UNIVERSIDADE DO ESTADO DO AMAZONAS
FUNDAÇÃO DE MEDICINA TROPICAL DR. HEITOR VIEIRA DOURADO
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MEDICINA TROPICAL
MESTRADO EM DOENÇAS TROPICAIS E INFECCIOSAS
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AGENTES CAUSADORES DE
CRIPTOCOCOSE ISOLADOS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA UNIDADE
TERCIÁRIA DE SAÚDE DO ESTADO DO AMAZONAS
ANA KARLA LIMA FREIRE
MANAUS
2011
i
ANA KARLA LIMA FREIRE
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AGENTES CAUSADORES DE
CRIPTOCOCOSE ISOLADOS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA UNIDADE
TERCIÁRIA DE SAÚDE DO ESTADO DO AMAZONAS
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Medicina Tropical da
Universidade do Estado do Amazonas em
convênio com a Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, para
obtenção do grau de Mestre em Doenças
Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Prof. Dr. João Vicente Braga de Souza
Co-orientador: Prof. Dr. Bodo Wanke
MANAUS
2011
.
FICHA CATALOGRÁFICA
Catalogação na Fonte: Auxiliadora Queiroz Batista – Bibliotecária - CRB11/ 596.
F866c
.
Freire, Ana Karla Lima
Caracterização molecular de agentes causadores de Criptococose
Isolados de pacientes atendidos em uma unidade terciária de saúde
do Estado do Amazonas / Ana Karla Lima Freire. – Manaus: UEA,
2011.
62 fl. : il ; 30 cm
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-Graduação em
Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas para
obtenção do grau de Mestre em Doenças Tropicais e Infecciosas.
Orientador: Profº. Dr. João Vicente Braga de Souza.
Co-orientador: Prof°. Dr. Bodo Wanke.
1. Cryptococcus spp. 2. Genotipagem. 3. PCR-Fingerprinting.
4. URA5-RFLP. 5. ITS5/NL. I. Título.
CDU 616.9
ii
FOLHA DE JULGAMENTO
CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE AGENTES CAUSADORES DE
CRIPTOCOCOSE ISOLADOS DE PACIENTES ATENDIDOS EM UMA
UNIDADE TERCIÁRIA DE SAÚDE DO ESTADO DO AMAZONAS
ANA KARLA LIMA FREIRE
“Esta Dissertação foi julgada adequada para obtenção do Título de Mestre em
Doenças Tropicais e Infecciosas, aprovada em sua forma final pelo Programa de PósGraduação em Medicina Tropical da Universidade do Estado do Amazonas em
convênio com a Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado”.
Banca Julgadora:
______________________________________
Prof. João Vicente Braga de Souza, Dr.
Presidente
______________________________________
Profa. Ani Beatriz Jackisch Matsuura, Dra.
Membro
______________________________________
Profa. Maria das Graças Vale Barbosa, Dra.
Membro
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo sopro da vida e pelos planos, dEle, cumpridos.
Aos meus pais queridos, pelo imenso amor, paciência, incentivo e suporte em todos
os momentos.
Ao meu noivo por todo amor, compreensão, pelas orações que nunca cessam e por
fazer tudo parecer mais simples.
Ao meu orientador, Dr. João Vicente Braga de Souza, pela oportunidade,
aprendizado, idéias, paciência, amizade e pela chance de conhecer essa grande
pessoa.
Ao meu co-orientador, Dr. Bodo Wanke pela chance de compartilhar de sua
experiência, conhecimento e colaboração.
À Dra. Júlia Ignez Salem pela imensa gentileza na realização e otimização deste
trabalho, com suas críticas e sugestões.
Às minhas amigas Ivanete Sampaio e Mirlane Santos, pelos ensinamentos sobre os
procedimentos.
Aos funcionários dos Laboratório de Micobacteriologia e Micologia do Instituto
Nacional de Pesquisas da Amazônia, pelo pronto auxílio.
Ao Laboratório de Micologia da Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado, onde tudo começou.
À Universidade do Estado do Amazonas pela qualificação profissional oferecida.
À Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pela oportunidade
concedida da utilização das instalações e materiais do Laboratório de Micologia.
Ao Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia pela cedência do espaço nos testes
de biologia molecular.
Ao INCQS-RJ pelo envio das cepas fúngicas de referência para a realização desta
pesquisa.
À Suframa e Fundação Muraki pelo apoio na estrutura deste Programa de PósGraduação.
À CAPES pelo auxílio financeiro.
À FAPEAM pelo financiamento desta pesquisa através do edital n°.014/2006 PPSUS
2006.
iv
RESUMO
A Criptococose é uma micose sistêmica que acomete órgãos profundos e a pele,
decorrente da aquisição de propágulos infectantes por via inalatória das espécies de
leveduras patogênicas pertencente à classe dos Basidiomycetes e ao gênero
Cryptococcus, afetando pacientes imunodeprimidos ou imunocompetentes. Embora
a porta de entrada no hospedeiro humano seja o pulmão, o fungo apresenta
tropismo pelo Sistema Nervoso Central (SNC), onde causa quadro grave de
meningoencefalite. A partir do conhecimento de que existem 4 grupos moleculares
de Cryptococcus neoformans (VNI e VNII, VNIII e VNIV) e 4 de C. gattii (VGI e
VGII, VGIII e VGIV) vem se tornando importante a identificação dos grupos
incidentes em diferentes regiões geográficas do mundo. Neste sentido foi
investigado quais os tipos moleculares de 60 cultivos de Cryptococcus spp., isolados
de pacientes atendidos em uma unidade terciária do Estado do Amazonas, entre
2006-2010. Os isolados foram caracterizados pela PCR-Fingerprinting utilizando o
minissatélite M13 e confirmados por PCR-RFLP do gene URA5. Avaliou-se também
um protocolo experimental de PCR-RFLP utilizando como alvo a região ITS do
DNAr. A presença de genes sexuais específicos, com locus mating type (MATα e
MATa) das espécies, foi analisada por PCR. Constatou-se que os pacientes em sua
maioria são do sexo masculino (66,7%), com idade entre 16-30 anos (51,7%),
portadores de HIV (75%) que apresentaram meningite (71,7%), cujos isolados de C.
neoformans (66,7%) em sua maioria foram caracterizados como grupo molecular
VNI (97,5%) e os de C. gattii como VGII (100%). Três isolados (5,0%) não puderam
ser caracterizados por nenhum dos protocolos estudados e o protocolo experimental
avaliado apenas discriminou 2 grupos moleculares de C. gattii (VGII e VGIII). Quanto
aos mating types, 58 isolados foram do tipo α e apenas 2 foram do tipo a. C.
neoformans do grupo molecular VNI é o principal agente etiológico. Entretanto, temse o encontro do grupo molecular VNII nunca antes relatado para a Região Norte do
Brasil. Além do exposto, constatou-se que a nova metodologia sugerida para
genotipagem utilizando como gene alvo a região ITS do DNAr caracterizou somente
os 2 grupos moleculares de C. gattii.
Palavras-Chaves: Cryptococcus spp.; Genotipagem; PCR-Fingerprinting M13;
URA5-RFLP; ITS5/NL4
v
ABSTRACT
Cryptococcosis is a systemic mycosis that affects deep organs and skin, resulting
from the acquisition of infective propagules inhalation of pathogenic yeast species
belonging to the class of Basidiomycetes and the genus Cryptococcus, affecting
immunocompetent or immunocompromised patients. Althought the entrance to the
human host is the lung, the fungus has tropism for Central Nervous System (CNS),
where it causes severe meningoencephalitis. From the knowledge that there are four
molecular groups of Cryptococcus neoformans (VNI and VNII, VNIII and VNIV) and
four of Cryptococcus gattii (VGI and VGII, VGIII and VGIV) has become important to
identify groups of incidents in different geographic regions worldwide. This effect was
investigated what molecular types of 60 cultures of Cryptococcus species isolated
from patients in a tertiary hospital in the State of Amazonas, Brazil, between 20062010. The isolates were characterized by PCR-Fingerprinting using M13 mini-satellite
and confirmed by PCR-RFLP of the URA5 gene. An experimental protocol using
PCR-RFLP targeting the ITS rDNA was also evaluated. The presence of specific
genes with mating type locus ((MATα and MATa) species was analyzed using PCR.
It was found that patients are mostly male (66.7%), aged 16-30 years (51.7%), HIV
(75.0%) with meningitis (71.7%). Whose isolates of C. neoformans (66.7%) were
mostly characterized as VNI molecular group (97.5%) and C. gattii (100.0%). Three
isolates (5.0%) could not be characterized by any of the protocols under study and
the experimental protocol evaluated only discriminated two molecular groups of C.
gattii (VGII and VGIII). As for the mating types, 58 isolates were of type α and only
two were type a. C. neoformans VNI molecular group was the main etiologic agent.
However, there is the meeting of the VNII molecular group has never been reported
for the northern region of Brazil. Besides the above, it was found that the new
methodology suggested for genotyping using as a target gene of rDNA ITS region
characterized only two groups of C. gattii.
Key words: Cryptococcus spp., Genotyping, PCR-Fingerprinting M13, URA5-RFLP,
ITS5/NL4.
vi
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Imagem do ciclo de infecção por Cryptococcus spp............................... 14
Figura 2. Imagem de leveduras do Gênero Cryptococcus..................................... 19
Figura 3. Imagem do cultivo de Cryptococcus em Ágar Sabouraud......................
19
Figura 4. Imagem do cultivo de Cryptococcus em Ágar Níger com produção de
melanina.................................................................................................................. 20
Figura 5. Imagem de cultivo de Cryptococcus em CGB, amarelo, C. neoformans
e azul, C. gattii........................................................................................................
20
Figura 6. Imagem da distribuição dos tipos moleculares de acordo com os
Estados Brasileiros incluídos na análise................................................................. 25
Figura 7. Fluxograma da Reativação e Isolamento Fúngico..................................
33
Figura 8. Fluxograma da Metodologia de Extração do DNA genômico.................
34
Figura 9. Fluxograma da PCR-Fingerprinting do Minissatélite M13......................
35
Figura 10. Fluxograma da PCR-RFLP do gene URA5..........................................
36
Figura 11. Fluxograma da PCR dos mating types.................................................
37
Figura 12. Fluxograma da PCR-RFLP da região ITS do DNAr.............................. 38
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 1. Fatores de Virulência das espécies patogênicas de Cryptococcus.......
Tabela 2. Lista de cepas de referência utilizadas neste estudo, incluindo
informações gerais, sorotipo (ST), mating type (MAT), tipo molecular
(TM)........................................................................................................................
18
29
viii
LISTA DE ABREVIATURAS
AIDS
Acquired Immune Deficiency Syndrome
µm
Microlitros
BC
British Columbia
CEP
Comitê de Ética em Pesquisa em Seres Humanos
CGB
Canavanina-glicina-azul de bromotimol
CR3
Complement Receptor Type 3
DNA
Desoxirribonucleic Acid
dNTP
Desoxirribonucleosídeo Trifosfato
EDTA
Ácido Etilenodiaminotetracético
EUA
Estados Unidos da América
FAPEAM
Fundação de Amparo à Pesquisa do Amazonas
FMT-AM
Fundação de Medicina Tropical do Amazonas
H
Hora
HCl
Ácido Clorídrico
HIV
Human Immunodeficiency Virus
INPA
Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia
ITS
Espaço Interno Transcrito
ITS5
Espaço Interno Transcrito 5
KCl
Cloreto de Potássio
LCR
Líquido Cefalorraquidiano
Mg
Miligrama
MgCl 2
Cloreto de Magnésio
Min
Minuto
mL
Mililitro
Nm
Nanômetro
PCR
Polymerase Chain Reaction
pH
Potencial Hidrogeniônico
RAPD
Random Amplified Polymorphic DNA
RFLP
Restriction Fragment Length Polymorphism
Rpm
Rotações por Minuto
S
Segundo
SNC
Sistema Nervoso Central
ix
Tris
2-amino-2-hidroximetilpropano-1,3-diol
U
Unidade
UFC
Unidade Formadora de Colônia
URA5
Urotidina Monofosfato Pirofosforilase 5
UV
Ultravioleta
V
Volts
VGI, VGII, VGIII, VGIV
Variedade gattii do tipo I, II, III e IV
VNI,VNII, VNIII, VN IV
Variedade neoformans do tipo I, II, III e IV.
x
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO................................................................................................. 12
1.1
1.2
1.3
1.4
1.5
O Microrganismo...........................................................................................
A doença.......................................................................................................
Fatores de Virulência....................................................................................
O Diagnóstico Laboratorial............................................................................
A Epidemiologia e Grupos Moleculares........................................................
12
13
16
18
21
2. OBJETIVOS..................................................................................................... 27
2.1 Geral.............................................................................................................. 27
2.2 Específicos.................................................................................................... 27
3. MATERIAIS E MÉTODOS............................................................................... 28
3.1
3.2
3.3
3.4
Modelo de Estudo.........................................................................................
Universo de Estudo.......................................................................................
Procedimentos..............................................................................................
Características dos Pacientes.......................................................................
28
28
29
39
4. RESULTADOS................................................................................................. 40
5. CONCLUSÃO.................................................................................................. 56
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................ 57
7. ANEXOS.......................................................................................................... 64
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 O Microrganismo
Os estudos com Cryptococcus tiveram início em 1894, na Itália, quando
Sanfelice registrou o primeiro isolado deste fungo a partir de suco de pêssego,
chamando-o de Saccharomyces neoformans1. No mesmo ano, foi relatada uma
infecção pela levedura em um paciente alemão, sendo a referida levedura chamada
de Saccharomyces hominis. Entretanto, observações posteriores demonstraram a
ausência dos ascóporos característicos do gênero Saccharomyces 2.
Atualmente, esta levedura capsulada é taxonomicamente descrita como
fazendo parte da Classe Basidiomycetes, Família Cryptococcaceae e gênero
Cryptococcus3. O gênero engloba mais de 50 espécies que se caracterizam
morfologicamente por se apresentarem na forma de levedura esférica, que variam
de 4 a 10 µm de diâmetro, possuem cápsula e reproduzem-se assexuadamente por
brotamento4.
As leveduras das espécies de Cryptococcus podem formar hifas verdadeiras
durante reprodução sexuada, mas não são considerados fungos dimórficos
verdadeiros, porque a fase filamentosa é apenas transitória, surgido após fusão
entre dois mating types: a e α resultando no estágio sexuado do fungo denominado
Filobasidiella
spp5.
Como
patógenos,
apresentam-se
como
intracelulares
facultativos, os quais fisiologicamente são capazes de tolerar desde baixas
temperaturas ambientais, à temperatura corpórea dos mamíferos (37°C)6.
As
espécies
patogênicas
do
gênero
Cryptococcus
atualmente
são
classificadas em duas: C. neoformans e C. gattii. Passoni (1999) descreveu que C.
neoformans tem a capacidade de colonizar a mucosa do sistema respiratório de
pombos (Columba spp.), sem causar doença, comportando-se como endosaprófitas
naturais destas aves. A peculiar adaptação de pombos aos centros urbanos
proporciona o isolamento do fungo em fontes ambientais, inclusive em poeira
domiciliar7. Já C. gattii é encontrado isolado em espécies de árvores, principalmente
Eucalyptus camaldulensis8.
2
As duas espécies foram classificadas em cinco sorotipos: Cryptococcus
neoformans (sorotipos A, D e o híbrido AD) de distribuição cosmopolita e encontrada
com facilidade em hábitat de pombos (Columba spp.), e Cryptococcus gattii
(sorotipos B e C) predominante em regiões tropicais e subtropicais e originalmente
encontrado em restos vegetais de Eucalyptus camaldulensis 9,10,11,12.
Os sorotipos B e C (C. gattii) são hábeis em infectar e causar doenças em
hospedeiros imunocompetentes, enquanto que os sorotipos A e D (C. neoformans)
ocorrem em pacientes imunocomprometidos, principalmente naqueles infectados
pelo Vírus da Imunodeficiência Humana (HIV) 13.
Litvintseva et al. (2007)14 explicam que o sorotipo AD é um híbrido das
variedades A e D. Ao contrário do que se pensava, a infecção por esse sorotipo
parece ser comum. Em estudo, realizado na América do Norte, foi relatado que 7,5%
dos isolados ambientais eram sorotipo AD14. Na Europa, Dromer et al. (2007)15
observaram que 30% dos isolados pertenciam também a esse sorotipo. No Brasil a
presença do sorotipo AD foi relatada por Nishikawa et al. (2003)11, isolado tanto em
amostras de origem clínica como ambientais.
1.2 A Doença
A Criptococose, antigamente conhecida como torulose ou blastomicose
Européia, é uma micose sistêmica que acomete órgãos internos e a pele14.
O primeiro caso de infecção humana provocada por C. neoformans foi
detectado há pouco mais de 100 anos por Busse e Buschke na Alemanha.
Entretanto, a Criptococose começou a receber atenção especial a partir da década
de 80, com o aumento da população imunocomprometida decorrente da pandemia
de HIV e uso de agentes imunossupressores, para a terapia do câncer ou
transplantes de órgãos. Por esta razão, a Criptococose oportunista transformou-se
em uma infecção relativamente comum neste começo de milênio16.
Quanto à patogenia, a doença caracteriza-se pela inalação de basidiósporos
ou leveduras desidratadas infectantes que chegam até os espaços alveolares. A
3
progressão da infecção para as formas sintomáticas depende da competência
imunológica do indivíduo, da virulência do isolado e da quantidade do inóculo
fúngico inalado (Figura 1)17.
Instalação nos
alvéolos
Inalação
Pulmões
Esporos
Disseminação para o
Sistema Nervoso
Árvores ou
Ocos
Excretas
Cultura
Positiva
Figura
1.
Imagem
do
ciclo
de
infecção
por
Cryptococcus
spp.
Fonte:
www.bmolchem.wisc.edu
Mecanismos de defesa do organismo, através da ativação de macrófagos,
normalmente são suficientes para uma satisfatória e protetora resposta do
hospedeiro. Entretanto, os fatores de virulência podem tornar a resposta imunológica
ineficaz, permitindo a infecção pulmonar, bem como a subseqüente disseminação do
fungo para outros órgãos e sistemas, em especial ao Sistema Nervoso Central
(SNC)18,19.
Uma maior susceptibilidade de infecção pelo fungo é manifestada por
alterações da imunidade celular ou humoral. A infecção pulmonar é o sintoma
preliminar da aquisição da Criptococose, resultando em doença pulmonar
progressiva ou foco pulmonar assintomático, que pode conduzir à disseminação
hematogênica e mais freqüentemente à infecção do SNC ou comprometimento
cutâneo. A infiltração nodular pulmonar é o achado clínico mais freqüente da
Criptococose pulmonar20.
O neurotropismo de C. neoformans vem sendo associado com sua
capacidade em utilizar as catecolaminas (adrenalina, noradrenalina e dopamina)
como substratos necessários ao seu desenvolvimento. Isto justifica o fato de que as
4
áreas cerebrais ricas em catecolaminas são as mais afetadas pelo Cryptococcus
durante a meningoencefalite, quadro prevalente da doença17,21.
O quadro de meningoencefalite varia de acordo com o quadro geral de saúde
dos indivíduos acometidos. Em pacientes imunocomprometidos, as manifestações
clínicas são agudas e predominantes, e em pacientes sem comprometimento
imunológico tendem a ser mais crônicas22.
A Criptococose é a infecção fúngica mais frequente e fatal em pacientes com
aids e a terceira causa de doença oportunista do SNC. Estudos multicêntricos
internacionais demonstraram que a taxa de mortalidade dos pacientes acometidos
de HIV aproximou-se de 69%, sendo que a maioria dos pacientes que foram ao
óbito, ocorreu nos primeiros 30 dias de co-infecção23. Sua prevalência varia de 2,9 a
13,3% representando importante causa de mortalidade na aids, apesar do
tratamento específico23,24.
Em indivíduos hígidos, as respostas imunológicas celular e humoral delimitam
a
contaminação
pela
espécie
C.
neoformans,
caracterizando
um
quadro
assintomático da doença. A resistência da infecção depende da sensibilização
prévia de linfócitos e posterior ativação de macrófagos e neutrófilos, além de uma
resposta humoral mediada por anticorpos opsonizantes25.
Quanto ao perfil característico dos indivíduos acometidos por Criptococose,
estudos prospectivos realizados na região Sudeste do Brasil, no período entre 1998
e 2003 relataram a presença de 96 pacientes com diagnóstico clínico-laboratorial de
Criptococose, sendo que destes a maior predominância (81,3%) foi de pacientes
portadores de aids26.
Em recentes estudos brasileiros sobre o perfil epidemiológico dos pacientes
acometidos com Criptococose por C. neoformans, constatou-se que a maioria dos
pacientes era do sexo masculino, com faixa etária de 30 a 39 anos e portadores de
HIV27,28 e que casos de infeçcão por C. gattii acometia pacientes sem
imunocomprometimento evidente29.
5
1.3 Fatores de Virulência
Os fatores de virulência estão abaixo e relacionados na Tabela 1.
1.3.1 A cápsula
A patogenicidade é determinada pela cápsula do Cryptococcus, composta
principalmente pelo polissacarídeo glicuronoxilmanana4. Este fator de virulência
impede a fagocitose e ativação do sistema complemento16. O processo fagocítico é
impelido, uma vez que o potencial zeta negativo dos componentes capsulares
decorre, e isto provoca repulsão eletrostática entre o fungo e os macrófagos30.
No meio ambiente, a cápsula possibilita a sobrevivência em condições de
baixa umidade, protegendo a levedura contra alta desidratação31.
A cápsula criptocócica fornece uma barreira física em torno da parede fúngica
e modula respostas imunes do hospedeiro em diversos níveis. O material capsular
está relacionado tanto com alterações na eficiência do processo fagocítico fúngico,
quanto com a resistência à destruição da parede celular pelos efeitos imunes,
redução na produção de citocinas pró-inflamatórias e a apresentação dos antígenos
aos linfócitos T. Este fator de virulência, ainda interfere, no funcionamento dos
componentes do complemento impossibilitando a ligação aos receptores CR3 dos
leucócitos o que prejudica a resposta humoral30,32.
1.3.2 Lacase e Melanina
As colônias de Cryptococcus, quando semeadas em Ágar Níger apresentam
coloração marrom, isso foi observado pela primeira vez, em 1962 por Staib33.
Porém, o mecanismo pelo qual ocorria a produção desse pigmento, no entanto, não
havia sido estabelecido ainda33,34. Todavia, desde então, a detecção da melanina
em meio de cultura tem sido utilizada para isolamento, purificação e identificação
desse microrganismo em laboratórios de análises clínicas4.
A melanina é um fator de virulência muito estudado no gênero Cryptococcus.
Esta é um pigmento carregado negativamente, que resiste à degradação em pH
6
ácido4. Ela é responsável pela proteção da célula fúngicas, contra a ação fagocitária
dos macrófagos, atuando como antioxidante, além disso, inibe a produção de TNFα, citocina importante para desencadeamento da resposta imune celular35.
Tanto C. neoformans quanto C. gattii secretam a lacase, enzima dependente
de cobre, substância que catalisa a formação de melanina, quando estes
microrganismos crescem em substratos contendo compostos difenólicos5, incluindo
as catecolaminas4.
Um estudo de interrupção gênica revelou que cepas selvagens de
Cryptococcus são mais virulentas que seus mutantes albinos21, portanto a melanina
é importante na patogenicidade da Criptococose.
1.3.3 Mating Types
Cryptococcus spp. possuem dois tipos sexuais ou mating types (MAT)
complementares: MATa e MATα3.
C. neoformans e C. gattii se reproduzem assexuadamente por brotamento,
estando a grande maioria dos isolados clínicos e ambientais presentes na forma
anamórfica
haplóide.
Apesar
disso,
essa
levedura
pode
se
reproduzir
sexuadamente, correspondendo ao estado perfeito, sendo este estágio denominado
de Filobasidiella neoformans e F. bacillispora, correspondente aos anamorfos C.
neoformans e C. gattii, respectivamente3,36,37.
O MATα apresenta maior prevalência tanto em amostras clínicas como
ambientais2,4,38. Essa maior prevalência do mating type α sugere que ele tenha
vantagem seletiva permitindo maior sobrevivência do fungo no meio ambiente e
também maior virulência39.
7
Tabela 1. Fatores de Virulência das espécies patogênicas de Cryptococcus.
Fator de
Virulência
Funções no Ambiente
Funções na
Patogênese
Prevenção da dessecação
Anti-fagocítico
Proteção contra predadores ameboides
Imunomodulador
Degradação da Lignina
Interferência no stress
oxidativo
Cápsula
Lacase
Proteção contra luz ultravioleta
Resistência à morte
oxidativa
Tolerância ao calor e frio
Antifagocítico
Redução da susceptibilidade à
degradação enzimática
Imunomodulador
Fosfolipase
Função Nutricional (ainda indefinida)
Crescimento intracelular
Proteases
Função Nutricional
Dano Tecidual
Urease
Captação de Nitrogênio
Crescimento intracelular
Mating Type
Reprodução Sexual
Regulação dos Fatores de
Virulência
Melanina
30
Fonte: Casadevall et al., 2003 .
1.4 O Diagnóstico Laboratorial
As leveduras de Cryptococcus spp. podem ser visualizadas facilmente em
espécimes clínicos como líquido cefalorraquidiano (LCR), escarro, lavado brônquico,
urina e outros tipos de secreções ou fluidos, por microscopia óptica contendo tinta
8
da China. Nesta coloração, visualiza-se a levedura no interior da cápsula (Figura 2),
uma vez que esta contrasta com a tinta40.
Figura 2. Imagem de leveduras do
Gênero
Cryptococcus.
Fonte:
www.adam.com
A microscopia é positiva quando há 103 ou 104 UFC/mL de células fúngicas.
O diagnóstico laboratorial através do teste da tinta da China tem sensibilidade de 7090% dos pacientes com aids, porém cai para somente 50% em pacientes
imunocompetentes17.
C. neoformans pode ser isolado em meios de cultivo que contenham uma
fonte de carbono, nitrogênio e oxigênio41, produzindo colônias brancas mucóides
(dependendo da espessura da cápsula), usualmente após 48 e 72 h (Figura 3).
Figura 3. Imagem de
Cryptococcus em Ágar
Fonte: Acervo Pessoal
cultivo de
Sabouraud.
As espécies do gênero Cryptococcus tem atividade de urease. A
patogenicidade de C. neoformans está relacionada com a sua capacidade de
crescer a 37 ºC. No entanto, a temperatura ótima de crescimento está entre 30-
9
35ºC. Em meios de cultura como o ágar níger, a presença de compostos difenólicos
propicia a produção de lacase que leva à formação de melanina (Figura 4), que pode
ser observada pelo aparecimento de coloração marrom nas colônias33.
Figura 4. Imagem de cultivo de Cryptococcus em
Ágar Níger com produção de melanina. Fonte: Acervo
Pessoal
Alguns sorotipos de C. neoformans podem ser diferenciados pela reação de
coloração quando cultivados em meio ágar CGB, pois C. gattii é resistente à
canavanina e utiliza a glicina como fonte de Carbono e Nitrogênio, modificando o pH
do meio, deixando-o alcalino. O azul de bromotimol funciona como um indicador da
mudança de pH, modificando a coloração do meio, de amarelo para azul,
caracterizando C. gattii, diferenciando de C. neoformans (Figura 5)42.
Figura 5. Imagem de cultivo de Cryptococcus em CGB,
amarelo, C. neoformans e azul, C. gattii. Fonte: Severo
43
LC. In: Consenso em Criptococose, 2008 .
Inúmeras técnicas baseadas na análise do DNA têm sido utilizadas para
estudos de detecção, caracterização, filogenia e epidemiologia do gênero
Cryptococcus. Essas técnicas incluem análises RFLP (fragmentos de DNA gerados
10
por enzimas de restrição). Em 1997, ao utilizar esta metodologia, Franzot et al.44 ao
analisarem a diversidade genética de isolados C. neoformans do Brasil e da cidade
de Nova York (EUA), através do perfil de RFLP da seqüência do gene URA5,
sugeriram uma dispersão global de certos isolados patogênicos.
1.5 A Epidemiologia e Grupos Moleculares
Cryptococcus
neoformans
possui
distribuição
geográfica
mundial,
freqüentemente associa-se a habitat de aves, excretas secas, ricas em fontes de
nitrogênio, como uréia e creatinina. Uma vez que tenha condições favoráveis para o
seu crescimento abundante, esta levedura forma microfocos, notadamente em
centros urbanos e relacionados a pombos45.
C. neoformans é mais comum no continente europeu, embora tenha
distribuição mundial, onde mais de 30% dos casos da doença são causados por
essa espécie2. Países como Suíça, Alemanha, Áustria46 e França47 já informaram
sobre seu isolamento.
A Criptococose neoformans ocorre como primeira manifestação oportunista
em cerca de 4,4% dos casos de aids no Brasil48. Esta micose sistêmica associada à
aids predomina nas regiões, Sul, Sudeste e Centro-oeste do Brasil
49,50,51
. Por outro
lado, Cryptococcus neoformans é capaz de causar infecção fatal em indivíduos
aparentemente normais52.
Todavia, esta espécie já foi encontrada no Brasil, sendo isolada de árvores
em diferentes localidades53,54,55: Rio de Janeiro (RJ), em Teresina (PI), em Boa Vista
e Ilha de Maracá (RR), no interior do Amazonas e na Cidade de São Paulo56.
Espécies de C. neoformans são isoladas com maior freqüência na Europa e
América do Sul. No Brasil, por ser área endêmica desta espécie, há um grande
interesse em se determinar os genótipos dos isolados deste fungo3,49,54,57.
A Criptococose por Cryptococcus gattii ocorre na América Latina, em países
como Argentina, Brasil, Venezuela11, Peru e Colômbia58,59. No Brasil, principalmente
nas regiões Norte e Nordeste, estudos clínico-epidemiológicos vem mostrando a
11
importância dessa espécie que acomente o SNC de adultos jovens e crianças, com
alta letalidade60. Sabe-se que Criptococose gattii pode ocorrer em áreas de clima
temperado e apresentar-se sob forma de surtos. Em áreas, onde há alta pressão
endêmica por C. gattii, observa-se significativa associação deste agente com aids50.
Em estudo prévio, na Região Norte do Brasil, realizado na Fundação de
Medicina Tropical do Estado do Amazonas, Santos (2000)61 relatou que a frequência
da Criptococose infantil entre os anos de 1988-1998, representou uma significante
fração dentre os casos reportados (33%, n=75), dado este realmente preocupante,
frente à vasta região de florestas, um dos hábitats deste fungo.
Um recente surto de infecção por Cryptococcus gattii, no clima temperado da
Ilha de Vancouver, British Columbia (BC), Canadá, deflagrou o início e a
colaboração de pesquisadores no esforço de investigação deste distúrbio em
relação às descrições geográficas, demográficas e microbiológicas, referenciando as
características clínicas dos casos de Criptococose, bem como identificar possíveis
reservas ambientais responsáveis pelo surto. Como a maioria dos pacientes eram
imunocompetentes, a infecção criptocócica foi listada como doença notificável em
BC, Canadá62.
A partir de então, muitos questionamentos foram surgindo em relação à
virulência da espécie de Cryptococcus que gerou a epidemia em BC. Por isso,
ferramentas moleculares foram utilizadas para caracterizar o genótipo envolvido no
surto. Os estudos genotípicos utilizando PCR-Fingerprinting e PCR-RFLP realizados
por Meyer et al. (1999)63 conseguiram distinguir oito genótipos, sendo 4 de C.
neoformans (VNI e VNII, VNIII e VNIV) e 4 de C. gattii (VGI e VGII, VGIII e VGIV).
Após as análises que reproduziram a metodologia de Meyer et al. (1999)63, um
estudo posterior constatou que VGII era o grupo molecular causador do surto na Ilha
de Vancouver62.
As técnicas moleculares de tipificação incluem a PCR-Fingerprinting onde um
lócus de polimorfismo no DNA é amplificado gerando diferentes fragmentos que
geram diferentes padrões de bandas de DNA e podem ser relacionados com uma
espécie, variedade ou linhagem. A técnica de RAPD (Random Amplified
Polymorphic DNA) é um fingerprinting que utiliza sequências arbitrárias que geram
12
diferentes padrões de amplificação, os quais permitem no caso de Cryptococcus
spp. discriminar grupos moleculares e também são utilizados em estudos
epidemiológicos64,65.
A metodologia proposta por Meyer et al. (1999)63 propuseram a tipagem
molecular de Cryptococcus spp. através do PCR-Fingerprinting que utilizou como
primer uma seqüência obtida do “núcleo” do fago M13 para detectar seqüências
minissatélites hipervariadas existentes no genoma da levedura. Este protocolo
permitiu a separação dos isolados de C. neoformans e C. gattii em oito grandes
grupos moleculares, como já foi mencionado.
Em 2003, um dos primeiros grandes estudos multicêntricos de caracterização
molecular de espécies de Cryptococcus foi realizado pelo Ibero American
Cryptocococcal Study Group, que envolveu oito países da America Latina e a
Espanha. O minissatélite M13 foi utilizado para diferenciação dos grupos
moleculares das espécies e a confirmação dos mesmos ocorreu por análises de
Restriction Fragment Length Polymorphism (RFLP) do Gene Urotidina Monofosfato
Pirofosforilase (URA5), o qual demonstrou a prevalência de VNI dentre as cepas de
Cryptococcus neoformans66.
Muitos estudos utilizando a classificação de Meyer et al. (1999)63 foram
realizados em diversas partes do mundo. Na Austrália, um estudo de 61 isolados
clínicos e 49 ambientais (isolados de eucaliptos e outras árvores) de C. gattii revelou
que 92% dos clínicos pertenciam ao genótipo VGI e 100% dos ambientais isolados
de eucaliptos, eram VGI, além disso, três isolados clínicos e um ambiental de outra
árvore, que não o eucalipto, foi VGII e apenas um isolado clínico foi VGIII67.
Na Índia, o genótipo VNI mostrou-se predominante ocorrendo em 89% dos 57
isolados clínicos, os genótipos VNIV e VGII também foram encontrados, com
porcentagens de 2% e 9%, respectivamente68.
Em Barcelona, Espanha, o tipo VNI ocorreu em todos os 22 isolados
escolhidos randomicamente para genotipagem, todos foram provenientes de
amostras do solo misturadas a excrementos de pombos69.
13
Na América Latina, Meyer et al. (2003)66, ao estudarem 304 cepas de
Cryptococcus spp. do Brasil, Argentina, Chile, Colômbia, México, Peru, Venezuela,
Guatamela e Espanha, encontraram o genótipo VNI em 68,2% dos isolados e o
genótipo VNII, em pequena proporção (5,6%) seguido do genótipo VNIII (sorotipo
AD) com 4,1% e do VNIV, com 1,8%. Já o genótipo VGI foi encontrado em 3,5% dos
isolados, VGII, em 6,2%, VGIII em 9,1% e VGIV em 1,5%. O Brasil participou do
estudo com 66 cepas. Dessas 82,3% foram VNI, 3% VNII e 13,6% VGII66.
Em relação aos estudos realizados no Brasil, Casali et al. (2003)38 ao estudar
105 cepas clínicas e 19 ambientais relataram que o genótipo VNI era o mais comum
na região sul do Brasil (89,3%), seguido pelo genótipo VGI (8,9%) e VNIV (7,3%), ao
qual pertenciam todos os isolados obtidos de Eucalyptus spp. O estudo de Abegg et
al. (2006)9, no Rio Grande do Sul, relatou que todos os genótipos de C. neoformans
foram VNI, já os C. gatiii, VGI9.
Já em 2008, Trilles e colaboradores70 realizaram um estudo verificando a
distribuição dos tipos moleculares de C. neoformans e C. gattii em todo o Brasil, a
fim de correlacionar os genótipos com as regiões geográficas e condições dos
hospedeiros. Foram analisados 443 isolados, sendo 320 de C. neoformans e 123 de
C. gattii, de todas as regiões do Brasil, representadas por onze Estados. Os tipos
moleculares mais comuns foram VNI (64%) e VGII (21%), seguido por VNII (5%),
VGIII (4%), VGI e VNIV (3% cada), e VNIII (< 1%). O tipo molecular VGIV não foi
identificado dentre os isolados estudados no Brasil. O estudo revelou ainda que o
genótipo VGII ocorreu predominantemente na macrorregião nordeste, e o VNI na
macrorregião sudeste, como ilustra a Figura 6. Do Estado do Amazonas foram
obtidos 12 isolados e os tipos moleculares identificados foram VNI e VGII70.
Em recente estudo realizado por Silva (2009)71, na Fundação de Medicina
Tropical do Amazonas, foram realizadas tanto a feno quanto a genotipagem de 40
isolados clínicos, sendo que usando o meio CGB (Canavanina-Glicina-Azul de
Bromotimol), foi observado que 75,5% (n=31) e 22,5% (n=9) dos isolados eram
Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii, respectivamente. Já a PCRfingerprinting usando a seqüência M13, mostrou que a maioria dos isolados, 72,5%
(n=29) era do genótipo VNI e que todos os nove isolados da espécie C. gattii eram
do genótipo VGII71.
14
Figura 6. Imagem da distribuição dos tipos moleculares de acordo com os Estados
70
Brasileiros incluídos na análise. Fonte: Trilles et al., 2008 .
Métodos
moleculares
tem
sido
desenvolvidos
para
diagnóstico
e
monitoramento de infecções fúngicas, bem como para tipificação dos isolados,
visando principalmente, estudos epidemiológicos. A reação em cadeia de polimerase
(PCR) tem sido a principal ferramenta utilizada no desenvolvimento de protocolos de
detecção de DNA de C. neoformans e C. gattii72.
Quanto à possibilidade de se utilizar a Região ITS (Internal Transcript Space)
para caracterização de Cryptococcus, os genes ribossomais são alvos estudados
nos sistemas baseados em PCR, para detecção e identificação deste patógeno
fúngico
73,74
. As regiões ITS possuem sequências altamente variáveis que tem sido
usadas para identificação de fungos nos mais diferentes formatos de níveis de
espécie 75,76,77.
Em 1999, Irobi e colaboradores78 descreveram um método molecular para
identificação de leveduras do gênero Candida, tendo como alvo a região ITS. Os
primers utilizados foram ITS5 (5’-GAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) e NL4 (5’GGTCCGTCTTTCAAGACGG-3’). O método provou ser simples e reprodutível, além
de oferecer potenciais vantagens sobre os métodos de fenotipagem78.
Já em 2009, Santos e colaboradores79 identificaram agentes causadores de
fungemias (Candida albicans, Candida parapsilosis, Candida tropicalis, Candida
glabrata, Cryptococcus neoformans, Cryptococcus gattii e Histoplasma capsulatum)
utilizando PCR/RFLP, e entre as combinações de pares de enzimas de restrição,
15
somente uma combinação (par de primers ITS5/NL4 e enzima de restrição Ddel)
produziu um padrão RFLP específico para cada microrganismo estudado. Neste
estudo, a região dos primers ITS5 e NL4, permitiu a distinção de genótipos VGII e
VNI79.
Diante do contexto, há escassez de estudos desta natureza na região Norte,
especialmente no Estado do Amazonas71. Em um país com dimensões continentais,
há necessidade de realizar pesquisas sobre as características genotípicas do gênero
Cryptococcus, pois fatores ambientais, geográficos e climáticos propiciam variações
tanto na feno quanto na genotipagem, e conseqüentemente na patogenicidade das
infecções oportunistas43.
O evento que ocorreu em Vancouver aumentou ainda mais o interesse das
comunidades médico-científicas em conhecer os grupos moleculares causadores da
doença, pois as espécies estão começando a ocupar novos nichos ecológicos. É de
grande importância monitorar onde e quantos casos de infecção por Cryptococcus
estão ocorrendo, a fim de identificar os grupos moleculares envolvidos, mesmo em
regiões com clima onde não seria esperado encontrar a espécie. Este estudo traz
informações particulares sobre os genótipos que causam infecção no Amazonas.
Estas informações são importantes para a epidemiologia da doença no Estado, uma
vez que os dados do Amazonas ainda são pouco conhecidos, pois há ausência de
outros estudos. Estudos similares devem ser estimulados em todas as áreas
endêmicas, determinando o grau de sua potencialidade patogênica em indivíduos
imunocomprometidos ou imunocompetentes.
16
2
OBJETIVOS
2.1 Geral
Caracterizar por métodos moleculares agentes causadores de Criptococose,
isolados de pacientes atendidos em Unidade Terciária de Saúde do Estado do
Amazonas.
2.2 Específicos
- Investigar quais os grupos moleculares causadores de Criptococose através do
PCR-Fingerprinting utilizando o minissatélite M13 e pelo perfil de restrição (PCRRFLP) utilizando o gene URA5;
- Avaliar a possibilidade de se utilizar uma PCR-RFLP, tendo como alvo a região ITS
do DNAr, para caracterização dos grupos moleculares de Cryptococcus;
- Verificar a presença de genes sexuais específicos, com locus mating type (MATα e
MATa) das espécies por PCR;
- Descrever e correlacionar as características epidemiológicas dos pacientes com os
grupos moleculares, a partir dos dados obtidos nas requisições de exames.
17
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 Modelo de Estudo
Estudo descritivo transversal com a finalidade de caracterizar os isolados
causadores de Criptococose no Estado do Amazonas.
3.2 Universo de estudo
Local: Este estudo foi realizado no Laboratório de Micologia da Fundação de
Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT-HVD) e no Laboratório de
Micobacteriologia do Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia (INPA).
Período: O período de estudo foi entre Março de 2006 a Fevereiro de 2010.
Amostras: Os isolados foram obtidos de material clínico procedente do Laboratório
de Micologia da FMT-HVD.
Aspectos éticos: Este projeto de pesquisa foi registrado e aprovado pelo CEPFMT/AM, Processo n°. 763/2010-FMT-AM, CAAE – 0007.0.114.000-10 (Anexos).
Financiamento: Este estudo foi financiado pela FAPEAM, através do edital
N°.014/2006 PPSUS 2006.
Microrganismos Analisados
Isolados Clínicos
Os 60 isolados deste estudo foram obtidos de pacientes acometidos por
Criptococose, portadores de HIV ou não, internados na Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado, entre março de 2006 a fevereiro de 2010. De
cada paciente foi utilizado apenas um único isolado fúngico (o primeiro isolado da
amostra enviada ao Laboratório). Estes isolados estavam sendo mantidos sob
refrigeração (4oC), na Coleção de Fungos da FMT-HDV.
Cepas de Referência
As linhagens foram caracterizadas genotipicamente de acordo com as cepaspadrão concedidas gentilmente pela Coleção de Culturas da Fundação Oswaldo
18
Cruz (FIOCRUZ-RJ) (Tabela 2).
Tabela 2. Lista de cepas de referência utilizadas neste estudo, incluindo informações gerais, sorotipo
(ST), mating type (MAT), tipo molecular (TM).
Isolados
WM 148R
WM 626R
WM 628R
WM 629R
WM 179R
WM 178R
WM 161R
WM 779R
WM N°.
WM 148
WM 626
WM 628
WM 629
WM 179
WM 178
WM 161
WM 779
País
Austrália
Austrália
Austrália
Austrália
Austrália
Austrália
Austrália
África do Sul
Fonte
CLIN
CLIN
CLIN
CLIN
CLIN
CLIN
CLIN
VET
ST
A
A
AD
D
B
B
B
C
MAT
Alpha
Alpha
Alpha
Alpha
Alpha
Alpha
Alpha
Alpha
TM
VNI
VNII
VNIII
VNIV
VGI
VGII
VGIII
VGIV
3.3 Procedimentos
3.3.1 Determinação dos grupos moleculares
3.3.1.1 Reativação dos isolados fúngicos
A fim de reativar os microrganismos, foi utilizado o cultivo em Ágar Sabouraud
a 37 oC por 48 h. Após este período, foram purificados em placa contendo Ágar
Níger, e apenas uma colônia foi retirada e semeada em Caldo Sabouraud a 30 °C,
para obtenção da biomassa, utilizada nos estudos genotípicos (extração de DNA)
(Figura 7).
3.3.1.2 Extração de DNA genômico
A extração foi baseada na utilização de membrana de sílica (Kit QIAamp
Tissue and Blood, Qiagen, Hilden, Germany) (Figura 8).
Cerca de 90 mg de biomassa foram transferidos com auxílio de alça
descartável para eppendorf contendo 180 µL de tampão de lise e pérolas de vidro
lavadas em ácido (450-600 nm). As células foram rompidas com choque mecânico e
depois se procedeu à extração genômica com adição de Proteinase K overnight a 56
°C, em seguida adicionou-se 200 µL de tampão de guanidina e fez-se a agitação a
frio em vórtex por 15 s e incubou-se por 10 min a 70 °C. Passado este período, foi
adicionado o mesmo volume, 200 µL, desta vez de etanol e foi homogeneizado em
19
agitador. A mistura foi transferida para as colunas de sílica e foi centrifugada a 8000
rpm em 1 min. O material foi transferido para novo tubo da coluna e 500 µL do
primeiro tampão de lavagem foi adicionado à coluna, em seguida, foi centrifugado
por 1 min a 8000 rpm. Novamente o tubo da coluna foi trocado, e 500 µL do segundo
tampão de lavagem foi adicionado à coluna de sílica, e centrifugado a 14000 rpm por
3 min. Mais uma vez, o tubo da coluna foi retirado e o tampão de eluição do DNA foi
adicionado, procedendo com a centrifugação a 8000 rpm por 1 min, desprezando a
coluna e armazenando o filtrado a 4 °C.
A concentração de DNA Genômico foi verificada através de leitura em
espectrofotômetro (GeneQuant-pro RNA/DNA Calculator, GE Healthcare) no
comprimento de onda de 260 nm (unidade de absorbância correspondeu a 50
μg/mL) e a razão de pureza foi determinada pela razão entre as absorbâncias a 260
e 280 nm.
3.3.1.3 PCR-Fingerprinting RAPD utilizando o minissatélite M13
Foi
utilizada
a
seqüência
específica
do
minissatélite
M13
(5’-
63
GAGGGTGGCGGTTCT-3’) (Meyer et al., 1999) . A reação de amplificação foi
realizada em um volume final de 25 μL contendo 50 ng de DNA molde, solução
tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl 2 1,5 mM), 0,2 mM de cada
dNTP, 30 ng de oligonucleotídeo iniciador e 2,5 U de Taq DNA polimerase
(Recombinante-Invitrogen). A PCR foi realizada em um termociclador Verite 96,
Applied Biosystens, a reação consitiu em 6 min de desnaturação (94 oC); 40 ciclos
de 1 min desnaturação à 94 ºC, 1 min de anelamento à 50 ºC e 2 min de extensão à
72 ºC; por fim foi realizada uma extensão final de 6 min à 72 ºC. Os produtos da
amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,4%, por 6 h a 60
V (Figura 9).
3.3.1.4 PCR-RFLP do Gene URA5
A PCR do gene URA5 foi conduzida com um volume final de 50 μL. Cada
reação continha 50 ng de DNA molde (extraído com conjunto de extração QIAamp
DNA blood kit - Qiagen, Hilden, Germany), solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3,
KCl 50 mM, MgCl 2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, e 1,5 U de Taq DNA polimerase
20
(Recombinante Invitrogen) e 50 ng de cada primer URA5 (5´-ATGTCCTCCCAAGC
CCTCGACTCCG´-3) e SJ01 (5´-TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC´-3).
A PCR foi realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens, iniciou-se
com 2 min de desnaturação (94 ºC) e 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94 ºC, 30
s de anelamento à 61 ºC e 1 min de extensão à 72 ºC, finalizou-se com um ciclo de
extensão final de 10 min à 72 ºC.
Os produtos da amplificação foram separados por eletroforese em gel de
agarose 1,5%, por 2 h a 100 V, corados com SybrGreen (0,5 μg/mL) e visualizados
sob luz ultravioleta.
Oito microlitros dos produtos de PCR foram misturados a 1 µL de tampão da
enzima Hha I e digeridos duplamente com Sau96I (10 U/µL)e Hha I (20 U/µL) em
incubação por 3 horas ou overnight a 37 °C, e separados por eletroforese em gel de
agarose 3%, por 5 h a 100 V, corados com SybrGreen (0,5 μg/mL) e visualizados
sob luz ultravioleta. Os padrões de RFLP foram visualizados comparando-os com os
padrões obtidos das cepas de referência (VNI-VNIV e VGI-VGIV) (Figura 10).
3.3.1.5 Determinação dos Mating Types
O mating type foi determinado por PCR, que foi conduzida para um volume
final de 25 µL. Os primers do tipo α-específicos foram Mat-αF (5'- CTTCACTGC
CATCTTCACCA-3') e Mat-αR (5'-GACACAAAGGGTC ATGCCA-3') e os primers do
tipo a-específicos foram Mat-aF (5’-CGCCTTCACTGCTAC CTTCT-3’) e Mat-aR (5’AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’).
Cada reação conteve 20 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM,
pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl 2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP e 20 ng cada primer, e
1,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen).
A amplificação foi realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens,
primeiramente foi realizada desnaturação inicial a 94 °C por 3 min, em seguida
foram realizados 35 ciclos de 30 s de desnaturação à 94 ºC, 30 s de anelamento a
58 ºC e 1 min de extensão à 72 ºC, seguidos por um ciclo de extensão final de 7 min
21
à 72 ºC. As reações de amplificação foram realizadas de acordo com o
procedimento de Chaturvedi et al. (2000) modificado80.
O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram visualizados por
eletroforese em gel de agarose 2% por 3 h a 100 V, corado com SybrGreen e
iluminado com luz ultravioleta (Figura 11).
3.3.2 Caracterização dos grupos moleculares utilizando região ITS do DNAr
A PCR do gene espaço transcrito interno (ITS) do DNAr foi conduzida com um
volume final de 50 µL. Cada reação continha 50 ng de DNA molde (extraído com
conjunto de extração QIAamp DNA blood kit - Qiagen, Hilden, Germany), solução
tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl 2 1,5 mM), 0,2 mM de cada
dNTP, e 3,0 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen) e 50 pM de cada
primer
ITS5
(5´-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-´3)
e
NL4
(5´-GGTCCGT
GTTTCAAGACGG-´3).
A amplificação foi realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens,
primeiramente com desnaturação inicial por 6 min a 94 °C, em seguida foram
realizados 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94 ºC, 30 s de anelamento à 55 ºC e
1 min de extensão à 72 ºC, seguidos por um ciclo de extensão final de 10 min à 72
ºC.
O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram visualizados por
eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com SybrGreen e iluminados com luz
ultravioleta.
Oito microlitros e meio dos produtos de PCR foram misturados a 1 µL de
tampão da enzima Ddel (New England Biolabs, Beverly, MA, USA) e foram digeridos
com 5,0 U da mesma (10 U/µL) em incubação por 3 horas ou overnight a 37 °C , e
separados por eletroforese em gel de agarose 2% por 3 h a 110 V, corados com
SybrGreen (0,5 μg/mL) e visualizados sob luz ultravioleta. Os padrões de RFLP
foram visualizados comparando-os com os padrões obtidos das cepas de referência
(VNI-VNIV e VGI-VGIV) (Figura 12).
REATIVAÇÃO/ISOLAM. FÚNGICO
22
Amostra Biológica
Isolamento em
Ágar Níger
Conservação a 4 °C
Reativação em Ágar
Sabouraud
Purificação em
Ágar Níger
Figura 7. Fluxograma da Reativação e Isolamento Fúngico
Uma colônia é cultivada em
Caldo Sabouraud
23
60 Isolados
EXTRAÇÃO
Colônia do Caldo
Sabouraud
90 mg de
biomassa
fúngica
Extração pelo Kit Qiagen
®
Obtenção do DNA
Figura 8. Fluxograma da Metodologia de Extração do DNA Genômico.
Leitura em
Espectrofotômetro da
Concentração de DNA e
pureza
24
PCR- FINGERPRINTING
60 Isolados
DNA
Minissatélite
M13
(5’-GAGGGTGGCGGTTCT-3’)
Mix de
PCR
Primer
Oligonucleotídeo
Amplificação
DNA amplificado
Figura 9. Fluxograma da PCR-Fingerprinting do Minissatélite M13
Gel de Agarose
1,4%
25
PCR- RFLP Gene URA5
60 Isolados
DNA
Gene URA5
URA5 (5'-TGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG-3')
SJ01 (5'-TTAAGACCTCTGAACACCGTACTC-3')
Mix de
PCR
Primer URA5/SJ01
Amplificação
DNA
amplificado
Figura 10. Fluxograma da PCR-RFLP do gene URA5
DNA digerido
Sau96I e HhaI
Gel de Agarose
3%
26
60 Isolados
PCR- Mating Types
DNA
MATα
Mat-αF (5'- CTTCACTGC CATCTTCACCA-3')
Mat-αR (5'-GACACAAAGGGTC ATGCCA-3')
MATa
Mat-aF (5’-CGCCTTCACTGCTAC CTTCT-3’)
Mat-aR (5’-AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’).
Mix de
PCR
Par de primers
Mat-αF/Mat-αR
ou
Mat-aF/mat-aR
Amplificação
DNA
amplificado
Figura 11. Fluxograma da PCR dos mating types.
Gel de Agarose
2%
27
60 Isolados
PCR- RFLP ITS
DNA
DNAr
ITS5 (5'-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3)
NL4 (5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3')
Mix de
PCR
Par de primers
ITS5/NL4
Amplificação
DNA
amplificado
Figura 12. Fluxograma da PCR-RFLP da região ITS do DNAr.
DNA digerido
Ddel
Gel de Agarose
2%
28
3.4 Caracterização Epidemiológica dos Pacientes
O perfil dos pacientes acometidos por Criptococose (gênero, idade, infecção
pelo HIV e tipo de amostra clínica de isolamento) foi obtido através da análise das
requisições de exames, presentes no Laboratório de Micologia da FMT-HVD.
29
4
RESULTADOS
Os resultados estão apresentados na forma de Artigo Científico que será
submetido à publicação na Revista Mycoses (Alemanha) (B1).
ARTIGO ORIGINAL
Molecular characterization of causative agents of Cryptococcosis isolated from
patients in a tertiary healthcare in the State of Amazonas.
1
2
1
Ana Karla Lima Freire, Amaury dos Santos Bentes, Lucilaide Oliveira Santos, Maurício
2
2
1,3
1,2
and João Vicente Braga de Souza
Morishi Ogusku, Julia Ignez Salem, Bodo Wanke
1
Laboratório de Micologia, Fundação de Medicina Tropical Dr. Heitor Vieira
Dourado, Universidade do Estado do Amazonas, Brasil 2 Laboratório de
Micobacteriologia, Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia, Brasil 3 Laboratório
de Micologia, Fundação Osvaldo Cruz, Brasil.
SUMMARY From the knowledge that there are four molecular groups of
Cryptococcus neoformans (VNI and VNII, VNIII and VNIV) and four of Cryptococcus
gattii (VGI and VGII, VGIII and VGIV) has become important to identify groups of
incidents in different geographic regions worldwide. This effect was investigated what
molecular types of 60 cultures of Cryptococcus species isolated from patients in a
tertiary hospital in the State of Amazonas, Brazil, between 2006-2010. The isolates
were characterized by PCR-Fingerprinting using M13 mini-satellite and confirmed by
PCR-RFLP of the URA5 gene. An experimental protocol using PCR-RFLP targeting
the ITS1 rDNA was also evaluated. The presence of specific genes with mating type
locus ((MATα and MATa) species was analyzed using PCR. It was found that
patients are mostly male (66.7%), aged 16-30 years (51.7%), HIV (75.0%) with
meningitis (71.7%). Whose isolates of C. neoformans (66.7%) were mostly
characterized as VNI molecular group (97.5%) and C. gattii (100.0%). Three isolates
(5.0%) could not be characterized by any of the protocols under study and the
experimental protocol evaluated only discriminated two molecular groups of C. gattii
(VGII and VGIII). As for the mating types, 58 isolates were of type α and only two
were type a. It found the prevalence of VNI molecular group, the meeting of the VNII
molecular group, never before reported for the northern region of Brazil, and
suggested that the new methodology for genotyping using as a target gene of rDNA
ITS region characterized only the two molecular groups C. gattii.
Key words: Cryptococcus, Genotyping, PCR-Fingerprinting M13, URA5-RFLP,
ITS5/NL4.
30
INTRODUÇÃO
A Criptococose é uma micose sistêmica que acomete os órgãos internos e a pele,
decorrente da inalação de propágulos infectantes das espécies patogênicas
leveduriformes - Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. A doença
apresenta-se de forma subaguda ou crônica, afetando tanto os indivíduos
imunodeprimidos (aids, principalmente) como os imunocompetentes. A aids é o fator
predisponente mais importante para infecção, sendo que, falhas no sistema
imunológico, inato e adaptativo, induzido pelo vírus HIV (Human Immunodeficiency
Virus)
são
responsáveis
pela
disseminação
da
Criptococose.
Uma
das
características do gênero Cryptococcus é o tropismo meningoencefálico que resulta
em elevada mortalidade na ausência de tratamento.1-3
A patogenicidade do gênero Cryptococcus é determinada, principalmente, pela
cápsula polissacarídica, que promove resistência a fagocitose, proteção da levedura
e inativação do sistema complemento; e pela produção da enzima fenol-oxidase
responsável pelo neurotropismo do fungo.4
Tanto C. neoformans quanto C. gattii, apesar de reproduzirem-se assexuadamente,
possuem um sistema complementar com dois mating types: a e α. Para que este tipo
de reprodução sexuada ocorra é necessário que haja o encontro entre dois mating
types opostos. Geneticamente, o locus mating type é a região do genoma fúngico
que regula o ciclo sexual e pode ser diferente entre células de mating types
opostos.5
A espécie C. neoformans possui distribuição geográfica mundial, enquanto que C.
gattii é encontrado com maior freqüência em regiões tropicais e subtropicais. Porém,
este cenário foi remodelado em 1998, quando foi observado um surto de infecção
por Cryptococcus gattii, no clima temperado da Ilha de Vancouver, British Columbia
(BC), Canadá, caracterizado por ferramentas de PCR-Fingerprinting.6-9
As técnicas moleculares de tipificação PCR-Fingerprinting fundamentam-se na
amplificação de produtos de PCR a partir de regiões gênicas que permitem estudos
filogenéticos e propiciam discussões nos vários níveis taxonômicos até mesmo de:
espécie, variedade ou linhagem.10-11 Atualmente, devido aos estudos realizados por
31
Meyer et al. [12], foram definidos oito grandes grupos moleculares a partir dos
protocolos de PCR-Fingerprinting Minissatélite M13 e PCR-RFLP-URA5. Os grupos
moleculares correspondentes a C. neoformans são VNI, VNII, VNIII e VNIV,
enquanto o C. gattii é subdividido em VGI, VGII e VGIII e VGIV.12-13
Outra região gênica que vem sendo utilizada na detecção e identificação de
patógenos fúngicos por PCR corresponde as regiões do espaço transcrito interno
(ITS), com sequências conservadas, encontradas em genes ribossomais.14-21 O uso
da região ITS foi estabelecida em 1999, quando Irobi et al. [15] descreveram um
método
molecular
para
identificação
de
leveduras
do
gênero
Candida.
Especificamente para Cryptococcus spp., os estudos realizados por Santos et al.
[19] , utilizando o mesmo alvo e primers, diferenciaram as espécies C. neoformans e
C. gattii. Segundo os autores, os resultados demonstram que a região gênica possui
potencial para distinção das espécies e talvez até mesmo dos grupos gênicos.19
Os estudos de tipificação molecular aperfeiçoam o diagnóstico fúngico, elucidam a
diversidade
genética
e
corroboram
com
bases
científicas
para
estudos
epidemiológicos globais.20,22-23 Atualmente, estes estudos também possuem
importância na associação de diferentes grupos moleculares às características de
virulência, à sensibilidade aos antifúngicos e a terapêutica.24-25
Investigar os grupos moleculares do gênero Cryptococcus, isolados de pacientes
atendidos em Unidade Terciária de Saúde do Estado do Amazonas, foi o objetivo do
presente estudo. Especificamente pretendeu-se: determinar os grupos moleculares
por PCR-Fingerprinting utilizando o minissatélite M13 e pela PCR-RFLP do gene
URA5; avaliar a utilização de uma PCR-RFLP tendo como alvo a região ITS do DNAr
para caracterizar os grupos moleculares de Cryptococcus; analisar a presença de
genes sexuais específicos, com locus mating type (MATα e MATa) das espécies por
PCR; e caracterizar os pacientes quanto ao gênero, idade, infecção pelo HIV e
amostra clínica, de onde os agentes foram isolados.
32
Materiais e Métodos
Microrganismos analisados
Os 60 isolados de Cryptococcus spp. analisados foram obtidos de amostras de
pacientes acometidos por Criptococose, internados na Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado (FMT/HVD), entre março de 2006 e fevereiro de
2010. Foi analisado apenas o isolado obtido da primeira amostra processada de
cada paciente, mantido sob refrigeração (4 oC), na Coleção de Fungos da FMT/HVD.
Os microrganismos foram reativados em meio de cultivo Ágar Sabouraud a 37 oC
por 48h. Posteriormente, foram semeados em Caldo Sabouraud a 30 ºC por 48h
para obtenção da massa fúngicas a ser utilizada nos estudos de caracterização
molecular. Para a caracterização foram utilizadas cepas padrões: WM 148 (sorotipo
A, VNI), WM 626 (sorotipo A, VNII), WM 628 (sorotipo AD, VNIII), WM 629 (sorotipo
D, VNIV), WM 179 (sorotipo B, VGI), WM 178 (sorotipo B, VGII), WM 161 (sorotipo
B, VGIII) e WM 779 (sorotipo C, VGIV). Estas foram gentilmente cedidas pela
coleção de fungos da FIOCRUZ-Rio de Janeiro-Brasil.
Extração do DNA Genômico
Na extração foi utilizado o kit comercial QIAamp Tissue and Blood, Qiagen, Hilden,
Germany). A concentração do DNA Genômico foi verificada por leitura em
espectrofotômetro (GeneQuant-pro RNA/DNA Calculator, GE Healthcare), no
comprimento de onda de 260 nm (unidade de absorbância correspondeu a 50
μg/mL) e a razão de pureza foi determinada pela razão entre as absorbâncias a 260
e 280 nm.
Caracterização dos Grupos Moleculares
PCR-Fingerprinting: Foi utilizada a seqüência específica do minissatélite M13 (5’GAGGGTGGCGGTTCT-3’) (MEYER et al. [12]). A reação de amplificação foi
realizada em um volume final de 25 μL contendo 50 ng de DNA molde, solução
tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl 2 1,5 mM), 0,2 mM de cada
33
dNTP, 30 ng de oligonucleotídeo iniciador e 2,5 U de Taq DNA polimerase
(Recombinante-Invitrogen). A PCR foi realizada em um termociclador Verite 96,
Applied Biosystens, a reação consistiu em 6 min de desnaturação (94oC); 40 ciclos
de 1 min desnaturação à 94ºC, 1 min de anelamento à 50ºC e 2 min de extensão à
72ºC; por fim foi realizada uma extensão final de 6 min à 72ºC. Os produtos da
amplificação foram separados por eletroforese em gel de agarose 1,4%, por 6 h a 60
V.
Gene URA5 RFLP: A PCR do gene URA5 foi conduzida com um volume final de 50
μL, contendo 50 ng de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50
mM, MgCl 2 1,5 mM), 0,2 mM de cada dNTP, 50 ng de cada primer URA5 (5´ATGTCCTCCCAAGCCCTCGACTCCG´-3)
e
SJ01
(5´-TTAAGACCTCTGAAC
ACCGTACTC´-3) e 1,5 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen). A
PCR foi realizada em um termociclador Verite 96, Applied Biosystens, a reação
consitiu em 2 min de desnaturação inicial (94oC); 40 ciclos de 30 s de desnaturação
à 94ºC, 30 s de anelamento à 61ºC e 1 min de extensão à 72ºC; por fim foi realizada
uma extensão final de 10 min à 72ºC. O tamanho e a pureza dos produtos de PCR
foram visualizados por eletroforese em gel de agarose 1,5% corado com SybrGreen
e iluminado com luz ultravioleta. Oito microlitros dos produtos de PCR foram
misturados a 1 µL de tampão da enzima Hha I e digeridos duplamente com Sau96I
(10U/ µL) e Hha I (20U/ µL) em incubação por 3 horas ou overnight à 37°C. Os
fragmentos de restrição foram analisados por eletroforese em gel de agarose 3% por
5 h a 100V.
Gene ITS RFLP: A PCR do gene espaço transcrito interno (ITS) do DNAr foi
conduzida com um volume final de 50 µL. Cada reação continha 50 ng de DNA
molde, solução tampão (Tris - HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl 2 1,5 mM), 0,2
mM
de
cada
dNTP,
e
50
pmoles
de
cada
primer
ITS5
(5´-
GGAAGTAAAAGTCGTAAC AAGG-´3) e NL4 (5´-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-´3) e
3,0 U de Taq DNA polimerase (Recombinante Invitrogen). A amplificação foi
realizada em termociclador Verite 96, Applied Biosystens, a reação consistiu em 6
min de desnaturação inicial (94oC); 40 ciclos de 30 s de desnaturação à 94°C, 30 s
de anelamento à 55°C e 1 min de extensão à 72°C; por fim foi realizada uma
extensão final de 10 min à 72°C. O tamanho e a pureza dos produtos de PCR foram
34
visualizados por eletroforese em gel de agarose 0,7% corado com SybrGreen e
iluminado com luz ultravioleta. Oito microlitros destes produtos de PCR foram
digeridos pela enzima de restrição Ddel (10U/ µL) (New England Biolabs, Beverly,
MA, USA) em incubação overnight a 37 °C. Os fragmentos de restrição foram
analisados por eletroforese em gel de agarose 2%, por 3 h a 110V.
Mating Types: O mating type foi determinado por PCR, que foi conduzida para um
volume final de 25 µL. Os primers do tipo α-específicos foram Mat-αF (5'CTTCACTGCCATCTTCACCA-3') e Mat-αR (5'-GACACAAAGGGTC ATGCCA-3') e
os primers do tipo a-específicos foram Mat-aF (5’-CGCCTTCACTGCTAC CTTCT-3’)
e Mat-aR (5’-AACGCAAGAGTAAGTCGGGC-3’). A reação de PCR continha 20 ng
de DNA molde, solução tampão (Tris-HCl 10 mM, pH 8,3, KCl 50 mM, MgCl 2 1,5
mM), 0,2 mM de cada dNTP e 20 ng cada primer, e 1,5 U de Taq DNA polimerase
(Recombinante Invitrogen). As reações de amplificação foram realizadas de acordo
com o procedimento de Chaturvedi et al. [26] modificado. Os produtos de
amplificação foram analisados por eletroforese em gel de agarose 2%, por 3 h a 110
V.
Características dos pacientes
As informações sobre gênero, idade, infecção pelo HIV e tipo de amostra clínica de
onde se isolaram os agentes microbianos, foram obtidas das requisições de exames,
presentes no Laboratório de Micologia da FMT/HVD.
Resultados
Dos 60 isolados obtidos, 40 (66,7%) foram caracterizados como C. neoformans, 17
(28,3%) eram C. gattii e apenas 3 (5%) dos isolados não puderam ser
caracterizados por nenhum dos protocolos estudados.
As metodologias de PCR-Fingerprinting (Fig. 1) e PCR-RFLP URA-5 (Fig. 2)
ilustram que os grupos moleculares encontrados foram VNI (39/60; 65%), VNII (1/60;
1,7%) e VGII (17/60; 28,3%). Estratificando os grupos moleculares incluídos em sua
respectiva espécie, tem-se que do total de 40 isolados de C. neoformans, 39 (39/40;
97,5%) eram grupo molecular VNI e 1 (1/40; 2,5%) do VNII; e todos os 17 isolados
35
da espécie C. gattii foram grupo molecular VGII (17/17; 100%). Foi observada
concordância total entre os dados de ambas as metodologias aplicadas.
Conforme indicado na Tabela 1, a correlação entre os grupos moleculares dos
isolados, com as características dos pacientes obtidas nas requisições de exames
demonstrou a prevalência do sexo masculino (40/60; 66,7%), faixa etária de 16-30
anos (31/60; 51,7%), os isolados obtidos foram derivados principalmente do líquor
(43/60; 71,7%) e a maioria do pacientes tinha infecção pelo HIV (45/60; 75%). Ainda
em relação à idade, observou-se que C. gattii (VGII) acometeu todos os grupos
etários, sendo que 4 (6,7%) casos da doença ocorreram em crianças de 0-15 anos.
Quanto ao achado de VNII, o isolado foi obtido de hemocultura, indivíduo do sexo
masculino, 36 anos, portador de HIV, autóctone.
.
M
VNI VNII VNIII VNIV VGI VGII VGIII VGIV 1
2
3
4
5
M
Bp
2200
738
123
Figura 1. Perfil de PCR-Fingerprinting com o minissatélite M13, das cepas de referência de
Cryptococcus spp. 1, 2, 3, 4 e 5 são amostras dos isolados.
pb
1000
M
VNI VNII VNIII VNIV VGI VGII VGIII VGIV 1
2
3
4
5
6
600
500
250
50
Figura 2. Perfil de RFLP-PCR utilizando o gene URA5 e as enzimas de restrição HhaI e
Sau96I. 1, 2, 3, 4, 5 e 6 são isolados.
36
O experimento que visou avaliar a capacidade de descriminar os grupos moleculares
através de uma PCR-RFLP da região ITS do DNAr, resultou em três distintos perfis,
um dos quais com 60, 120, 500 e 700 pares de base (pb) foi encontrado em todos os
quatro grupos moleculares de C. neoformans e em dois C. gattii (VGI e VGIV). Os
demais perfis foram observados nos grupos moleculares de C. gattii, sendo um com
60, 300, 400 e 490 pb em VGII e o outro com 60, 110, 150, 300 e 700 pb em VGIII
(Fig. 3).
M
VNI
VNII
VNIII
VNIV
VGI
VGII
VGIII
VGIV
pb
1000
700
500
250
50
Figura 3. Distinção entre espécimes de Cryptococcus spp, utilizando o par de primers
ITS5/NL4 e a digestão feita com a enzima de restrição Ddel.
Quanto à caracterização dos mating types contatou-se que 58 eram do tipo alfa e
apenas 2 do tipo a (Fig. 4).
M
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
pb
1000
250
101
50
Figura 4. Mating Types dos isolados de Cryptococcus spp, utilizando o par de primers αMatF/α-MatR, onde o MATα gera um fragmento de 101 pb.
37
TABELA 1. Correlação entre os grupos moleculares dos isolados com as características dos pacientes.
Espécie
n/%
SEXO n
(%)
Grupo
Molecular
n/%
Mas
C. neoformans
40 (66,7)
C. gattii
17 (28,3)
VNI
(39/97,5)
VNII
25
14
(23,3)
(17/100)
Indeterminado
(3/5)
TOTAL n
(%)
0-15
-
16-30
13
3
(21,7)
(5)
-
12
5
4
6
(20)
(8,3)
(6,7)
(10)
2
1
(1,7)
-
4660
23
-
(3,3)
31-45
2
(3,3)
1
>60
-
Líquor
Não
1
4
36
3
(1,7)
(6,7)
(60)
(5)
-
-
1
5
7
10
(1,7)
(8,3)
(11,7)
(16,7)
2
2
11
(5)
(3,3)
(3,3)
(18,3)
-
Sim
3
3
1
*
Outros
(5)
-
(1,7)
Escarro
31
-
-
Hemocultura
(51,7)
-
(1,7)
INFECÇÃO PELO HIV
n
(%)
AMOSTRA BIOLÓGICA n
(%)
(38,3)
-
(1,7)
VGII
Fem
(41,7)
1
(1/2,5)
IDADE n
(%)
1
(1,7)
-
1
1
(1,7)
(1,7)
-
1
(1,7)
-
1
1
2
(1,7)
(1,7)
(3,3)
40
20
4
31
17
6
2
43
5
2
10
45
15
(66,7)
(33,3)
(6,7)
(51,7)
(28,3)
(10)
(3,3)
(71,7)
(8,3)
(3,4)
(16,6)
(75)
(25)
*Amostras como: Lavado Brônquico, Líquido Ascítico, Mielocultura e Urina.
38
Discussão
Cryptococcus neoformans predominou entre os isolados (66,7%), esse agente causa
doença quase que exclusivamente entre pacientes imunossuprimidos. De fato, a
maioria dos isolados do presente trabalho, foram obtidos a partir de pacientes com
aids. Este dado corrobora com a literatura que demonstra que esta espécie é
responsável por até 82,3% dos casos de infecção.13,27 Quanto ao grupo molecular,
os resultados obtidos são semelhantes aos estudos anteriores que encontraram
perfis característicos de VNI, como tipo molecular predominante.13,27 Um estudo
realizado com isolados Ibero-Americanos, provenientes de nove países, incluindo o
Brasil, mostrou a prevalência de VNI dentre as 340 cepas de Cryptococcus
neoformans.13 Especificamente, das 66 cepas brasileiras três tipos moleculares
foram encontrados, sendo VNI predominante, com 82,3%, seguido por VGII (13,6%)
e VNII (3,0%), não indicando de quais Estados ou regiões os isolados foram
obtidos.13 Casali et al. [28], em um importante levantamento sobre Criptococose em
amostras da região Sul do Brasil, demonstrou que 105 isolados clínicos e 19
ambientais foram compatíveis com C. neoformans, com predominância do grupo
molecular VNI. Em 2008, Trilles et al. [27] realizaram um estudo de verificação da
distribuição dos tipos moleculares oriundos de onze Estados do Brasil. Foram
analisados 443 isolados, sendo 320 de C. neoformans e 123 de C. gattii. Os 12
isolados do Estado do Amazonas pertenciam aos grupos moleculares VNI e VGII.
No presente estudo, apenas um isolado foi caracterizado como VNII (1,7%).
Este dado está de acordo com a literatura, que vem demonstrando que este é o
terceiro grupo molecular com uma frequência de 3 a 5% em análises feitas no
Brasil.27 Entretanto, nenhum dos isolados do Estado do Amazonas analisados em
estudos anteriores, foram caracterizados como pertencente ao referido grupo
molecular.27,29 Assim sendo, esse é o primeiro relato de existência de C. neoformans
do grupo molecular VNII na região Norte do Brasil.
Dentre os 17 isolados de C. gattii, 10 foram obtidos a partir de pacientes sem
imunocomprometimento evidente e 7 de pacientes com aids. O C. gattii é
considerado um patógeno primário, no entanto, estudos recentes tem demonstrado
este causando infecção em imunocomprometidos.30-33 Apenas o grupo molecular
VGII (100%) foi encontrado, sendo esse resultado compatível com recentes estudos
que demonstraram ser o referido grupo, o principal causador da doença em
39
imunocompetentes, em diferentes Estados das regiões Norte e Nordeste do Brasil.
27,29,34
Três isolados ficaram sem caracterização quanto ao grupo molecular. Esta
situação pode ser explicada, porque a maioria dos isolados de Cryptococcus são
haplóides, no entanto, alguns isolados diplóides ou aneuplóides podem levar a
fenótipos instáveis, que podem interferir na genotipagem.35 Estudos são necessários
para avaliar este resultado, uma vez que pode se tratar, inclusive, de outras
espécies ou subespécies, ainda não classificadas.
O protocolo elaborado para genotipagem (PCR-RFLP ITS1) demonstrou ser
adequado somente para a distinção entre os grupos moleculares VGII e VGIII,
correspondentes ao Cryptococcus gattii. Para a caracterização dos oito grupos
moleculares das espécies, novos estudos precisam ser efetuados utilizando outras
regiões gênicas do ITS1 e enzimas de restrição.
O mating type α tem maior prevalência em amostras clínicas26,36-37, dados
esses também encontrado no presente estudo. Kozel sugere que essa maior
prevalência do mating type α é devida a vantagens seletivas de maior sobrevivência
no meio ambiente e maior virulência.38 A sugestão tem por base, estudos de
infecção em camundongos que demonstraram que o, mating type
do tipo α é
significativamente mais virulento que o a.39
A presente pesquisa constatou ainda que os pacientes do sexo masculino,
com idade entre 16-30 anos, portadores do HIV são os principais acometidos por
Criptococose no Estado do Amazonas-Brasil. A literatura descreve o gênero
masculino como o mais acometido pela infecção, bem como nesta faixa etária, fato
esse atribuído à epidemiologia da aids37,40 e, mais recentemente, tem-se que as
mulheres obtém proteção contra a Criptococose gerada por seus próprios
hormônios.36,41
O achado de C. gattii como agente de meningite em crianças de 0-15 anos
não portadoras de HIV, está em de acordo com o exposto na literatura.31,34,42-43 No
Brasil, estudo realizado no Estado do Amazonas, região Norte, demonstrou que a
frequência da Criptococose infantil entre os anos de 1988-1998, representou uma
significante fração dentre os casos reportados (33%, n=75).42 Também na região
Norte, no Estado do Pará em um período de sete anos, 24% (n=78) dos pacientes
com Criptococose, hospitalizados, eram crianças.43 Esta alta frequência de
meningite criptocócica continuou sendo observada de 2003-2007 (8/43; 18,6%)
40
ainda no mesmo Estado.34 Já no Piauí e Maranhão, Estados da região Nordeste,
21% (n=257) eram casos de Criptococose na infância.44 A região Norte abrange uma
grande área de floresta Amazônica e mais estudos sobre a etiopatogenia da
Criptococose em humanos, e mais especificamente em crianças, bem como seus
perfis moleculares, precisam ser executados, uma vez que os dados de infecções
infantis são preocupantes.34
O líquor foi o principal material biológico de isolamento fúngico, isto pode ser
explicado, porque a maioria dos pacientes (dependendo da cepa infectante, do
estado imunológico do paciente e do quantidade do inóculo inalado) apresenta
disseminação criptocócica e neurocriptococose. Essa advém do fato do gênero
Cryptococcus produzir fenol-oxidase que converte uma grande variedade de
substratos hidroxibenzóicos, incluindo as catecolaminas, em um pigmento marrom
ou preto, conhecido como melanina, a qual funciona como fator de virulência do
fungo para sua proliferação no organismo do hospedeiro.30,45 Como o líquor é rico
em
substratos
fenólicos,
tem-se
a
explicação
para
o
neurotropismo
do
Cryptococcus.30 Os resultados obtidos dão suporte à literatura, pois demonstram a
alta freqüência da retrovirose e alta prevalência do isolamento do agente em líquido
cefalorraquidiano. Em estudo recente no Estado do Amazonas, obteve-se a alta
prevalência de indivíduos infectados pelo HIV e que desenvolveram co-infecção
criptocócica (29/40; 72%).29 Sendo a Criptococose umas das principais causas de
morbimortalidade em pacientes com aids. Em muitos indivíduos, essa micose é a
primeira indicação da evolução da infecção pelo vírus para o quadro de aids.46
Conclusivamente, a Criptococose no Estado do Amazonas mantem-se
prevalente em portadores do vírus HIV, tendo o C. neoformans do grupo molecular
VNI como principal agente etiológico. Entretanto, tem-se o encontro do grupo
molecular VNII nunca antes relatado para a Região Norte do Brasil. Além do
exposto, constatou-se que a nova metodologia sugerida para genotipagem utilizando
como gene alvo a região ITS do DNAr caracterizou somente os 2 grupos
moleculares de C. gattii.
Agradecimentos
À Universidade do Estado do Amazonas em convênio com a Fundação de Medicina
Tropical Dr. Heitor Vieira Dourado pelo suporte, ao Instituto Nacional de Pesquisas
41
da Amazônia pela permissão e cedência do espaço para a realização dos ensaios,
aos funcionários do Laboratório de Micobacteriologia (INPA) pelo pronto auxílio, ao
INCQS-RJ pelo envio das cepas fúngicas de referência, à CAPES pelo apoio
financeiro e à FAPEAM pelo financiamento desta pesquisa através do edital
N.014/2006 PPSUS 2006.
Referências
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diagnosis of cryptococcosis. J Clin Microbiol 1981; 13: 383-387.
2 Py EA, Aloé M, Burlamaqui L, Guasti S, Monerat PJT. Relato de cinco casos
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adquirida (AIDS). Arquiv Bras Pediat 1997; 4: 15-20.
3 Yamamoto Y, Kohno S, Koga H et al. Random amplified polymorphic DNA
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Nagasaki. J Clin Microbiol 1995; 33: 3328–3332.
4 Diamond RD. Cryptococcus neoformans. In: Mandell, G.L., Bennett, J. E. and
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5 CONCLUSÃO
Cryptococcus neoformans do grupo molecular VNI foi identificado como
principal agente etiológico e todos os isolados de Cryptococcus gattii foram
caracterizados como sendo do grupo molecular VGII;
Neste estudo, houve o encontro do grupo molecular VNII nunca antes
relatado para a Região Norte do Brasil;
Além do exposto, constatou-se que a metodologia avaliada para genotipagem
utilizando como gene alvo a região ITS do DNAr gerou perfis de RFLP para VGII e
VGIII e outros grupos moleculares apresentaram-se sob um mesmo perfil;
O mating type alpha é o prevalente dentre os isolados, o que favorece a alta
virulência do fungo;
A Criptococose no Estado do Amazonas mantem-se prevalente em
portadores do vírus HIV.
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74. Einsele H, Hebart H, Roller G, Loffler J, Rothenhofer I, Muller CA, Bowden RA,
van Burik J, Engelhard D, Kanz L, Schumacher U. Detection and identification of
fungal pathogens in blood by using molecular probes. J Clin Microbiol 1997;
35:1353–1360.
52
75. Scherer S, Magee PT. Genetics of Candida albicans. Microbiol. Rev 1990;
54:226–241.
76. Holmes, AR, Cannon RD, Shepherd MG, Jenkinson H. F. Detection of Candida
albicans and other yeasts in blood by PCR. J Clin.Microbiol 1994; 32:228–231.
77. Selvarangan R, Limaye AP, Cookson BT. Rapid identification and differentiation
of Candida albicans and Candida dubliniensis by capillary-based amplification and
fluorescent probe hybridization. J Clin Microbiol 2002; 40:4308– 4312.
78. Irobi J, Schoofs A, Goossens H. Genetic identification of Candida species in HIVpositive patients using the polymerase chain reaction and restriction fragment length
polymorphism analysis of its DNA. Molec Cell Probes 1999; 14: 401–406.
79. Santos MS, Souza ES, Junior RMS, Talhari S, Souza JVB. Identification of
fungemia agents using the polymerase chain reaction and restriction fragment length
polymorphism analysis. Braz J Med Biol Res 2010; 43(8): 712-716.
80. Chaturvedi S, Rodeghier B, Fan J, Mcclelland CM, Wickes BL, Chaturvedi V.
Direct PCR of Cryptococcus neoformans MATa and MATa pheromones to determine
mating type, ploidy, and variety: a tool for epidemiological and molecular
pathogenesis studies. J Clin Microbiol 2000; 38: 2007-2009.
53
7 ANEXOS
7.1 Parecer do Comitê de Ética
54
7.2 Regras da Revista Mycoses
E-mail: [email protected]
Electronic submission
Manuscripts should be uploaded as Word (.doc) or Rich Text Format (.rft) files
plus separate figure files. JPEG, TIFF or EPS files are acceptable for submission, but
only high-resolution JPEG, TIFF or EPS files are suitable for printing. The files will be
automatically converted to a PDF document on upload and will be used for the
review process. The text file must contain the entire manuscript including title page,
abstract, text, references, tables, and figure legends, but noembedded figures. Figure
tags should be included in the file.
TEXT
Authors should aim for a concise readable style. Spelling should follow
the Concise
Oxford
Dictionary, and The
Oxford
Dictionary
for
Writers
and
Editors. The Editor reserves the right to make corrections, both literary and technical,
to the papers. All pages must be numbered consecutively in the upper right-hand
corner of each page. Starting with the title page as p.1, the pages should be
numbered in the following order: title page, summary and key words, text,
acknowledgements, references, tables, figure legends. The following items should
each start on a separate page.
Title Page
This should bear (1) the title, (2) the names of all authors, (3) the institutions of
origin with brief addresses, (4) a short title of not more than 50 characters (including
spaces) to be used as a running head, (5) a list of up to eight key words for indexing
purposes, and (6) the name and full postal address (with phone and fax numbers and
e-mail address) of the author who will be responsible for reading the proofs (the
corresponding author). The corresponding author must keep the mycoses office
informed of any change in details until the paper is published. Authors should keep a
copy of their manuscript.
55
Summary
Normally in less than 210 words, this should indicate clearly the scope and
main conclusions of the paper. Original articles should have a structured abstract,
comprising the five headings: Background, Objectives, Patients/Methods, Results
and Conclusions.
Main Text
Papers should be divided into sections headed (1) introduction, (2) materials
and
methods
(or patients
and
methods/subjects
and
methods
if
human
patients/subjects were used), (3) results, (4) discussion and (5) acknowledgements.
Avoid an excess of sub-headings - two further divisions, if necessary, should be
adequate.
The introduction should explain why the work was done and briefly introduce
the scope and contents of the paper. Essential details should be included in materials
and methods, including experimental design and statistical analysis. Results should
be recorded in the past tense. The discussion should present the author's results in
the broader context of other work on the subject. Acknowledgements should be as
brief as possible.
REFERENCES
All references must be cited in numerical order in the text following the
Vancouver system. The numbers of references should appear in the text in brackets
e.g. [1, 21] or [1-4]. If giving the names of authors in the text the following form
should be used: Brown & Smith [1] or Brown et al. [2] if there are more than two
authors. Unpublished observations and personal communications may be included in
the text only.
The reference list should show the references in numerical order as they
appear in the text. References should include the following: (1) authors (surname
followed by initials), (2) year, (3) title of (a) article or (b) chapter, (4) editors (if a
book), (5) title of (a) journal or (b) book, (6) volume number, (7) place of publication
and name of publisher (if a book), and (8) first and last page numbers of (a) article or
56
(b) chapter. Journal titles should be abbreviated according to the system adopted
in Index Medicus.
The following format should be used:
Journal articles
(List all authors if six or fewer, list the first three then add et al. if there are seven or
more).
1 Bloch B, Kretzel A. Econazole nitrate in the treatment of Candida vaginitis. S Afr
Med J 1984; 58:314-472. Books
2 Weinstein L, Swartz MN. Pathogenic properties of invading microorganisms. In:
Sodeman, W. A. Jr & Sodeman, W. A. (eds) Pathogenic Physiology: Mechanisms of
Disease. Philadelphia: W. B. Saunders, 1974: 457-72.
LETTERS TO THE EDITOR
There are no keywords required. The references must be integrated into the
text (Author AA et al., Journal 2002; 1: 242) or (Book author AA. Book Title, 2nd
Edition, Publisher, Place, 1996).
Letters to the Editor are considered for publication (subject to editing and
abridgment) if they do not contain material that has been submitted or published
elsewhere.
• Letters in reference to a Journal article must not exceed 200 words (excluding
references), and must relate to articles Mycoses published within the last three years.
• A letter can have no more than five references and one figure or table. References
should be incorporated into the body text.
• A letter can be signed by no more than three authors.
• You will be asked to include your full address and e-mail address.
57
TABLES
These must be numbered consecutively with arabic numerals and typed on
separate sheets carrying an appropriate legend and presented in a way that makes
the table self-explanatory.
Numerical results should be expressed as means with the relevant standard
errors and/or statistically significant differences, quoting probability levels (P-values).
Three significant figures are usually sufficient for mean values and standard errors
should be quoted two or three more decimals than the mean.
The only lines appearing in the table should be horizontal and all decimals
should be aligned in columns. The placement of all tables should be indicated in the
text, being referred to as Table 1 or Tables 2 and 3.
FIGURES
Figures should be numbered in sequence in Arabic numerals as they appear
in the text. Labels, lettering and symbols etc. must be professionally prepared and
should be uniform. Lines should be of sufficient thickness to stand reduction (no less
than 4 mm wide for a 50% reduction), and letters should be a minimum of 14 pt
Times New Roman or an equivalent size. Acceptable symbols for experimental points
are ¡, r, o, ˜, p, ¢. The symbols + and × will not be accepted.
Legends should be typed on a separate sheet and consist of a short title
together with a brief explanatory paragraph. The legend must make the meaning of
each figure understandable without further reference to the text. Photomicrographs
should state the original magnification.
The position of all figures should be indicated in the text and should be
referred to as Fig. 1 or Figs 1 and 3. Figure 1 should be written out in full if at the
beginning of a sentence.
Colour photos can be reproduced in black and white (with a possible loss
of contrast). It is the policy of Mycoses for authors to pay the full cost for the
reproduction of their colour artwork.
58
Electronic Artwork
Vector graphics (e.g. line artwork) should be saved in Encapsulated Postscript
Format (EPS), and bitmap files (e.g. photographs) in Tagged Image File Format
(TIFF). Do not use any pixel-oriented programmes. Scanned figures (only in TIFF
format) should have a resolution of 300 dpi (halftone) or 600 to 1200 dpi (line
drawings) in relation to the reproduction size. Colour graphics should be created
using the CMYK colour palette (print colours), not RGB (monitor colours). There is a
charge for alterations to figures when carried out by the publisher.
If submitted as hardcopy, figures should be submitted as glossy prints in
duplicate and preferably with a transparent overlay for protection. The overlay should
be used to indicate masking instructions, lettering or arrows. Each figure should bear
the number, author's name and an arrow to indicate the top in soft pencil on the
reverse. If figures have more than one part, each part should be labelled (preferably)
in the top left-hand corner with lower-case letters in parentheses e.g. a figure with
two parts would be labelled (a) and (b). In the text this should be referred to as Fig.
1a or Figs 2a, b.
Figures should be planned to fit the printed column, i.e. 7.9 cm wide for single
column and 16.5 cm wide for double column. Photographs can be up to twice the
reproduction size and must be unmounted glossy prints showing good detail and
moderate contrast.
UNITS, SYMBOLS and ABBREVIATIONS
SI (Système International) units should be used and should conform with the
lists printed Units, Symbols and Abbreviations - A Guide for Biological and Medical
Editors and Authors 4th edn as published by the Royal Society of Medicine.
Nomenclature of disease should follow theInternational Classification of Disease,
published by the World Health Organization, as far as possible.
When first mentioned, cumbersome medical names should be abbreviated for
later reference in the text. Latin bi-nominals should abbreviate the genera to the initial
letter after the first mention unless it begins a sentence.
59
Doses of drugs should be given as unit weight per body weight, e.g. mmol kg1. Rates should be expressed with negative indices. Concentrations should be given
in terms of molarity, e.g. mmol l-1, not mM.
Numerals are to be used from 10 upwards; and the 24-hour clock, e.g. 21.00
hours, should be used.
MATERIALS
The source of all materials used should be given stating company, city of
location and country.
Verification of the identity of living specimens used must take place through
sequencing, or by consultation of taxonomists working at a reference centre.
Specimens analyzed must remain accessible for later reference. Strains should be
deposited in one of the major culture collections, and sequences in a public data
bank. Collection and sequence numbers must be cited in the text. It is recommended
that new taxa are deposited in MycoBank. Descriptions of new taxa must comply with
the rules of the International Code of Botanical Nomenclature.
PROOFS
The corresponding author will receive an email alert containing a link to a web
site. A working e-mail address must therefore be provided for the corresponding
author. The proof can be downloaded as a PDF (portable document format) file from
this site.
60
7.3 Trabalhos Enviados aos Eventos Científicos Relacionados à Dissertação
2009- 25º. Congresso Brasileiro de Microbiologia – Porto de Galinhas (PE)
AVALIAÇÃO DO LIMITE DE DETECÇÃO DA PCR E ANÁLISE DE
POLIMORFISMO DE FRAGMENTO DE RESTRIÇÃO PARA IDENTIFICAÇÃO DE
AGENTES CAUSADORES DE FUNGEMIA EM AMOSTRA BIOLÓGICA.
1
1
2
FREIRE, Ana Karla Lima Freire ; SAMPAIO, Ivanete de Lima ; SANTOS, Mirlane Silva ; SILVA, Erica
3
1,4
Simplício ; SOUZA, João Vicente Braga
1. PPGMT/UEA-FMTAM; Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical; Av. Pedro Teixeira, 25
Dom Pedro. Manaus-AM.
2. UNINORTE; Centro Universitário do Norte; Av. Joaquim Nabuco, 1232 Centro. Manaus-AM.
3. ULBRA; Centro Universitário Luterano de Manaus; Av. Solimões, 02- Cj. Atílio Andreazza.
Manaus-AM.
4. INPA; Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia; Av. André Araújo, 2936, Aleixo. Manaus-AM.
Resumo:
Introdução: As fungemias representam importante causa de morbimortalidade em pacientes
imunocomprometidos. A identificação molecular tem se mostrado de grande utilidade na prática
laboratorial. É uma ferramenta sensível e específica para o diagnóstico precoce das micoses
oportunistas e auxilia na escolha de terapêutica eficaz. Objetivos: Avaliar o limite de detecção da
reação de cadeia de polimerase e análise de polimorfismo de fragmento de restrição para
identificação de agentes causadores de fungemia em amostra de sangue. Especificamente
pretendeu-se: a) determinar a concentração necessária de células/mL para a PCR e b) avaliar os
perfis de RFLP gerados pelos microrganismos. Metodologia: Os agentes patogênicos (Cryptoccocus
neoformans FMT125, Candida albicans FMT457 e Histoplasma capsulatum FMT046) foram
selecionados da coleção de fungos da Fundação de Medicina Tropical do Amazonas. Amostras de
sangue foram contaminadas com diferentes concentrações de células dos microrganismos estudados
6
5
4
3
2
(10 , 10 , 10 , 10 e 10 /mL). A extração do DNA (200 µL de sangue) foi realizada utilizando-se o
sistema comercial de extração DNeasy® Blood & Tissue Kit (QIAGEN Group- DU® - Beckman
Instruments, Inc.). A reação de cadeia de polimerase foi feita utilizando-se o par de primers ITS5 e
NL4, que foram desenhados para amplificar as regiões do espaçamento interno do rDNA, sendo esta
uma região semi-conservada destes agentes etiológicos. A digestão dos produtos de PCR foi
o
realizada com 10U da enzima de restrição Ddel por 12 horas a 37 C. Resultados: A concentração
4
mínima para a amplificação de C. neoformans e H. capsulatum foi de 10 /mL células enquanto para
5
C. albicans foram necessárias 10 células/mL. A enzima Ddel que gerou os seguintes perfis de RFLP:
450, 400, 225 e 200 pb (C. albicans); 550, 425, 100 pb (C. neoformans) e 475, 425, 300, 100 e 50 pb
(H. capsulatum). Conclusão: Estes protocolos conseguiram diferenciar as espécies patogênicas de
fungos.
Palavras-chaves: Fungemia, Limite de Detecção, PCR, RFLP
61
2010 - II Simpósio Internacional de Microbiologia – Costão do Santinho (SC)
AVALIAÇÃO DA CONCENTRAÇÃO E RAZÃO DE PUREZA DO DNA DE
Cryptococcus spp. OBTIDOS POR DIFERENTES MÉTODOS DE LISE DA
CÁPSULA FÚNGICA.
1
3
3
FREIRE, Ana Karla Lima ; BENTES, Amaury Santos ; SILVA, Erica Simplício ; SOUZA, João Vicente
1,3
Braga
1. PPGMT/UEA-FMTAM; Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical; Av. Pedro Teixeira, 25
Dom Pedro. Manaus-AM.
2. ULBRA; Centro Universitário Luterano de Manaus; Av. Solimões, 02- Cj. Atílio Andreazza. ManausAM.
3. INPA; Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia; Av. André Araújo, 2936, Aleixo. Manaus-AM
Resumo:
Introdução: A criptococose é uma micose de natureza sistêmica de porta de entrada inalatória
causada pelos fungos Cryptococcus neoformans e Cryptococcus gattii. O crescente interesse em
epidemiologia molecular e biologia molecular de Cryptococcus neoformans chama para novos
procedimentos capazes de extrair DNA e RNA de boa qualidade a partir de isolados clínicos e
ambientais. A extração de ácidos nucléicos dessas leveduras patogênicas é normalmente dificultada
por uma cápsula espessa e resistente que representa, pelo menos, 70% do volume celular total.
Objetivos: Avaliar a concentração e razão de pureza do DNA de Cryptococcus spp. obtidos por
diferentes métodos de lise da cápsula fúngica. Especificamente pretendeu-se: a) determinar qual o
procedimento mais adequado para ruptura da cápsula do fungo e b) avaliar a metodologia que
fornecia melhor capacidade de extração de DNA de boa qualidade. Metodologia: O agente
patogênico (Cryptococcus neoformans FMT949) foi selecionado da coleção de fungos da Fundação
de Medicina Tropical do Amazonas e foi cultivado em meio líquido Saboraud por 18 horas. Dois tipos
de combinações para lise da levedura foram empregadas. São elas: a) Células Jovens de Meio
Líquido/Lyticase/Ruptura com Sílica e b) Células Jovens de Meio Líquido/Tampão Uréia (8
M)/Ruptura com Sílica; após o rompimento celular, cada um dos experimentos passou por dois tipos
distintos de extração do DNA: o sistema comercial de extração DNeasy® Blood & Tissue Kit
(QIAGEN Group- DU® - Beckman Instruments, Inc.) e extração por Fenol-Clorofórmio, em seguida foi
quantificado. Os experimentos foram feitos em duplicata. Resultados: A combinação que obteve
resultado satisfatório quanto à qualidade do DNA extraído foi: Leveduras jovens do meio
líquido/Lyticase/Ruptura com Sílica e extração com o Kit Comercial da Qiagen, sendo 1.80 a razão de
pureza (Abs 260 /Abs 280 ). Porém, experimentando-se leveduras jovens do meio líquido/Tampão de
Uréia/Ruptura com Sílica e extração pelo Fenol-Clorofórmio obteve-se melhores resultados quanto à
concentração de DNA (33.75 ng/μL), todavia sua razão de pureza (Abs 260 /Abs 280 ) foi menor quando
comparada aos outros testes (1.37). Conclusão: Estes protocolos podem ser estendidos para todas
as espécies de leveduras, em especial para aquelas difíceis de lidar pela presença de cápsula.
Palavras-chaves: Cryptococcus neoformans, Cápsula, Extração de DNA, Concentração de DNA,
Razão de Pureza.
62
2010- II Congresso de Diversidade Microbiana da Amazônia
AVALIAÇÃO DA EXISTÊNCIA DE ESPÉCIES DE Cryptococcus EM ÁRVORES
PRESENTES NO INSTITUTO NACIONAL DE PESQUISAS DA AMAZÔNIA.
1
2
1
SOUZA, Isabela Ponciano ; FREIRE, Ana Karla Lima ; BENTES, Amaury Santos ; SOUZA, João
1,2
1
Vicente Braga ; SALEM, Júlia Ignez.
1. INPA; Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia; Av. André Araújo, 2936, Aleixo. Manaus-AM
2. PPGMT/UEA-FMTAM; Programa de Pós-Graduação em Medicina Tropical; Av. Pedro Teixeira, 25
Dom Pedro. Manaus-AM.
Resumo:
Introdução: A criptococose é uma micose sistêmica causada por uma levedura capsulada, do gênero
Cryptococcus, que apresenta distribuição cosmopolita, sendo o mesmo encontrado em ocos de
árvores ou em fezes de aves. O isolamento do agente etiológico é importante para a sua
identificação, uma vez que a infecção é adquirida através da inalação de esporos ressecados da
levedura, presentes no meio ambiente. Embora a porta de entrada no hospedeiro humano seja o
pulmão, o fungo apresenta tropismo pelo Sistema Nervoso Central (SNC), onde causa quadro grave
de meningoencefalite, após disseminação hematogênica. Objetivos: Foi realizado um estudo
transversal com o objetivo de avaliar a existência de espécies de Cryptococcus em árvores presentes
no Instituto Nacional de Pesquisas da Amazônia. Metodologia: Foram selecionados seis ocos de
espécies de grande porte, com abundante material vegetal em decomposição. As amostras foram
coletadas utilizando swab, com posterior armazenamento em tubo de ensaio estéril. Inicialmente,
pesou-se 1 g de cada material coletado e adicionou-se 9 mL de água destilada a cada um, realizando
diluições a partir de 1:10. Em seguida, as amostras foram homogeneizadas por agitação, durante 5
minutos. Após sedimentação, foram efetuadas diluições decimais em água destilada, as quais foram
plaqueadas em meio de cultura Ágar Níger, suplementado com cloranfenicol e amicacina. Ao longo
de 30 dias, a observação das colônias foi realizada, a fim de verificar o isolamento de leveduras do
gênero Cryptococcus, que no meio níger oxida os substratos fenólicos e produz melanina,
escurecendo as colônias. Resultados: Nas amostras estudadas, foi evidenciada a ausência de
isolados compatíveis com o fungo Cryptococcus spp. Deve-se ressaltar, entretanto, o
desenvolvimento de um grande número de colônias de Deuteromicetos, especificamente os Gêneros:
Penicillium, Aspergillus, Fusarium, Gliocladium e Paucilomyces. Conclusão: Apesar disso, deve-se
continuar a busca de isolados ambientais, uma vez que são as fontes primárias de infecção para o
indivíduo.
Palavras-Chave: Cryptococcus; isolamento; árvores.