente, o teste de paternidade é considerado
como o exame mais adequado para a determinação
de vínculo genético, pois no mínimo 17 características
genéticas independentes entre si são analisadas,
configurando mais de 99,999% de precisão do
resultado.
ALGUMAS DOENÇAS DIAGNOSTICADAS, POR BIOLOGIA MOLECULAR,
PELO QUAGLIA LABORATÓRIO DE ANÁLISES CLÍNICAS
Citomegalovírus
Hepatite C
Chlamydia trachomatis
Hepatite B
Mycobacterium tuberculosis
Gene IL28B
Neisseria gonorrhoeae
Fibrose Cística
Toxoplasmose
PML - Translocação Rara
HTLV
Hemocromatose
HIV
X Frágil - Pesquisa molecular do cromossomo
Papilomavírus Humano (HPV)
Microdeleção do cromossomo Y
Perfil para Trombose
• Mutação do gene da enzima MTHFR
• Fator V Leiden
• Mutação do gene da protrombina
Teste de Paternidade
• Trio: suposto pai, filho, mãe
• Duo: suposto pai e filho
• Post mortem: filho, mãe e 2 parentes,
preferencialmente, de primeiro grau
Ciente da importância da qualidade para o diagnóstico laboratorial, o Quaglia Laboratório
de Análises Clínicas trabalha com uma equipe de profissionais altamente preparados para
a execução dos processos, disponibilizando o diagnóstico preciso de diversas patologias,
contribuindo para o tratamento direcionado e o monitoramento em resposta a terapia. Em
síntese, auxilia nas decisões clínicas como contribuição para a melhoria da saúde.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1 - BRASIL. Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia das Doenças do Papilomavírus.
Disponível em: www.hpv.org.br. Acesso em: 23 agosto 2011.
2 - BRASIL. Associação Brasileira dos Portadores de Hepatite – ABPH.
Disponível em: www.hepatite.org.br. Acesso em: 03 agosto 2011.
3 - BRASIL. Centro de Genomas – Cartas Moleculares.
Disponível em: www.centrodegenomas.com.br. Acesso em: julho 2011.
4 - BRASIL. Confiança e Relevância Clínica em Saúde da Mulher - COBAS® 4800 System.
Roche Diagnóstica Brasil. 2010.
5 - Silva, M.O. Diversidade genética do vírus da Hepatite B no Brasil – genótipos,
subgenótipos e recombinantes. Instituto Oswaldo Cruz. Rio de Janeiro. 2008.
6 - Filho, A. M.; Remualdo, V. Biologia Molecular aplicada ao Diagnóstico de Doenças
Infecciosas. Em: Prática Hospitalar. Ano IX, n.53, Set-Out/2007.
7 - Seadi, C.F.; Oravec, R.; Poser, B.V.; Cantarelli, V.V.; Rosetti, M.L. Diagnóstico Laboratorial
da infecção pela Chlamydia trachomatis: vantagens e desvantagens das técnicas.
Jornal Brasileiro de Patologia e Medicina Laboratorial. Rio de Janeiro, v.38, n.2, 2002.
O Caderno de Informação Científica é um informativo editado pelo
Quaglia Laboratório de Análises Clínicas.
Textos
Dra. Luciane Loesch de Souza
Revisão Final
Dra. Carmen T. P. Quaglia
Dr. Vitor M. Pariz
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QUAGLIA
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