Técnicas de Biologia Molecular
em microbiologia Clínica
Técnicas de estudo de mutações
desconhecidas
Prof.Doutor José Cabeda
Técnicas de estudo de mutações
desconhecidas


Métodos Baseados No Tm
 Melting Profiles and GC clamps
 DGGE
• Perpendicular
• Paralelo
 CDGE
 TTGE
Métodos Baseados na conformação
 SSCP
 HA
 CSGE
“Melting Profiles”





Vários domínios de fusão
As moléculas de DNA fundem por etapas
Moléculas parcialmente fundidas migram mais devagar no gel
Moléculas totalmente fundidas migram de acordo com o seu Pm
Podem-se adicionar GC clamps para impedir a fusão total
Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE)


Gradiente de desnaturação
 Químico
 Temperatura
O gradiente pode ser:
 Perpendicular ao
campo eléctrico
 Paralelo ao campo
eléctrico
Denaturing Gradient Gel
Electrophoresis (DGGE)
heteroduplexes
homoduplexes
Constant Denaturing Gel
Electrophoresis (CDGE)
Temporal Temperature Gradient
Gel Electrophoresis (TTGE)



Não existe um gradiente no gel,
em cada momento da corrida
Existe uma temperatura
crescente ao longo da corrida
Em cada momento, a migração
em cada molécula depende de
esta já ter atingido ou não
algum domínio de fusão
Temporal Temperature Gradient
Gel Electrophoresis (TTGE)
Vantagens


Mais fácil de fazer os
geis
Mais reprodutível de
gel para gel
Desvantagens

Mais difícil de acertar
a gama de Tm
HR-1
High Resolution Melter







0.01ºC/s a 1ºC/s
Tambiente a 100ºC
24bit Fluorescence
24bit Temperature
5-20µL Volume
40-45 amostras/h (0.3ºC/s)
LCGreen I
 Excitação a 440-470nm
 Emissão a 470-520 nm
HR-1
Métodos baseados na
conformação


Conformação do dsDNA
 não depende da sequência
 A conformação de homodupletos é diferente da
dos heterodupletos
 A conformação dos heterodupletos depende da
sequencia de “mismatch”
Conformação do ssDNA
 depende da sequência (forma zonas de dupleto
intramolécular, dependentes da sequência)
Single Strand Conformation
Polimorfism (SSCP)





dsDNA é desnaturado
dsDNA é diluido
Renaturação rápida
Corrida em condições semidesnaturantes e a temperaturas
fixas
Resultado depende muito de:
 Temperatura de corrida
 Concentração de
desnaturante
 Presença de certos
químicos (ex: glicerol, etc)
WT1
mutantes
WT2
Heteroduplex Analysis (HA)



Heterodupletos causam
 Distorção na conformação
 Migração no gel mais lenta
Heterodupletos podem existir por:
 Co-amplificação por PCR de heterozigotos
 Introdução de DNA WT e M no mesmo PCR
Correm-se no mesmo gel amostras WT, M e
WT+M
Heteroduplex Analysis (HA)
Sensibilidade entre 80-90% (fragmentos <300bp)
 Utilização do análogo de acrilamida (MDE ou
DEM) aumenta a sensibilidade da HA
 A adição de ureia ao gel pode criar um ambiente
semi-desnaturante que aumenta a resolução do
HA

Conformation Sensitive Gel
Electrophoresis


Principio:
 Ambiente ligeiramente desnaturante aumenta a
capacidade de mutações pontuais produzirem alterações
conformacionais.
Método:
 Electroforese em 6-10% PAGE com tampão tris-taurina
e 100% PEG e 15% formamida (desnaturante)
 Pode utilizar-se BAP ou PDA como “crosslinker”,
aumentando a força do gel e tamanho dos seus poros
 Utilizar fragmentos com 300-800 bp
DHPLC




Coluna Hidrofóbica
Interacção entre coluna e DNA efectuado pelo
Acetato de Trietilamónio (TEEA)
Libertação da retenção efectuada por um gradiente
crescente de Acetonitrilo (ACN)
ssDNA menos retido que dsDNA
DHPLC
Perfil de utilização dos Tampões
BRCA1
Transgenomics DHPLC Wave Systems
3500
3500HT
4000Plus
Microbial
Hibridização
desnaturar
Hibridização
Adicionar sonda
Hibridização
Hibridização
Dot-Blot
Variações
Hibridização em microplaca
 hibridização reversa

DEIA
(hibridização reversa em microplaca)
(detecção com anti-dsDNA)
Inno-Lippa
Hibridização em filtro
 Várias sondas por filtro dispostas em tiras
(tipo código de barras)
 Hibridização reversa
 Marcação no produto do PCR

Resultados do INNO-LIPA
MEIA
MEIA
Southern
Blot
Northern Blot

Semelhante ao Southern
 Utiliza RNA e não DNA
 Não utiliza reacções de restrição
Hibridização em microchip




Miniaturização de um
dot-blot
Densidade variável
Hibridização
automática
Leitura automática
Hibridização em microchip:
procedimento
Hibridização em Microchip:
Staph-A (1)
Hibridização em Microchip:
Staph-A (II)
Hibridização em Microchip:
Coagucheck

Marcadores para factores de risco de trombose